Informacija

Može li se umjetno povećati aktivnost određenog gena u stanici?

Može li se umjetno povećati aktivnost određenog gena u stanici?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Iako postoji mnogo mehanizama za regulaciju gena iz same stanice, pitao sam se je li moguće trajno povećati aktivnost gena u živoj stanici (tako da se protein koji ona kodira proizvodi u većim količinama) primjenom biotehnoloških metoda (tj. nema vanjskih čimbenika)? Postoje li studije ili eksperimenti u vezi s ovom temom?


Dostupne su tehnologije za induciranje veće (ili niže) ekspresije gena u kultiviranim stanicama sisavaca/ljudi, kao iu bakterijama. Stanje tehnike je aktivacija/represija gena posredovana s CRISPR-om, gdje spajate domenu aktivacije transkripcije s Cas genom u CRISPR-Cas sustavu (obično Cas9) i dajete RNA vodič za ciljane gene od interesa. Ovaj Cas gen je napravljen "mrtvim od nukleaze" tako da može samo ciljati, ali ne i rezati ili razgraditi DNK (za razliku od prirodnih CRISPR-Cas sustava koji rade oboje), i služi za dovođenje domene aktivacije transkripcije do vašeg gena od interesa, što dovodi do povećanja transkripcije tog gena.

Pogledajte ovaj rad za raniji primjer takvog sustava u kultiviranim staničnim linijama. Područje je od tada prilično napredovalo, a ljudi su uspješno aktivirali gene u mišjim linijama


Ako tražite velike količine određenog proteina, potražite "proizvodnja rekombinantnog proteina". To je ogromno polje.


Slijed se izvodi s transkriptazom. Da biste udvostručili količinu signalizacije ili neku proizvodnju proteina, pokušajte udvostručiti pojavu sekvence.


To se može učiniti. Pronašao sam ovaj članak koji opisuje kako možete koristiti modificirani mehanizam CRISPR-Cas9 za potiskivanje ili aktiviranje transkripcije.


Dizajn vektora za optimizaciju ekspresije transgena

B Inaktivacija gena

Nokaut gena je moćno i nepovratno sredstvo za inaktivaciju gena. Sustav Cre-LoxP je jedna od mogućnosti (vidi odjeljak 17.V.A). Nokaut se može postići upotrebom konvencionalne homologne rekombinacije ili s konstruiranim endonukleazama (vidi odjeljak 17.IV). Nokaut gena također se može postići korištenjem NHEJ nakon dvostrukog prekida DNK na odabranom mjestu korištenjem konstruiranih endonukleaza ili sustava RGEN (vidi odjeljak 17.IV). Prednosti ovog pristupa su njegova visoka učinkovitost i činjenica da se inaktivacija može postići u jednostaničnim embrijima.


Molekularna patogeneza oralnog karcinoma pločastih stanica: implikacije za terapiju

Razvoj oralnog karcinoma skvamoznih stanica (OSCC) je proces u više koraka koji zahtijeva nakupljanje višestrukih genetskih promjena, pod utjecajem pacijentove genetske predispozicije, kao i utjecaja okoline, uključujući duhan, alkohol, kronične upale i virusne infekcije. Tumorigene genetske promjene sastoje se od dva glavna tipa: tumor supresorskih gena, koji potiču razvoj tumora kada su inaktivirani i onkogena, koji potiču razvoj tumora kada se aktiviraju. Tumorski supresorski geni mogu se inaktivirati putem genetskih događaja kao što su mutacija, gubitak heterozigotnosti ili delecija, ili epigenetskim modifikacijama kao što je metilacija DNA ili remodeliranje kromatina. Onkogeni se mogu aktivirati prekomjernom ekspresijom zbog genske amplifikacije, povećane transkripcije ili promjena u strukturi zbog mutacija koje dovode do povećane transformacijske aktivnosti. Ovaj pregled se usredotočuje na molekularne mehanizme oralne karcinogeneze i upotrebu biološke terapije za specifično ciljanje molekula izmijenjenih u OSCC. Brzi napredak koji je postignut u našem razumijevanju molekularnih promjena koje doprinose razvoju OSCC-a dovodi do poboljšanja u ranoj dijagnozi tumora i usavršavanju bioloških tretmana individualiziranih specifičnim karakteristikama tumora pacijenta.


Novi mehanizam koji stoji iza kontinuirane aktivnosti matičnih stanica u biljkama

Slika 1: Dijagrami mreže vaskularne genetske ekspresije (ljubičasta = stanice ksilema, zelena = stanice floema, plava = vaskularne matične stanice). A. Vaskularni razvoj tijekom sekundarnog rasta biljke. B. Sustav kulture indukcije vaskularnih stanica „VISUAL“. C. Konstruirana mreža vaskularne ekspresije gena. Svaka točka označava gen, a linije pokazuju jake međusobne odnose između njih. Zasluge: Sveučilište Kobe

Međusveučilišna istraživačka skupina uspjela je izgraditi mrežu ekspresije gena iza procesa vaskularnog razvoja u biljkama. To su postigli provođenjem bioinformatičke analize pomoću platforme za kulturu tkiva 'VISUAL' koja generira vaskularne matične stanice iz stanica lista. U ovoj mreži su također otkrili novi faktor transkripcije BES/BZR, BEH3, koji regulira vaskularne matične stanice. Osim toga, osvijetlili su novi sustav održavanja vaskularnih stanica u kojem se BEH3 natječe s drugim transkripcijskim čimbenicima iz iste BES/BZR obitelji kako bi stabilizirao umnožavanje i diferencijaciju vaskularnih matičnih stanica.

Zajedničku istraživačku skupinu činili su znanstveni istraživač Furuya Tomoyuki i izvanredni profesor Kondo Yuki i sur. (sa postdiplomske škole znanosti Sveučilišta Kobe), profesor Satake Akiko sa sveučilišta Kyushu, posebno imenovani profesor Tanokura Masaru i posebno imenovan izvanredni profesor Miyakawa Takuya (sa diplomske škole za poljoprivredu i prirodne znanosti Sveučilišta u Tokiju) i profesor Yaofija Wamo Institut za održive usluge agroekosustava Sveučilišta u Tokiju).

Istraživači se nadaju da će identificirati više regulatornih čimbenika za matične stanice, što će doprinijeti našem razumijevanju molekularne osnove koja stoji iza kontinuirane aktivnosti matičnih stanica u biljkama.

Ovi rezultati istraživanja objavljeni su u američkom časopisu biljnih znanosti Biljna stanica dana 1. lipnja 2021.

  • Istraživači su izdvojili ukupno 394 gena specifična za vaskularne matične stanice iz opsežnih skupova podataka o ekspresiji gena. Među njima su otkrili BEH3, novi regulatorni faktor matičnih stanica koji pripada BES/BZR obitelji transkripcijskih čimbenika.
  • Otkrili su da za razliku od drugih BES/BZR transkripcijskih čimbenika, BEH3 gotovo da nema funkcionalnih domena i kompetitivno inhibira aktivnost tih drugih čimbenika.
  • Istraživačka skupina je pokazala da ovaj kompetitivni odnos između BES/BZR transkripcijskih čimbenika stabilizira umnožavanje i diferencijaciju vaskularnih matičnih stanica, osvjetljavajući regulacijski sustav koji održava kontinuiranu aktivnost vaskularnih matičnih stanica.
Slika 2: Dijagram modela koji prikazuje kompetitivni odnos između BEH3 i drugih BES/BZR transkripcijskih čimbenika. BEH3 i drugi faktori transkripcije BES/BZR (ovdje predstavljeni BES1) natječu se jedni s drugima kako bi se vezali na DNA motiv BRRE, regulirajući nizvodnu ekspresiju gena. Zasluge: Sveučilište Kobe

Biljke se oblikuju samoumnožavajući svoje matične stanice i diferencirajući te matične stanice tako da imaju specijalizirane funkcije za izgradnju dijelova biljke, kao što su njezini organi i tkiva. Za razliku od životinja, biljke se nastavljaju regenerirati i rasti proizvodeći matične stanice tijekom svog života. Na primjer, drveće poput kriptomerije može imati dug životni vijek (Jomon cedar na japanskom otoku Yakushima staro je najmanje 2000 godina), a svake godine potiče sekundarni rast što rezultira još jednim prstenom oko njihovih debla. Taj se sekundarni rast događa unutar regije meristemskog tkiva zvanog sloj kambija gdje se vaskularne matične stanice umnožavaju i diferenciraju u stanice ksilema i floemske stanice, omogućujući da deblo raste šire. Drugim riječima, biljka mora kontinuirano proizvoditi vaskularne matične stanice tijekom svog života kako bi nastavila rasti, a za njih je od vitalnog značaja održati ravnotežu između umnožavanja i diferencijacije matičnih stanica.

Posljednjih godina provedene su studije koje su koristile model biljke Arabidopsis thaliana o tome kako se umnožavanje i diferencijacija matičnih stanica regulira iz perspektive genetike, znanosti o životu i istraživanja informatike. Međutim, mehanizam kojim biljke reguliraju i održavaju odgovarajuću ravnotežu matičnih stanica tek treba razumjeti.

Metodologija istraživanja i nalazi

Kako bi analizirali proces kojim se vaskularne matične stanice diferenciraju u stanice ksilema i stanice floema (slika 1), izvanredni profesor Kondo i suradnici razvili su sustav kulture tkiva 'VISUAL' za umjetno stvaranje matičnih stanica iz stanica lista. VISUAL ima mnoge prednosti koje ga čine pogodnim za istraživanje vaskularnih matičnih stanica, na primjer, lako je genetski analizirati biljke koje imaju uklonjenu određenu gensku funkciju (tj. mutante), a također je moguće promatrati vremensko napredovanje vaskularnih matičnih stanica U ovoj studiji znanstvenici su prikupili podatke o višestrukim mutantima i proveli opsežne analize ekspresije gena u različitim vremenskim točkama.Proveli su analizu mreže koekspresije gena o sličnostima u obrascima ekspresije kako bi procijenili odnos između različitih gena. Iz ove analize uspjeli su identificirati posebne skupine gena u stanicama ksilema, stanicama floema i vaskularnim matičnim stanicama (Sl. ponovno 1). Koristeći VISUAL, ova istraživačka skupina je prethodno otkrila da BES/BZR transkripcijski čimbenici BES1 i BZR1 igraju važnu ulogu u diferencijaciji vaskularnih matičnih stanica. Ovaj put su identificirali još jedan faktor transkripcije BES/BZR, BEH3, u skupini gena vaskularnih matičnih stanica putem mrežne analize, a također su ispitali njegovu funkciju supresije vaskularnih matičnih stanica.

Slika 3: Model regulacije vaskularnih matičnih stanica na temelju ovog istraživanja. Natjecanje unutar obitelji transkripcijskih faktora BES/BZR snažno regulira ravnotežu između umnožavanja i diferencijacije vaskularnih matičnih stanica, pridonoseći održavanju kontinuirane aktivnosti matičnih stanica. Zasluge: Sveučilište Kobe

Zatim su istraživači istraživali vaskularnu formaciju koristeći mutante s uklonjenom funkcijom BEH3. Otkrili su da mutanti imaju velike varijacije u vaskularnoj veličini u usporedbi s divljim tipom (biljka koja nije mutantna) i zaključili da BEH3 stabilizira vaskularne matične stanice. Istraživačka skupina je prethodno otkrila da jačanje funkcije BES1 (koji potiče diferencijaciju vaskularnih stanica) uzrokuje smanjenje broja vaskularnih stanica, no otkrili su da kada su ojačali funkciju BEH3 dolazi do suprotnog i povećava se broj vaskularnih matičnih stanica. Nakon daljnjeg istraživanja, istraživačka je skupina otkrila da iako se BEH3 može vezati na isti DNA motiv kao i drugi transkripcijski čimbenici BES/BZR, sposobnost BEH3 da regulira ekspresiju nizvodnih gena bila je znatno slabija. Ovi rezultati su pokazali da BEH3 ometa aktivnost drugih BES/BZR transkripcijskih čimbenika (slika 2), a istraživači su iz tog odnosa zaključili da je funkcija BEH3 u vaskularnim matičnim stanicama suprotna funkciji čimbenika u istoj obitelji, uključujući BES1. Matematički model korišten je za provjeru i simulaciju ovog kompetitivnog odnosa između BEH3 i drugih BES/BZR transkripcijskih čimbenika, a rezultati su pokazali da prisutnost BEH3 u vaskularnim matičnim stanicama doprinosi stabilizaciji veličine vaskularne bolesti (Slika 3).

Smatra se da postoji mnogo važnih genskih kandidata u mreži ekspresije gena vaskularnih matičnih stanica ove istraživačke skupine koji će pridonijeti razumijevanju vaskularnog razvoja i funkcija. Nadamo se da će vrijedne informacije dobivene ovom studijom ubrzati vaskularna istraživanja. Osim toga, daljnje rasvjetljavanje odnosa između BEH3 i drugih BES/BZR transkripcijskih čimbenika i njihovih odgovarajućih razlika produbit će naše razumijevanje mehanizma pomoću kojeg biljke održavaju ravnotežu između umnožavanja i diferencijacije matičnih stanica.

U budućnosti bi ovo znanje moglo doprinijeti tehnikama proizvodnje biomase i drugim područjima koja zahtijevaju stabilan rast biljaka velikih razmjera.


Odnos rasta stanica i regulacije tkivno specifične genske ekspresije tijekom diferencijacije osteoblasta

Odnos stanične proliferacije i vremenske ekspresije gena koji karakterizira razvojni slijed povezan s diferencijacijom koštanih stanica može se ispitati u primarnim diploidnim kulturama fetalnih osteoblasta dobivenih iz kalvarije kombinacijom molekularnih, biokemijskih, histokemijskih i ultrastrukturnih pristupa. Modifikacije u ekspresiji gena definiraju razvojni slijed koji ima 1) tri glavna razdoblja: proliferaciju, sazrijevanje ekstracelularnog matriksa i mineralizaciju i 2) dvije točke ograničenja do kojih stanice mogu napredovati, ali ne mogu proći bez daljnjih signala. Prva restrikcijska točka je kada je proliferacija smanjena i ekspresija gena povezana sa sazrijevanjem izvanstaničnog matriksa je inducirana, a druga kada dolazi do mineralizacije. U početku, aktivno proliferirajuće stanice, eksprimirajući gene regulirane staničnim ciklusom i staničnim rastom, proizvode fibronektin/tip I kolagen izvanstanični matriks. Recipročan i funkcionalno povezan odnos između pada proliferativne aktivnosti i naknadne indukcije gena povezanih sa sazrijevanjem i mineralizacijom matriksa podržava 1) vremenski slijed događaja u kojem se pojačana ekspresija alkalne fosfataze javlja neposredno nakon proliferativnog razdoblja, a kasnije povećana ekspresija osteokalcina i osteopontina na početku mineralizacije 2) povećana ekspresija specifične podskupine markera fenotipa osteoblasta, alkalne fosfataze i osteopontina, kada je proliferacija inhibirana i 3) povećane razine ekspresije markera osteoblasta kada se potiče taloženje kolagena, što sugerira da izvanstanični matriks doprinosi i zaustavljanju proliferacije i razvoju fenotipa osteoblasta. Gubitak stroge kontrole rasta u transformiranim osteoblastima i u stanicama osteosarkoma popraćen je deregulacijom usko povezanog odnosa između proliferacije i progresivne ekspresije gena povezanih s diferencijacijom koštanih stanica.— S tein, GS L ian, JB O wen, TA Relationship rasta stanica do regulacije tkivno specifične genske ekspresije tijekom diferencijacije osteoblasta. FASEB J. 4: 3111-3123 1990.


MATERIJALI I METODE

Obrada i analiza podataka

Za svaki kompendij izraza (HBI [GEO pristupni broj <"type":"entrez-geo","attrs":<"text":"GSE7307","term_id":"7307">> GSE7307], expO [GEO Pristupni broj <"type":"entrez-geo","attrs":<"text":"GSE2109","term_id":"2109">> GSE2109] i CCLE [www.broadinstitute.org/ccle] ), Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 nizovi su normalizirani s robusnim prosjekom višestrukih nizova (RMA) korištenjem affy paketa tvrtke Bioconductor (www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/affy.html) i Entrez Gene (www.ncbi .nlm.nih.gov/gene) ID prilagođenih definicija sonde kako je prethodno definirano ( Dai etਊl., 2005.). Vrijednosti RMA odabranih gena naknadno su srednje centrirane i hijerarhijski grupirane (na temelju necentrirane korelacije i prosječne povezanosti) koristeći Cluster 3.0 (de Hoon etਊl., 2004.) i vizualizirano s Java TreeView (Saldanha, 2004.). Grafičke analize glavnih komponenti dale su slične rezultate kao i hijerarhijsko grupiranje (neobjavljeni podaci).

Za studiju staničnog ciklusa (Grant etਊl., 2013.), obrađeni omjeri niza oligonukleotida cijelog ljudskog genoma Agilenta (uzorak/referenca) preuzeti su iz dopunske tablice S1. Profili odabranih gena razvrstani su prema vrijednostima arctan2, kako je navedeno u tablici.

Za TCGA podatke o invazivnom karcinomu dojke, obrađeni Agilentovi podaci o ekspresiji (razina 3) za podudaranje normalnih i tumorskih parova (ID-ovi uzorka dati su u tablici 1) preuzeti su s podatkovnog portala TCGA (https://tcga-data.nci.nih). gov). Za svaki uzorak raka, log2 omjeri odabranih gena izračunati su u odnosu na odgovarajući normalni uzorak, a toplinska karta je napravljena kako je opisano.

STOL 1:

TCGA uzorci tumoraTCGA normalni uzorci
TCGA-A7-A13E-01A-11R-A12P-07TCGA-A7-A13E-11A-61R-A12P-07
TCGA-A7-A13F-01A-11R-A12P-07TCGA-A7-A13F-11A-42R-A12P-07
TCGA-BH-A0AU-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0AU-11A-11R-A12P-07
TCGA-BH-A0B5-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0B5-11A-23R-A12P-07
TCGA-BH-A0BS-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0BS-11A-11R-A12P-07
TCGA-BH-A0BZ-01A-31R-A12P-07TCGA-BH-A0BZ-11A-61R-A12P-07
TCGA-BH-A0C3-01A-21R-A12P-07TCGA-BH-A0C3-11A-23R-A12P-07
TCGA-BH-A0DD-01A-31R-A12P-07TCGA-BH-A0DD-11A-23R-A12P-07
TCGA-BH-A0DT-01A-21R-A12D-07TCGA-BH-A0DT-11A-12R-A12D-07
TCGA-BH-A0HA-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0HA-11A-31R-A12P-07
TCGA-BH-A18J-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18J-11A-31R-A12D-07
TCGA-BH-A18K-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18K-11A-13R-A12D-07
TCGA-BH-A18L-01A-32R-A12D-07TCGA-BH-A18L-11A-42R-A12D-07
TCGA-BH-A18M-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18M-11A-33R-A12D-07
TCGA-BH-A18N-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18N-11A-43R-A12D-07
TCGA-BH-A18P-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18P-11A-43R-A12D-07
TCGA-BH-A18Q-01A-12R-A12D-07TCGA-BH-A18Q-11A-34R-A12D-07
TCGA-BH-A18R-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18R-11A-42R-A12D-07
TCGA-BH-A18S-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18S-11A-43R-A12D-07
TCGA-BH-A18U-01A-21R-A12D-07TCGA-BH-A18U-11A-23R-A12D-07
TCGA-BH-A18V-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18V-11A-52R-A12D-07
TCGA-BH-A1EO-01A-11R-A137-07TCGA-BH-A1EO-11A-31R-A137-07
TCGA-BH-A1EU-01A-11R-A137-07TCGA-BH-A1EU-11A-23R-A137-07
TCGA-E2-A153-01A-12R-A12D-07TCGA-E2-A153-11A-31R-A12D-07
TCGA-E2-A158-01A-11R-A12D-07TCGA-E2-A158-11A-22R-A12D-07
TCGA-E2-A15I-01A-21R-A137-07TCGA-E2-A15I-11A-32R-A137-07
TCGA-E2-A15M-01A-11R-A12D-07TCGA-E2-A15M-11A-22R-A12D-07
TCGA-E2-A1BC-01A-11R-A12P-07TCGA-E2-A1BC-11A-32R-A12P-07

Podskup expO uzoraka tumora također je uspoređen s normalnim kolegama u HBI kompendiju. Za svako uobičajeno HBI tkiva (bubreg, debelo crijevo, jetra, dojka, pluća, jajnik/maternica i prostata) izračunata je srednja razina ekspresije svakog gena u tom tkivu, a svaki expO uzorak tumora uspoređen je sa skupom odgovarajući normalni medijani. Toplinska karta je generirana kako je opisano.

Pearsonove korelacije izračunate su u R uspoređivanjem izraza (log2 omjeri) svakog gena u odnosu na svaki drugi gen u skupu podataka. Vrijednosti korelacije su zatim grupirane u Cluster3 i vizualizirane u Java TreeView, kako je opisano. Korelacije su sažete srednjom vrijednosti preko Fisherove transformacije.


Sadržaj

DCas9 Uredi

Cas9 Endonuclease Dead, također poznat kao mrtvi Cas9 ili dCas9, je mutantni oblik Cas9 čija je endonukleazna aktivnost uklonjena točkastim mutacijama u njegovim endonukleaznim domenama. Slično svom nemutiranom obliku, dCas9 se koristi u CRISPR sustavima zajedno s gRNA za ciljanje specifičnih gena ili nukleotida komplementarnih gRNA s PAM sekvencama koje omogućuju vezanje Cas9. Cas9 obično ima 2 domene endonukleaze nazvane RuvC i HNH domene. Točkaste mutacije D10A i H840A mijenjaju 2 važna ostatka za aktivnost endonukleaze što u konačnici rezultira njenom deaktivacijom. Iako dCas9 nema aktivnost endonukleaze, još uvijek je sposoban vezati se za svoju vodeću RNA i DNK lanac koji je cilj jer takvim vezanjem upravljaju druge domene. Samo to je često dovoljno za slabljenje, ako ne i izravnu blokadu transkripcije ciljanog gena, ako gRNA pozicionira dCas9 na način koji sprječava transkripcijski čimbenici i RNA polimerazu da pristupe DNA. Međutim, ova sposobnost vezanja DNA također se može iskoristiti za aktivaciju budući da dCas9 ima modificirane regije, tipično N i C kraj proteina, koje se mogu koristiti za pričvršćivanje aktivatora transkripcije. [2]

Vodič RNA Uredi

Mali vodič RNA (sgRNA), ili gRNA je RNA s oko 20 nukleotida koji se koriste za usmjeravanje Cas9 ili dCas9 na svoje mete. gRNA sadrže dvije glavne regije važne za CRISPR sustave: skele i razmaknice. Razmaknica ima nukleotide koji su komplementarni onima koji se nalaze na ciljnim genima, često u promotorskoj regiji. Područje skele odgovorno je za formiranje kompleksa s (d)Cas9. Zajedno vežu (d)Cas9 i usmjeravaju ga na gen(e) od interesa. Budući da se razmaknica gRNA može modificirati za bilo koju potencijalnu sekvencu, oni daju sustavima CRISPR mnogo veću fleksibilnost jer bilo koji geni i nukleotidi sa sekvencom komplementarnom razmakničkoj regiji mogu postati moguće mete. [2]

Transkripcijski aktivatori Uredi

Transkripcijski aktivatori su proteinske domene ili cijeli proteini povezani s dCas9 ili sgRNA koji pomažu u regrutiranju važnih kofaktora, kao i RNA polimeraze za transkripciju gena(ova) ciljanih od strane sustava. Da bi se protein napravio od gena koji ga kodira, RNA polimeraza mora napraviti RNA od DNK šablona gena tijekom procesa koji se zove transkripcija. Transkripcijski aktivatori imaju domenu za vezanje DNA i domenu za aktivaciju transkripcije. Aktivacijska domena može angažirati opće faktore transkripcije ili RNA polimerazu u sekvenciju gena. Aktivacijske domene također mogu funkcionirati olakšavanjem transkripcije zaustavljenim RNA polimerazama, a kod eukariota mogu djelovati na pomicanje nukleosoma na DNA ili modificiranje histona kako bi se povećala ekspresija gena. [3] Ovi se aktivatori mogu uvesti u sustav putem vezanja na dCas9 ili na sgRNA. Neki istraživači su primijetili da se opseg regulacije transkripcije može modulirati korištenjem više mjesta za pričvršćivanje aktivatora u jednom eksperimentu i korištenjem različitih varijacija i kombinacija aktivatora odjednom u danom eksperimentu ili uzorku. [4] [5] [6]

Izrazni sustav Uredi

Ekspresijski sustav je potreban za uvođenje gRNA i (d)Cas9 proteina u stanice od interesa. Tipično korištene opcije uključuju, ali nisu ograničene na plazmide i virusne vektore kao što je vektor adeno-asociranog virusa (AAV) ili vektor lentivirusa.

VP64-p65-Rta Uredi

VP64-p65-Rta, ili VPR, dCas9 aktivator stvoren je modificiranjem postojećeg aktivatora dCas9, u kojem je Vp64 transkripcijski aktivator spojen na C kraj dCas9. U dCas9-VPR proteinu, faktori transkripcije p65 i Rta dodani su na C kraj dCas9-Vp64. Stoga su sva tri transkripcijska faktora usmjerena na isti gen. Korištenje tri faktora transkripcije, za razliku od samo Vp64, rezultira povećanom ekspresijom ciljanih gena. Kada su različiti geni bili ciljani dCas9, svi su pokazali značajno veću ekspresiju s dCas9-VPR nego s dCas9-VP64. Također je pokazano da se dCas9-VPR može koristiti za povećanje ekspresije više gena unutar iste stanice stavljanjem više sgRNA u istu stanicu. [7] dCas9-VPR je korišten za aktiviranje gena za neurogenin 2 (link) i neurogene diferencijacije 1 (link), što je rezultiralo diferencijacijom induciranih pluripotentnih matičnih stanica u inducirane neurone. [7] Studija koja je uspoređivala aktivatore dCas9 otkrila je da su aktivatori VPR, SAM i Suntag najbolje radili s dCas9 kako bi povećali ekspresiju gena u različitim vrstama stanica voćnih mušica, miševa i ljudi. [8]

Sinergijski posrednik aktivacije Uredi

Kako bi se prevladalo ograničenje sustava aktivacije gena dCas9-VP64, razvijen je sustav dCas9-SAM koji uključuje više faktora transkripcije. Koristeći proteine ​​MS2, p65 i HSF1, dCas9-SAM sustav regrutira različite transkripcijske čimbenike koji rade sinergistički kako bi aktivirali gen od interesa.

Kako bi sakupio različite aktivatore transkripcije, dCas9-SAM sustav koristi modificiranu jednostruku vodeću RNA (sgRNA) koja ima vezna mjesta za MS2 protein. Ukosni aptameri su pričvršćeni na tetra petlju i petlju stabljike 2 sgRNA kako bi postali vezna mjesta za dimerizirane proteine ​​omotača MS2 bakteriofaga. Kako su ukosnice izložene izvan dCas9-sgRNA kompleksa, drugi transkripcijski čimbenici mogu se vezati na MS2 protein bez ometanja dCas9-sgRNA kompleksa. Dakle, MS2 protein je konstruiran tako da uključuje proteine ​​p65 i HSF1. Fuzijski protein MS2-p65-HSF1 stupa u interakciju s dCas9-VP64 kako bi angažirao više transkripcijskih čimbenika na promotoru ciljnih gena.

Koristeći dCas-SAM sustav, Zhang i sur. (2015.) uspješno su reaktivirali latentni HIV gen za prekomjernu ekspresiju virusnih proteina iz stanica domaćina HIV-a. [9] Bili su u stanju prekomjerno eksprimirati virusne proteine ​​kako bi pokrenuli apoptozu latentnih stanica HIV-1 zbog toksičnosti virusnih proteina. U drugom eksperimentu dCas-SAM sustava, Konermann i sur. (2015.) pronašli su gene u stanicama melanoma koji daju otpornost na BRAF inhibitor aktiviranjem gena kandidata putem dCas sustava. [6] Stoga se dCas9-SAM sustav može dalje koristiti za aktiviranje latentnih gena, razvoj genskih terapija i otkrivanje novih gena.

SunTag Edit

Sustav aktivatora SunTag koristi protein dCas9, koji je modificiran da bude povezan sa SunTag-om. SunTag je niz ponavljajućih polipeptida koji može regrutirati više kopija antitijela. Povezivanjem transkripcijskih čimbenika na antitijela, kompleks za aktiviranje SunTag dCas9 pojačava svoje regrutiranje transkripcijskih čimbenika. Kako bi vodio dCas9 protein do ciljanog gena, dCas9 SunTag sustav koristi sgRNA.

Tanenbaum i sur. (2014) zaslužni su za stvaranje dCas9 SunTag sustava. Za antitijela su koristili GCN4 antitijela koja su bila vezana na transkripcijski faktor VP64. Kako bi prenijeli protutijela u jezgre stanica, pričvrstili su NLS oznaku. Da bi se potvrdila nuklearna lokalizacija antitijela, u svrhu vizualizacije korišten je sfGFP. Stoga je GCN4-sfGFP-NLS-VP64 protein razvijen za interakciju s dCas SunTag sustavom. Protutijela su se uspješno vezala na SunTag polipeptide i aktivirala ciljni gen CXCR4 u K562 staničnim linijama. [10] U usporedbi s dCas9-VP64 aktivacijskim kompleksom, uspjeli su povećati ekspresiju gena CXCR4 5-25 puta veću u K562 staničnim linijama. Ne samo da je postojala veća prekomjerna ekspresija proteina CXCR4, već su i proteini CXCR4 bili aktivni za daljnje putovanje na testu migracije preko jažice. Dakle, dCas9-SunTag sustav se može koristiti za aktiviranje gena koji su latentno prisutni, kao što su geni virusa.

Aktivacijski sustav dCas9 omogućuje ekspresiju željenog gena ili više gena u istoj stanici. Moguće je proučavati gene uključene u određeni proces koristeći široki ekran genoma koji uključuje aktiviranje ekspresije gena. Ispitivanje koje sgRNA daju fenotip sugerira koji su geni uključeni u određeni put. Aktivacijski sustav dCas9 može se koristiti za kontrolu točno koje se stanice aktiviraju i u koje vrijeme dolazi do aktivacije. Napravljeni su dCas9 konstrukti koji uključuju fuzijski protein dCas9-aktivatora u prisutnosti svjetla ili kemikalija. Stanice se također mogu reprogramirati ili diferencirati iz jedne vrste stanice u drugu povećanjem ekspresije određenih gena važnih za stvaranje ili održavanje tipa stanice. [11]

Veća kontrola nad ekspresijom gena Uredi

Jedna istraživačka skupina koristila je sustav u kojem je dCas9 bio spojen s određenom domenom, C1B1. Kada plavo svjetlo obasjava stanicu, Cry2 domena se veže na C1B1. Cry2 domena je spojena s transkripcijskim aktivatorom, tako da plavo svjetlo cilja aktivator na mjesto gdje je vezan dCas9. Korištenje svjetla omogućuje veliku kontrolu nad time kada se ciljani gen aktivira. Uklanjanje svjetla iz stanice rezultira samo dCas9 koji ostaje na ciljnom genu, tako da se ekspresija ne povećava. Na taj je način sustav reverzibilan. [12] Sličan sustav razvijen je korištenjem kemijske kontrole. U ovom sustavu, dCas9 regrutira MS2 fuzijski protein koji sadrži domenu FKBP. U prisutnosti kemijskog RAP-a, FRB domena spojena na kompleks koji modificira kromatin veže se na FKBP. Kad god se RAP doda stanicama, specifični kromatin modifikatorski kompleks može biti usmjeren na gen. To omogućuje znanstvenicima da ispitaju kako specifične modifikacije kromatina utječu na ekspresiju gena. [13] Sustav dCAs9-VPR koristi se kao aktivator ciljajući ga na promotor gena uzvodno od kodirajuće regije. Studija je koristila različite sgRNA za ciljanje različitih dijelova gena, otkrivši da aktivator dCas9-VPR može djelovati kao aktivator ili represor, ovisno o mjestu na kojem se veže. U stanici, sgRNA ciljane na promotor mogu omogućiti dCas9-VPR da poveća ekspresiju, dok sgRNA ciljane na kodirajuću regiju gena rezultiraju smanjenjem ekspresije dCas9-VPR. [14]

Aktivacija cijelog genoma Uredi

Svestranost sgRNA omogućuje aktivatorima dCas9 da povećaju ekspresiju bilo kojeg gena unutar genoma organizma. To bi se moglo koristiti za povećanje ekspresije gena koji kodira protein ili transkribirane RNA. Rad je pokazao da se aktivacija cijelog genoma može koristiti za određivanje koji proteini su uključeni u posredovanu rezistenciju na određeni lijek. [6] Drugi je rad koristio aktivaciju dugih nekodirajućih RNA u cijelom genomu i primijetio da povećanje ekspresije određenih dugih nekodirajućih RNA daje otpornost na lijek vemurafenib. [15] U oba slučaja, stanice koje prežive lijek mogle bi se proučiti kako bi se utvrdilo koje sgRNA sadrže. To omogućuje istraživačima da odrede koji je gen aktiviran u svakoj preživjeloj stanici, što sugerira koji su geni važni za otpornost na taj lijek.

Upotreba u organizmima Uredi

Fuzija dCas9 s VP64, p65 i HSF1 (faktor toplinskog šoka 1) omogućila je istraživačima da ciljaju gene u Arabidopsis thaliana i povećaju transkripciju na sličnu razinu kao kada je sam gen umetnut u genom biljke. Za jedan od dva testirana gena, aktivator dCas9 mijenja broj i veličinu listova i čini da biljke bolje podnose sušu. Autori zaključuju da aktivator dCas9 može stvoriti fenotipove u biljkama koji su slični onima uočenim kada je transgen umetnut radi prekomjerne ekspresije. [16] Istraživači su koristili višestruke RNK za vođenje za ciljanje sustava aktivacije dCas9 na više gena u specifičnom soju miša u kojem se dCas9 može uključiti u specifičnim staničnim linijama koristeći Cre rekombinazni sustav. Znanstvenici su koristili ciljanje i povećanu ekspresiju nekoliko gena kako bi ispitali procese uključene u regeneraciju i karcinome jetre. [17]


Genetski inženjering za transgenezu biljaka

Surender Khatodia, S.M. Paul Khurana , u Omics Technologies i Bio-inženjering , 2018.

Sažetak

Genetski inženjering biljaka za izradu sustava proizvodnje rekombinantnih proteina za proizvodnju medicinskih i industrijskih spojeva od ljudske vrijednosti naziva se molekularno uzgoj biljaka. Korištenje biljaka kao bioreaktora za proizvodnju rekombinantnih proteina ima nekoliko prednosti, uključujući nisku cijenu uspostavljanja i skalabilnost biljaka i proizvoda koji se općenito smatraju sigurnima. Biljni lijekovi (PMP) već se proizvode komercijalno za neke bolesti kao što je Gaucherova bolest, a mnoga cjepiva iz biljaka su pod kliničkim ispitivanjima. Dvije glavne klase lijekova su u razvoju pomoću genetskog inženjeringa biljaka — Plantitijela i jestiva cjepiva. This chapter highlights the procedure of using plants as bioreactor for recombinant protein production through plants, increasing recombinant protein accumulation, commercial status of PMPs and chloroplast genome engineering.


Rasprava

A cell-based reporter system was established for demonstrating hammerhead and glmS ribozyme activity via the assessment of reporter protein production. The established E coli cells contained two foreign genes encoding EGFP-hDHFR reporter protein and RNaseJ1 ribonuclease enzyme. Initially, expression of the proteins was tested in single plasmid transformant or co-transformant cells. Highly variable growth and reporter production were observed in these transformants (Fig. 2b and Table S3) that reduced power to detect ribozyme activity. Plasmids impose a metabolic burden on transformed E coli owing to the expression of plasmid encoded genes and replication of plasmid DNA [29]. The overproduction of RNaseJ1 inhibits growth of the pRJ1 plasmid transformant (Fig. S1). RNaseJ1 functions as a 5′-3′ exonuclease enzyme which plays a pivotal role in B. subtilis RNA metabolism. Although RNaseJ1 is not present in E coli, it has some functional overlap with E coli RNaseE [30]. The overexpression of RNaseJ1 in E coli transformants carrying pRJ1 plasmid thus might have an impact on general RNA metabolism, affecting cell homeostasis and growth.

The degree of the metabolic load in plasmid transformants is also dependent on plasmid copy number and size [29]. Poor growth of co-transformants over-expressing RNaseJ1 (Fig. 2b) could also be exacerbated by the extra burden of carrying two plasmid types lacking segregation control. The reporter gene-expressing plasmids contain a pUC origin of replication, whereas the RNaseJ1-expressing plasmid contains a p15A origin of replication (Fig. 1). Plasmid copy numbers of these two replication systems are comparable [31]. However, the transformant population is heterogeneous owing to the unequal distribution of cellular components in cell division [32, 33], which is manifest as a bimodal distribution of plasmid copy number [31]. To mitigate metabolic burden, the heterologous genes were stably integrated via homologous recombination into the E coli kromosom. Previous studies have demonstrated that genome integration of foreign genes is superior to plasmid-based expression, in which the heterologous protein is expressed more stably and with less impact on growth [34,35,36]. In concordance with previous studies showing the benefit of gene integration, the growth of iRJ1 with integrated RNaseJ1 gene transformed with different reporter plasmids was more consistent compared with plasmid co-transformants, with only minor retardation in the induced condition (Fig. 4b). However, induction of RNaseJ1 expression in iRJ1 transformants had a small and unspecific effect on plasmid-expressed reporter signal such that it was not possible to demonstrate ribozyme activity (Fig. 4c). We do not know why ribozyme activity could not be demonstrated with plasmid-based reporters, but the combined metabolic burden of carrying reporter plasmids and expressing heterologous proteins may create a cellular condition in which RNaseJ1 is less active and/or mRNA is globally more stable.

In contrast to iRJ1 plasmid transformants, specific effects of upstream active ribozyme sequences on reporter activity were demonstrated in double integrants. However, the mean level of reporter protein for the +ara condition was less than two-fold different from the corresponding −ara condition (Fig. 5b). This suggests that the degradation of ribozyme-cleaved reporter RNA by RNaseJ1 has a modest effect on the level of reporter protein under the assay conditions used. Although degradation of ribozyme-cleaved RNA by RNaseJ1 is rapid in E coli [23], the reporter protein used in our assays may be stable owing to the EGFP moiety that has a half-life of more than 24 h in E coli [37]. The reporter protein signal could thus persist even after RNaseJ1-mediated mRNA degradation. Reporter protein stability can be reduced by fusing with a degron, or degradation tag for in vivo proteolysis. For example, C-terminal fusion of the ssrA peptide degron can direct fusion proteins for degradation by the endogenous ClpXP and ClpAP proteases, leading to rapid protein degradation in E coli [38]. The reporter protein with a shorter half-life will be beneficial for widening the dynamic range of the reporter assay. In addition, the ribozyme activity can be monitored in real time along with bacterial growth. As an alternative to protein reporters, turn-on fluorescent RNA reporters could be used [39]. RNA reporters expressed on the same RNA molecule as the ribozyme could give a better time-resolved signal of ribozyme activity, although extensive empirical testing may be required to establish a general ribozyme reporter system. Turn-on fluorescent RNA reporters are generally less bright and thus more difficult to quantify than fluorescent proteins [39], although their performance can be improved by flanking scaffolds, which act by stabilizing the in vivo folding of the RNA reporter [40]. However, scaffolded RNA reporters are more resistant to ribonucleases [40], which may interfere with the detection of ribozyme activity as RNaseJ1-mediated loss of reporter after ribozyme cleavage.

Using the double-integrant reporter system, we demonstrated the activities of the constitutively active (RzI) and cofactor-dependent (glmS) ribozyme. The latter was surprising as no exogenous cofactor was added in the assay, suggesting that the intracellular level of the glmS cofactor, GlcN6P, is sufficiently high for in vivo ribozyme activity. The level of GlcN6P in E coli varies from 0.062 to 9 mM, depending on the available carbon source [41]. This concentration range is sufficient to activate the glmS ribozyme in vitro [13]. In other cell types such as Saccharomyces cerevisiae yeast [42] and Plasmodium falciparum malaria parasite [43], the glmS ribozyme is inactive unless the intracellular GlcN6P level is increased by treatment with exogenous sugar that can be converted to GlcN6P. The glmS ribozyme cleaves more slowly in vitro than the hammerhead ribozyme at physiological concentrations (≈ 1 mM) of magnesium (glmS rate constant (Kops) < 1 min − 1 , [13, 44] hammerhead Kops > 1.2 min − 1 [7]), which could partly explain why the reduction of reporter in the induced condition is less for iglmS_iRJ1 than iRzI_iRJ1 (Fig. 5b). It would be interesting to test other classes of ribozymes for further comparison in our reporter system, including the rapidly cleaving twister ribozyme (twister Kops ≈ 1000 min − 1 , [10]).


4 DISKUSIJA

Planarians are extremely resilient to the perturbation of cell homeostasis processes, including traumatic events such as extensive tissue damage. Their sturdiness resides in the adaptive response of a plastic body where homeostatic processes are continuously adjusted by cross-talk between stem cells and differentiated body parts, which have been suggested to represent a global stem cell niche. 31 For these reasons, unbalancing regenerative and homeostatic performances of planarians is challenging. Accordingly, artificially altered gravity did not permanently perturb planarian regeneration even in extreme conditions. Indeed, animals were able to complete a functional regeneration, although we observed a reduced regenerative capability in head fragments following exposure to simulated hypergravity. Higher susceptibility of head fragments – with respect to tail fragments – to factors perturbing stem cell activity has been commonly demonstrated for these organisms. 58 This phenomenon is probably due to the lower number of stem cells spread in this part of the body, so that minimal variations in the number of neoblasts induce a more readily observable phenotype. In general terms, a reduction in the regeneration ability might owe to reduced cell proliferation and/or an increased cell death. These two biological phenomena are indeed finely regulated during planarian regeneration, both showing two waves of activity, that is, one early after cut and the other later. While apoptosis and proliferation share this biphasic pattern, their distribution in the body is opposite. For apoptosis, the early peak occurs near the wound surface, and the second one is dispersed throughout the body 59 the exact contrary occurs for proliferation, being mitotic cells accumulated under the growing blastema only in the second proliferation burst. 60 A maximal impact upon blastema growth is therefore expected in case of an increase in the first peak of apoptosis and of a decrease in the second peak of proliferation. Slight changes in the number of apoptotic or mitotic cells spread far from the regeneration site are unlikely to directly perturb blastema growth.

In all altered gravity conditions tested in this study, we monitored a reduction of the proliferative activity in the second peak, which is consistent with a reduced blastema growth. On the contrary, we monitored an increase in apoptotic cells under the wound surface in early regeneration only in artificial hypergravity conditions. In the RPM, the number of apoptotic cells localized below the wound is slightly reduced. This difference might be at the basis for the different effect upon blastema growth observed in microgravity versus hypergravity simulations. Indeed, in this latter case the combination of two adverse effects, that is a reduced proliferation at the blastema site and an increased apoptosis under the wound surface, might concur to the slight reduction of the blastema growth rate. We currently do not know which cells underwent apoptosis, but, as at the same time (6 h) at which we observed an increase in apoptosis, we also monitored a number of mitosis comparable to controls so, it is possible to hypothesize that this process preferentially affects post-mitotic cells. Accordingly, it has been demonstrated that the two regenerative apoptotic waves predominantly, if not exclusively, occurred in differentiated cells. 59 We can thus imagine that a first early consequence of hypergravity is the induction of cell-death processes: this is also in line with what we observed in intact animals, where an increment in TUNEL-positive cells was monitored after 24 h of 10 g exposure. Altered gravity is also known to influence cell determination and differentiation in different types of cells ( 22, 61-64 ), and it also has an effect on cell differentiation in planarians, a process that can be easily followed by studying differentiation towards the epidermal lineage, for which early and late molecular markers are available. 50 Obtained data show again an opposite effect of hypergravity and microgravity experiments. Indeed, a significant increase of NB-21.11.e-positive cells (marker for enhanced differentiation) was detectable after simulated hypergravity exposure, while its significant reduction was produced by artificial microgravity exposure indicating a possible demonstration of the gravity continuum paradigm. 65

Pre-treatment with CONPs rescued the negative impact of simulated altered gravity on the blastema growth, cell proliferation, apoptosis, and cell differentiation. We can assume that protective effect is due to internalized nanoparticles, as we extensively washed planarian before exposition to altered gravity conditions. Owing to concomitance on CONP crystalline surface of both Ce 4+ and Ce 3+ states, 40 CONPs show self-regenerating antioxidant properties and ROS-scavenger functions, resulting into anti-inflammatory activity. 66 Hence, CONPs have had several biomedical applications, and showed a protective role in disorders characterized by ROS overproduction. 67-69 Since several literature sources report on overproduction of ROS induced by altered gravity, 70-73 we hypothesize that oxidative unbalance might be the principal cellular stress at which planarian cells are exposed following altered gravity, despite additional concurrent causes cannot be ruled out. Thus, we speculate that upon hypergravity exposure cells experience an increase in ROS production, to which some respond activating a cell-death program. In turn, increases in cell death may influence the cellular homeostasis of the animal, inducing premature cell differentiation and perturbing activation of neoblasts and their subsequent accumulation to form a blastema. Further experiments will be necessary to validate our hypothesis.


Hands-on Activity Bacteria Transformation

Units serve as guides to a particular content or subject area. Nested under units are lessons (in purple) and hands-on activities (in blue).

Note that not all lessons and activities will exist under a unit, and instead may exist as "standalone" curriculum.

TE Newsletter

Sažetak

The Enterococcus faecalis bacterium lives in the human gut.

Engineering Connection

Bacteria are the most common organisms modified by genetic engineers due to the simple structures of bacteria cells compared to those of eukaryotic cells. Engineers are able to add genes to bacteria using recombinant plasmids, which enable the bacteria to produce the desired beneficial proteins. Students use a paper model to simulate this real-life process used by bio-technicians.

Ciljevi učenja

Nakon ove aktivnosti učenici bi trebali biti sposobni:

  • Model and describe the process used by engineers to modify the genome of bacteria.
  • Explain why bacteria are genetically modified more often than other organisms.
  • Discuss possible applications for genetically modified bacteria.

Educational Standards

Svaki TeachEngineering lesson or activity is correlated to one or more K-12 science, technology, engineering or math (STEM) educational standards.

All 100,000+ K-12 STEM standards covered in TeachEngineering are collected, maintained and packaged by the Achievement Standards Network (ASN), a project of D2L (www.achievementstandards.org).

In the ASN, standards are hierarchically structured: first by source npr., by state within source by type npr., science or mathematics within type by subtype, then by grade, itd.

NGSS: Next Generation Science Standards - Science

HS-LS1-1. Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. (Grades 9 - 12)

Do you agree with this alignment? Thanks for your feedback!

Alignment agreement: Thanks for your feedback!

Alignment agreement: Thanks for your feedback!

All cells contain genetic information in the form of DNA molecules. Genes are regions in the DNA that contain the instructions that code for the formation of proteins, which carry out most of the work of cells.

Alignment agreement: Thanks for your feedback!

Alignment agreement: Thanks for your feedback!

International Technology and Engineering Educators Association - Technology
  • Medical technologies include prevention and rehabilitation, vaccines and pharmaceuticals, medical and surgical procedures, genetic engineering, and the systems within which health is protected and maintained. (Grades 9 - 12) More Details

Do you agree with this alignment? Thanks for your feedback!

Do you agree with this alignment? Thanks for your feedback!

State Standards
Texas - Science
  • describe how techniques such as DNA fingerprinting, genetic modifications, and chromosomal analysis are used to study the genomes of organisms. (Grades 9 - 11) More Details

Do you agree with this alignment? Thanks for your feedback!

Popis materijala

  • škare
  • tape, 3 small pieces , one per group these represent plasmid DNA and mammal DNA containing the insulin gene helpful to print page 1 on different colored paper than page 2 , one per group , one per student
  • stapler (can be shared among groups)

Worksheets and Attachments

More Curriculum Like This

Students learn how engineers apply their understanding of DNA to manipulate specific genes to produce desired traits, and how engineers have used this practice to address current problems facing humanity. Students fill out a flow chart to list the methods to modify genes to create GMOs and example a.

As a class, students work through an example showing how DNA provides the "recipe" for making human body proteins. They see how the pattern of nucleotide bases (adenine, thymine, guanine, cytosine) forms the double helix ladder shape of DNA, and serves as the code for the steps required to make gene.

Students learn about mutations to both DNA and chromosomes, and uncontrolled changes to the genetic code. They are introduced to small-scale mutations (substitutions, deletions and insertions) and large-scale mutations (deletion duplications, inversions, insertions, translocations and nondisjunction.

Students reinforce their knowledge that DNA is the genetic material for all living things by modeling it using toothpicks and gumdrops that represent the four biochemicals (adenine, thiamine, guanine, and cytosine) that pair with each other in a specific pattern, making a double helix. Student teams.

Pred-Req znanja

A basic understanding of protein synthesis and DNA's role in the cell/body is helpful so students can follow how changes in DNA result in major changes in the characteristics of organisms.

Introduction/Motivation

How big are bacteria? (Answer: most are only a few micrometers. Micrometers are one millionth of a meter. 1 cm = 10,000 micrometers 1 mm = 1,000 micrometers) Bacteria are so small that most are less than one-tenth of the diameter of a human hair.

How many different species of bacteria exist? (Answer: Estimates vary from 10 million to 1 billion species.) So far, we have only discovered less than 10,000 different species, but some scientists estimate that as many as 1 billion different species of bacteria may exist on Earth! How prolific are bacteria? Bacteria are so plentiful that a 20-ounce bottle of water may contain up to 600 million bacteria!

Bacteria are everywhere, and most of the time they are harmless. In fact, many are beneficial to people because they are useful and necessary to a healthy human body and environment. What are some examples of these "good" bacteria? (Possible answers: E coli within the intestines of mammals, bacteria within the soil, bacteria used to make foods such as yogurt.) Without bacteria, we would not be able to digest food or produce some of our favorite foods such as yogurt and cheese. The bacteria we might generally call "bad" for us include those responsible for causing illnesses like food poisoning.

Do you think genetic engineers could use and modify bacteria for any purpose? (Answer: Yes) Bacteria are the most commonly modified organisms. Let's look at how we can modify these bacteria and why we would want to modify them.

Postupak

Bacteria can be adapted to produce a number of useful materials. Because of the simple structures of bacterial cells, they are the most commonly modified organisms. Many times, and in this activity, a gene is simply added to the bacteria, causing the bacteria to be able to produce a useful protein, such as insulin. Other changes to bacteria can reconfigure the cellular respiration product to create desirable byproducts such as diesel or plastic molecules instead of the usual byproduct, such as carbon dioxide.

The common method used for genetically modifying bacteria is to use recombinant plasmids. Plasmids are circular pieces of DNA when placed near bacteria, the plasmid is absorbed and incorporated into the bacterial cell. Once inside the bacteria, the plasmid is treated the same as the bacteria's original DNA. This means that the bacteria will use this new DNA from the plasmid to create proteins, and the plasmid will be replicated when the cell divides.

The process of creating genetically modified bacteria used in this activity is one of the simplest methods. First, a desired gene must be selected from some (any) organism, that is, the gene that codes for the creation of insulin protein, and removed from the DNA of that organism. Genes are removed using restriction enzymes. These enzymes search for specific nucleotide sequences in the DNA, called recognition sites, where they "cut" the DNA by breaking certain bonds. When the bonds are broken in a staggered manner it creates "sticky ends." If the enzyme breaks the bond to create a straight cut, the ends are called "blunt ends." The next step is to use the same restriction enzyme to cut open the plasmid.

The isolated gene is now placed where the plasmid was cut, and they are bonded together using another enzyme called ligase. Now a recombinant plasmid has been produced. The final step is to get the plasmid into a bacteria cell. Sometimes simply placing the bacteria in the correct environment is enough to artificially induce the bacteria to intake the recombinant DNA, otherwise some special method may be required if the plasmid is too large to cross the bacteria's cell membrane. Figure 1.shows a diagram of the entire process. Figure 1. The process to build a recombinant plasmid to modify bacteria.

  • Gather materials and make copies of the Modeling Bacteria Transformation Worksheet, one per group, and Assessment Questions, one per person.
  • Make copies of the DNA Sequences for Cut-Outs, one per group it is helpful if the plasmid DNAs (page 1) are printed on different colored paper from the mammal DNAs (page 2) to help distinguish them during the activity. Then cut the DNA sequences into strips.
  • If time is short, tape the cut-out plasmid DNA into circles with the DNA sequence facing outward. Otherwise, have students do this in step 2.

  1. Divide the class into groups of two students each. Hand out to each group a worksheet and its two strips of DNA sequences, pointing out which will be used to create the plasmid, and which is the mammal DNA containing the insulin gene.
  2. Direct groups to tape together the ends of the plasmid DNA to form a circular piece of DNA (see Figure 2) so that the printed sequence is visible on the outside of the plasmid. This is the initial plasmid that will be modified with the insulin gene. Figure 2. Illustration of the circular DNA created in step 2.


Gledaj video: Geenin siirto kasviin (Svibanj 2022).