Informacija

Kanali protočne citometrije

Kanali protočne citometrije



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Prvi put sam napravio pokus protočne citometrije. Imao sam tri stanja: (1) neobojeni zdravi monociti (2) zdravi monociti obojeni zeleno/crveno (488/570) iz Live/Dead thermofisher kita (3) mrtvi monociti obojeni istim zeleno/crvenim bojama.

Napravio sam te uvjete kako bih znao koje grafove očekivati ​​i naučio FAC proces i analizu. Bio bih zahvalan ako bi netko mogao odgovoriti na sljedeća pitanja:

  1. Tako da imam dvije boje u uzorcima i kontrolu. Koji kanal za protočnu citometriju trebam koristiti u svojim dijagramima (FL1, FL2, FL3 ili FL4)?

  2. Kako znati postotak živih i mrtvih stanica u svakom stanju?

  3. Zna li netko besplatni softver za analizu?
  4. Koliko je R praktično raditi analizu protočne citometrije?

Izmijenit ću ovaj odgovor kada dobijem pojedinosti od vas.

Koji je vaš citometar i kako je postavljena optika? Obično imate 1-5 lasera: UV (355nm), ljubičasti (405nm), plavi (488nm), zeleno/žuti (~561nm) i crveni (~633nm) laseri. Vaš FL broj, FL1-4, obično se odnosi na određenu PMT (fotomultipliersku cijev) i kombinaciju filtera. Na primjer, tipični FACSCantoII ima postavku 4-2-2 s 4 PMT na plavom laseru, 2 na ljubičastom laseru i 2 na crvenom laseru (ako ste uređaj kupili na taj način, postoje i druge konfiguracije). Ovi fluorescentni kanali postavljeni su za detekciju određenog fluorofora ili ekvivalenta s propusnim filtrom. Osnovni filteri na FACSCanto II crvenom laseru su 660/20 i 780/60. Ove filtriraju svjetlost koju emitiraju obojene stanice na određenom rasponu valnih duljina, a vi ih čitate kao 600 nm +/- 10 nm i 780 nm +/- 30 nm, na primjer.

Možete postaviti svoj softver na FL brojeve ili fluorofore, ali ono što trebate znati je koji je filter FL1 i tako dalje? Tipični citometri poput FACSAria, to su FL1 = FITC, FL2 = PE, FL3 = 7AAD, PerCP/Cy5.5, itd., FL4 = APC.

Dakle, koristili ste komplet za termofisher živ/mrtv, navedite nam i kataloške brojeve.

Ono što želimo učiniti je uzeti informacije o vašim bojama i vašem citometru i uskladiti ih kako bismo odredili u kojem kanalu trebaju fluorescirati. 488 nm izgleda kao FITC ili FL1, a 570 nm izgleda kao PE ili FL2, ali oni izgledaju kao laseri, dok mi želite reći emisiju boje da je uskladim s kanalom, koristeći informacije o konfiguraciji vašeg uređaja!

Što se softvera tiče, postoji niz dobrih, skupih opcija kao što su FCS Express i FlowJo, ali su skupe. Provjerite ima li vaša jezgra ili što imate to dostupno za korištenje na licu mjesta. Inače, ugrađeni softver citometra kao što je FACSDiva možda će biti dovoljan, a često i jest. Koristio sam neke od "besplatnih", ali su vrlo nezgrapni i/ili užasni za korištenje.

R ima neku korisnost za visokodimenzionalnu analizu, ali morate biti u mogućnosti tečno koristiti R, a ne možete crtati ručna vrata. Ipak, postoje korisni paketi s dobrom dokumentacijom kao što je X-cyt (široki institut). A za vizualizaciju poput PCA i t-SNE, R ima puno dokumentacije za podatke o protoku. Također razmislite o tome da R sve učitava u RAM pa na sporijem računalu od 2-4 GB može imati slabe performanse.

Za početak vaše analize, pitat ću zašto si koristio dvije boje? Linija LIVE/DEAD proizvoda reaktivna je sa slobodnim aminima koji su prisutni unutar i izvan stanice. Umiruće stanice imaju propusnije membrane i preuzimaju više boje. Dakle, kada analizirate stanice, sve je pozitivno, ali mrtve i umiruće stanice imaju 1-2 log većeg intenziteta bojenja u odnosu na živu populaciju.

Dakle, prva stvar koja treba svakom eksperimentu protoka su kontrole. Imate neokaljane kontrole, FMO kontrole i kontrole kompenzacije. Nezamrljenost vam samo daje ideju o vašoj morfologiji raspršivanjem svjetla, ali za eksperimente niskih dimenzija može djelovati kao FMO. FMO ili fluorescencija minus-jedan je stanica obojena svime što se nalazi na ploči s vašim antitijelom/bojom osim jednog markera, tako da možete usporediti s potpuno obojenim uzorkom i vidjeti gdje nacrtati svoju kapiju. Kontrole kompenzacije pomažu citometru da ispravi činjenicu da filteri pokupe emisiju drugih fluorofora osim ciljane. Također imate biološku kontrolu, što je dobro, jer za analizu uvijek želite vidjeti gdje se nalazi jasna pozitivna i negativna populacija na vašim točkama ili histogramima. Žive stanice vam pomažu vidjeti gdje su pozitivni i negativni, ali mogu imati slabe pozitivne signale, a neobojene stanice će imati negativnu populaciju koja je pomaknuta dolje za 1/2 log ili tako, jer uopće nemaju boju. Mrtve obojene stanice pokazat će vam jak pozitivan signal i potencijalno slab negativan signal. Koristite ih da nacrtate svoja vrata.

Dakle, kompenzirajte podatke elektronički sa svojim softverom (slijedite priručnik) i stvorite točkasti prikaz s FSC-A i SSC-A na osi. Samo će iskustvo reći kako vaše stanice izgledaju na ovoj grafici, ali za referencu, uzorak krvi ili leukocita želi ovako:

Želite nacrtati vrata oko svojih monocita, a zatim izraditi zaplet na temelju vaših monocitnih vrata (barem izbacite krhotine). Također je korisno za daljnje eksperimente obojiti markerom monocita kako biste mogli izbaciti sve osim svojih ciljnih stanica, pa koristite CD14, na primjer, koji je specifičan za monocite.

Na sljedećoj točki napravimo osi FSC-A i FSC-H. Ovo je korak dubletne diskriminacije u kojemu mnogo pomaže lasersko skaliranje područja prije citometra (pogledajte svog glavnog stručnjaka). Ovdje je princip izbaciti (riješiti se) stanica koje su zaglavljene zajedno:

Tada biste željeli potražiti svoje ciljne stanice. Ako su obje boje žive/mrtvo, imat ćete isti signal na dva različita kanala, tako da vjerojatno možete odabrati samo jedan, poput live/dead green.

Možete napraviti histogram FL1 na temelju ćelija koje se nalaze u dubletnoj grafici. Trebali biste vidjeti dva diskretna vrha na log ili bi-eksponencijalno transformiranoj osi intenziteta (osnova širine -10 je dobra za korištenje, ali FACSDiva to čini automatski). Baza širine je kofaktor koji komprimira podatke oko 0, tako da se negativne populacije smanjuju, a vi dobivate bolju razlučivost među pozitivnim populacijama.

Nacrtali biste bifur vrata između pozitivnog i negativnog vrha ili vrata raspona oko pozitivnog i odabrali biste reći softveru da generira statistiku kako biste dobili vaše postotke. I možete ponoviti za FL2/crvenu boju da dobijete i te postotke, ali oba markera gledaju na istu stvar.

Zatim primijenite ta vrata na sve svoje uzorke i prilagodite vrata na temelju toga kako podaci izgledaju.

Pokušajte ovu prezentaciju: https://www.slideshare.net/richardhastings589/kumc-introduction-to-flow-cytometry


4 najveće greške koje znanstvenici čine tijekom eksperimenata sortiranja stanica višebojnom protočnom citometrijom

Višebojno sortiranje stanica kompliciran je proces i određene znanstvene pogreške mogu biti uobičajene.

Neuspješno višebojno sortiranje može rezultirati pogrešnim podacima i neuvjerljivim rezultatima. Uspješne višebojne sorte, s druge strane, mogu dati izvrsne rezultate i dovesti do dinamičnih zaključaka.

Uspješno višebojno sortiranje stanica zahtijeva posebnu pozornost na planiranje.

Korištenje specifičnih strategija postavljanja za vaš eksperiment može stvoriti pojednostavljen sustav za inače kompliciran proces. Na primjer, ovi kritični koraci i strategije za eksperimente s višebojnim sortiranjem mogu vam uštedjeti vrijeme i maksimizirati rezultate.

Prilikom postavljanja višebojnog eksperimenta, najčešće pogreške su neuspjeh pravilnog postavljanja PMT napona, neuspješno korištenje boje za održivost, neuspjeh u rješavanju dubletne diskriminacije na odgovarajući način i neuspjeh u postavljanju pravih područja sortiranja i vrata. Otklanjanje ove 4 pogreške važno je za bilo koju vrstu pokusa protočne citometrije, ali posebno za eksperimente sortiranja stanica protočne citometrije.

Sljedeće 4 pogreške treba izbjegavati prije faze postavljanja, koja bi se trebala izvršiti neposredno prije sortiranja. Ova faza postavljanja trebala bi biti uključena kao dio planiranja, optimizacije i probnog procesa eksperimenta kako biste dobili najbolje moguće rezultate sortiranja ćelija.

Ovdje su 4 uobičajene pogreške pri sortiranju višebojnih ćelija koje biste trebali izbjegavati…


Protočna citometrija u ljudskoj reproduktivnoj biologiji

Protočna citometrija (FC) je tehnika analitičke citologije koja se naširoko koristi desetljećima. Ima mnoge prednosti u usporedbi s drugim sličnim metodama za proučavanje stanične biologije, čak i na molekularnoj osnovi. FC omogućuje analizu stanica po stanicu mnogih optičkih ili imunoloških značajki u istom uzorku, u isto vrijeme i brzinom od tisuća stanica u sekundi, generirajući goleme količine podataka i na taj način pružajući gotovo neograničene informacije koje su statistički robustan zbog broja proučavanih jedinica. Cilj ovog pregleda je opisati doprinos FC proučavanju fizioloških i patoloških procesa vezanih uz ljudsku reprodukciju, te raspraviti kako se ova tehnika koristi u istraživanjima, kao i njezine kliničke primjene u ovom području. Koristili smo neke praktične primjere odabrane iz najrelevantnijih studija u okviru širokog spektra istraživanja objavljenih u literaturi, a također smo se oslonili na vlastito iskustvo korištenja protočne citometrije za proučavanje različitih fenomena vezanih za reprodukciju. Zaključeno je da je FC koristan instrument za temeljno istraživanje ginekoloških problema, kao i za proučavanje muških reproduktivnih karakteristika, bilo u istraživačkim aplikacijama ili izravno u kliničke dijagnostičke svrhe. Budući razvoj ovih tehnika omogućit će daljnji napredak kako u našem znanju tako i u poboljšanju tehnika potpomognute oplodnje.


Razlika između linearnih i log prikaza u protočnoj citometriji

Prikaz podataka je temeljni za protočnu citometriju i snažno utječe na način na koji tumačimo temeljne informacije.

Jedan od najvažnijih aspekata grafičkog prikaza podataka protočne citometrije je vrsta mjerila. Ljestvice podataka protočne citometrije dolaze u dvije vrste, linearne i logaritamske (log), koje određuju kako su podaci organizirani na dijagramima. Razumijevanje ove dvije ljestvice ključno je za interpretaciju podataka.

Počnimo od početka, gdje se generira signal, i pratimo njegov put sve od detektora do zaslona.

Iza svake podatkovne točke protočne citometrije nalazi se ono što nazivamo puls. Impuls je izlazni signal detektora generiran dok čestica prolazi kroz lasersku zraku tijekom vremena. Kako stanica prolazi kroz lasersku zraku, intenzitet signala iz detektora se povećava, doseže maksimum i konačno se vraća na osnovnu liniju kako stanica napušta lasersku zraku. Cjelokupnost ovog signalnog događaja je puls (vidi sliku 1).

Slika 1: Puls napona počinje kada ćelija uđe u laser, dostiže svoj maksimum kada je ćelija maksimalno osvijetljena, a zatim se vraća na osnovnu liniju kada ćelija izlazi iz snopa.

Sve je to dobro, ali električni puls nam sam po sebi nije koristan. Moramo iz njega izvući neku vrstu informacija kako bismo izmjerili biološke karakteristike koje tražimo. Ovdje na scenu stupa elektronika citometra (koja značajno doprinosi performansama i cijeni određenog modela citometra).

Moderni instrumenti koriste digitalnu elektroniku. To znači da se intenzitet signala tijekom impulsa digitalizira analogno-digitalnim pretvaračem (ADC) prije nego što se iz njega izvuče informacija.

To nije bio slučaj u prošlosti, kada je većina sustava koristila analognu elektroniku. U analognim sustavima, informacije o impulsu izračunavaju se unutar samog sklopa i digitaliziraju se isključivo u svrhu slanja podataka računalu na prikaz.

Bez obzira na instrument, vrsta podataka o pulsu je ista: površina, visina i širina (vidi sliku 2). Ova tri pulsna parametra su ono što se u konačnici prikazuje na dijagramima.

Slika 2: Tri karakteristike naponskog impulsa: površina, visina i širina.

Površina i visina se koriste kao mjerenje intenziteta signala, dok se širina često koristi za razlikovanje jedne stanice od dvije stanice koje su prošle kroz laser tako blizu jedna drugoj, da ih je citometar klasificirao kao jedan događaj (događaj dubleta).

Tipično, na dijagramima protočne citometrije vidjet ćete os ili skalu označenu A, H, ili W označavajući parametar pulsa koji se prikazuje (npr. "FITC-A", "FITC-H" ili "FITC-W").

Važno je napomenuti da se sva obrada impulsa izvodi u elektroničkom sustavu citometra, a ne u računalu.

Razlog tome je što potrebna brzina obrade može premašiti ono što je moguće s računalom i njegovom ethernet vezom. S obzirom na to, citometar prosljeđuje sva mjerenja pulsa, već uredno obrađena i zapakirana, na računalo i softver citometra koji prikazuje podatke.

Tada skaliranje parcele postaje važno.

Raspon razina signala koje citometar prenosi na računalo je iznimno velik i funkcija je ADC-a citometra. Broj bitova ADC-a određuje koliko vrijednosti obuhvaća ovaj raspon signala.

Na primjer, 24-bitni ADC može podijeliti raspon signala u 16,777,216 (2 24 ) diskretnih vrijednosti. (Imajte na umu da svaki kanal raspršivanja ili fluorescencije dobiva svoj vlastiti ADC, tako da je broj ADC-a jednak ukupnom broju parametara na instrumentu.) Stoga se najtamnijem FITC signalu na ovom primjeru instrumenta može dodijeliti vrijednost 1 dok je najsvjetlijem FITC-u signalu se može dodijeliti vrijednost od 16,277,216.

Iako je granularnosti svakog signala dodijeljene 2 24 različite vrijednosti, ova vrsta razlučivosti je previše fina da bi bila korisna na ljestvici dijagrama.

Kada bi ljestvica histograma odražavala ovolike vrijednosti, događaji bi bili raspoređeni među toliko kanala da bismo morali prikupiti milijune događaja da bismo vidjeli vrhove i populacije na koje smo navikli.

Nadalje, računalni monitori nemaju razlučivost potrebnu za crtanje točaka na ovoj ljestvici. Čak i da jesu, točke bi bile tako male da ih ne bismo mogli vidjeti na ekranu.

Univerzalno korišteno rješenje je smanjiti rezoluciju na parcelama na praktičniji, ali još uvijek korisni stupanj.

Umjesto da ljestvicu podijelimo na milijune jedinica, dijelimo je na 256 (ili, u nekim slučajevima, 512) jedinica koje se nazivaju kanali.

Za 256-kanalni sustav dodjeljujemo svih 16.277.216 digitalnih vrijednosti jednako među kanale, tako da svaki sadrži 65.536 diskretnih vrijednosti (16.277.216 podijeljeno s 256). Kanal 1 može sadržavati do 65 536 najsjajnijih događaja, dok kanal 256 može sadržavati do 65 536 najsvjetlijih događaja.

Ova vrsta mjerila je linearna jer ekvivalentni koraci u prostornoj udaljenosti na skali predstavljaju linearne promjene u podacima. Kao što je prikazano na slici 3, pomicanje udaljenosti od x odražava promjenu 64 kanala, bez obzira na to je li početna točka kanal 0, kanal 64 ili kanal 192.

Kao takva, ključna značajka linearne ljestvice je da su kanali ravnomjerno raspoređeni duž skale: udaljenost između kanala 1 i kanala 2 jednaka je udaljenosti između kanala 100 i kanala 101.

Slika 3: Na linearnoj skali, kanali su jednako raspoređeni.

Linearna ljestvica je svakako dobra, ali što se događa ako se dvije populacije, s vrlo različitim razinama intenziteta, moraju nacrtati zajedno? Ovo je uobičajena situacija u protočnoj citometriji, u kojoj se nefluorescentne stanice vizualiziraju na istoj grafici kao i svijetle fluorescentne stanice.

U ovom slučaju, dijagram s linearnim skaliranjem postaje mnogo manje koristan, jer će biti vrlo teško vidjeti i fluorescentne i nefluorescentne stanice u isto vrijeme, bez obzira na to koji napon PMT koristimo. Ili će sve nefluorescentne stanice biti nagurane u prvih nekoliko kanala, ili će sve fluorescentne stanice biti nagurane u nekoliko gornjih kanala.

Ovdje na scenu stupa logaritamska ljestvica.

Log skala je ona u kojoj koraci u prostornoj udaljenosti na skali predstavljaju promjene u potencijama od 10 (obično) u podacima.

Drugim riječima, pomicanje logaritamske ljestvice za jednu četvrtinu ljestvice omogućuje nam prelazak s kanala 1 na kanal 10 (vidi sliku 4). Pomicanje za još jednu četvrtinu udaljenosti na ljestvici dovodi nas ne do kanala 20, već do kanala 100, stepena 10.

Slika 4: Na log skali, kanali su nejednako raspoređeni tako da se na istom grafikonu mogu vizualizirati i visoki i niski signali.

Log ljestvice su stvarno dobre u olakšavanju vizualizacije podataka s vrlo različitim medijanima i organizirane su u desetljećima. Ljestvica od četiri desetljeća označena je: 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , dakle sadrži ukupno 10 000 kanala.

Važno je da, iako svaki kanal sam po sebi sadrži isti broj digitalnih vrijednosti, podatkovni kanali nisu raspoređeni jednako na ljestvici.

Prvo desetljeće, od 10 0 do 10 1 , sadrži 10 kanala (kanal 1 do kanal 10). Drugo desetljeće, iako zauzima isto toliko prostora na ljestvici, sadrži ne 10 već 90 kanala (11 do 100). A četvrto desetljeće od 10 3 do 10 4 – koje zauzimaju isti prostor kao i jedno drugo desetljeće – sadrži nevjerovatnih 9 000 kanala (1001 do 10 000).

Na log skali, podaci su komprimirani u mnogo većem stupnju na visokom nego na donjem kraju, a upravo to svojstvo čini ga tako dobrim za vizualno predstavljanje podataka s vrlo različitim medijanima (vidi sliku 5).

Slika 5: Učinci linearnog i log skaliranja na rezoluciju kuglica s 8 vrhova. Spherotech 8-peak set perlica izveden je na instrumentu DIVA s bilo s logaritamskim skaliranjem (lijevo) ili linearnim skaliranjem (desno). Osmi vrh postavljen je, u mjerilu, krajnje desno od parcele. Kao što se može vidjeti, bez logičkog skaliranja podataka, donjih 6 vrhova ne može se razriješiti.

Vrlo je važno imati na umu da su u svijetu digitalne citometrije ove ljestvice samo metode vizualizacije i, poput kompenzacijske matrice, nemaju utjecaja na temeljne podatke. Skala se primjenjuje softverom za citometriju, a ne hardverom za citometriju.

Uzgred, to nije bio slučaj u starijim analognim sustavima koji su primjenjivali logaritamsku transformaciju u elektronici citometra koristeći logaritamska pojačala, pa su podaci koji su streamirani na računalo već bili "log transformirani" prije nego što su došli do softvera.

U ovom trenutku, vjerojatno se pitate o praktičnosti ovih ljestvica: kada biste trebali koristiti linearnu skalu, a kada biste trebali koristiti logaritamsku ljestvicu?

Obično se linearna ljestvica koristi za mjerenja raspršenja svjetlosti (gdje se čestice suptilno razlikuju u intenzitetu signala), a log skala se koristi za fluorescenciju (gdje se čestice prilično razlikuju u signalu).

Međutim, nije uvijek tako jednostavno.

Za većinu protočne citometrije na stanicama sisavaca, raspon signala naprijed i bočnog raspršenja koje generiraju sve čestice u jednom uzorku nije dovoljno širok da bi jamčio logaritamsku ljestvicu za ispravnu vizualizaciju.

Veličina čestica može se kretati od nekoliko mikrona do 20+ mikrona u tipičnom uzorku, tako da bi cijeli raspon čestica bio sretno na skali koristeći linearnu ljestvicu. Zapravo, logaritamska ljestvica bi bila kontraproduktivna u ovoj situaciji, komprimirajući raspon i otežavajući, na primjer, razlikovanje različitih populacija krvnih stanica jedne od drugih.

Međutim, bočno raspršivanje na logaritamskoj skali može biti iznimno informativno, posebno kada se mjere "neuredni" uzorci s mnogo različitih tipova stanica, poput onih dobivenih iz disociranih čvrstih tkiva.

Osim toga, pri mjerenju mikročestica ili mikrobioloških uzoraka poput bakterija upotrijebite i naprijed i bočno raspršivanje na log skali. Ove vrste čestica generiraju prigušene signale raspršenja koji su bliski šumu citometra, pa je često potrebno vizualizirati signal u log skali kako bi se odvojio signal od raspršenog šuma.

Mjerenja fluorescencije obično uključuju populacije koje se značajno razlikuju po intenzitetu i stoga zahtijevaju log skalu za vizualizaciju. To je slučaj kod mjerenja signala imunofluorescencije, fluorescentnih proteina, boja za održivost ili većine funkcionalnih boja.

Međutim, postoji velika iznimka: analiza staničnog ciklusa. Analiza staničnog ciklusa protočnom citometrijom obično se postiže mjerenjem sadržaja DNA putem fluorescencije. Stanice u G2/M sadrže do dvostruko veću količinu DNK koja se nalazi u drugim stanicama, tako da moramo vidjeti relativno male razlike u intenzitetu signala kako bismo procijenili stanje staničnog ciklusa.

Stoga se analiza staničnog ciklusa mora vizualizirati na linearnoj skali.

Nadamo se da će ovo objašnjenje baciti svjetlo na skaliranje. Znati kako pravilno prikazati svoje podatke kritičan je dio znanstvene komunikacije. Ne zaboravite koristiti linearno skaliranje za većinu parametara raspršivanja ili kada trebate vizualizirati male promjene i zabilježiti skaliranje za većinu parametara fluorescencije ili kada trebate vizualizirati širok raspon vrijednosti. Kao i uvijek u protočnoj citometriji, zasigurno postoje iznimke, ali naoružani tim znanjem trebali biste biti u mogućnosti donijeti obrazovane prosudbe o tome koje vrste ljestvica koristiti u različitim testovima i bolje interpretirati svoje podatke. Sretan protok!

Da biste saznali više o razlici između linearnih i log prikaza u protočnoj citometriji i da biste dobili pristup svim našim naprednim materijalima, uključujući 20 videozapisa za obuku, prezentacija, radnih bilježnica i članstvo u privatnim grupama, uključite se na listu čekanja za majstorski razred protočne citometrije.

Tim Bushnell je doktorirao biologiju na Politehničkom institutu Rensselaer. On je suosnivač ExCytea, vodeće svjetske tvrtke za obuku u protočnoj citometriji, koja se može pohvaliti pravom bibliotekom laboratorijskih resursa o sekvenciranju, mikroskopiji i srodnim temama u znanostima o životu.


Pregled razgovora

Dr. Malte Paulsen daje uvod u protočnu citometriju s izvrsnim objašnjenjem osnovnih principa koji upravljaju tehnikom. On objašnjava kako se protok tekućine koristi za fokusiranje uzorka u laserskoj zraki. Svjetlost lasera se raspršuje po stanicama u uzorku, a stupanj raspršenja daje informacije o optičkoj gustoći stanice i drugim karakteristikama. U konvencionalnoj protočnoj citometriji, laseri se prvenstveno koriste za pobuđivanje fluorescentnih antitijela vezanih za specifične tipove stanica. Detektor s različitim filterima omogućuje da se određene valne duljine odvoje od ukupne fluorescencije. Taj se signal zatim može prikazati na načine koji pružaju najviše informacija o vrsti ćelije od interesa.


Uvod u protočnu citometriju

Protočna citometrija je široko korištena metoda za analizu ekspresije stanične površine i unutarstaničnih molekula, karakteriziranje i definiranje različitih tipova stanica u heterogenoj staničnoj populaciji, procjenu čistoće izoliranih subpopulacija i analizu veličine i volumena stanice. Omogućuje istovremenu multiparametarsku analizu pojedinačnih stanica.

Uglavnom se koristi za mjerenje intenziteta fluorescencije koju proizvode fluorescentno obilježena antitijela koja detektiraju proteine, ili ligande koji se vežu na specifične molekule povezane sa stanicama kao što je vezanje propidij jodida na DNA.

Postupak bojenja uključuje izradu suspenzije jedne stanice iz stanične kulture ili uzoraka tkiva. Stanice se zatim inkubiraju u epruvetama ili mikrotitarskim pločama s neobilježenim ili fluorokromom obilježenim antitijelima i analiziraju na protočnom citometru.

Ako se želite uhvatiti ukoštac s analizom protočne citometrije, pogledajte naš besplatni online trening za protočnu citometriju.

Sadržaj

Protočni citometar: fluidika

Slika 1. Pregled protočnog citometra. Tekućina omotača fokusira staničnu suspenziju, uzrokujući da stanice prolaze kroz lasersku zraku jednu po jednu stanicu. Otkriva se naprijed i bočno raspršena svjetlost, kao i fluorescencija koja se emitira iz obojenih stanica.

Kada se suspenzija stanica prođe kroz citometar, tekućina omotača se koristi za hidrodinamičko fokusiranje stanične suspenzije kroz malu mlaznicu. Sićušni mlaz tekućine vodi stanice pokraj laserskog svjetla jednu po jednu ćeliju (slika 1).

Svjetlost raspršena iz stanica ili čestica detektira se dok prolaze kroz lasersku zraku. Detektor ispred svjetlosnog snopa mjeri raspršenje prema naprijed (FS), a nekoliko detektora na strani mjeri bočno raspršenje (SS). Fluorescencijski detektori mjere fluorescenciju koju emitiraju pozitivno obojene stanice ili čestice.

Protočni citometar: mjerenje prednjeg i bočnog raspršenja svjetlosti

Stanice ili čestice koje prolaze kroz snop raspršuju svjetlost, što se detektira kao FS i SS. FS korelira s veličinom stanice, a SS je proporcionalan granularnosti stanica. Na taj se način populacije stanica često mogu razlikovati samo na temelju razlika u njihovoj veličini i granularnosti.

Slika 2. Rasipanje svjetlosti dok zeleni laser ispituje ćeliju. Smjer svjetlosti koju raspršuje stanica korelira s veličinom i granularnošću stanice.

Koristan primjer za to je provođenje uzoraka krvi na protočnom citometru.

  • Veće i granularne stanice granulocita proizvode veliku populaciju s visokim SS i FS.
  • Monociti su velike stanice, ali ne tako zrnate, tako da oni proizvode zasebnu populaciju s visokim FS, ali nižim SS.
  • Manji limfociti i limfoblasti proizvode zasebnu populaciju s manje FS. One nisu granularne stanice, pa također imaju nizak SS.

Stoga se te stanice mogu razdvojiti u različite populacije samo na temelju njihovih FS i SS.

Slika 3. Točkasti prikaz FS u odnosu na SS. Svaka točka predstavlja jednu stanicu analiziranu protočnim citometrom. Karakterističan položaj različitih staničnih populacija određen je razlikama u veličini i granularnosti stanica. Referenca slike: Riley i Idowu. Principi i primjena protočne citometrije*.

Protočni citometar: mjerenje raspršene svjetlosti i fluorescencije

Osim odvajanja stanica na temelju FS i SS, stanice se također mogu odvojiti prema tome izražavaju li određeni protein. U ovom slučaju, fluorokrom se često koristi za bojenje proteina od interesa. Fluorokromi koji se koriste za detekciju ciljnih proteina emitiraju svjetlost kada su pobuđeni laserom s odgovarajućom valnom duljinom pobuđivanja. Ove fluorescentno obojene stanice ili čestice mogu se detektirati pojedinačno.

Naprijed i bočno raspršena svjetlost i fluorescencija iz obojenih stanica dijele se na definirane valne duljine i kanaliziraju nizom filtera i zrcala unutar protočnog citometra. Fluorescentno svjetlo se filtrira tako da će svaki senzor detektirati fluorescenciju samo na određenoj valnoj duljini. Ti se senzori nazivaju fotoumnožajuće cijevi (PMT).

Slika 4. Fluorescentno svjetlo se filtrira tako da svaki PMT detektira određenu valnu duljinu. PMT pretvaraju energiju fotona u elektronički signal - napon.

U primjeru prikazanom na slici 4, FITC (fluorescein izotiocijanat) kanal PMT će detektirati svjetlost emitiranu iz FITC na valnoj duljini od približno 519 nm. PE kanal PMT će detektirati svjetlost koju emitira PE (fikoeritrin) na valnoj duljini 575 nm. Svaki PMT također će otkriti sve druge fluorokrome koji emitiraju na sličnoj valnoj duljini kao i fluorokrom koji detektira.

U protočnom citometru koriste se različiti filtri za usmjeravanje fotona ispravne valne duljine na svaki PMT (slika 5.).

Slika 5. Filtri u protočnom citometru. Pojasni filteri (BP) omogućuju prijenos fotona koji imaju valne duljine unutar uskog raspona. Short pass (SP) filteri omogućuju prijenos fotona ispod određene valne duljine.

Long pass (LP) filteri omogućuju prijenos fotona iznad određene valne duljine. Dikroični filtri/ogledala (kao što su dikroična LP ogledala) postavljeni su pod kutom od 45° u odnosu na svjetlosni snop. Podnaslov

U dugoprolaznom dikroičkom filtru, fotoni iznad određene valne duljine prenose se ravno naprijed, dok se fotoni ispod određene valne duljine reflektiraju pod kutom od 90°.

Mjerenje signala

Kako fluorescentna stanica prolazi kroz lasersku zraku, ona stvara vrhunac ili puls emisije fotona tijekom vremena. PMT ih detektira i pretvara u impuls napona, poznat kao događaj. Ukupna visina i površina pulsa mjere se protočnim citometrom. Izmjereno područje impulsa napona izravno će korelirati s intenzitetom fluorescencije za taj događaj.

Slika 6. PMT mjeri područje impulsa napona stvorenog svaki put kada fluorescentna stanica otpusti fotone. Kada nijedna fluorescentna stanica ne prođe kroz optiku, fotoni se ne emitiraju i signal se ne detektira. Kako fluorescentno obilježena stanica prolazi kroz optiku i ispituje je laserom, emitiraju se fotoni i tako se povećava intenzitet mjerenog napona. Kako svaka fluorescentna stanica završava svoj put kroz lasersku zraku, to ostavlja puls napona tijekom vremena.

Područje impulsa izračunava se zbrajanjem vrijednosti visine za svaki vremenski odsječak impulsa, određene brzinom analogno-digitalnog pretvarača (ADC), koja iznosi 10 MHz (tj. 10 milijuna u sekundi ili 10 po mikrosekundi).

Ovim događajima se dodjeljuju kanali na temelju intenziteta impulsa (područje impulsa). Ovaj signal se može pojačati povećanjem napona koji prolazi kroz PMT.

Slika 7. Histogram s jednim parametrom koji prikazuje broj kanala u odnosu na broj događaja. Kanali se obično gledaju na log skali na x osi.

Svaki događaj dobiva broj kanala ovisno o njegovom izmjerenom intenzitetu što je fluorescencija intenzivnija, to je veći broj kanala dodijeljen događaju.

Slika 8. Mjerenja intenziteta fluorescencije za negativan i pozitivan rezultat. Negativan rezultat prikazan na lijevoj strani nema bojenje i mnoge događaje pri niskom intenzitetu fluorescencije. Pozitivan rezultat je prikazan na desnoj strani, ovo ima veliki broj događaja pri visokom intenzitetu fluorescencije.

Za pozitivan rezultat tražite pomak u intenzitetu između negativne kontrole i pozitivnih uzoraka (slika 9).

Slika 9. Bojenje anti-CCR2 antitijela (ab21667) humanog PBMC zatvorenog na monocitima. Podaci su iz anonimnog pregleda.

Bojenje antitijela

    Izravno bojenje:

Kod izravnog imunofluorescentnog bojanja, stanice se inkubiraju s protutijelom koje je izravno konjugirano s fluorokromom (npr. FITC). Ovo ima prednost što zahtijeva samo jedan korak inkubacije protutijela i eliminira mogućnost nespecifičnog vezanja iz sekundarnog protutijela.

Ovaj pristup je osobito koristan za intracelularno bojenje, gdje veliki kompleksi protutijelo-fluorokrom, uključujući sekundarna antitijela, mogu postati zarobljeni uzrokujući nespecifično vezanje, ili ne uspiju ući u stanicu sprječavajući detekciju primarnog antitijela.

Kod neizravnog bojanja, primarno protutijelo nije obilježeno fluorokromom, već se detektira sekundarnim protutijelom obilježenim fluorokromom. Ovaj drugi reagens može biti antitijelo sa specifičnošću za prvo protutijelo. Alternativno, može se koristiti sustav avidin-biotin, pri čemu se antitijelo konjugira s biotinom i detektira s fluorokromom obilježenim avidinom.

Sa širokim rasponom konjugiranih antitijela sada dostupnih, ova metoda znači da se nekonjugirana primarna protutijela podignuta protiv mnogih različitih ciljeva mogu koristiti zajedno s obilježenim sekundarnim protutijelom za FACS analizu. Ovo proširuje izbor ciljnih proteina za istraživača.

Bojenje intracelularnih antigena za protokole protočne citometrije ovisi o različitim metodama fiksacije i permeabilizacije kako bi se omogućio pristup antitijelima unutarnjim staničnim proteinima. A successful staining procedure in all cases is dependent on optimization of experimental conditions through titering of antibodies, use of appropriate controls to set up the flow cytometer correctly and optimized fixation and permeabilization procedures.

Selecting a fluorochrome conjugate

The ability of a given antibody to resolve a positive signal from a negative signal often depends on which fluorochrome conjugate is used.

A general guideline for the relative intensities of the various fluorochromes is, from brightest to dimmest, PE, PE-Cy 7, PE-Cy5, APC, APC-Cy7, Alexa Fluor 647®, Alexa Fluor 700®, FITC, Pacific Blue, Alexa Fluor 488®. This is a general pattern some differences in the relative intensities are seen for individual antibodies.

A highly expressed antigen will usually be detected and resolved from the negative control with almost any fluorochrome. An antigen expressed at lower density might require the higher signal to background ratio provided by a brighter PE or APC conjugate to separate the positive cells adequately from the unstained cells.

The relative fluorochrome intensity depends on the instrument. This is because of differences in the laser and filter combinations used on the different instruments. Be sure to use the appropriate FACS instrument.


BD Biosciences offers a comprehensive portfolio of flow cytometry instruments and reagents for cancer biology research

From specimen collection to sample preparation to cell analysis, BD Biosciences offers a multitude of tools.

Sample collection

The BD Vacutainer ® products family can be used for blood cell and biomarker preservation.

Sample preparation tools

The BD Horizon™ Dri Tumor and Tissue Dissociation Reagent (TTDR) offers gentle and effective dissociation with superior epitope preservation. TTDR maximizes cell yields, while minimizing cell death, which allows effective dissociation of a variety of tumor types to enable single cell studies.

Cell staining, characterization and analysis tools

BD Biosciences offers a comprehensive portfolio of over 9,000 immunology and immuno-oncology–related research reagents that are designed for efficient characterizations of cells.

The dried reagent cocktails of BD Horizon™ Dri Panels are predesigned, ready-to-use multicolor panels optimized and tested for memory T cell, monocyte subset and TBNK cell characterization.

Fluorochrome Marker Clone
FITC CD16 4G8
PE HLA-DR L243
PerCP CD14 MΦP9
APC CD192 (CCR2) LS132.1D9
Fluorochrome Marker Clone
FITC CD197 150503
PE-Cy7 CD95 DX2
BD Horizon™ APC-R700 CD27 M-T271
APC-H7 CD3 SK7
BD Horizon™ V450 CD4 SK3
BD Horizon™ V500-C CD8 SK1
BD Horizon Brilliant Violet™ 605 CD45RA HI100
Fluorochrome Marker Clone
BD Horizon Brilliant Violet™ 450 CD20 L27
FITC CD3 SK7
PE CD16 B73.1
PE CD56 NCAM16.2
PerCP-Cy5.5 CD45 2D1 (Hle-1)
APC CD19 SJ25C1
PE-Cy7 CD4 SK3
APC-Cy7 CD8 SK1

In addition to predesigned panels, our Custom Solutions offer contract manufacturing of multicolor panels in lyophilized, liquid and/or dried formats to minimize the error(s) and time associated with manual cocktailing of reagents, increase reagent stability, and significantly enhance performance consistency.

The BD Horizon Brilliant™ Polymer Dyes were developed from advanced Sirigen dye technology, enabling high-parameter flow cytometry experiments for discerning cell populations. The bright dyes help in distinguishing dim cell populations, such as tumor-infiltrating lymphocytes or cells that have few receptors on the surface from other cells in a sample.

From sorting to analysis, our cell sorters, cell analyzers and downstream sequencing and informatics analysis tools provide efficient solutions for cancer biology research.

Our research cell analyzers, such as BD FACSymphony™ Flow Cytometer, can be used for the simultaneous measurement of up to 50 parameters. The BD LSRFortessa™ System can analyze up to 20 parameters.

Our multiomic solutions include the BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System, which enables high-throughput capture and analysis of hundreds of single cells. Our single-cell multiomics reagents portfolio enables the analysis of the entire transcriptome or of targeted genes of interest. Targeted panels like the BD Rhapsody™ Immune Response Panel allow profiling of specific immune cell types.


ZAKLJUČCI

To summarize, there is a distinct difference between simply scaling data by changing the relative positions of the axis coordinates and scaling the data by changing the histogram bin-widths. The valley and picket fencing artifact associated with the logarithmic binning both result from the effective resolution of the logarithmic histogram increasing as the channel number decreases. The valley artifact results from the resolution increasing so dramatically that the widths of logarithmic channels become so small that the number of events per channel is too low to see any structure. The picket fencing results from improper graphing of the data in the region where the histogram resolution exceeds the resolution of the instrument's ADC's resolution. New transformations that transition between linear and logarithmic binning help to minimize these artifacts and provide a way to display negative data values. The primary motivation of these transformations is to make the data appear more visually intuitive. The transition parameters of these transformations should be held constant whenever data is compared to avoid plots that are visually misleading solely as a result of differing axis scales.


Flow Cytometry: An Overview

Flow cytometry is a technology that provides rapid multi-parametric analysis of single cells in solution. Flow cytometers utilize lasers as light sources to produce both scattered and fluorescent light signals that are read by detectors such as photodiodes or photomultiplier tubes. These light signals are converted into electronic signals that are analyzed by a computer and written to a standardized format (.fcs) data file. Cell populations can be analyzed and/or purified based on their fluorescent or light scattering characteristics. A variety of fluorescent reagents are utilized in flow cytometry. These include fluorescently conjugated antibodies, nucleic acid binding dyes, viability dyes, ion indicator dyes, and fluorescent expression proteins. Flow cytometry is a powerful tool that has applications in immunology, molecular biology, bacteriology, virology, cancer biology, and infectious disease monitoring. It has seen dramatic advances over the last 30 years, allowing unprecedented detail in studies of the immune system and other areas of cell biology. © 2018 by John Wiley & Sons, Inc.

Ključne riječi: flow cytometry fluorescence light scatter reagents.

Copyright © 2018 John Wiley & Sons, Inc.

Figure

Example of CFSE staining used…

Example of CFSE staining used for proliferation analysis. Human CD4+ T cells were…

Example of BrdU, Ki67 and PCNA used to measure proliferation. Cells from H23…

Example of gating for standard…

Example of gating for standard data analysis using FlowJo 10.3. Cells are first…


Flow Cytometry Channels - Biology

Description of the Facility
FACS Facility
The Flow-Cytometry Facility is located on the Nineth floor, East wing of the Hunter North building. This Facility can provide analyses of up to 7 parameters in eukaryotic cell populations and sort cells under sterile conditions. These analyses can be used to identify and isolate rare cell populations, determine chromosome ploidy in individual cells, study apoptosis, and study cell-signaling, among other applications.

User training for the FACSCalibur(Becton-Dickinson Biosciences) and assistance in its operation is available, by appointment, through the Facility's Manager. Periodic user training on the FACSCalibur is also provided through specialized seminars.

The FACSVantage(Becton-Dickinson Biosciences) is operated only by the Facility Manager. The Manager and Project Director are available to discuss projects and to advise investigators on the applications relevant to their project.

Instrumenti

FACSCalibur Flow Cytometer

FACSCalibur is a bench top analyzer consisting of Argon, air-cooled laser emitting at 488 nm and 633 nm diode laser. It can provide analyses up to 6 parameters and up to 4-colors.

FACSVantage Flow Cytometer

FACSVantage is a sorter consisting of Helium-Neon (HeNe) air-cooled laser emitting at 633 nm and an Enterprise II, water-cooled laser emitting at both 488 nm and Ultra Violet(UV). It can provide analyses up to 7 parameters and up to 5-colors.

Rules of operations
Rules and Regulations

1. Make an appointment to use the equipment at least one week in advance.

2. Equipment use is limited to a 2-hour period per laboratory per day unless special arrangements are authorized. Users must notify the Facility of any cancellation at least 6 hours in advance. For the FACSVantage, a set-up fee will be charged for a missed appointment.

3. Sign the log Book that is placed adjacent to all instruments.

4. After each session on the FACSCalibur, follow the instrument cleaning procedure.

5. The Principal Investigator of each lab will be responsible for his/her laboratory personnel.

6. Report any problems to the manager as soon as possible.

Sigurnosne mjere
Sigurnost

1. Lasers

a. FACSCaliubr is equipped with Air-cooled Argon laser emitting at 488 nm and a Diode laser emitting at 633 nm. Although the lasers are enclosed, the light may be visible (with difficulty) if the cover is opened. Do not look at the laser light. It can damage your eyes.

b. FACSVantage is equipped with Enterprise and HeNe water-cooled lasers, which are visible when the instrument is in operation. No one is allowed in the room without the presence of the Facility Manager while the instrument is in operation.


2. Specimens: Depending on the investigator's specimens, one needs to wear an appropriate protective clothing (latex gloves, lab coats, face shield etc.). No materials requiring BL2 should be brought to the Facility. Latex gloves should be used when changing fluids in the FACSCalibur.


Service Schedules and Required forms
FACS Facility Service Charges

FACSCalibur usage: $10.00 per hour

(minimum charge of $10 for each use)

FACSVantage Usage: $20.00 per hour + set-up fee of $20.00 (per day) (1/2 hr. minimum)