Informacija

Je li sigurno autoklavirati agar s morskom vodom?

Je li sigurno autoklavirati agar s morskom vodom?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Za pokus ću pripremiti umjetni agar s morskom vodom. Prije upotrebe medij naravno moram sterilizirati. Pretpostavljam da će autoklaviranje uzrokovati taloženje soli u morskoj vodi. Mogu li ih nakon toga ponovno suspendirati ili će to nepovratno promijeniti sastav mog medija? Trebam li koristiti potpuno drugačiju metodu sterilizacije, npr. sterilizacija filtera?


Ne vidim razlog zašto bi se kemijski taložio. Osim toga, morate otopiti agar toplinom. Stoga je auklaviranje u redu.

Ako mi ne vjerujete, ovaj protokol omogućuje autoklaviranje agara s morskom vodom 15min ciklus 121 stupanj: 1. https://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium246.pdf 2. http://himedialabs.com/ TD/M592.pdf


Praktični rad za učenje

Sposobnost izrade različitih medija za uzgoj različitih mikroorganizama bitan je dio svakog mikrobiološkog istraživanja.

Agar pruža matricu potpornog želea za otopljene hranjive tvari. Za uzgoj različitih mikroorganizama prikladne su različite hranjive tvari.

Aparati i kemikalije

U osnovni agar dodajte različite hranjive tvari ovisno o organizmima koje planirate uzgajati.

Zdravlje i sigurnost i tehničke napomene

Pogledajte karticu CLEAPSS recept 1 za sve pojedinosti o rukovanju agarom. Utvrđena opasnost odnosi se na udisanje praha pri izradi agar želea – kontrolna mjera je vaganje praha u dimnom ormariću. Rizik od opekotina pri radu s vrućom tekućinom smanjuje se nošenjem rukavica za pećnicu.

1 Osnovni agar Pomiješajte 1,5 g agara s 10 cm 3 vode u pastu. Polako dodavati još vode uz miješanje dok volumen ne bude 100 cm 3 . Zagrijte smjesu na kipućoj vodenoj kupelji na 95 °C u potrebnoj posudi. Ovo prethodno zagrijavanje može se izostaviti ako se agar potom sterilizira, osim ako je potrebno dekantirati agar u manje posude prije autoklaviranja.

2 Hranjivi agar za bakterije Pomiješajte 2 g Bovrila, 0,5 g natrijevog klorida i 1,5 g agara s 10 cm 3 vode u pastu. Polako dodavati još vode uz miješanje dok volumen ne bude 100 cm 3 . Zagrijte u kipućoj vodenoj kupelji na 95 °C u potrebnoj posudi.

3 Sladni agar za gljivice Pomiješajte 2 g ekstrakta slada s 2 g agara s 10 cm 3 vode u pastu. Polako dodavati još vode uz miješanje dok volumen ne bude 100 cm 3 . Zagrijte u kipućoj vodenoj kupelji na 95 °C u potrebnoj posudi.

4 Škrobni agar Napravite pastu koja sadrži 1 g topivog škroba u 10 cm 3 vruće vode. Dodati 1,5 g agara, dobro promiješati i uz miješanje polako dodavati još vode dok volumen ne bude 100 cm 3 . Zagrijte u kipućoj vodenoj kupelji na 95 °C u potrebnoj posudi.

5 Škrobni sladni agar za rast gljivica i probavu škroba U 20 ml vode pomiješajte 3 g praha svijetlog slada (kristalni ili spraymalt) (iz trgovina kućnih piva) i 0,5 g peptona (za poticanje rasta). Također napravite pastu koja sadrži 1 g topivog škroba u 10 cm 3 vruće vode. Ove dvije otopine dodajte uz miješanje u 1,5 g agara, a uz miješanje polako dodajte još vode dok volumen ne bude 100 cm 3 . Promiješajte prije dekantiranja u manje posude (ako je potrebno) i sterilizacije.

6 agar s ekstraktom kvasca manitola (MYEA) Za 1 litru agara s ekstraktom kvasca manitola (MYEA) suspendirajte 10 g agara u 1 litri vode. Zagrijati da se otopi. Dodati 0,5 g K2HPO4 (Hazcard 95C), 0,2 g MgSO4.7 H2O (Hazcard 59B), 0,2 g NaCl (Hazcard 47B), 0,2 g CaCl2.6H2O (Hazcard 19A), 10 g manitola i 0,4 g ekstrakta kvasca. K2HPO4, MgSO4.7 H2O i NaCl su opisani kao nisko opasni. CaCl2.6H2O je iritant kao prah, ali ne u konačnom mediju.

7 Agar mineralnih soli bez dušika Za 500 cm 3 najprije otopite 0,05 g FeCl3.6H2O u 500 cm 3 destilirane vode. Dodati 2 g K2HPO40,25 g MgSO4.7H2O i 10 g glukoze. Otopite i provjerite pH, podešavajući na 8,3 ako je potrebno s 0,1 M NaOH (pogledajte CLEAPSS Hazcard 91: Nadražujuće u ovoj koncentraciji). Ulijte u bocu koja sadrži 1 g CaCO3 i 7,5 g agara. Autoklavirati na 121°C. Pomiješajte kako biste raspršili CaCO3 prije izlijevanja. Možete kupiti gotovi agar mineralnih soli bez dušika. K2HPO4 (Hazcard 95C), MgSO4.7H2O (Hazcard 59B), glukoza (Hazcard 40C) i CaCO3 (kartica opasnosti 19B) svi su navedeni kao niska opasnost. FeCl3.6H2O je štetan kao krutina, ali ne pri niskoj koncentraciji konačnog agara.

Postupak

CLEAPSS Laboratory Handbook odjeljak 15.2.7 sadrži više informacija o tome kako upravljati agarom i pripremati ploče. Ili možete kupiti pripremljene medije u bocama ili tanjurima (pogledajte Dobavljači u nastavku).

a Izračunajte potrebnu količinu i pripremite dovoljno agara za ispitivanje – oko 15 cm 3 za normalnu dubinu u Petrijevoj zdjelici od 90 mm. Svaki višak će se čuvati 6-12 mjeseci u dobro zatvorenim bocama s navojnim vrhom ako je sterilan.

b Odvažite prašak agar medija koji sadrži gel i odabrane hranjive tvari, dodajte vodu i sterilizirajte smjesu određeno vrijeme i na temperaturi koju je odredio proizvođač.

c Zagrijte agar i vodu na 95 °C da se agar otopi. Za kuhanje agara uvijek koristite vodenu kupelj i nikada ne dodajte agar u kipuću vodu.

d Tikvice s čepom s čepom od neupijajuće pamučne vune. Pokrijte masnim papirom ili aluminijskom folijom prije sterilizacije u autoklavu.

e Nakon autoklaviranja, premjestiti u vodenu kupelj da se uravnoteži na 50 °C. Složite ploče nakon izlijevanja kako biste smanjili kondenzaciju osim na gornjoj ploči(ama).

f Zagrijte Petrijeve zdjelice prije izlijevanja kako biste smanjili kondenzaciju.

g Držite izlivene ploče u zatvorenoj plastičnoj vrećici dok ne bude potrebno kako biste smanjili dehidraciju medija.

h Podijelite agar u pojedinačne sterilne McCartneyjeve boce ako želite da učenici sipaju svoje tanjure (pogledajte Ulijevanje agar ploče).

Web veze

Resursi učitelja mikrobiologije
Društvo za opću mikrobiologiju – izvor temeljne praktične mikrobiologije, izvrstan priručnik za laboratorijske tehnike i praktičnu mikrobiologiju za srednje škole, izbor okušanih praktikanata korištenjem mikroorganizama.

Mikrobiologija online
MiSAC (Microbiology in Schools Advisory Committee) podržan je od strane Društva za opću mikrobiologiju (vidi gore), a njihove web stranice sadrže više informacija o sigurnosti i poveznicu za traženje savjeta putem e-pošte.

(web-stranice pristupljeno u listopadu 2011.)

© 2019, Royal Society of Biology, 1 Naoroji Street, London WC1X 0GB Registrirana dobrotvorna organizacija br. 277981, Incorporated by Royal Charter


Sigurnost u autoklavu

Autoklavi pružaju fizičku metodu za dezinfekciju i sterilizaciju. Rade kombinacijom pare, pritiska i vremena. Autoklavi rade na visokoj temperaturi i tlaku kako bi ubili mikroorganizme i spore.

Svrha

Sterilizacija se odnosi na potpuno ubijanje svih živih organizama, uključujući spore.

Uobičajene tehnike sterilizacije uključuju primjenu vlažne topline, suhe topline, kemikalija i zračenja. Vrsta materijala, spremnik i količina predmeta koji se steriliziraju određuju koju metodu koristiti.

Unatoč ugrađenim zaštitnim mjerama, autoklav predstavlja mogućnost ozbiljnih ozljeda osoblja od vrućih površina i od ispuštanja pare. Stoga je važno da laboratorijsko osoblje razumije pravilan rad, ograničenja i mjere zaštite za sterilizaciju autoklaviranjem.

Povezani rizici

Autoklavi su sterilizatori koji koriste paru visokog tlaka i visoke temperature. Potencijalni sigurnosni rizici za operatere su:

• Opekline toplinom - od vrućih materijala i zidova i vrata komore autoklava

• Opekline od pare - od preostale pare koja izlazi iz autoklava i materijala po završetku ciklusa

• Vruća tekućina se opeče od kipuće tekućine i prolije u autoklavu.

• Ozljede ruku i ruku pri zatvaranju vrata autoklava.

• Ozljeda tijela ako dođe do eksplozije

Autoklavi se koriste u laboratorijima za sterilizaciju opreme, instrumenata i infektivnog otpada. Svi operateri moraju proći obuku o sigurnom radu autoklava prije korištenja opreme. Korisnici bi trebali pročitati i razumjeti vlasnički priručnik za određeni model autoklava koji koriste.

Kompatibilni/nekompatibilni materijali

Kompatibilan s autoklavom

Autoklav nekompatibilan

Stakleno posuđe (Pyrex® ili borosilikat tipa I)

Medijska rješenja (Napunite do 2/3 spremnika i otpustite čepove)

Klor, hipoklorit, bjelilo

Kiseline, baze i organska otapala

Sigurnosne mjere

• Nosite izolirane termo rukavice kada vadite stakleno posuđe iz autoklava. Publikacija OSHA-ovog informativnog lista o autoklavima i sterilizatorima opisuje što treba i što se NE smije raditi tijekom rada s autoklavima i sterilizatorima.

• Osigurajte da su zaposlenici koji koriste autoklav informirani o tome kako sigurno koristiti autoklave.

• Svi operateri moraju proći obuku o sigurnom radu autoklava prije korištenja opreme. Obuka se može povjeriti kvalificiranom pojedincu, ali ostaje odgovornost nadzornika da osigura da je njihovo osoblje adekvatno osposobljeno.

• Svo stakleno posuđe treba pregledati prije autoklaviranja. Starije stakleno posuđe može biti manje stabilno i može se razbiti tijekom procesa.

• Uvijek nosite prikladnu osobnu zaštitnu opremu. Zatvorene cipele s prstima, laboratorijski kaputi i izolirane rukavice moraju se nositi pri rukovanju autoklaviranim materijalima. Kada postoji opasnost od prskanja, morate nositi štitnike za lice i pregače.

• Kada sterilizirate tekućine, koristite samo tekući ciklus i nemojte miješati posude s zagrijanim tekućinama, stavite posude u ladicu za autoklaviranje.

• Spremnici s staklenkama mogu uzrokovati eksplozije vrućih boca. Ostavite materijale da se ohlade prije transporta. Stavite spremnike na kolica ili kolica obložena papirom kako biste izbjegli razbijanje stakla.

• Osigurajte da svi poklopci imaju labave zatvarače s ventilacijom kako biste spriječili pritisak/vakuum.

• Sterilizatori, stalci i materijali bit će vrlo vrući nakon obrade. Odmaknite se od sterilizatora kada otvarate vrata i ostavite da se materijali ohlade prije istovara.

• Odmah očistite sav prosuti materijal ili kondenzat s poda kako biste spriječili klizanje ili pad.

• Drži ruke i ruke izvan otvora vrata prilikom zatvaranja sterilizatora.

• Prijavite sve probleme s opremom, uključujući neočekivane zvukove, vibracije ili mirise, osobi odgovornoj za tužbu.

• Stavite sve oštre predmete za autoklaviranje u za to predviđeni spremnik za oštre predmete.

• Ne pokušavajte otvoriti vrata kada je ciklus u tijeku ili u slučaju alarma.

Nikada ne autoklavirajte:

• Zapaljivi, reaktivni, korozivni, otrovni ili radioaktivni materijali

• Tekućine u zatvorenim spremnicima.

• Materijal sadržan na takav način da dodiruje unutarnje površine autoklava.

• Parafinski dijelovi tkiva.

Ciklusi autoklava

Da bi bio učinkovit, autoklav mora postići i održavati temperaturu od 121°C najmanje 30 minuta korištenjem zasićene pare pod tlakom od najmanje 15 psi. Možda će biti potrebno produljeno vrijeme ciklusa ovisno o sastavu i volumenu tereta.

Brzina ispuha ovisit će o prirodi opterećenja. Suhi materijal može se obraditi u ciklusu brzog ispuštanja, dok tekućine i biološki otpad zahtijevaju polagano ispuštanje kako bi se spriječilo prekuhanje pregrijanih tekućina.

Preporučeno za

Koristite staklene posude s ventiliranim zatvaračima i samo 2/3 pune.

Suhi materijali neumotani ili u poroznom omotu

Zamotana roba ili ciklus predvakuma

Biohazardni otpad u vrećama za autoklav

Stakleno posuđe koje je potrebno sterilizirati uspravno

Postupak autoklava

Nosite osobnu zaštitnu opremu:

Rukavice otporne na toplinu za uklanjanje predmeta, posebno vrućeg staklenog posuđa

Pakiranje i utovar

Samo određenim osobama treba dopustiti postavljanje i/ili promjenu parametara za autoklave.

Prije uporabe autoklava provjerite ima li u njemu bilo kakvih stvari koje je ostavio prethodni korisnik koji bi mogli predstavljati opasnost.

Očistite cjedilo za odvod prije stavljanja u autoklav.

Stavke uvijek stavljajte u sekundarni spremnik.

Nemojte preopteretiti ili pakirati vrećice previše čvrsto. Ostavite dovoljno prostora za cirkulaciju pare. Ako je potrebno, stavite posudu na bočnu stranu kako biste maksimalno povećali prodor pare i izbjegli zarobljavanje zraka.

Za pakiranje otpada koristite samo vrećice koje se mogu autoklavirati.

Nemojte dopustiti da vrećice dodiruju unutarnje stijenke autoklava kako biste izbjegli topljenje plastike.

Uvjerite se da je dovoljno tekućine napunjeno sadržajem vrećica za autoklav ako su suhe.

Stavite zaprljano stakleno i laboratorijsko posuđe u sekundarne posude i autoklavirajte u ciklusu krutih tvari. Nemojte puniti spremnike tekućinom više od 2/3. Otpustite kapice ili upotrijebite zatvarače s ventilacijom.

U slučaju čistog staklenog posuđa i omotanih instrumenata, položite ih u sekundarni spremnik prije autoklava u ciklusu zamotane robe.

Za sekundarno zadržavanje koristite ladice za autoklav izrađene od polipropilena, polikarbonata ili nehrđajućeg čelika. Pladnjevi trebaju imati čvrsto dno i stranice kako bi sadržavali sadržaj i hvatali prolivene.

Odaberite odgovarajući ciklus za materijal. Neispravan odabir ciklusa može oštetiti autoklav, prouzročiti ključanje tekućine ili razbijanje boca.

Započnite svoj ciklus i ispunite korisnički dnevnik autoklava. Završeni ciklus obično traje između 1 i 1,5 sata.

Provjerite mjerač tlaka u komori/oblozi za minimalni tlak od 20 funti po kvadratnom inču (psi).

Provjerite temperaturu za 250°F (121°C) pri svakom punjenju.

Ne pokušavajte otvoriti vrata dok autoklav radi.

Uvjerite se da je ciklus završen i da su se temperatura i tlak vratili u siguran raspon.

Nosite OZO opisanu gore, plus pregaču i štitnik za lice ako uklanjate tekućine. Odmaknite se od vrata kao mjeru opreza i pažljivo otvorite vrata ne više od 1 inča. To će osloboditi preostalu paru i omogućiti normalizaciju tlaka u tekućinama i spremnicima.

Ostavite autoklavirano punjenje da odstoji 10 minuta u komori. To će omogućiti pari da očisti i zarobljeni zrak da izađe iz vrućih tekućina, smanjujući rizik za operatera.

Nemojte miješati spremnike s pregrijanim tekućinama niti skidati čepove prije istovara.

Stavite tekućine na mjesto koje jasno pokazuje da su predmeti „vruće“.

Ostavite autoklavirane materijale da se ohlade na sobnu temperaturu prije transporta. Nikada ne transportirajte pregrijane materijale.

Stavite ohlađenu autoklaviranu vrećicu za biološku opasnost u reguliranu kutiju za medicinski otpad. Autoklavirane infektivne tekućine mogu se baciti u sudoper.

Dnevnik autoklava

Osoblje laboratorija mora voditi dnevnik autoklava. Dnevnik bi trebao sadržavati sljedeće pojedinosti:

Datum, vrijeme i ime operatera

Kontakt podaci: Laboratorij, broj sobe, broj telefona

Vrsta steriliziranog materijala/ciklus

Temperatura, tlak i trajanje sterilizacije tereta.

Validacija u autoklavu

Kemijski pokazatelji

Indikatori trake su papirnate trake s ljepljivom podlogom s oznakama kemijskih indikatora osjetljivih na toplinu. Indikatori trake mijenjaju boju ili prikazuju dijagonalne pruge, riječi “sterilno” ili “autoklavirano” kada su izložene temperaturama od 121°C. Indikatori trake obično se postavljaju na vanjsku stranu tereta otpada. Ako vrpca osjetljiva na temperaturu ne pokazuje da je tijekom postupka sterilizacije postignuta temperatura od najmanje 121°C, teret se ne smatra dekontaminiranim. Ako indikatori trake pokvare dva uzastopna opterećenja, obavijestite svog upravitelja za sigurnost odjela.

Trakasti indikatori nisu dizajnirani niti namijenjeni dokazivanju da su organizmi stvarno ubijeni. Oni pokazuju da je u autoklavu postignuta temperatura od 121°C. OLS preporučuje da NE koristite autoklavnu traku kao jedini pokazatelj dekontaminacije ili sterilizacije.

Integrirane kemijske indikatorske trake

Integrirane kemijske indikatorske trake pružaju ograničenu provjeru temperature i vremena prikazujući promjenu boje nakon nekoliko minuta izlaganja normalnim radnim temperaturama autoklava od 121ºC. Indikatori kemijske promjene boje mogu se postaviti unutar tereta otpada. Ako kemijski indikatori ne uspiju pri dva uzastopna punjenja, zatražite servis na autoklavu.

Biološki pokazatelji

Bočice bioloških indikatora sadrže spore iz B. stearothermophilus, mikroorganizma koji se inaktivira kada je izložen zasićenoj pari na 121°C tijekom najmanje 20 minuta. Autoklavi koji se koriste za obradu biološkog otpada moraju se ocjenjivati ​​biološkim indikatorom na mjesečnoj bazi.

Indikatori se moraju inkubirati 24 sata na 60°C s kontrolom koja se održava na sobnoj temperaturi.

Ako autoklavirani indikator pokazuje rast, provjera valjanosti nije uspjela i mora se ponoviti.

Ako drugi indikator provjere ne uspije, zatražite servis na autoklavu. Autoklav se ne smije koristiti dok se ne izvrši servis i ne prođe validacijski test.

Molimo pošaljite rezultate provjere valjanosti putem e-pošte OLS-u.

Čišćenje razbijenog stakla i izlijevanja

Ako se otkrije slomljeno staklo, autoklav treba ostaviti da se potpuno ohladi prije čišćenja krhotina slomljenog stakla

Operater opreme odgovoran je za uklanjanje razbijenog stakla i njegovo postavljanje u za to predviđeni spremnik za razbijeno staklo.

Do izlijevanja može doći zbog prokuhavanja ili lomljenja spremnika. Ne pokušavajte pokrenuti autoklav dok se izliveni ne očisti.

Ako dođe do izlijevanja, spriječite širenje izlijevanja i pričekajte dok se autoklav i materijal u njemu ne ohlade na sobnu temperaturu. Ne pokušavajte očistiti prolivenu vodu kada je vruća. Očistite zahvaćeno područje i na odgovarajući način odložite otpad.


6 Uobičajene metode laboratorijske sterilizacije

1. Mokra toplina (autoklaviranje)

Metoda laboratorijske sterilizacije po izboru u većini laboratorija je autoklaviranje: korištenje pare pod tlakom za zagrijavanje materijala koji se sterilizira. Ovo je vrlo učinkovita metoda koja ubija sve mikrobe, spore i viruse, iako su za neke specifične bube potrebne osobito visoke temperature ili vrijeme inkubacije.

Autoklaviranje ubija mikrobe hidrolizom i koagulacijom staničnih proteina, što se učinkovito postiže intenzivnom toplinom u prisutnosti vode.

Intenzivna toplina dolazi od pare. Tlačna para ima visoku latentnu toplinu na 100 o C zadržava 7 puta više topline od vode na istoj temperaturi. Ta se toplina oslobađa u kontaktu s hladnijom površinom materijala koji se sterilizira, što omogućuje brzu isporuku topline i dobar prodor gustih materijala.

Na ovim temperaturama voda izvrsno hidrolizira proteine… tako da te bube nemaju šanse.

2. Suha toplina (zapaljenje, pečenje)

Suho grijanje ima jednu bitnu razliku od autoklaviranja. Pogodili ste - nema vode, pa se hidroliza proteina ne može dogoditi.

Umjesto toga, suha toplina nastoji ubiti mikrobe oksidacijom staničnih komponenti. To zahtijeva više energije nego hidroliza proteina pa su potrebne više temperature za učinkovitu sterilizaciju suhom toplinom.

Na primjer, sterilizacija se normalno može postići za 15 minuta autoklaviranjem na 121 o C, dok bi suho zagrijavanje općenito zahtijevalo temperaturu od 160 o C za sterilizaciju u sličnom vremenskom razdoblju.

3. Filtriranje

Filtracija je izvrstan način za brzu sterilizaciju otopina bez zagrijavanja.Filtri, naravno, rade tako da otopinu propuštaju kroz filter s promjerom pora koji je premali da bi mikrobi mogli proći.

Filtri mogu biti lijevci od sinteriranog stakla izrađeni od toplinski topljenih staklenih čestica ili, danas češće, membranski filtri izrađeni od celuloznih estera. Za uklanjanje bakterija obično se koriste filteri s prosječnim promjerom pora od 0,2um.

Ali zapamtite, virusi i fagi mogu proći kroz te filtere tako da filtracija nije dobra laboratorijska metoda sterilizacije ako su oni zabrinuti.

4. Otapala

Etanol se obično koristi kao dezinficijens, ali izopropanol je bolje otapalo za masnoću i vjerojatno je bolja opcija.

Oba otapala djeluju tako što denaturiraju proteine ​​kroz proces koji zahtijeva vodu, pa se moraju razrijediti na 60-90% u vodi da bi bili učinkoviti.

Opet, važno je zapamtiti da iako su etanol i IPA dobri u ubijanju mikrobnih stanica, nemaju utjecaja na spore.

5. Zračenje

UV, x-zrake i gama-zrake su sve vrste elektromagnetskog zračenja koje imaju duboko štetne učinke na DNK, stoga su izvrsni alati za sterilizaciju.

Glavna razlika između njih, u smislu njihove učinkovitosti, je njihova prodornost.

UV ima ograničeni prodor u zrak pa se sterilizacija događa samo na prilično malom području oko lampe. Međutim, relativno je siguran i vrlo je koristan za sterilizaciju malih površina, poput napa s laminarnim protokom. (Zbilja je važno ne zaboraviti sterilizirati i svoju opremu.)

X-zrake i gama zrake daleko su prodornije, što ih čini opasnijim, ali vrlo učinkovitima za veliku hladnu sterilizaciju plastičnih predmeta (npr. šprice) tijekom proizvodnje.

6. Plinska sterilizacija

Etilen oksid se može koristiti za sterilizaciju opreme koja je osjetljiva na toplinu ili vlagu i često se koristi za sterilizaciju medicinske opreme kao što su kateteri i stentovi. Etilen oksid u biti sprječava metabolizam i replikaciju stanice alkilacijom. Budući da se etilen oksid lako apsorbira, oprema se nakon sterilizacije mora prozračiti kako bi se uklonili ostaci. Etilen oksid je također vrlo toksičan i može predstavljati brojne zdravstvene rizike. Budući da se općenito koristi za zdravstvene proizvode, malo je vjerojatno da ćete ga koristiti u laboratoriju.

Dakle, to su neke od glavnih metoda laboratorijske sterilizacije. Ako smo nešto propustili, slobodno nas obavijestite u odjeljku za komentare.

Izvorno objavljeno 28. ožujka 2012. Pregledano i ažurirano u veljači 2021.


Je li sigurno autoklavirati agar s morskom vodom? - Biologija

LABORATORIJSKI POSTUPCI ZA MIKROORGANIZME

Priprema i skladištenje medija za kulturu

Mjere opreza - dehidrirani mediji
Svjetlo
Vlažnost
Temperatura i vrijeme

Priprema dehidriranih medija
Rekonstitucija dehidriranih medija
Sterilizacija medija za kulturu
Provjere sterilizacije
Efekti pregrijavanja
Tablica grešaka i mogućih uzroka sterilizacije medija

Priprema steriliziranog medija

Skladištenje pripremljenih medija

Mjere opreza pri uporabi i odlaganju pripremljenih medija

Mjere opreza - dehidrirani mediji

Korisnički laboratorijska ispitivanja kvalitete na pripremljenim medijima

Podloge za kulturu moraju se čuvati na određenoj temperaturi, pod određenim uvjetima i ne dulje od roka valjanosti koji je prikladan za svaki proizvod. Uvjeti skladištenja i rok trajanja svakog proizvoda prikazani su na naljepnicama ili umetcima proizvoda, ali sljedeća opća pravila pomoći će da se oni čuvaju u optimalnom okruženju. Prilikom skladištenja proizvoda obratite pozornost na rok trajanja na etiketi i koristite proizvode prema brojevima serije/serije.

Sve pripremljene podloge za uzgoj kulture i njihove komponente treba čuvati podalje od svjetlosti i cijelo vrijeme treba izbjegavati izlaganje izravnoj sunčevoj svjetlosti.

Na zatvorene staklene i plastične posude normalna laboratorijska vlažnost ne utječe. Otvorene posude s dehidriranim prahom bit će pod utjecajem visoke vlažnosti. Vruće prostorije za pripremu medija koje su zapaljene nisu prikladna okruženja za pohranjivanje spremnika s podlogom za kulturu, a posebno spremnika koji se često otvaraju i zatvaraju. Susjedna rashladna soba ili odgovarajući ormar za pohranu su poželjni prostori za pohranu.

Temperaturni uvjeti skladištenja medija kulture i njihovih komponenti uvelike se razlikuju. Sljedeće grupe proizvoda pomoći će u razlikovanju različitih zahtjeva.

Medij za uzgoj: Zatvorene, neotvorene posude treba čuvati na sobnoj temperaturi 15-20°C. Otvorene posude treba pažljivo i sigurno postaviti na čep ili poklopac. Važno je da se otvorene posude čuvaju u suhoj atmosferi na sobnoj temperaturi. Rok trajanja 1 do 5 godina.

Pripremljeni bujon medij: Čuvati na 2-8°C. Nemojte dopustiti da se proizvodi zamrznu. Rok trajanja od 6 mjeseci do 2 godine.

Pripremljene ploče s podlogom za kulturu: Izlivene ploče agar medija posebno su osjetljive na infekciju, dehidraciju i kemijsku razgradnju. Aseptička priprema i skladištenje neophodni su za zaštitu ploča od mikrobne infekcije. Gubici vode pri skladištenju mogu se minimizirati nepropusnim omotavanjem i/ili skladištenjem na 2-8°C. Kemijska razgradnja npr. oksidaciju ili gubitak antimikrobnih tvari, može se usporiti zaštitom od svjetlosti, topline i dehidracije.

Međutim, važno je pratiti skladištenje pripremljenih ploča testovima kontrole kvalitete kako bi se eventualno pogoršanje moglo otkriti i točno odrediti razdoblje skladištenja. Jednostavni testovi vaganja svježih i uskladištenih ploča odredit će brzinu gubitka vlage. Gubitak težine veći od 5% ukazivat će na značajan gubitak vode.

Kompleti za proizvodnju plina: Čuvati na 2-8°C na suhom mjestu. Nemojte čuvati ove komplete na višoj temperaturi dulje vrijeme. Rok trajanja 3 godine.

Sterilni reagensi: Čuvati na 2-8°C, osim konjskog seruma čuvati na -20 do +8°C.

Diskovi za osjetljivost : Čuvajte na -20 °C, ali održavajte radnu zalihu na 2-8 °C. Rok trajanja 1 do 2 godine.

Priprema dehidriranih medija

Dehidrirani mediji su higroskopni i osjetljivi na vlagu, toplinu i svjetlost. Na njih nepovoljno utječu drastične promjene temperature na pr. ciklične temperature vruće/hladne koje se mogu pojaviti između dnevnih i noćnih laboratorijskih temperatura zimi.

Uvjeti skladištenja obično su navedeni na naljepnici proizvoda i treba ih se pridržavati.

1 Na naljepnicu upišite datum primitka u laboratorij.

2 Čuvajte kako je naznačeno na naljepnici obično na temperaturi ispod 25°C na suhom mjestu, daleko od izravne sunčeve svjetlosti, autoklava, sušara ili drugih izvora topline.

3 Provjerite datum isteka na etiketi, neki mediji imaju znatno kraći rok trajanja od drugih.

4 Upotrijebite zalihe u redoslijedu serije/serije. Ne otvarajte novu bocu dok se prethodna boca ne isprazni. Zabilježite na naljepnici datum kada je spremnik prvi put otvoren. Nakon uporabe, provjerite je li spremnik dobro zatvoren i vratite ga u za to predviđeno skladište.

5 Naručite medij u posudi odgovarajuće veličine i u količini koja je u skladu sa zahtjevima uobičajene uporabe. Medij u velikom spremniku koji je mnogo puta otvaran pokvarit će se tijekom skladištenja. Bacite medij ako prašak ne teče, ako se promijenila boja ili ako se na bilo koji način čini nenormalnim.

Rekonstitucija dehidriranih medija

Cjelovite upute za pripremu medija za kulturu dane su na naljepnici svake bočice. U pravilu je mudro pripremiti samo tjedan dana.

1 Uvijek koristite svježe pripremljenu destiliranu ili deioniziranu vodu. Koristite toplu (50°C) vodu da ubrzate otopinu medija. Isperite svo stakleno posuđe destiliranom/deioniziranom vodom i provjerite jesu li posude čiste i bez otrovnih kemikalija koje se mogu apsorbirati na površini stakla, npr. žučne soli, telurit, selenit itd.

2 Pripremite medij u posudi oko dvostruko većeg volumena medija kako bi se omogućilo odgovarajuće miješanje. Slijedite upute navedene na etiketi svakog proizvoda.

3 Otvorite posudu za medij za kulturu dalje od propuha i vlage. Izbjegavajte udisanje praha i produženi kontakt s kožom. Izvažite prašak brzo, točno i bez stvaranja 'oblaka prašine'. Ponovo zatvorite posudu što je prije moguće. U posudu ulijte polovicu potrebnog volumena destilirane vode, zatim izvaganu količinu medija i žustro miješajte nekoliko minuta. Ulijte ostatak destilirane vode niz stranice posude kako biste isprali sve priljepljene medije natrag u otopinu. Ovo je važan korak jer suhi prašak medija za uzgoj iznad razine vode možda neće biti steriliziran u autoklavu i može biti izvor kontaminacije.

Medij bez agara obično će se otopiti pri laganom miješanju. Medij koji sadrži agar treba zagrijati da se agar otopi prije autoklaviranja. Zakuhajte medij da ne zagori ili ne zagori. Većina medija za uzgoj zahtijeva konačnu sterilizaciju u autoklavu na 121°C tijekom 20 minuta.

Proizvođač je podesio pH dehidriranog medija tako da konačni pH pripremljenog medija bude u skladu sa specifikacijom na etiketi kada je medij ohlađen na 25°C. Nemojte podešavati pH dehidriranih medija prije sterilizacije.

Sterilizacija medija za kulturu

Iako je sterilizaciju medija kulture najbolje provoditi u parnom autoklavu na temperaturama između 121-134°C, mora se znati da se medij može oštetiti procesom zagrijavanja.

Toplinska obrada složenih medija za uzgoj koji sadrže peptide, šećere, minerale i metale rezultira uništavanjem hranjivih tvari, bilo izravnom toplinskom razgradnjom ili reakcijom između komponenti medija.

Otrovni produkti uzrokovani kemooksidacijom također mogu nastati tijekom toplinske obrade. Stoga je važno optimizirati proces zagrijavanja tako da medij nakon zagrijavanja bude sterilan, ali da se minimalno ošteti sastojci medija. Općenito je pravilo da su kratkotrajni, visokotemperaturni procesi smrtonosniji za organizme i manje kemijski štetni od duljih procesa niže temperature, npr. Poželjnije je 3 minute na 134°C nego 20 minuta na 115°C.

Opće upute za sterilizaciju medija kulture u volumenima do jedne litre na 121°C tijekom 20 minuta nalaze se na svakoj naljepnici. Međutim, autoklavi se razlikuju u izvedbi, a potrebno je provesti ispitivanja termoelementa korištenjem različitih volumena medija kako bi se odredila vremena 'zagrijavanja i 'hlađenja'. Bit će to bitno učiniti kada se pripremaju količine medija veće od dvije litre. Kako bi se izbjeglo pregrijavanje velikih jedinica medija, razdoblja 'zagrijavanja' i 'hlađenja' obično su integrirana u vrijeme održavanja od 121°C.

Ciklus sterilizacije može se podijeliti u četiri faze:

Stupanj 1 20°-121°C Vrijeme zagrijavanja komore

Vrijeme zagrijavanja komore ovisi o učinkovitosti autoklava (ispuštanje zraka/ulaz pare) i veličini tereta u komori. Vrijeme potrebno za ovu fazu mjeri se sondom za snimanje koja se nalazi u ventilu za ispuštanje zraka koji se nalazi u dnu komore.

Stupanj 2 <100 -121 C Vrijeme prodiranja topline u spremnik za medij

Vrijeme prodora topline ovisi uglavnom o volumenu pojedinačnih spremnika, iako oblik i svojstva prijenosa topline spremnika mogu utjecati na ovu fazu. Vrijeme potrebno da volumen medija dosegne 121°C mjeri se termoelementima postavljenim u središte najnutarnjeg spremnika.

Volumen (ml) u staklenim bocama Vrijeme (min)

Ova vremena pretpostavljaju da je agar medij otopljen prije autoklaviranja. Također se pretpostavlja da je moguće maksimalno izlaganje pari. Dakle, iako je jednoj boci od 100 ml potrebno 12 minuta da postigne 121°C, kada se stavi u sanduk s drugim bocama potrebno je 19 minuta, a kada se stavi u središte naslaganih sanduka potrebno je 30 minuta.

Faza 3 121°-121°C Vrijeme držanja na propisanoj temperaturi

Vrijeme zadržavanja na 121°C ovisi o (i) broju organizama koji su izvorno prisutni u mediju (ii) o razlomku organizma za koji se pretpostavlja da je prisutan nakon zagrijavanja, npr. N = 0,001 ekvivalentno jednoj boci na svakih 1000 zagrijanih boca koje postaju kontaminirane (iii) konstanta toplinske smrti pretpostavljenog organizma prisutnog na 121°C.

Preporučena vremena držanja su:

Temperatura (°C) ⎡ ⎦ ⎮

Faza 4 121°- 80°C Vrijeme hlađenja da komora dostigne 80°C

Vrijeme hlađenja ovisi o veličini tereta u komori i brzini gubitka topline iz autoklava. Vodeni sprejevi se koriste za ubrzanje hlađenja u komercijalnim sterilizatorima, ali je potrebna vrlo pažljiva kontrola kako bi se izbjeglo lomljenje boce i ulazak rashladnog spreja u sterilizirani medij. Potonji problem nastaje kada vakuum nastao u prostoru za glavu tijekom hlađenja usisava kontaminiranu rashladnu tekućinu uz navoj čepa i u bocu.

Autoklavi za podloge za kulturu trebaju biti bez zaostajanja i samo umjerenog kapaciteta komore. Termičke brave na vratima trebale bi spriječiti njihovo otvaranje kada je temperatura komore iznad 8°C, ali čak i u tim okolnostima treba paziti da se izbjegne iznenadni toplinski udar prilikom vađenja staklenih boca s vrućom tekućinom iz autoklava. Kada se spremnici s navojnim poklopcima stave u autoklav, poklopci trebaju biti slobodni za pola okreta kako bi se omogućio izlaz zagrijanog zraka. Kada se izvade iz autoklava, posude treba ostaviti da se ohlade u laminarnom ormariću za protok zraka. Alternativno, spremnici s navojnim poklopcem mogu se sterilizirati u staklenki koja je prekrivena komadom filca koji učinkovito štiti spremnike od infekcije mikroorganizmima koji se prenose zrakom. Čepovi se čvrsto zašrafljuju nakon što se sadržaj ohladi na temperaturu okoline.

Sve autoklave treba provjeravati u određenim vremenskim razdobljima kako bi se osiguralo da rade učinkovito. Fizička mjerenja treba izvršiti na očitanjima temperature i tlaka, provjeriti kvalitetu pare, utvrditi učinkovitost zračnih zamki 'blizu pare' u podnožju autoklava i provjeriti sigurnosne ventile. Obvezne preglede autoklava kao tlačnih posuda obično provode stručnjaci godišnje prema uputama osiguravatelja takvih aparata. Kod malih laboratorijskih autoklava ova kontrola nije obavezna.

Kemijski indikatori pokazat će dostignutu ili prekoračenu temperaturu, a neki će pokazivati ​​vrijeme održavanja na navedenoj temperaturi. Nedovoljno autoklaviranje je obično samo po sebi razumljivo jer će neuspjeh uništavanja svih bakterijskih spora koje su prirodno prisutne u dehidriranom mediju ('bioopterećenje') omogućiti da se rast odvija u pohranjenom ili inkubiranom mediju. Uvijek treba posumnjati na neuspjeh sterilizacije kada dođe do kontaminacije pripremljenog medija sa spornim organizmima. Biološki pokazatelji sterilizacije će pokazati sposobnost autoklava da uništi bakterijske spore.

Pregrijavanje je čest uzrok odstupanja pH vrijednosti, zamračenja, oborina, slabe čvrstoće gela i smanjene bakteriološke učinkovitosti. Ovi učinci također se mogu proizvesti ako se zagrije koncentrirani 'bazen' sastojaka na dnu spremnika. Svi mediji za uzgoj trebaju biti u otopini prije sterilizacije. To će smanjiti pojavu reakcija Maillardovog tipa (neenzimsko smeđe boje) koje se odvijaju u mediju.

Efekti pregrijavanja će se pojaviti ako se agar medij pusti da se želira u bocama i kasnije se pari da se agar otopi. Također će se pojaviti ako se rastaljeni medij drži na 50°C više od 3 sata prije upotrebe. Agar mediji s pH vrijednostima na ili ispod 5,0 vrlo su osjetljivi na pregrijavanje u bilo kojem obliku jer je agar hidroliziran i čvrstoća gela slabi. Preporuča se zasebno sterilizirati agar medija s pH nižim od 5,0.

Većina poteškoća u sterilizaciji medija za uzgoj nastaje kada se moraju obraditi velike jedinične količine medija (>2 litre). Najbolje rješenje za ovaj problem je korištenje preparata medija za kulturu. Ovi poluautomatski procesori, proizvedeni od New Brunswicka i drugih proizvođača, prevladavaju problem slabog prodiranja topline agara kontinuiranim miješanjem ili miješanjem medija tijekom faze zagrijavanja. Takvi preparati značajno će smanjiti vrijeme potrebno za sterilizaciju na 121°C ili u nekim modelima na 134°C. Preporučuju se zbog njihove visoke učinkovitosti i minimalne štete na podlogama za kulturu.

Tablica grešaka i mogućih uzroka sterilizacije medija

pH test proveden iznad 25°C. Pregrijavanje kroz produljenu sterilizaciju, pretapanje ili predugo razdoblje na 50°C. Nepotpuno rješenje medija. Voda ili posude loše kvalitete. Dehidrirani medij pohranjen pogrešno ili preko navedenog roka trajanja.

Voda ili posude loše kvalitete. Pregrijavanje ili dugotrajno skladištenje na 50°C. pH vrijednost netočna. Nepotpuno rješenje.

Pregrijavanje, nepotpuna otopina ili odstupanje pH vrijednosti. Prisutnost fosfata uz glukozu ili druge šećere i agar.

Agar nije u otopini, loše miješanje, dugotrajno skladištenje na 50°C. Pregrijavanje pri niskim pH vrijednostima. Pogreška u vaganju ili prekomjerno razrjeđivanje s inokulumom ili dodacima medija. pH je prenizak za agar.

Dugotrajno i pretjerano zagrijavanje, nepotpuno rješenje. Inhibitorne tvari u vodi ili posudama. Zamračenje i pH drift.

Priprema steriliziranog medija

Tekući medij koji se sterilizira u konačnim spremnicima treba ohladiti na sobnu temperaturu što je prije moguće. Zatim je potrebno zategnuti čepove zavrtnja.

Posude sa steriliziranim agarnim podlogama treba staviti u vodenu kupelj na 50°C i medij dozirati čim dostigne tu temperaturu, ili u roku od najviše 3 sata u kupelji. Medij treba temeljito promiješati, bez stvaranja mjehurića i aseptički dozirati u sterilne posude. Ne izlažite posude s agar podlogom sunčevoj svjetlosti jer to uzrokuje prekomjernu kondenzaciju na poklopcima i može uzrokovati stvaranje inhibitornih tvari fotooksidacijom.

Toplotno labilne dodatke treba dodati u medij nakon što se ohladi na 50°C. Pustite da sterilni dodatak dođe na sobnu temperaturu prije nego što ga dodate u agar medij. Vrlo hladne tekućine mogu uzrokovati geliranje agara ili stvaranje prozirnih pahuljica koje se lako mogu vidjeti, npr. u krvlju obogaćenom agaru. Sve dodatke pomiješajte u medij nježno i temeljito, a zatim rasporedite u završne posude što je brže moguće.

Krv koja se koristi za pripremu krvnog agara treba biti što svježija i čuvana na 2-8°C (krv se ne smije smrzavati). Zagrijte krv u inkubatoru na 35°C prije dodavanja u sterilnu otopljenu bazu agara, koja je ohlađena na 40-45°C. Odgovarajuće miješanje u velikoj posudi s prostorom za glavu ključno je kako bi se osigurala aeracija krvi. Slabo oksigenirane krvne ploče su ljubičaste boje, dok je pravilno prozračeni krvni agar trešnjastocrvene boje. Preporuča se korištenje defibrinirane krvi umjesto krvi koja sadrži antikoagulans.

Skladištenje pripremljenih medija

Preporučeni rok trajanja pripremljenih medija za uzgoj znatno varira. Zatvorene boce hranjive juhe i agara mogu se čuvati 6 mjeseci na niskim temperaturama okoline (12-l6°C). Važno je sve medije pohraniti dalje od svjetlosti. Ploče s agarom treba čuvati na 2-8°C u zatvorenim posudama kako bi se izbjegao gubitak vlage. NE SMRZATI.

Svježi mediji su bolji od pohranjenih, stoga izbjegavajte dugo vremena skladištenja.Neki vrlo labilni beta-laktamski selektivni agensi imaju vrlo kratak radni vijek i medije koji sadrže takve tvari treba upotrijebiti unutar nekoliko dana od pripreme.

Dobra je laboratorijska praksa utvrditi rokove trajanja za sve pripremljene medije i u skladu s tim obilježiti datumski žig na spremnicima ili držačima.

Gubitak vlage iz ploča s agarom čest je uzrok lošeg bakteriološkog učinka. Nemojte predinkubirati sve ploče preko noći kao provjeru sterilnosti. Samo očito mokre ploče zahtijevaju sušenje prije inokulacije.

Osigurajte da su sve ploče inkubirane u vlažnom okruženju.

Pregledajte pripremljene podloge prije inokulacije. Potražite dokaze kontaminacije, neravnomjernog punjenja ili mjehurića na površini agara, promjene boje, hemolize i znakove dehidracije kao što su skupljanje, pucanje i gubitak volumena. Odbacite sve neispravne ploče ili cijevi.

Mjere opreza pri uporabi i odlaganju pripremljenih medija

Treba priznati da cijepljenje medija kulture bakterijama, namjerno ili slučajno, dovodi do stvaranja vrlo velikog broja organizama. Visoke koncentracije bilo kojeg organizma potencijalno su opasne i moraju se zbrinuti na siguran način odobrenim metodama.

Svim zaraženim uzorcima i inokuliranim podlogama za kulturu treba rukovati samo kvalificirano osoblje koje je obučeno za mikrobiološke postupke. Takvo osoblje treba osigurati da se sa svim uzorcima i kulturama pod njihovom skrbi pravilno rukuje i konačno autoklavira prije odlaganja. Svi korišteni i kontaminirani aparati moraju biti sigurno dezinficirani ili sterilizirani, što je posebno važno kada se takav aparat mora servisirati ili iznijeti iz laboratorija.

Okruženje u kojem se rukuje mikrobiološkim kulturama također se mora uzeti u obzir. Većina zemalja ima kategorije organizama koje se dijele na one s kojima se može rukovati u općem mikrobiološkom laboratoriju, one koje zahtijevaju posebne laboratorijske uvjete, a za najopasnije organizme potreban je potpuno zatvoren i visoko zaštićen okoliš. Nepoštivanje ovih pravila i propisa može biti kazneno djelo. Kada koristite medij za uzgoj, uvijek označite ili identificirajte spremnik s detaljima uzorka prije inokulacije.

Inokulirajte medij korištenjem aseptičkih tehnika i inkubirajte u odgovarajućim uvjetima.

Pregledajte medij nakon inkubacije na dokaz rasta mikroba i provedite odgovarajuće postupke izolacije i identifikacije.

Mjere opreza - dehidrirani mediji

Većina isporučenih proizvoda nema poznatih rizika osim onih koji su obično povezani s finim prahom. Međutim, kako bi se spriječio rizik od udisanja fine prašine, preporučuje se nošenje maski tijekom rukovanja dehidriranim medijima. Odabrana maska ​​trebala bi biti na razini britanskog standarda br. 6016. Tip maske koju proizvodi 3M Corporation bi bio prikladan za ovu svrhu.

Podaci o opasnostima dostupni su za pojedinačne proizvode.

Dehidrirani medij za uzgoj u obliku praha, granula ili tableta ne smije se jesti. Praške se ne smije udisati jer može doći do iritacije gornjih dišnih puteva, osobito s proizvodima žučne soli. Kako biste izbjegli blagi osip na koži, spriječite dugotrajni kontakt s puderom. Proizvodi u prahu, ako se proliju, mogu se pomesti i zbrinuti na uobičajen način. Ostatke treba isprati s dovoljno hladne vode.

Postoji nekoliko proizvoda koji sadrže otrovne tvari i s njima se mora postupati pažljivo.

1 Mediji koji sadrže talijeve soli. Ovi proizvodi imaju oznaku OTROV.

Talijeve soli su vrlo otrovne ako se udišu ili gutaju i postoji opasnost od kumulativnih učinaka. Proizvodi koji sadrže talijeve soli moraju se držati podalje od hrane, pića i stočne hrane. Prilikom rukovanja puderom uvijek nosite masku i rukavice.

2 Mediji koji sadrže natrijev azid

Ovi proizvodi sadrže manje od 1% natrijevog azida i imaju nisku toksičnost. Neke osobe, međutim, imaju povećanu osjetljivost na azid i stoga mogu reagirati na slučajno izlaganje proizvodu. Moraju se poduzeti mjere opreza kako bi se spriječilo gutanje ili udisanje prašine. Uvijek nosite rukavice, masku i zaštitu za oči.

Natrijev azid reagira s mnogim metalima, posebno s bakrom, stvarajući eksplozivne metalne azide. Prilikom pranja proizvoda koji sadrže azidne puhove sudopera, bitno je da se koristi dovoljno vode kako bi se spriječilo da prah ostane u kontaktu s cjevovodom i žljebovima. Ista mjera opreza vrijedi za svaku biološku otopinu koja sadrži natrijev azid kao konzervans.

3 Natrijev biselenit. Ovaj proizvod je označen kao OTROVAN.

Korozivan je u dodiru s kožom i proizvodi toksične učinke ako se udiše ili proguta. Predloženi su teratogeni učinci.

Ovaj spoj, pripremljen u bočicama s dodatkom, postiže koncentraciju koja se smatra otrovnom i sukladno tome je označena. Međutim, kada se razrijedi u medij kulture, njegova koncentracija pada ispod minimalne razine koja se smatra opasnom. Pri rekonstituciji bočica koje sadrže toksične razine cikloheksimida važno je osigurati da otopina bočice ne dodiruje kožu i spriječiti stvaranje aerosola koji bi omogućili udisanje spoja. Prilikom korištenja ovih bočica savjetuju se zaštitne rukavice i maska ​​za lice.

Korisnički laboratorijska ispitivanja kvalitete na pripremljenim medijima

Laboratorij za krajnjeg korisnika trebao bi provesti testove kontrole kvalitete kako bi se osiguralo da su karakteristike učinka medija unutar specifikacije i da je metodologija pripreme medija zadovoljavajuća.

Svaka serija/serija pripremljenog medija treba biti podvrgnuta minimalnom programu testiranja koji će osigurati da je prihvatljiv i da će pokazati tipične bakterijske performanse.

1 pH vrijednost: provjerite je li pH pripremljenog medija, kada se testira u konačnom obliku na sobnoj temperaturi (25°C) unutar raspona navedenog na naljepnici proizvoda. Medij treba baciti ako je pH vrijednost izvan navedenog raspona.

2 Sterilnost: reprezentativni uzorak svake serije/serije medija treba inkubirati 2-5 dana na 35-30°C i 50-55°C. Kao opće pravilo, za partiju od 100 ili manje jedinica treba testirati uzorak od 3-5%. Za veći lot uzima se 10 nasumičnih ploča ili cijevi. Nakon inkubacije ne bi trebalo biti nikakvih dokaza o mikrobnom rastu. Odbacite sve uzorke sterilnosti kada su testovi dovršeni.

3 Performanse rasta: testirajte svojstva potpore rasta proizvoda inokulacijom medija s odgovarajućim osnovnim kulturama i/ili svježim izolatima. Upotrijebite standardni postupak inokulacije i ispitajte dobivene kvantitativne i kvalitativne rezultate. Ako testirate nove serije/serije medija, inokulirajte stare i nove serije u jednom testu i usporedite performanse dviju serija jedna uz drugu.

4 Stabilnost: povremeno izvodite gore navedene postupke na pohranjenim pripremljenim medijima kako biste utvrdili hoće li uvjeti skladištenja dati optimalne rezultate.

NAPOMENA: Ako medij ne ispunjava očekivanja i ako se poštuju sve preporuke proizvođača, potrebno je poduzeti sljedeće korake: (1) zabilježiti prirodu problema i način pripreme medija (2) zabilježiti seriju /broj serije i datum kada je primljena (3) nazovite odjel tehničke službe dobavljača.

(reproduciran, s malo izmjena, iz Priručnika Oxoid, 6. izdanje, 1990.)

Smjernice koje su za CABRI pripremili DSMZ, CBS i BCCM, 17. svibnja 1998.
Izgled stranice CERDIC
Autorsko pravo CABRI, 1998

© Konzorcij CABRI 1999.-2013.
Ovo djelo ne može se reproducirati u cijelosti ili djelomično bez izričitog pismenog dopuštenja konzorcija CABRI.
Stranicu održava Paolo Romano. Posljednja revizija u travnju 2013.


Sadržaj

Sterilizacijski autoklavi se široko koriste u mikrobiologiji i mikologiji, medicini i izradi protetika, tetoviranju i piercingu te pogrebnoj praksi. Razlikuju se po veličini i funkciji ovisno o mediju koji se sterilizira i ponekad se nazivaju retortom u kemijskoj i prehrambenoj industriji.

Tipično opterećenje uključuje laboratorijsko stakleno posuđe, drugu opremu i otpad, kirurške instrumente i medicinski otpad. [5] [6]

Značajna novija i sve popularnija primjena autoklava je obrada prije odlaganja i sterilizacija otpadnog materijala, kao što je patogeni bolnički otpad. Strojevi u ovoj kategoriji uglavnom rade po istim principima kao i konvencionalni autoklavi po tome što su u stanju neutralizirati potencijalno infektivne agense korištenjem pare pod tlakom i pregrijane vode. Nova generacija pretvarača otpada sposobna je postići isti učinak bez tlačne posude za sterilizaciju medija za uzgoj, gumenog materijala, haljina, zavoja, rukavica itd. Posebno je koristan za materijale koji ne mogu podnijeti višu temperaturu peći s vrućim zrakom . [7]

Autoklavi se također široko koriste za stvrdnjavanje kompozita, posebno za stapanje više slojeva bez ikakvih šupljina koje bi smanjile čvrstoću materijala, te u vulkanizaciji gume. [8] Visoka toplina i tlak koje stvaraju autoklavi pomažu da se osigura ponovljivost najboljih mogućih fizičkih svojstava. Proizvođači nosača za jedrilice imaju autoklave duge i preko 15 metara (15 m) i 10 stopa (3 m) široke, a neki autoklavi u zrakoplovnoj industriji dovoljno su veliki da drže cijele trupe aviona izrađene od slojevitih kompozita. [9]

Druge vrste autoklava koriste se za uzgoj kristala pod visokim temperaturama i pritiscima. Sintetski kristali kvarca koji se koriste u elektronskoj industriji uzgajaju se u autoklavima. Pakiranje padobrana za specijalističke primjene može se izvesti pod vakuumom u autoklavu, što omogućuje zagrijavanje padobrana i njihovo umetanje u pakiranje pri najmanjoj zapremini.

Sustav za termičku dekontaminaciju efluenta funkcionira kao jednonamjenski autoklavi dizajnirani za sterilizaciju tekućeg otpada i otpadnih voda.

Vrlo je važno osigurati da se sav zarobljeni zrak ukloni iz autoklava prije aktivacije, jer je zarobljeni zrak vrlo loš medij za postizanje sterilnosti. Para na 134 °C (273 °F) može postići željenu razinu sterilnosti za tri minute, dok postizanje iste razine sterilnosti u vrućem zraku zahtijeva da provede dva sata na 160 °C (320 °F). [10] Metode uklanjanja zraka uključuju:

Pomak prema dolje (ili gravitacijski tip) Kako para ulazi u komoru, prvo ispunjava gornja područja jer je manje gustoća od zraka. Ovaj proces komprimira zrak do dna, tjerajući ga kroz odvod koji često sadrži senzor temperature. Tek kada je evakuacija zraka završena, pražnjenje prestaje. Protok se obično kontrolira pomoću sifona za paru ili elektromagnetnog ventila, ali se ponekad koriste otvori za odzračivanje. Kako se para i zrak miješaju, također je moguće istisnuti smjesu s mjesta u komori osim na dnu. Parna pulsirajuća razrjeđivanje zraka pomoću niza parnih impulsa, u kojima se komora naizmjenično stavlja pod tlak, a zatim spušta tlak blizu atmosferskog tlaka. Vakuumska pumpa Vakuumska pumpa usisava zrak ili smjese zraka/pare iz komore. Superatmosferski ciklusi postignuti vakuum pumpom. Počinje s vakuumom nakon kojeg slijedi puls pare nakon čega slijedi vakuum nakon kojeg slijedi puls pare. Broj impulsa ovisi o odabranom autoklavu i ciklusu. Subatmosferski ciklusi slični su superatmosferskim ciklusima, ali tlak u komori nikada ne prelazi atmosferski tlak sve dok se ne postigne tlak do temperature sterilizacije.

Autoklavi s štednjakom koji se koriste u lošijim ili nemedicinskim uvjetima nemaju uvijek programe za automatsko uklanjanje zraka. Od operatera se zahtijeva da ručno izvede pulsiranje pare pri određenim tlakovima kako pokazuje mjerač. [11]

Medicinski autoklav je uređaj koji koristi paru za sterilizaciju opreme i drugih predmeta. To znači da su sve bakterije, virusi, gljivice i spore inaktivirane. Međutim, prioni, kao što su oni povezani s Creutzfeldt-Jakob bolešću, i neki toksini koje oslobađaju određene bakterije, kao što je Cereulide, ne mogu se uništiti autoklaviranjem na tipičnih 134 °C tijekom tri minute ili 121 °C tijekom 15 minuta i umjesto toga treba uroniti u natrijev hidroksid (1N NaOH) i grijati u autoklavu s gravitacijskim pomicanjem na 121 °C tijekom 30 minuta, očistiti, isprati u vodi i podvrgnuti rutinskoj sterilizaciji. [12] Iako je širok raspon vrsta arheja, uključujući Geogemma barosii, mogu preživjeti, pa čak i razmnožavati se na temperaturama iznad 121 °C, nije poznato da je nijedan od njih zarazan ili na neki drugi način predstavlja zdravstveni rizik za ljude, zapravo, njihova je biokemija toliko različita od naše, a njihova stopa razmnožavanja je toliko spora da je mikrobiolozima potrebni ne brini za njih. [ potreban je citat ]

Autoklavi se nalaze u mnogim medicinskim ustanovama, laboratorijima i drugim mjestima koja trebaju osigurati sterilnost predmeta. Mnogi postupci danas koriste predmete za jednokratnu upotrebu, a ne predmete koji se mogu sterilizirati, za višekratnu upotrebu. To se prvo dogodilo s hipodermskim iglama, ali danas su mnogi kirurški instrumenti (kao što su pincete, držači igala i ručke skalpela) obično jednokratni, a ne za višekratnu upotrebu (vidi otpadni autoklav). Autoklavi su od posebne važnosti u siromašnijim zemljama zbog puno veće količine opreme koja se ponovno koristi. Pružanje autoklava sa štednjakom ili solarnih autoklava ruralnim medicinskim centrima bilo je predmet nekoliko predloženih misija medicinske pomoći. [ potreban je citat ]

Budući da se koristi vlažna toplina, toplinski labilni proizvodi (kao što su neke plastike) ne mogu se sterilizirati na ovaj način ili će se otopiti. Papir i drugi proizvodi koji se mogu oštetiti parom također se moraju sterilizirati na drugi način. U svim autoklavima, predmete uvijek treba odvojiti kako bi para mogla ravnomjerno prodrijeti u teret.

Autoklaviranje se često koristi za sterilizaciju medicinskog otpada prije odlaganja u standardni tok komunalnog krutog otpada. Ova je primjena postala češća kao alternativa spaljivanju zbog zabrinutosti za okoliš i zdravlje zbog nusproizvoda izgaranja koje emitiraju spalionice, posebno iz malih jedinica koje su obično radile u pojedinačnim bolnicama. Spaljivanje ili sličan proces toplinske oksidacije još uvijek je općenito obvezan za patološki otpad i drugi vrlo otrovan ili infektivni medicinski otpad. Za tekući otpad, sustav za dekontaminaciju otpadnih voda je ekvivalentni hardver.

U stomatologiji autoklavi osiguravaju sterilizaciju dentalnih instrumenata.

U većini industrijaliziranog svijeta medicinski autoklavi su regulirani medicinski uređaji. Mnogi medicinski autoklavi stoga su ograničeni na izvođenje ciklusa koje je odobrio regulator. Budući da su optimizirani za kontinuiranu bolničku uporabu, preferiraju pravokutni dizajn, zahtijevaju zahtjevne režime održavanja i skupi su za rad. (Propisno kalibriran medicinski autoklav koristi tisuće galona vode svaki dan, neovisno o zadatku, uz odgovarajuću veliku potrošnju električne energije.)

Većina medicinskih autoklava neprikladna je za istraživačke zadatke. Nemedicinski (često se nazivaju "istraživački") autoklavi opće uporabe sve se više koriste u širokom rasponu obrazovnih, istraživačkih i industrijskih okruženja (uključujući biomedicinska istraživanja) gdje su učinkovitost, jednostavnost korištenja i fleksibilnost na prvom mjestu. premija. Autoklavi istraživačkog razreda mogu se konfigurirati za "prolazni" rad. To omogućuje održavanje apsolutne izolacije između "čistih" i potencijalno kontaminiranih radnih područja. Prolazni istraživački autoklavi posebno su važni u objektima BSL-3 ili BSL-4.

Autoklavi istraživačke klase—koji nisu odobreni za upotrebu u sterilizacijskim instrumentima koji će se izravno koristiti na ljudima—primarno su dizajnirani za učinkovitost, fleksibilnost i jednostavnost korištenja. Prikazuju širok raspon dizajna i veličina, a često su prilagođeni njihovoj upotrebi i vrsti opterećenja. Uobičajene varijacije uključuju ili cilindričnu ili četvrtastu tlačnu komoru, sustave hlađenja zrakom ili vodom i vertikalno ili vodoravno otvaranje vrata komore (koja mogu biti na električni ili ručni pogon).

Godine 2016. Ured za održivost na Sveučilištu Kalifornije, Riverside (UCR) proveo je studiju učinkovitosti autoklava u svojim laboratorijima za istraživanje genomike i entomologije, prateći potrošnju energije i vode nekoliko jedinica. Otkrili su da, čak i kada funkcioniraju unutar predviđenih parametara, medicinski autoklavi korišteni u njihovim istraživačkim laboratorijima svaki troše 700 galona vode i 90 kWh električne energije po ciklusu (1.134 MWh električne energije i 8,8 milijuna galona vode ukupno). UCR-ovi autoklavi istraživačke klase obavljali su iste zadatke s jednakom učinkovitošću, ali su koristili 83% manje energije i 97% manje vode. [13]

Postoje fizikalni, kemijski i biološki pokazatelji koji se mogu koristiti kako bi se osiguralo da autoklav postigne ispravnu temperaturu za točan vremenski period. Ako se neobrađeni ili nepropisno tretirani predmet može zamijeniti s tretiranim, postoji rizik da će se pomiješati, što je, u nekim područjima kao što je kirurgija, kritično.

Kemijski pokazatelji na medicinskom pakiranju i autoklavnoj vrpci mijenjaju boju nakon što se ispune ispravni uvjeti, što ukazuje da je predmet unutar pakiranja ili ispod trake na odgovarajući način obrađen. Traka za autoklav samo je oznaka da su para i toplina aktivirale boju. Marker na vrpci ne ukazuje na potpunu sterilnost. Teži izazovni uređaj, nazvan Bowie-Dickov uređaj prema svojim izumiteljima, također se koristi za provjeru punog ciklusa. Sadrži cijeli list kemijskog indikatora smještenog u središte hrpe papira. Osmišljen je posebno da dokaže da je proces postigao punu temperaturu i vrijeme potrebno za normalan minimalni ciklus od 134 °C u trajanju od 3,5-4 minute. [ potreban je citat ]

Za dokazivanje sterilnosti koriste se biološki indikatori. Biološki indikatori sadrže spore bakterije otporne na toplinu, Geobacillus stearothermophilus. Ako autoklav ne postigne odgovarajuću temperaturu, spore će proklijati kada se inkubiraju i njihov metabolizam će promijeniti boju kemikalije osjetljive na pH. Neki fizikalni pokazatelji sastoje se od legure dizajnirane da se rastali tek nakon što je podvrgnuta određenoj temperaturi tijekom odgovarajućeg vremena držanja. Ako se legura otopi, promjena će biti vidljiva. [ potreban je citat ]

Neki kompjuterski upravljani autoklavi koriste F0 (F-nula) vrijednost za kontrolu ciklusa sterilizacije. F0 vrijednosti su postavljene za broj minuta sterilizacije ekvivalentne 121 °C (250 °F) na 100 kPa (15 psi) iznad atmosferskog tlaka tijekom 15 minuta. Budući da je točna kontrola temperature teška, temperatura se prati, a vrijeme sterilizacije sukladno tome prilagođava se. [ potreban je citat ]


Kako odložiti agar ploče

Agar je vrsta hranjive tvari koja se koristi u laboratoriju za uzgoj kultura bakterija, gljivica i drugih raznih mikroorganizama. Pravilno odlaganje ploča s agarom je sigurnosna briga za laboratorij i okoliš. Korištene ploče imaju drugačiji protokol od neiskorištenih ploča. Vrsta petrijeve zdjelice u kojoj se nalazi agar također određuje dostupne metode zbrinjavanja. Vodite računa o radu s infektivnim ili drugim opasnim materijalima. Slijedite sve laboratorijske sigurnosne smjernice prema uputama.

Identificirajte mikroorganizam koji raste na ploči s agarom.Kategorizirajte većinu vrsta bakterija i gljivica, uključujući kvasac, kao opasan otpad. Ljudske i životinjske stanice ili tkiva također su biološki opasni materijali. Iz sigurnosnih razloga, većinu korištenih agar ploča tretirajte kao biološki opasan otpad.

Odlučite je li išta dodano u agar opasno. Antibiotici, pesticidi, krv ili druge potencijalno štetne kemikalije imaju posebne smjernice za odlaganje. Tretirajte ploče s ovim aditivima kao biološku opasnost. Sterilizirajte agar s dodacima prije odlaganja kao čvrsti otpad.

Odaberite odgovarajuću vrećicu za biološku opasnost za svoje rabljene tanjure. Stavite agar ploče s ljudskim ili životinjskim stanicama i tkivima ili tjelesnim tekućinama u crvenu vrećicu za biološku opasnost. Sve ostale vrste opasnog otpada idu u narančaste vrećice za biološku opasnost. Zapečatite vrećice trakom ili ih zavežite kako bi materijali ostali zatvoreni i spriječili curenje.

Stavite sav opasni otpad u autoklav prije nego ga odložite. Provjerite specifikacije vašeg autoklava i odaberite odgovarajući ciklus za biološku sterilizaciju. Nakon što ste potpuno sterilizirali tanjure, bacite ih u smeće. Također možete natopiti korištene ploče s agarom u 10% otopini izbjeljivača kako biste ih sterilizirali ako autoklav nije dostupan. Međutim, bolje je koristiti autoklav ako je dostupan. Izbjeljivač ne utječe na neke vrste bioloških opasnosti i kemikalija.

Neiskorišteni obični agar u plastičnim pločama odložite izravno u kantu za smeće. Agar s bilo kojim aditivima biološki je opasan i treba ga sterilizirati prije odlaganja. Izstružite neiskorišteni agar iz staklenih petrijevih zdjela i bacite ga. Operite i ponovno upotrijebite staklene ploče. Alternativno, rastopite neiskorišteni agar na izvoru topline ili u mikrovalnoj pećnici i ulijte ga u nove tanjure ili posude za pohranu za kasniju upotrebu.


(Zapravo, jesmo.)

Studentica preddiplomskog studija biologije otkrila je da joj ne treba skupa oprema za sterilizaciju alata i materijala, sve što joj treba je njezin pouzdani Instant Pot.

Kada rade u laboratoriju, znanstvenici trebaju stvari da budu točne, dosljedne i čiste, čiste, čiste. Posebno pri radu s mikrobiološkim uzorcima ključna je ispravno sterilizirana okolina. Autoklav je alat koji se koristi u bolnicama i laboratorijima diljem svijeta kako bi se osiguralo da se svi neželjeni mikrobi čiste iz instrumenata i medija.

Profesionalci koriste autoklav za sterilizaciju znanstvene i kirurške opreme prije upotrebe visokom temperaturom izazvanom pritiskom. Zvuči poznato? Upravo tako radi elektronički ekspres lonac kao što je Instant Pot.

V aille Swenson, apsolvent na Državnom sveučilištu Dakota, napravio je istu vezu nakon što je za Božić primio Instant Pot. Instant lonac je dovoljno jeftin da se pojavi u svakoj kućnoj kuhinji, dok autoklav može koštati tisuće dolara i može biti izvan dosega cijena mnogih manjih laboratorija.

Swensen se pitala: može li se jeftin Instant Pot koristiti za isto što i skupi autoklav? Kao znanstvenica, odlučila je svoju hipotezu testirati znanstvenom metodom.

Osmislila je eksperiment u kojem je koristila Instant Pot zajedno s nekoliko drugih marki ekspres lonca kako bi vidjela kako je svaki od njih uspio ubiti različite vrste mikroba. Iako su svi uspjeli ubiti većinu mikroba, samo Instant Pot uspjela učinkovito sterilizirati protiv spora geobacillusa, bakterije koja se zapravo koristi za testiranje komercijalnih autoklava zbog svoje posebno visoke otpornosti na toplinu.

Swensen i njezin istraživački tim zaključili su da “ekspres lonci kupljeni u trgovini mogu biti prikladna zamjena za komercijalne autoklave... Samo je ekspres lonac marke Instant Pot mogao deaktivirati G. stearothermophilus endospore, što je pokazalo da bi to bio najprikladniji izbor za laboratorijski ekspres lonac.”

Kao što možete zamisliti, Instant Pot je također dobar za uništavanje štetnih bakterija kod kuće. To je idealan alat za sterilizaciju stvari kao što su bočice za bebe i staklenke za konzerviranje i najučinkovitiji je način da se hrana riješi potencijalnih mikrobnih opasnosti tijekom kuhanja.

Ništa od ovoga nam nije novo. Još 2012. godine izumitelj Instant Pot Robert Wang napisao je blog o tome zašto je Instant Pot savršen za kuhanje riže. Jedan od razloga je njegova jedinstvena sposobnost uništavanja kancerogenih toksina u riži:

“Riža, ako se ne skladišti pravilno, može nositi gljivične otrove zvane aflatoksini, snažan okidač raka jetre. Istraživanje je pokazalo da 6% nekuhane riže prikupljene na tržnicama u Seulu sadrži flatoksine. Uobičajeno kuhanje i kuhanje riže na pari na temperaturi ispod 100°C (212°F) nije dovoljno da ubije sve aflatoksine. Studija je pokazala da kuhanje pod tlakom na temperaturi većoj od 100°C (212°F) može smanjiti koncentraciju aflatoksina na sigurne razine.”

Dakle, evo ga. Ne samo da je vaš prijateljski Instant Pot brz i praktičan način kuhanja večere, već čini svijet sigurnijim mjestom, jednu kuhinju (ili laboratorij) u isto vrijeme.


5.11 Fekalne bakterije

Pripadnici dviju skupina bakterija, koliformi i fekalni streptokoki, koriste se kao pokazatelji moguće kontaminacije kanalizacijskim vodama jer se obično nalaze u izmetu ljudi i životinja. Iako uglavnom sami po sebi nisu štetni, ukazuju na moguću prisutnost patogenih (koje izazivaju bolesti) bakterija, virusa i protozoa koji također žive u probavnom sustavu ljudi i životinja. Stoga njihova prisutnost u potocima sugerira da bi mogli biti prisutni i patogeni mikroorganizmi te da bi plivanje i jedenje školjki mogli predstavljati zdravstveni rizik. Budući da je teško, dugotrajno i skupo izravno testirati prisutnost velikog broja patogena, voda se obično testira na koliforme i fekalne streptokoke. Izvori fekalne kontaminacije površinskih voda uključuju postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda, septičke sustave na licu mjesta, gnoj domaćih i divljih životinja te oborinsko otjecanje.

Osim mogućeg zdravstvenog rizika povezanog s prisutnošću povišenih razina fekalnih bakterija, mogu uzrokovati i zamućenu vodu, neugodne mirise i povećanu potrebu za kisikom. (Pogledajte odjeljak o otopljenom kisiku.)

Indikatorske vrste bakterija i što vam mogu reći

Najčešće ispitivani pokazatelji fekalnih bakterija su ukupni koliformi, fekalni koliformi, Escherichia coli, fekalni streptokoki i enterokoki. Sve ali E coli sastoje se od niza vrsta bakterija koje dijele zajedničke karakteristike kao što su oblik, stanište ili ponašanje E coli je jedna vrsta u skupini fekalnih koliforma.

Totalni koliformi su skupina bakterija koje su rasprostranjene u prirodi. Svi članovi ukupne koliformne skupine mogu se pojaviti u ljudskom izmetu, ali neki također mogu biti prisutni u životinjskom gnoju, tlu i potopljenom drvu te na drugim mjestima izvan ljudskog tijela. Dakle, korisnost ukupnih koliforma kao pokazatelja fekalne kontaminacije ovisi o mjeri u kojoj su pronađene vrste bakterija fekalnog i ljudskog porijekla. Za rekreacijske vode, ukupni koliformi se više ne preporučuju kao pokazatelj. Za pitku vodu, ukupni koliformi su još uvijek standardni test jer njihova prisutnost ukazuje na kontaminaciju vodoopskrbe vanjskim izvorom.

Fekalne koliformne bakterije, podskup ukupnih koliformnih bakterija, su fekalno-specifičnijeg porijekla. Međutim, čak i ova skupina sadrži rod, Klebsiella, s vrstama koje nisu nužno fekalnog porijekla. Klebsiella obično se povezuju s tekstilnim otpadom i otpadom iz tvornica celuloze i papira. Stoga, ako se ti izvori ispuštaju u vaš tok, možda biste trebali razmisliti o praćenju više fekalnih bakterija i bakterija specifičnih za ljude. Za rekreacijske vode ova je skupina bila primarni pokazatelj bakterija sve do relativno nedavno, kada je EPA počela preporučivati E coli i enterokoki kao bolji pokazatelji zdravstvenog rizika od kontakta s vodom. Fekalne koliformne bakterije još uvijek se koriste u mnogim državama kao indikatorske bakterije.

E coli je vrsta fekalnih koliformnih bakterija koja je specifična za fekalni materijal ljudi i drugih toplokrvnih životinja. EPA preporučuje E. coli kao najbolji pokazatelj zdravstvenog rizika od kontakta s vodom u rekreacijskim vodama, neke su države promijenile svoje standarde kvalitete vode i prate u skladu s tim.

Fekalni streptokoki općenito se javljaju u probavnom sustavu ljudi i drugih toplokrvnih životinja. U prošlosti su se fekalni streptokoki pratili zajedno s fekalnim koliformima te je izračunat omjer fekalnih koliforma i streptokoka. Taj je omjer korišten za utvrđivanje je li kontaminacija ljudskog ili neljudskog porijekla. Međutim, ovo se više ne preporučuje kao pouzdan test.

Enterokoki su podskupina unutar skupine fekalnih streptokoka. Enterokoki se odlikuju svojom sposobnošću preživljavanja u slanoj vodi, te u tom pogledu više oponašaju mnoge patogene nego ostali pokazatelji. Enterokoki su tipično specifičniji za ljude od veće skupine fekalnih streptokoka. EPA preporučuje enterokoke kao najbolji pokazatelj zdravstvenog rizika u slanoj vodi koja se koristi za rekreaciju i kao koristan pokazatelj u slatkoj vodi.

Koje bakterije trebate pratiti?

Na koje bakterije ćete testirati ovisi o tome što želite znati. Želite li znati predstavlja li plivanje u vašem potoku rizik za zdravlje? Želite li znati zadovoljava li vaš potok državne standarde kvalitete vode?

Studije koje je provela EPA kako bi se utvrdila korelacija između različitih bakterijskih pokazatelja i pojave bolesti probavnog sustava na plažama za kupanje sugeriraju da su najbolji pokazatelji zdravstvenog rizika od rekreacijskog kontakta s vodom u slatkoj vodi E coli i enterokoka. Za slanu vodu najbolji su enterokoki. Zanimljivo je da je fekalna koliformna skupina kao skupina utvrđena kao loš pokazatelj rizika od bolesti probavnog sustava. Međutim, mnoge države i dalje koriste fekalne koliforme kao svoj primarni pokazatelj zdravstvenog rizika.

Ako vaša država još uvijek koristi ukupne ili fekalne koliforme kao indikatorske bakterije i želite znati zadovoljava li voda državne standarde kvalitete vode, trebali biste pratiti fekalne koliforme. Međutim, ako želite znati zdravstveni rizik od rekreacijskog kontakta s vodom, rezultati EPA studija sugeriraju da biste trebali razmisliti o prelasku na E coli ili enterokoka metoda za ispitivanje slatke vode. U svakom slučaju, najbolje je konzultirati se s odjelom za kvalitetu vode vaše državne agencije za zaštitu okoliša, osobito ako očekujete da će koristiti vaše podatke.

Razmatranje uzorkovanja i opreme

Bakterije može biti teško uzorkovati i analizirati iz više razloga. Razine prirodnih bakterija u potocima mogu značajno varirati. Uvjeti bakterija su u snažnoj korelaciji s padalinama, pa stoga usporedba podataka o bakterijama na vlažnom i suhom vremenu može biti problem. Mnoge analitičke metode imaju nisku razinu preciznosti, ali mogu biti prilično složene i potrebni su apsolutno sterilni uvjeti za prikupljati i rukovati uzorcima.

Primarna odluka o opremi koju trebate donijeti prilikom uzorkovanja na bakterije je vrsta i veličina spremnika za uzorke koji ćete koristiti. Nakon što donesete tu odluku, koristi se isti, jednostavan postupak prikupljanja bez obzira na vrstu bakterije koja se prati. Postupci prikupljanja opisani su ispod "Kako prikupiti uzorke".

Prilikom praćenja bakterija važno je da svi spremnici i površine s kojima će uzorak doći u kontakt budu sterilni. Spremnici izrađeni od nekog oblika plastike ili Pyrex stakla prihvatljivi su za EPA. Međutim, ako se spremnici ponovno koriste, moraju se sterilizirati toplinom i pritiskom. Spremnici se mogu sterilizirati korištenjem autoklava, koji je stroj koji sterilizira spremnike parom pod tlakom. Ako koristite autoklav, materijal spremnika mora biti u stanju izdržati visoke temperature i pritisak. Plastični spremnici ili polietilen visoke gustoće ili polipropilen mogli bi biti poželjniji od stakla s praktičnog stajališta jer će bolje izdržati lom. U svakom slučaju, svakako provjerite specifikacije proizvođača kako biste vidjeli može li posuda izdržati 15 minuta u autoklavu na temperaturi od 121°C bez topljenja. (Savjetuje se iznimni oprez pri radu s autoklavom.) Jednokratne, sterilne, plastične Whirl-pak® vrećice koriste se u brojnim programima. Veličina spremnika ovisit će o količini uzorka potrebnoj za metodu analize bakterija koju odaberete i količini potrebnoj za druge analize.

Postoje dvije osnovne metode za analizu uzoraka vode na bakterije:

  1. Metoda membranske filtracije uključuje filtriranje nekoliko različitih dijelova uzorka pomoću filtera standardnog promjera i veličine pora, stavljanje svakog filtra na selektivni hranjivi medij u petrijevoj ploči, inkubiranje ploča na određenoj temperaturi u određenom vremenskom razdoblju, a zatim brojeći kolonije koje su izrasle na filteru. Ova se metoda razlikuje za različite vrste bakterija (varijacije mogu uključivati, na primjer, vrstu hranjivog medija, broj i vrste inkubacija, itd.).
  2. Metoda fermentacije s više cijevi uključuje dodavanje određenih količina uzorka u epruvete koje sadrže hranjivu juhu, inkubiranje epruveta na određenoj temperaturi u određenom vremenskom razdoblju, a zatim traženje razvoja plina i/ili zamućenja koje bakterije proizvode. Prisutnost ili odsutnost plina u svakoj cijevi koristi se za izračunavanje indeksa poznatog kao najvjerojatniji broj (MPN).

S obzirom na složenost postupaka analize i potrebnu opremu, terenska analiza bakterija se ne preporučuje. Volonter može analizirati bakterije u dobro opremljenom laboratoriju ili ih poslati u laboratorij s certifikatom države na analizu. Ako pošaljete uzorak bakterije u privatni laboratorij, provjerite ima li državni certifikat za analizu bakterija. Uzmite u obzir državne laboratorije za kvalitetu vode, sveučilišne i fakultetske laboratorije, privatne laboratorije, laboratorije postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda i bolnice. Možda ćete morati platiti ovim laboratorijima za analizu.

Ovaj priručnik ne bavi se laboratorijskim metodama jer se obično prati nekoliko vrsta bakterija i metode su različite za svaku vrstu. Za više informacija o laboratorijskim metodama, pogledajte reference na kraju ovog odjeljka. Ako odlučite analizirati svoje uzorke u vlastitom laboratoriju, svakako izvršite program osiguranja kvalitete/kontrole kvalitete. Preporučuju se posebni postupci u odjeljku u nastavku.

Kako prikupljati uzorke

Postupci prikupljanja i analize uzoraka na bakterije sastoje se od sljedećih zadataka:

ZADATAK 1 Pripremite posude za uzorke

Ako se za uzorkovanje koriste tvornički zatvorene, predsterilizirane, jednokratne Whirl-pak® vrećice, priprema nije potrebna. Sve ponovno korištene posude za uzorke (i svo stakleno posuđe korišteno u ovom postupku) moraju se isprati i sterilizirati na 121 C tijekom 15 minuta u autoklavu prije nego što se ponovno upotrijebi za uzorkovanje.

ZADATAK 2 Pripremite se prije odlaska na mjesto uzorkovanja

Pogledajte odjeljak 2.3 – Sigurnosna razmatranja za pojedinosti o potvrđivanju podataka o uzorkovanju i vremenu, preuzimanju opreme, pregledu sigurnosnih razmatranja i provjeravanju vremena i uputa. Osim toga, za uzorkovanje koliforma trebali biste provjeriti svoju opremu na sljedeći način:

  • Whirl-pak® vrećice su tvornički zatvorene i sterilizirane. Provjerite nije li pečat uklonjen.
  • Boce bi trebale imati ljepljivu traku preko čepa ili neku brtvu ili oznaku koja označava da su sterilizirane. Ako bilo koja od boca s uzorcima nije numerirana, pitajte koordinatora laboratorija kako ih numerirati. Osim ako posude za uzorke ne moraju biti označene brojem mjesta, nemojte ih sami numerirati.

ZADATAK 3 Sakupite uzorak

Pogledajte Zadatak 2 u Poglavlju 5 – Uvjeti kakvoće vode za detalje o prikupljanju uzorka pomoću boca s navojnim čepom ili Whirl-pak® vrećica. Ne zaboravite temeljito oprati ruke nakon prikupljanja uzoraka za koje se sumnja da sadrže fekalnu kontaminaciju. Također, pazite da ne dodirnete oči, uši, nos ili usta dok ne operete ruke.

Preporučeni postupci osiguranja kvalitete/kontrole kvalitete na terenu uključuju:

  • Praznine za polje. Oni bi se trebali prikupiti na 10 posto vaših uzoraka zajedno s redovitim uzorcima. Sterilnu vodu u steriliziranim posudama treba poslati odabranim uzorcima. Na unaprijed određenom mjestu uzorkovanja, uzorkivač puni uobičajeni spremnik za uzorke ovom sterilnom vodom. Ovo je označeno kao običan uzorak, ali s posebnom oznakom (kao što je "B") koja označava da je polje prazno. Zatim se analizira redovitim uzorcima. Laboratorijska analiza trebala bi rezultirati brojem bakterija "0" za sve slijepe probe. Praznine se koriste za identifikaciju pogrešaka ili kontaminacije u prikupljanju i analizi uzoraka.
  • Duplikati unutarnjeg polja. Oni bi se trebali prikupiti na 10 posto vaših mjesta uzorkovanja zajedno s redovitim uzorcima. Duplikat polja je duplikat uzorka toka prikupljen u isto vrijeme i na istom mjestu ili istim uzorkivačem ili drugim uzorkovačem. Ovo je označeno kao običan uzorak, ali s posebnom oznakom (kao što je "D") koja označava da je duplikat. Zatim se analizira s redovitim uzorcima. Laboratorijska analiza trebala bi rezultirati usporedivim brojem bakterija na 100 mL za duplikate i redovite uzorke prikupljene na istom mjestu. Duplikati se koriste za procjenu preciznosti uzorkovanja i laboratorijske analize.
  • Duplikati vanjskih polja. Eksterni duplikat polja je duplikat uzorka toka koji prikuplja i obrađuje neovisni (npr. profesionalni) uzorkivač ili tim na istom mjestu u isto vrijeme kao i obični uzorci toka. Koristi se za procjenu preciznosti uzorkovanja i laboratorijske analize.

ZADATAK 4 Vratite terenske podatkovne listove i uzorke u laboratorij ili mjesto za isporuku

Uzorci na bakterije moraju se analizirati unutar 6 sati od prikupljanja. Držite uzorke na ledu i odnesite ih u laboratorij ili mjesto za predaju što je prije moguće.

ZADATAK 5 Analizirajte uzorke u laboratoriju

Ovaj priručnik ne bavi se laboratorijskom analizom uzoraka vode. Laboratorijske metode opisane su u referencama u nastavku (APHA, 1992 River Watch Network, 1991 USEPA, 1985). Međutim, laboratorij s kojim radite trebao bi provesti sljedeće preporučene postupke laboratorijskog osiguranja kvalitete/kontrole kvalitete:

  • Negativne ploče nastaju kada je puferirana voda za ispiranje (voda koja se koristi za ispiranje strana lijevka filtra tijekom filtracije) filtrirana na isti način kao i uzorak. To se razlikuje od slijepog polja po tome što sadrži reagense koji se koriste u vodi za ispiranje. Nakon inkubacije na filteru ne smije biti rasta bakterija. Koristi se za otkrivanje laboratorijske bakterijske kontaminacije uzorka.
  • Pozitivne ploče nastaju kada se voda za koju je poznato da sadrži bakterije (kao što je dotok postrojenja za pročišćavanje otpadnih voda) filtrira na isti način kao i uzorak. Nakon inkubacije na filteru bi trebalo biti dosta bakterija. Pozitivne ploče koriste se za otkrivanje proceduralnih pogrešaka ili prisutnosti kontaminanata u laboratorijskoj analizi koji bi mogli inhibirati rast bakterija.
  • Laboratorijske replike. Laboratorijska kopija je uzorak koji se u laboratoriju dijeli na poduzorke. Svaki poduzorak se zatim filtrira i analizira. Laboratorijske replike koriste se za dobivanje optimalnog broja kolonija bakterija na filterima za potrebe brojanja. Obično se poduzorci od 100, 10 i 1 mililitar (mL) filtriraju kako bi se dobile kolonije bakterija na filteru koje se mogu pouzdano i točno izbrojati (obično između 20 i 80 kolonija).Ploča s brojem između 20 i 80 kolonija odabire se za izvješćivanje o rezultatima, a broj se pretvara u kolonije na 100 mL.
  • Poznato. Vodi za reagens dodaje se unaprijed određena količina dehidriranih bakterija, što bi trebalo rezultirati poznatim rezultatom, unutar prihvatljive granice pogreške.
  • Vanjska laboratorijska analiza dupliciranih uzoraka. Duplikati unutarnjeg ili vanjskog polja mogu se analizirati u neovisnom laboratoriju. Rezultati bi trebali biti usporedivi s onima dobivenim u projektnom laboratoriju.

Reference

APHA. 1992. godine. Standardne metode ispitivanja vode i otpadnih voda. 18. izd. Američko udruženje za javno zdravstvo, Washington, DC.

Hogeboom, T. Mikrobiolog, Vermont Environmental Conservation Laboratory, Waterbury, VT. Osobna komunikacija.

Mreža za čuvanje rijeke. 1991. Escherichia coli (E coli) postupak membranskog filtra (prilagođeno iz USEPA metode 1103.1, 1985.). Montpelier, VT. Listopad.


Mogu li novo autoklavirane predmete držati u autoklavu preko noći? - (5. listopada 2013.)

Trebam li se dodatno kasno vratiti u laboratorij kako bih premjestio svoje autoklavirane vrhove i pipete u pećnicu za sušenje? Ili ga je netko ostavio u stroju za autoklav cijelu noć natopljenu na sobnoj temperaturi i zatim prebacio u sušilicu?

Trebalo bi biti u redu, unutrašnjost autoklava je općenito sterilna.

bob 1 je sasvim u pravu. Sve dok ne otvorite autoklav stroj sigurno je.

Poklopac našeg autoklavnog stroja olabavi se nakon završetka sterilizacije (što znači, zrak može lako vratiti mikrobe).  Možda se samo previše brinem.  

Još jedna stvar je da također koristimo isti autoklav za dekontaminaciju otpada (npr. bilo kakvih mikrobiološki kontaminiranih materijala, agar ploča itd.).  

Ne bih zamislio da je unutrašnjost vaše pećnice sterilnija od vanjskog zraka (OK, 60C će ubiti nekoliko stvari, ali ne i spore gljivica itd.), osim toga, što ćete učiniti s vrhovima nakon što se osuše ?  Spremite ih na klupu, bio bih spreman kladiti se.

Često ću dopustiti da savjeti ili tikvice ostanu u autoklavu preko noći iz logističkih razloga i nikada nisam imao problema.  Za moj rad, jedina stvar koja nije dopuštena ostati u autoklavu su mediji, ali vjerujem da je primarna briga postoji odgođeno hlađenje, a time i duže vrijeme izlaganja višim temperaturama što nije dobro nego značajna zabrinutost za sterilnost.