Informacija

Koja je minimalna duljina potrebna za kružnu ligaciju DNK?

Koja je minimalna duljina potrebna za kružnu ligaciju DNK?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Koja je minimalna duljina molekule DNK da bi krajevi došli u dovoljno blizak kontakt da se mogu vezati. Pretpostavimo da se u otopini nalaze slobodni dvovalentni kationi. Ima li tko kakvu ideju?


Naišao sam na ovaj rad koji pokazuje da je između 150-200 parova baza.

Fleksibilnost DNK proučavana kovalentnim zatvaranjem kratkih fragmenata u krugove D Shore, J Langowski i R L Baldwin PNAS 1981. 78 (8) 4833-4837

http://www.pnas.org/content/78/8/4833.full.pdf


Ljudska citomegalovirusna terminaza pUL89 pune duljine usvaja strukturu s dvije domene specifičnu za pakiranje DNK

Ključni korak u replikaciji humanog citomegalovirusa (HCMV) u stanici domaćinu je stvaranje i pakiranje genoma jedinične duljine u prethodno oblikovane kapside. Enzimi uključeni u ovaj proces su terminaze. HCMV terminazni kompleks sastoji se od dvije terminazne podjedinice, ATPaze pUL56 i nukleaze pUL89. Predložena je potencijalna treća komponenta pUL51. Iako se pokazalo da je podjedinica terminaze pUL89 ključna za pakiranje DNA i interakciju s pUL56, nije poznato kako pUL89 mehanički postiže vezanje i odrezivanje DNA specifično za sekvencu. Kako bi se identificirale esencijalne domene i invarijantne aminokiseline u odnosu na aktivnost nukleaze i vezanje DNA, analizirane su alaninske supstitucije predviđenih motiva. Analize su pokazale da je aspartat 463 invarijantna aminokiselina za aktivnost nukleaze, dok je argin 544 invarijantna aa za vezanje DNA. Strukturna analiza rekombinantnog proteina korištenjem elektronske mikroskopije u kombinaciji s analizom jedne čestice otkrila je zakrivljeni monomer s dvije različite domene povezane tanjim područjem nalik šarkama koje se dobro slaže s predviđenom strukturom. Ovi rezultati nam omogućuju da modeliramo kako struktura podjedinice terminaze pUL89 može posredovati u njezinoj funkciji.


Istaknuti video

Izbjegavanje kontaminacije RNase

SplintR ligaza, također poznata kao PBCV-1 DNA ligaza ili Chlorella DNA ligaza virusa, učinkovito katalizira ligaciju susjedne, jednolančane DNA spojene komplementarnim RNA lancem. Ova prethodno neprijavljena aktivnost može omogućiti nove pristupe karakterizaciji miRNA i mRNA, uključujući SNP. SplintR je idealno prikladan za mnoge tijekove rada obogaćivanja cilja s primjenama u sekvenciranju sljedeće generacije i molekularnoj dijagnostici. Snažna aktivnost enzima i njegov afinitet za RNA-udvojene DNA supstrate (prividni Km = 1 nM) omogućuju sub-nanomolarnu detekciju jedinstvenih RNA vrsta unutar složene smjese, čineći SplintR ligazu vrhunskim izborom za zahtjevne tehnologije detekcije RNA.

Enzim je aktivan u širokom rasponu koncentracija ATP-a (10 µM &ndash 1 mM) i pH (6,5&ndash9). Optimalna aktivnost je opažena upotrebom Mg 2+ > 5 mM, i pH između 7,5 i 8,0. Aktivnost se pojačava na višim temperaturama (do 37°C), te dodavanjem 5 mM Mn 2+. Reakcija je inhibirana koncentracijama soli većim od 100 mM.

Enzim tolerira sve kombinacije parova baza na spoju ligacije, ali ga djelomično inhibiraju dC/G i dG/C parovi baza na spoju ligacije na donorskoj (fosforiliranoj) strani, osobito kada je baza + 2 također bila C/G bazni par .

Ligacija DNA slinirane RNA
(A) Pregled testa ligacije: 5´-fosforilated, 3´-FAM obilježen DNA &ldquodonor&rdquo oligonukleotid i nemodificirani DNA &ldquoacceptor&rdquo oligonukleotid su spojeni na RNA. Ovaj supstrat reagira s ligazom da nastane smjesa neizreagiranog početnog materijala (I), adeniliranog DNA (II) i ligiranog produkta (III). Ti se produkti denaturiraju, odvajaju kapilarnom elektroforezom i detektiraju fluorescencijom. (B) Ligacija RNA-splinted supstrata u SplintR ligaznom reakcijskom puferu tijekom 15 minuta na 25°C s (a) bez enzima, (b) 1 &muM T4 DNA ligaze i (c) 100 nM SplintR ligaze. Navedeni vrhovi odgovaraju početnoj pDNA (I), AppDNA (II) i ligiranom produktu (III) kako je određeno koeluiranjem sa sintetički pripremljenim standardima. (C) Frakcija ligiranog produkta kataliziranog ili SplintR ligazom ili T4 DNA ligazom analizirana je izvođenjem niza ligacija s obje ligaze u koncentracijama između 10 pM i 10 µM tijekom 15 minuta na 25°C. SplintR ligaza je očito mnogo učinkovitija u vezivanju RNA urezane DNA od T4 DNA ligaze.

Izvor proizvoda

Isporučeni reagensi

Uz ovaj proizvod se isporučuju sljedeći reagensi:

SplintR® ligaza M0375SVIAL -20 1 x 0,05 ml 25 000 jedinica/ml
SplintR ligazni reakcijski pufer B0375SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
SplintR® ligaza M0375LVIAL -20 1 x 0,25 ml 25 000 jedinica/ml
SplintR ligazni reakcijski pufer B0375SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

Značajke

Značajke aplikacije

  • Ligacija ssDNA splintirane komplementarnim RNA sekvencama
  • Detekcija RNA pomoću ligacije DNA sondi
  • SNP ili otkrivanje varijante spajanja
  • RASL-sljed

Definicija jedinice

Jedna jedinica je definirana kao količina enzima potrebna za ligiranje (do 50% završetka) 2 pikomola tripartitnog FAM-obilježenog hibridnog supstrata DNA:RNA u reakciji od 20 µm na 25°C u 15 minuta u 1X SplintR ligaznom reakcijskom puferu.

1X SplintR ligazni reakcijski pufer
50 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
1 mM ATP
10 mM DTT
pH 7,5 pri 25°C

Međuspremnik za pohranu

10 mM Tris-HCl
300 mM NaCl
1 mM DTT
0,1 mM EDTA
50% glicerol
pH 7,4 pri 25°C

Inaktivacija topline

  1. SplintR ligazu inhibiraju monovalentni kationi. Izričito preporučujemo da se ti uobičajeni reaktanti (NaCl, KCl) održavaju ispod 50 mM u reakciji. Enzim se isporučuje u puferu za skladištenje koji sadrži 300 mM NaCl, radi stabilnosti skladištenja. Preporuča se minimalno 6-struko razrjeđivanje enzima dodavanjem u reakciju, pri čemu je optimalno razrjeđivanje &ge 10-struko.
  2. Ako je za pohranu potrebno razrjeđivanje enzima, preporučujemo korištenje razrjeđivača A (NEB #B8001).
  3. Reakcije sa SplintR-om treba izvesti između 16&ndash37°C. Preporučujemo da se početna ispitivanja provedu na 25°C.
  4. Enzim se isporučuje kao otopina od 10,5 µM. Predlažemo održavanje enzima ispod 1 µM u reakciji s predloženim rasponom od 100 nM do 1 µM. Za mnoge primjene idealan je početak s 2-strukim viškom enzima na krajevima koji se mogu ligirati. Na primjer, u eksperimentu opisanom na priloženoj slici utvrđeno je da je koncentracija supstrata od 100 nM idealna. U tom tijeku rada, 250 nM enzima dao je potpunu ligaciju za 15 minuta na svim testiranim sekvencama.
  5. Ako se reakcija ne odvija tako učinkovito kako bi se željelo, snažno preporučamo produljenje vremena inkubacije umjesto povećanja koncentracije enzima u reakciji iznad 1 µM.
  6. Alternativna opcija za neposlušne supstrate je korištenje niske koncentracije ATP-a. Nizak ATP pufer može dati veće prinose produkta ligacije za supstrate koji imaju nisku učinkovitost ligacije u standardnom SplintR ligaznom reakcijskom puferu, kao što su supstrati s parovima G:C baza na spoju ligacije. Predlažemo 1X reakcijski pufer T4 RNA ligaze (NEB #B0216) dopunjen s ATP-om (NEB #P0756) do konačne koncentracije od 10 µM.
  7. Preporučamo RNA udlagu od najmanje 20 komplementarnih baza. Otkrili smo da je 10 bp dsDNA/RNA s obje strane spoja dovoljno za sve testirane supstrate. Međutim, udlaga ne mora biti centrirana na spoju ligacije, sa samo četiri baze na jednoj strani spoja što daje potpunu ligaciju za udlagu s 20 baza ukupne komplementarnosti, ovisno o slijedu supstrata. Ako su poželjna područja preklapanja <10 bp, bit će potrebna neka testiranja kako bi se odredila minimalna duljina ds regije za vašu specifičnu sekvencu.
  8. Kako bi se maksimizirala vjernost ligacija pomoću SplintR DNA ligaze, razmotrite sljedeće:


Rezultati

Formiranje nareza koji se može ligirati zahtijeva aktivnost egzonukleaze POLγA

Egzonukleazna aktivnost POLγ može se inaktivirati jednom zamjenom aminokiselina u drugom motivu egzonukleaze u podjedinici POLγA (D274A, u daljnjem tekstu „EXO-”) 29 . EXO-mutacija uzrokuje aktivnost pomicanja lanaca, to jest, polimeraza nastavlja istiskivati ​​nizvodno DNA na koju se susreće tijekom sinteze DNA 15,22. Nagađali smo da bi neuspjeh zastoja na 5′-kraju nizvodne DNK doveo do stvaranja 5′-preklopa, što je nespojivo s podvezivanjem. Da bismo odgovorili na ovu mogućnost, koristili smo linearni supstrat s jednolančanim razmakom od 20 nt i istražili kako se aktivno sintetizirajući WT i EXO-POLγ ponašaju kada naiđu na slobodni kraj 5′-DNA. Korišteni šablon je konstruiran od 80-nt dugog oligonukleotida žarenog na 30-nt radioaktivno obilježenog uzvodnog primera i 30-nt nizvodnog blokirajućeg oligonukleotida (slika 1a). Precizno popunjavanje praznina i stvaranje spojnih krajeva produžit će temeljni premaz na 50 nt. U ranim vremenskim točkama (1-3 min), WT POLγ se nije zaustavio na 5′-kraju nizvodnog blokirajućeg prajmera, već se proširio do 6 nt u dupleksnu regiju (slika 1b). Nakon 5 minuta, vrpce na pozicijama 50-52 postale su dominantna vrsta, što sugerira da se POLγ povukao prema nisku. EXO-POLγ se ponašao slično kao WT u najranijoj vremenskoj točki, ali kasnije je enzim nastavio polimerizirati u dvolančanu regiju, na kraju potpuno istisnuvši nizvodni lanac kako bi proizveo glavni proizvod od 81 nts duljine za 5 minuta (slika 1b , trake 13–15). Imajte na umu da dodatni nukleotid (predložak je dugačak samo 80 nt) proizlazi iz terminalne aktivnosti transferaze EXO-POLγ (prikazano na dodatnoj slici 1).

(a) Dijagram supstrata s linearnim razmakom koji se koristi u testovima pomicanja niti, s proizvodima prikazanim u nastavku. (b) Pomicanje niti za WT i EXO-POLγ tijekom vremena. WT polimeraza izvodi ograničeno pomicanje niti, do 6 nt unutar nizvodne dupleks regije, prije nego što se povuče prema nick poziciji (vrh strelice na 50 nt). EXO-polimeraza brzo potpuno istiskuje nizvodni oligonukleotid (vrh strelice na 81 nt). Reakcije su započele dodatkom POLγ. Vremenske točke su gore navedene u minutama (− predstavlja reakcije u kojima nije dodan POLγ). MM, molekularni marker.

Za daljnju analizu pomaka niti, koristili smo isti supstrat, ali sada označen oligonukleotidom nizvodno (dopunska slika 2). Potvrđujući gornje rezultate, uočili smo povećani pomak niti s EXO-POLγ u usporedbi s WT POLγ u svim vremenskim točkama. Do 30 minuta sinteze DNA, gotovo 50% nizvodnog oligonukleotida potpuno je istisnuto EXO-POLγ u usporedbi s <5% za WT POLγ. Stoga smo zaključili da je aktivnost egzonukleaze POLγ potrebna za ograničavanje aktivnosti pomicanja POLγ lanaca i za promicanje praznog hoda u blizini izrezane pozicije.

Učinkovita ligacija DNA zahtijeva aktivnost POLγ egzonukleaze

Pretpostavili smo da bi aberantna tvorba 5′-preklopa EXO-POLγ narušila ligaciju. Da bismo istražili ovu mogućnost, proveli smo sintezu spojene DNA i testove ligacije korištenjem pročišćenih rekombinantnih proteina WT i EXO-POLγ na DNA supstratima. U tu svrhu, pripremili smo ∼ 3-kb kružni ssDNA supstrat s 32-nt DNA oligonukleotidom koji je radioaktivno obilježen na 5′-terminusu (slika 2a). WT POLγ je bio u stanju polimerizirati sve dok nije dosegao 5′-kraj prajmera, stvarajući izrezanu, kružnu molekulu dsDNA (slika 2a, sredina i slika 2b, traka 2). Kada je dodana ligaza, urez je zapečaćen (slika 2a, desno i slika 2b, traka 3). EXO-mutant je također mogao proizvesti dvolančani proizvod punog kruga (slika 2b, traka 4), ali nije generirao krajeve koji se mogu ligirati, jer nisu uočene zatvorene kružne molekule DNA (slika 2b, traka 5).

(a) Dijagram kružnog supstrata i rezultirajućih proizvoda u replikacijskim spregnutim reakcijama ligacije. (b) POLγ treba funkcionalnu aktivnost 3′–5′eksonukleaze za proizvodnju zatvorene kružne molekule DNA. U spojenom drugom lancu, test sinteze i ligacije WT (traka 3), ali ne EXO- (traka 5) može formirati ligirani proizvod. Prisutnost EtBr u agaroznom gelu olakšava diferencijaciju između izrezanih i zatvorenih kružnih molekula dsDNA. (c) Dijagram supstrata s linearnim razmakom i rezultirajućih proizvoda u replikacijskim spregnutim reakcijama ligacije. (d) Ligacija (proizvod od 80 nt, označen glavom strelice) je ozbiljno smanjen u reakcijama korištenjem EXO- u usporedbi s WT POLγ. Molekularni marker u stazi 1. (e) Kvantifikacija učinkovitosti ligacije izmjerena je kao količina formiranog produkta ligacije (trake označene strelicom) u odnosu na količinu početnog supstrata u odsutnosti ligaze (traka 3). WT je postavljen na 100%. Srednje vrijednosti±s.e.m., n=3, P≤2,5 × 10 −3 (učenik je nesparen t-test).

Zatim smo istražili spajanje popunjavanja praznina i ligaciju DNA koristeći supstrat u kojem su 30-nt neobilježeni uzvodni prajmer i 30-nt radioaktivno obilježen nizvodno blokirajući oligonukleotid žareni na 80-nt dugu nit šablone (slika 2c). Dodavanje WT POLγ ili EXO- u prisutnosti mtSSB i T4 DNA ligaze dovelo je do stvaranja 80-nt dugog ligiranog proizvoda (slika 2d, staze 6 i 8). Učinkovitost ligacije je međutim bila oko deset puta veća za WT POLγ nego za EXO- (slika 2e). Test je ponovljen s mitohondrijskim Lig3 sa sličnim rezultatima (dopunska slika 3). Stoga bismo mogli zaključiti da je egzonukleazna aktivnost POLγ potrebna za učinkovitu ligaciju DNA in vitro.

Identifikacija POLγ s nedostatkom egzonukleaze kod pacijenata

Brojne supstitucije aminokiselina koje uzrokuju bolest identificirane su u domeni egzonukleaze POLγ 31 i željeli smo istražiti jesu li te mutacije također utjecale na aktivnost egzonukleaze i formiranje ligiranih krajeva. U tu svrhu ekspresirali smo i pročistili sedam mutiranih POLγA varijanti u rekombinantnom obliku (R232H, G268A, R275Q, H277L, G303R, L304R i S305R (slika 3a)). Prvo smo istražili aktivnost mutanata vezanja DNA u testu elektroforetskog pomaka mobilnosti (EMSA), u kojem je POLγA inkubiran zajedno s kratkim, radioaktivno obilježenim primarnim DNA šablonom. U nedostatku POLγB, svi mutanti R275Q, G303R, L304R i S305R pokazali su smanjeni afinitet vezanja DNA u usporedbi s WT POLγ (slika 3b). Međutim, u kombinaciji s POLγB, svi su mutanti bili u stanju vezati DNA (slika 3b) i sintetizirati kratki dio DNA s učinkovitošću sličnom onoj uočenoj za WT POLγ (dopunska slika 4).

(a) Shematski dijagram domene egzonukleaze POLγA i položaj mutacija povezanih s pacijentom. EXO-mutacija D274A označena je sivom bojom. Crne kutije predstavljaju motive egzonukleaze I, II i III. (b) Učinkovitost vezanja DNA POLγA mutanata testirana je na pripremljenom predlošku ili kao monomeri ili heterotrimeri s POLγB (kao što je ilustrirano na lijevoj strani). Mutanti R275Q, G303R, L304R i S305R imali su značajno smanjenu aktivnost vezanja monomera. (c) Slično EXO-POLγ, mutanti G303R, L304R i S305R nemaju vidljivu aktivnost egzonukleaze. R232H ima povećanu aktivnost egzonukleaze u usporedbi s WT. Supstrat je prikazan u donjem desnom kvadrantu. (d) Polimerizacija DNA pomoću različitih POLγ proteina na kružnom šablonu ssDNA od 3000 nt (kao što je prikazano u donjem desnom kvadrantu). Stope sinteze su umjereno sporije za mutante R232H i R275Q, a značajno su ugrožene za proteine ​​G303R, L304R i S305R.

Zatim smo pratili aktivnost egzonukleaze korištenjem radioaktivno označenog oligonukleotida dužine 32 nt žarenog na pBluescript SK+ ssDNA, stvarajući dvolančanu regiju od 31 bp s neusklađenošću jednog nukleotida na 3′-kraju (donja desna ploča na slici 3c ). Predložak je inkubiran s WT i mutantnim POLγ varijantama tijekom naznačenih vremena. Od sedam proteina, G303R, L304R i S305R pokazali su ozbiljan nedostatak egzonukleaze, sličan EXO-mutantnom proteinu, dok su mutanti G268A i R275Q imali blago oslabljenu aktivnost egzonukleaze. Zanimljivo je da smo također pronašli mutaciju, R232H, koja je značajno povećala aktivnost egzonukleaze u usporedbi s WT. Slični rezultati za aktivnost egzonukleaze također su dobiveni za sve mutante korištenjem 5'-obilježenog supstrata temeljnog predloška u odsutnosti dNTP-a (dopunska slika 4, staze s 0 μM dNTP-a).

Učinkovitost sinteze DNA na dužem supstratu

Da bismo istražili mogu li naši POLγ mutanti sintetizirati duže dijelove DNA, koristili smo ∼ 3000-nt kružni ssDNA šablon opisan gore (slika 2a). Slično WT POLγ, mutanti EXO-, G268A i H277L proizveli su proizvode pune duljine unutar 5 minuta (slika 3d, usporedite trake 2, 7, 17 i 22). Uočili smo smanjenu polimerizaciju za mutante R232H i R275Q, a još slabiju aktivnost kod G303R, L304R i S305R. Mutanti L304R i S305R uspjeli su proizvesti produkt pune duljine tek nakon 30 min inkubacije (slika 3d, staze 30 i 45), dok kod mutanta G303R nisu uočeni proizvodi pune duljine (slika 3d, traka 40).

Aktivnosti pomicanja niti POLγ mutanata

Dok je aktivnost pomicanja lanaca EXO-polimeraze bila jasno vidljiva u dugotrajnom testu sinteze DNA (slika 3d, razmaz iznad glavnog proizvoda u stazama 8-10), nismo mogli vidjeti sličan učinak za mutante koji uzrokuju bolest . Odlučili smo dodatno analizirati aktivnosti pomicanja lanaca različitih mutantnih polimeraza tijekom vremena, koristeći linearnu razmaknutu podlogu (prikazano na slici 1a). Precizno popunjavanje praznina rezultirat će pojasom od 50 nt, dok će pomicanje niti generirati proizvode do 80 nt. Koristeći ovaj predložak, niti jedan od mutantnih proteina povezanih s pacijentom nije imao tako ozbiljne aktivnosti pomicanja niti kao EXO- (slika 4a). Međutim, primijetili smo da su tri mutanta, L304R, G303R i S305R, generirala pojaseve od oko 50 nt koji su izgledali širi od odgovarajućeg pojasa koji je generirao WT (slika 4a, usporedite trake 4-6 s 34-36, 46-48 i 52 –54), što bi moglo biti rezultat ulaska u dupleks područje i stvaranja kratkog 5′-preklopa. Kako bismo odgovorili na ovu mogućnost, koristili smo gelove za sekvenciranje za povećanu rezoluciju (slika 4b). U ovoj analizi, primijetili smo zastoj na poziciji 50-56 (to jest, na nicku ili 1-6 nt unutar nizvodne regije dsDNA). U skladu sa svojom povećanom aktivnošću egzonukleaze, mutant R232H pokazao je smanjenu aktivnost pomicanja niti, zastajkujući na mjestu (slika 4b, usporedite staze 2-3 sa 6-7). Mutanti H277L, G268A i R275Q ponašali su se slično kao WT POLγ pauziranjem na nick poziciji ili 1-2 nt nizvodno. Preostala tri mutanta, L304R, G303R i S305R (trake 12-13, 16-19), zaustavila su se u širem rasponu unutar regije nizvodne dsDNA, stvarajući duže 5'-preklope.

(a) Vremenski tijek pomicanja lanca pročišćenim rekombinantnim WT i mutantnim POLγ proteinima. Reakcije su izvedene kao što je prikazano na slici 1a. Strelice: pune linije označavaju popunjavanje praznina isprekidane linije označavaju pomak pramenova. Trake su označene brojevima 1-54. (b) Reakcije pomicanja lanaca kao što je gore razriješeno na gelu za sekvenciranje. Očigledan je neuspjeh G303R, L304R i S305R da se vrate na poziciju nicka u vremenskoj točki od 10 minuta (vrh strelice na 50 nt). Veličine oligonukleotidnog molekularnog markera označene su lijevo. (c) Kvantifikacija učinkovitosti ligacije (proizvod ligacije formiran kao postotak supstrata) različitih POLγ proteina u odnosu na WT. Test ligacije i kvantifikacija izvedeni su kao na slici 2c–e. Srednje vrijednosti±s.e.m., WT je postavljen na 100%, zvjezdice predstavljaju značajne razlike u usporedbi s WT (n=3 *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0,001 jednosmjerna analiza varijance).

POLγ mutacije utječu na ligaciju vezanu uz replikaciju

Tako su tri istraživana mutanta pokazala povećani pomak lanca (L304R, G303R i S305R), dok je jedan pokazao smanjeni pomak lanca (R232H) u usporedbi s WT. Istražili smo jesu li te mutacije također narušile ligaciju, kao što je pokazano za EXO-POLγ (slika 2). U tu svrhu, izveli smo testove spojene replikacije i ligacije na linearnom supstratu s razmakom kao što je prikazano na slici 2c,d. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka i količina ligiranih produkata je kvantificirana. Grafikon na slici 4c uspoređuje učinkovitost ligacije za različite mutante u odnosu na WT POLγ. Ligacija je ozbiljno smanjena s 5'-preklopom koji proizvode POLγ mutante (L304R, G303R i S305R). Nasuprot tome, R232H mutant sa smanjenom aktivnošću pomicanja lanaca bio je čak i bolji od WT POLγ u proizvodnji krajeva koji se mogu ligirati.

Povećane razine mtDNA ureza u staničnim linijama miša mutatora

Naše su studije pokazale da mutacije koje mijenjaju aktivnost egzonukleaze POLγ narušavaju ligaciju in vitro. Istražiti mogu li se i ti problemi otkriti in vivo, koristili smo mišje embrionalne fibroblaste (MEF) dobivene od miša mutatora. Ovi homozigotni knock-in miševi izražavaju EXO- (D257A) umjesto WT POLγ. Ako EXO-POLγ proizvodi 5′-preklope i ometa ligaciju in vivo, očekivali bismo da ćemo primijetiti višu razinu urezane mtDNA kod ovih životinja. Kako bismo odgovorili na ovu mogućnost, analizirali smo genomsku DNA izoliranu iz WT i mutatorskih MEF elektroforezom u agaroznom gelu i Southern blottingom. Analiza gela provedena je u prisutnosti ili odsutnosti etidijevog bromida (EtBr) kako bi se razlikovale izrezane i zatvorene kružne molekule dsDNA. U nedostatku EtBr u agaroznom gelu, mtDNA pune duljine iz WT i mutatorskih stanica migrirala je kao jedna traka jednake veličine. Kao što se očekivalo, DNA izolirana iz mutatorskih stanica također je sadržavala kraći, linearni fragment DNA, koji je detektiran samo sondom protiv glavnog luka mtDNA (slika 5a). U prisutnosti EtBr, mtDNA pune duljine mogla bi se razdvojiti u zatvorene ili izrezane krugove, koji ne mogu formirati superzavojnice u prisutnosti EtBr. Dok je većina mtDNA molekula izoliranih iz WT stanica bila u zatvorenoj konformaciji, suprotno je vrijedilo za mtDNA izoliranu iz mutatorskih stanica, koje su uglavnom sadržavale izrezane krugove. Kao kontrole, kako bi se provjerio obrazac migracije zatvorenih i izrezanih oblika mtDNA, DNK je izrezana različitim restrikcijskim enzimima (dopunska slika 5). Stoga bismo mogli zaključiti da POLγ s nedostatkom egzonukleaze uzrokuje stvaranje ureza in vivo.

(a) MtDNA je analizirana na 0,4% agaroznom gelu u odsutnosti (lijeva ploča) ili prisutnosti (desna ploča) EtBr. Prisutnost EtBr u agaroznom gelu olakšava diferencijaciju između izrezanih i zatvorenih kružnih molekula dsDNA. MtDNA je detektirana Southern blotingom korištenjem sondi protiv glavnog ili manjeg luka. Rezultati su potvrđeni tri puta s dvije neovisne serije preparata genomske DNK. (b) Shematski prikaz PCR predloška uključujući regiju D-petlje. Strelice i crne trake pokazuju područja PCR amplifikacije. (c) Relativni omjer DNA kopija H-/L-lanaca u WT i mutator (EXO-) miševa. Zvjezdice predstavljaju značajne razlike u usporedbi s WT (n=3 *P≤0,05, studentski t-test). (d) Model formiranja linearne delecije mtDNA. Neuspjeh ligiranja na OriH dovodi do ureza u H-lancu (lijeva ploča). Nadimak ne inhibira inicijaciju novog kruga replikacije iz OriH-a, jer se netaknuti L-lanac koristi kao predložak za sintezu H-lanca. Sinteza DNK započeta u OriH-u može se stoga nastaviti punim krugom i stvoriti novu molekulu DNA s urezom u OriH-u (desna gornja ploča). Suprotno tome, sinteza DNA započeta u OriL-u rezultirat će linearnim, izbrisanim fragmentima. U ovom kasnijem slučaju, sinteza L-lanca DNA će započeti iz OriL-a i koristiti H-lanac kao predložak. Sinteza DNK će doći do nicka u blizini OriH-a i nastat će dvolančani prekid. Formirana molekula također će sadržavati nestabilnu ssDNA regiju koja će se razgraditi, ostavljajući linearni dvolančani proizvod koji se proteže kroz glavni luk (desni donji panel). Neuspjeh ligiranja na OriH-u će stoga rezultirati istim krugom replikacije koji generira dva različita proizvoda replikacije, kružnu, izrezanu mtDNA i linearni, izbrisani fragment koji se proteže kroz OriH i OriL. Čvrsta stražnja linija, H-pramen isprekidana crna linija, H-pramen puna crvena linija, L-pramen isprekidana crvena linija, nastajajući L-pramen.

Kako se inicijacija replikacije mtDNA odvija u OriH-u, a zatim nastavlja jednosmjerno, završetak jedne od dvije nove molekule kćeri također bi se trebao dogoditi u OriH-u. Dakle, neuspjeh ligiranja nakon završetka replikacije DNA trebao bi rezultirati molekulama mtDNA koje sadrže izrezani H-lanac, ali netaknuti L-lanac u blizini OriH-a. Kako bismo odgovorili na ovu mogućnost, koristili smo PCR specifičan za lančiće i pratili razine intaktnih H- i L-lanaca u OriH regiji WT i miševa mutatora. Naš uzvodni prajmer nalazio se u regiji koja nije prisutna u linearnoj deleciji, osiguravajući da smo pratili samo kružnu mtDNA (slika 5b). Za preciznu kvantifikaciju koristili smo digitalni PCR (ddPCR). Kao kontrole, prvo smo kvantificirali razine intaktnih H- i L-lanaca u tri različite regije: ND5 i COXII u glavnom luku i 16S rRNA u manjem luku. Pronašli smo jednake razine dvaju niti na svim tim mjestima (slika 5c). Zatim smo analizirali regiju koja okružuje OriH i otkrili da je omjer između H- i L-lanca smanjen kod miševa mutatora kao što bi se očekivalo ako postoji urez u H-lancu (slika 5c, OH-1). Zahvaljujući aktivnosti pomicanja EXO-POLγ, udubljenja će biti smještena u širokoj zoni, a ne u jednoj točki. U skladu s pojmom, pristranost niti je bila još jača kada smo analizirali dužu regiju, koja obuhvaća cijelu D-petlju regiju (slika 5c, OH-2). Također smo analizirali OriL regiju i pronašli jednake razine dvaju niti. To je također ono što se očekuje prema modelu replikacije pomaka niti, kao što je objašnjeno u raspravi (vidi dolje). Zajedno, ovi rezultati daju in vivo podržava ideju da je aktivnost egzonukleaze potrebna za učinkovitu ligaciju i također pokazuje da se H-lanac često razrezuje u OriH regiji miševa mutatora.


Sadržaj

YAC se gradi korištenjem početnog kružnog DNA plazmida, koji se obično izrezuje u linearnu molekulu DNA pomoću restrikcijskih enzima. DNA ligaza se zatim koristi za ligiranje sekvence DNA ili gena od interesa u lineariziranu DNK, tvoreći jedan veliki, kružni komad DNK. [2] Osnovna generacija linearnih umjetnih kromosoma kvasca može se podijeliti u 6 glavnih koraka:

  1. Ligacija selektabilnog markera u plazmidni vektor: to omogućuje diferencijalnu selekciju kolonija sa ili bez markerskog gena. Gen za otpornost na antibiotike omogućuje amplificiranje YAC vektora i odabir za in E coli spašavanjem sposobnosti mutantne E. coli da sintetizira leucin u prisutnosti potrebnih komponenti unutar medija za rast. TRP1 i URA3 geni su drugi selektivni markeri. Mjesto kloniranja YAC vektora za stranu DNK nalazi se unutar SUP4 gen. Ovaj gen kompenzira mutaciju u stanici domaćina kvasca koja uzrokuje nakupljanje crvenog pigmenta. Stanice domaćina su normalno crvene, a one transformirane samo s YAC-om formirat će bezbojne kolonije. Kloniranje stranog fragmenta DNA u YAC uzrokuje insercijsku inaktivaciju gena, vraćajući crvenu boju. Stoga su kolonije koje sadrže strani fragment DNK crvene. [4]
  2. Ligacija potrebnih centromernih sekvenci za mitotičku stabilnost [5]
  3. Ligacija autonomno replicirajućih sekvenci (ARS) koja osigurava ishodište replikacije za podvrgavanje mitotičkoj replikaciji. To omogućuje plazmidu da se replicira ekstrakromosomski, ali plazmid čini vrlo mitotički nestabilnim i lako se gubi bez centromernih sekvenci. [3][6]
  4. Ligacija umjetnih telomernih sekvenci za pretvaranje kružnog plazmida u linearni dio DNK [7]
  5. Umetanje DNA sekvence koja se amplificira (do 1000 kb)
  6. Transformacijska kolonija kvasca [8]

U ožujku 2014. Jef Boeke iz medicinskog centra Langone na Sveučilištu New York objavio je da je njegov tim sintetizirao jedan od S. cerevisiae 16 kromosoma kvasca, kromosom III, koji je nazvao sinIII. [9] [10] Postupak je uključivao zamjenu gena u izvornom kromosomu sintetskim verzijama, a gotovi sintetizirani kromosom je zatim integriran u stanicu kvasca. Bilo je potrebno dizajnirati i stvoriti 273 871 bazni par DNK - manje od 316 667 parova u izvornom kromosomu.

Ekspresijski vektori kvasca, kao što su YACs, YIps (plazmidi koji integriraju kvasac) i YEps (epizomalni plazmidi kvasca), imaju prednost u odnosu na bakterijske umjetne kromosome (BAC) u tome što se mogu koristiti za ekspresiju eukariotskih proteina koji zahtijevaju posttranslacijsku modifikaciju. Budući da su u stanju umetnuti velike fragmente DNK, YAC-ovi se mogu koristiti za kloniranje i sastavljanje cjelokupnih genoma organizma. [11] Umetanjem YAC-a u stanice kvasca, oni se mogu razmnožavati kao linearni umjetni kromosomi, klonirajući umetnute regije DNA u procesu. Kada se ovo završi, mogu se koristiti dva procesa za dobivanje sekvenciranog genoma ili područja od interesa:

To je značajno po tome što omogućuje detaljno mapiranje specifičnih regija genoma. Ispitani su cijeli ljudski kromosomi, kao što je X kromosom, [13] koji generira lokaciju genetskih biljega za brojne genetske poremećaje i osobine. [14]

YAC-ovi su znatno manje stabilni od BAC-a, proizvodeći "kimerne efekte": artefakte u kojima slijed klonirane DNK zapravo ne odgovara jednoj genomskoj regiji, već višestrukim regijama. Kimerizam može biti posljedica ili ko-ligacije više genomskih segmenata u jedan YAC, ili rekombinacije dvaju ili više YAC-a transformiranih u istoj stanici kvasca domaćina. [15] Učestalost kimerizma može biti i do 50%. [16] Ostali artefakti su brisanje segmenata iz klonirane regije i preuređivanje genomskih segmenata (kao što je inverzija). U svim tim slučajevima, slijed kako je određen iz YAC klona razlikuje se od izvornog, prirodnog slijeda, što dovodi do nedosljednih rezultata i pogrešaka u interpretaciji ako se oslanja na informacije klona. Zbog ovih problema, Projekt Human Genome na kraju je napustio korištenje YAC-a i prešao na bakterijske umjetne kromosome, gdje je učestalost ovih artefakata vrlo niska. Uz probleme sa stabilnošću, posebno relativno čestu pojavu himernih događaja, YAC-ovi su se pokazali neučinkovitima pri generiranju minimalnog puta koji pokriva cijeli ljudski genom. Generiranje kloniranih knjižnica oduzima mnogo vremena. Također, zbog prirode oslanjanja na mjesta označena sekvencijom (STS) kao referentnu točku pri odabiru odgovarajućih klonova, postoje velike praznine koje zahtijevaju daljnju generiranje knjižnica kako bi se obuhvatile. Upravo je ta dodatna prepreka natjerala projekt da umjesto toga koristi BAC. [17] To je zbog dva čimbenika: [18]

  1. BAC-ovi se mnogo brže generiraju, a kod generiranja suvišnih biblioteka klonova to je bitno
  2. BAC-ovi omogućuju gušću pokrivenost STS-ovima, što rezultira potpunijim i učinkovitijim minimalnim putovima popločavanja generiranih u silikonu.

Međutim, moguće je koristiti oba pristupa, kao što je pokazano kada je genom nematode, C. elegans. There majority of the genome was tiled with BACs, and the gaps filled in with YACs. [17]


Synthesis of circular DNA templates with T4 RNA ligase for rolling circle amplification

Currently, isothermal methods of nucleic acid amplification have been well established in particular, rolling circle amplification is of great interest. In this approach, circular ssDNA molecules have been used as a target that can be obtained by the intramolecular template-dependent ligation of an oligonucleotide C-probe. Here, a new method of synthesizing small circular DNA molecules via the cyclization of ssDNA based on T4 RNA ligase has been proposed. Circular ssDNA is further used as the template for the rolling circle amplification. The maximum yield of the cyclization products was observed in the presence of 5−10% polyethylene glycol 4000, and the optimum DNA length for the cyclization constituted 50 nucleotides. This highly sensitive method was shown to detect less than 10 2 circular DNA molecules. The method reliability was proved based on artificially destroyed dsDNA, which suggests its implementation for analyzing any significantly fragmented dsDNA.


Rasprava

The establishment and persistence of hepadnavirus infection is dependent upon the viral cccDNA, which is a non-replicating episomal viral genome deposited in the nucleus of infected cell after conformational conversion from viral rcDNA [9]. Due to the limited gene-coding capacity of hepadnavirus genome, the virus needs to borrow host functions to complete its lifecycle [8]. The cellular DNA repair is a well-conserved surveillance and restoration system to detect and heal the damage in chromosomal DNA, by which maintains the stability and integrity of the host genome for replication and transcription [33, 34]. It is plausible that hepadnaviruses hijack the cellular DNA repair apparatus for cccDNA formation by disguising the rcDNA as a “damaged” DNA [9, 20]. The two gaps on rcDNA would be recognized as lesions for DNA repair by the host, and the DNA termini and their associated modifications are expected to undergo trimming, elongation, and ligation, during cccDNA formation (Fig 1). However, the host DNA repair pathway responsible for cccDNA formation remain largely unknown, and thus far, only a few host DNA repair enzymes have been reported to be involved in cccDNA formation, including the tyrosol-DNA phosphodiesterase 2 (TDP2) [17], polymerase κ (POLK) and λ (POLL) [21]. In this study, we screened 107 host DNA repair factors to assess their individual effect on HBV cccDNA formation by lentiviral shRNA knock-down, and identified and validated the host DNA LIG1 and LIG3 as key factors for hepadnavirus cccDNA formation by using a battery of in vitro and cell-based assays. Such work hence provides new insights into the mechanisms underlying hepadnavirus cccDNA formation in hepatocyte nucleus.

As part of the cellular DNA replication and repair machineries, DNA ligases complete joining of DNA strands by catalyzing the phosphodiester bond formation. Specifically, LIG1 ligates the Okazaki fragments during chromosomal DNA synthesis, and it is involved in the ligation steps of homologous recombination repair (HRR), long-patch base-excision repair (BER) and nucleotide excision repair (NER) LIG3 is responsible for sealing single strand DNA breaks during the process of short-patch BER and NER [26]. The involvement of DNA ligases in cccDNA formation indicated that the process of rcDNA termini generates ends that can be ligated and DNA ligases are the end-effectors for sealing the breaks of rcDNA. It is worth noting that previous studies have shown that LIG3, but not LIG4, is essential for nuclear DNA replication in the absence of LIG1 [35, 36] and LIG1 is a backup enzyme for LIG3 in BER and NER DNA repair pathways [37, 38]. Such functional redundancy between LIG1 and LIG3 may explain the unaffected cell viability and the incomplete inhibition of cccDNA formation by knocking down/out LIG1 or LIG3 only (Figs 4A, 5–7 and S8A) or knocking down both (Figs 4B and S8B). In previous studies, the redundant functions in cccDNA formation have also been observed between POLK and POLL [21], and perhaps between TDP2 and an unknown TDP2-like protein(s) [17]. It is of note that the potential role of TDP2 in cccDNA formation remains controversial. While one study demonstrated that knock-down of TDP2 inhibited, or at least delayed, DHBV cccDNA formation [17] another study suggested that TDP2 might even serve as a negative regulator of HBV cccDNA formation rather than a facilitator [18], and a recent study showed that TDP2 chemical inhibitors did not inhibit HBV infection in cell cultures [39]. In our shRNA screen, POLK or TDP2 lentiviral shRNA did not significantly reduce cccDNA formation in HepDES19 cells (S1 Fig), indicating that cellular functional redundancy for each enzyme might also exist in our experimental system. Further validation and mechanistic studies are required to reconcile these results. On the other hand, it is also possible that the first round cccDNA formation from virion DNA during infection and the intracellular cccDNA amplification pathway may have preference for different DNA repair enzymes, or there is hepatic cell line- or clone-specific requirement of host DNA repair factors/pathways for cccDNA formation. We had attempted to CRIPSR out both ligases in HepDG10 cells but only achieved partial double knock-down (Fig 4B), suggesting that at least one of LIG1 and LIG3 is required by the cells, and perhaps by hepadnaviruses as well. However, our data does not completely rule out a possibility that a LIG1/3-independent ligation mechanism might be involved in cccDNA formation, such as DNA topoisomerase I (TOP1) which has been suggested to play a role in rcDNA circularization through its DNA endonuclease and strand transferase activities [40]. Based on the previous and current data, it can be also inferred that hepadnaviruses have evolved to take advantage of the functional redundancy of host DNA repair machinery for a successful cccDNA formation.

The mechanism underlying the different efficiency of cccDNA formation between HBV and DHBV remains largely unknown, but likely in a virus-specific but not host-specific manner [16, 25, 30]. Based on that, we created the cell-free and the human hepatoma cell-based DHBV system to facilitate the identification and validation of host and viral regulators of cccDNA formation (Figs 2 and 3). In addition to the possible determining factors for cccDNA formation in the steps of rcDNA maturation, deproteinization, nuclear importation and uncoating, whether the cellular DNA repair system differentially recognizes and repairs nuclear HBV and DHBV rcDNA into cccDNA remains obscure. In this study, we found that both viruses employ LIG1 and LIG3 for cccDNA formation (Figs 4–7, S8 and S11), suggesting that the different repair process of HBV and DHBV rcDNA, if any, should be at the steps upstream of rcDNA end joining.

Though LIG1 and LIG3 have overlapping functions, knocking out/down of LIG3 resulted in relatively lower level of cccDNA than LIG1 knock-out/down (Figs 4–7 and S8), which suggests that LIG3 may play a more important role in cccDNA formation. In line with this notion, the two separated nicks/gaps in rcDNA are reminiscent of single strand breaks, which are preferable substrates for LIG3 in BER- and NER-mediated single strand break repair (Fig 1). Moreover, during the primary screen, two other BER components, APEX1 and POLB [41], emerged as candidates for positive regulator of cccDNA formation (S1 Fig), further suggesting the potential involvement of short-patch BER in cccDNA formation, which awaits further systematic investigations.

With the protein and RNA attachments at the 5’ end of minus- and plus-strand, respectively, hepadnavirus rcDNA is not a typical DNA break substrate for the major known repair pathways, and it is unknown whether the two gaps in rcDNA are repaired simultaneously or separately, including the final ligation step. A recent study revealed a nuclear rcDNA species with a covalently closed minus strand but an open plus strand, indicating that the nick on minus strand may be sealed first during cccDNA formation [28]. However, we did not observe an increased accumulation of protein-free rcDNA after blocking cccDNA synthesis in LIG1 or LIG3 knock-out cells (Figs 4, 6, 7B and S8). This phenomena may be due to a fact that the processed rcDNA ready for ligation is unstable. Previous studies have shown that the Hirt DNA samples from DHBV replicating cells contain high levels of nicked cccDNA which might be generated intracellularly or during the Hirt extraction [16, 30]. We also found that the protein-free rcDNA in Hirt extraction from HepDG10 cells were largely nicked cccDNA (S9 Fig), indicating that the observed reduction of protein-free rcDNA in LIG1/3 knock-out cells might be a consequence of cccDNA reduction (Figs 4 and 7). Nonetheless, further characterization of the nuclear rcDNA in LIG1/3 knock-out cells will provide further information for understanding the biological processes of rcDNA termini prior to the final ligation step during cccDNA formation.

In parallel with the bona fide rcDNA-to-cccDNA formation during hepadnavirus infection, the viral dslDNA byproduct is also repaired into cccDNA with indel mutations at the joint region [16, 23]. Although the dslDNA-derived cccDNA is generally defective of initiating a new round of viral DNA replication, it remains functional to express HBsAg and thus may play a role in viral pathogenesis. Based on the linear format of dslDNA and the indel mutations of its cccDNA derivative, it is hypothesized that dslDNA is a substrate for host error-prone NHEJ DNA repair system, and we have previously reported that another NHEJ component Ku80 is required for DHBV cccDNA formation from the dslDNA but not rcDNA [25]. LIG4 is the DNA ligase responsible for performing the last step of double strand DNA end joining in the NHEJ pathway [24]. In this study, we have demonstrated that LIG4 plays an essential role in cccDNA formation from DHBV dslDNA, and no functional redundancy was observed between LIG4 and other ligases (Fig 8). In addition, it has been reported that the chromosome DNA double strand breaks are targets for DHBV DNA integration [42], which indicates that the NHEJ machinery, including LIG4, is also responsible for the integration of hepadnavirus dslDNA into host genome.

Altogether, our study revealed a critical role of cellular DNA ligases in hepadnavirus cccDNA biosynthesis. Another possible function of DNA ligases in hepadnavirus life cycle can be to maintain the integrity of cccDNA, provided the preexisting cccDNA undergoes DNA damage and the host cell is able to repair it. Based on our observations, the DNA ligase inhibitors, which are currently under development for anti-cancer therapy [43], may be developed into host-targeting antiviral means to treat chronic hepatitis B by blocking cccDNA formation and/or repair.


Reference

Kato, S. et al. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 100, 8424–8429 (2003).

Röder, K., Stirnemann, G., Dock-Bregeon, A. C., Wales, D. J. & Pasquali, S. Structural transitions in the RNA 7SK 5’ hairpin and their effect on HEXIM binding. Nucl. Acids Res. 48, 373–389 (2020).

David, J. P. et al. Deletion in mice of X-linked, Brugada syndrome- and atrial fibrillation-associated Kcne5 augments ventricular KV currents and predisposes to ventricular arrhythmia. FASEB J. 33, 2537–2552 (2019).

Lõhmussaar, K. et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. komun. 11, 2660. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16432-0 (2020).

Liu, H. & Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesisprotocol. BMC Biotechnol. 8, 91. https://doi.org/10.1186/1472-6750-8-91 (2008).

Costa, G. L., Bauer, J. C., McGowan, B., Angert, M. & Weiner, M. P. Site-directedmutagenesis using a rapid PCR-based method. Metode Mol. Biol. 57, 239–248 (1996).

Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K. & Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gen 77, 51–59 (1989).

Barettino, D., Feigenbutz, M., Valcarcel, R. & Stunnenberg, H. G. Improved method for PCR-mediated site-directed mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 541–542 (1994).

Giebel, L. B. & Spritz, R. A. Site-directed mutagenesis using a double-stranded DNA fragment as a PCR primer. Nucl. Acids Res. 18, 4947 (1990).

Lin, J. W., Wei, T. Y. & Fang, T. Y. A novel megaprimed and ligase-free, PCR-based, site-directed mutagenesis method. Analni. Biochem. 375, 376–378 (2008).

Zheng, L., Baumann, U. & Reymond, J. L. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucl. Acids Res. 32, 115. https://doi.org/10.1093/nar/gnh110 (2004).

Weiner, M. P. & Costa, G. L. Rapid PCR site-directed mutagenesis. PCR metode Appl. 4, S131–S136 (1994).

Zhang, B. Z. et al. An easy-to-use site-directed mutagenesis method with a designed restriction site for convenient and reliable mutant screening. J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 479–482 (2009).

Edelhei, O., Hanukoglu, A. & Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotech. 9, 61. https://doi.org/10.1186/1472-6750-9-61 (2009).

Kitagawa, K. & Abdulle, R. In vivo site-directed mutagenesis of yeast plasmids using a three fragment homologous recombination system. Biotehnike 33, 288–294 (2018).

Wu, D. et al. A rapid and efficient one-step site-directed deletion, insertion, and substitution mutagenesis protocol. Analni. Biochem. 434, 254–258 (2013).

Khalil, A. M., Julius, J. A. & Bachant, J. One step construction of PCR mutagenized libraries for genetic analysis by recombination cloning. Nucl. Acids Res. 35, e104. https://doi.org/10.1093/nar/gkm583 (2007).

Trehan, A. et al. REPLACR-mutagenesis, a one step method for site-directed mutagenesis by recombineering. Sci. Rep. 6, 19121. https://doi.org/10.1038/srep19121 (2015).

Liu, H., Ye, R. & Wang, Y. Y. Highly efficient one-step PCR-based mutagenesis technique for large plasmids using high-fidelity DNA polymerase. Genet. Mol. Rez. 14, 3466–3473 (2015).

Meng, F., Chen, C., Wan, H. & Zhou, Q. A method for introducing mutations into large vectors. Brada. J. Lung Cancer 7, 563–568 (2014).

Xia, Y. et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucl. Acids Res. 7, 15 (2019).

Heydenreich, F. M. et al. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Sci. Rep. 7, 6787 (2017).


What is the minimum length required for a circular DNA ligation? - Biologija


Directionality, in molecular biology and biochemistry, is the end-to-end chemical orientation of a single strand of nucleic acid. The chemical convention of naming carbon atoms in the nucleotide sugar-ring numerically gives rise to a 5′-end and a 3′-end (usually pronounced "five prime end" and "three prime end"). The relative positions of structures along a strand of nucleic acid, including genes and various protein binding sites, are usually noted as being either upstream (towards the 5′-end) or nizvodno (towards the 3′-end). (See alsoupstream and downstream.)

This naming convention is important because nucleic acids can only be synthesized in vivoin the 5′-to-3′ direction, as the polymerase that assembles new strands only attaches new nucleotides to the 3′-hydroxyl (-OH) group, via a phosphodiester bond. Directionality is related to, but independent from sense. In coding DNA, codons read 5′–ATG–⋯–3′ on the sense strand, and 3′–TAC–⋯–5′ on the complementary antisense strand. Thus only theantismisla strand will be transcribed to sense (5′–AUG–⋯–3′) mRNA. By convention, single strands of DNA and RNA sequences are written in 5′-to-3′ direction.

The 5′-end (pronounced "five prime end") designates the end of the DNA or RNA strand that has the fifth carbon in the sugar-ring of the deoxyribose or ribose at its terminus. Aphosphate group attached to the 5′-end permits ligation of two nucleotides, i.e., the covalent binding of a 5′-phosphate to the 3′-hydroxyl group of another nucleotide, to form aphosphodiester bond. Removal of the 5′-phosphate prevents ligation. To prevent unwanted nucleic acid ligation (e.g. self-ligation of a plasmid vector in DNA cloning), molecular biologists commonly remove the 5′-phosphate with a phosphatase.

The 5′-end of nascent messenger RNA is the site at which post-transcriptional cappingoccurs, a process which is vital to producing mature messenger RNA. Capping increases the stability of the messenger RNA while it undergoes translation, providing resistance to the degradative effects of exonucleases. [ potreban je citat ] It consists of a methylated nucleotide (methylguanosine) attached to the messenger RNA in a rare 5′- to 5′-triphosphate linkage.

The 5′-flanking region of a gene often denotes a region of DNA which is not transcribed into RNA. The 5′-flanking region contains the gene promoter, and may also contain enhancers or other protein binding sites.

The 5′-untranslated region (5′-UTR) is a region of a gene which is transcribed into mRNA, and is located at the 5′-end of the mRNA, but which does not contain protein-coding sequence. The 5′-untranslated region is the portion of the DNA starting from the cap site and extending to the base just before the AUG translation initiation codon. While not itself translated, this region may have sequences, such as the ribosome binding site and Kozak sequence, which determine the translation efficiency of the mRNA, or which may affect the stability of the mRNA.

The 3′-end of a strand is so named due to it terminating at the hydroxyl group of the third carbon in the sugar-ring, and is known as the tail end. The 3′-hydroxyl is necessary in the synthesis of new nucleic acid molecules as it is ligated (joined) to the 5′-phosphate of a separate nucleotide, allowing the formation of strands of linked nucleotides.

Molecular biologists can use nucleotides that lack a 3′-hydroxyl (dideoxyribonucleotides) to interrupt the replication of DNA. This technique is known as the dideoxy chain-termination termination method or the Sanger method, and is used to determine the order of nucleotides in DNA.

The 3′-end of nascent messenger RNA is the site of post-transcriptional polyadenylation, which attaches a chain of 50 to 250 adenosine residues to produce mature messenger RNA. This chain helps in determining how long the messenger RNA lasts in the cell, influencing how much protein is produced from it.

The 3′-flanking region is a region of DNA that is not copied into the mature mRNA, but which is present adjacent to 3′-end of the gene. It was originally thought that the 3′-flanking DNA was not transcribed at all, but it was discovered to be transcribed into RNA and quickly removed during processing of the primary transcript to form the mature mRNA. The 3′-flanking region often contains sequences that affect the formation of the 3′-end of the message. It may also contain enhancers or other sites to which proteins may bind.

The 3′-untranslated region (3′-UTR) is a region of the DNA which je transcribed into mRNA and becomes the 3′-end of the message, but which does not contain protein coding sequence. Everything between the stop codon and the polyA tail is considered to be 3′-untranslated. The 3′-untranslated region may affect the translation efficiency of the mRNA or the stability of the mRNA. It also has sequences which are required for the addition of the poly(A) tail to the message, including the hexanucleotide AAUAAA.


T4 DNA Ligase




For details on NEB's quality controls for DNA ligases, visit our Ligase Quality page.

T4 DNA Ligase Competitor Study - Nuclease Contamination
T4 DNA Ligase from multiple suppliers was tested in reactions containing a fluorescent labeled single stranded, double stranded blunt, 3&rsquooverhang or 5&rsquo overhang containing oligonucleotides. The percent degradation by contaminating nucleases is determined by capillary electrophoresis and peak analysis. The resolution is at the single nucleotide level.

Naglasci

Product Source

Reagents Supplied

The following reagents are supplied with this product:

T4 DNA Ligase M0202SVIAL -20 1 x 0.05 ml 400,000 units/ml
T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202AVIAL -20 2 x 0.5 ml 10 X
T4 DNA Ligase M0202TVIAL -20 1 x 0.01 ml 2,000,000 units/ml
T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202AVIAL -20 2 x 0.5 ml 10 X
T4 DNA Ligase M0202LVIAL -20 1 x 0.25 ml 400,000 units/ml
T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202AVIAL -20 2 x 0.5 ml 10 X
T4 DNA Ligase M0202MVIAL -20 1 x 0.05 ml 2,000,000 units/ml
T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202AVIAL -20 2 x 0.5 ml 10 X

Application Features

Unit Definition

One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of &lambda DNA (5´ DNA termini concentration of 0.12 µM, 300- µg/ml) in a total reaction volume of 20 &mul in 30 minutes at 16°C in 1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer.

Concentration:
400,000 cohesive end units/ml and 2,000,000 cohesive end units/ml

Reaction Conditions

1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer
Incubate at 16°C

1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer
50 mM Tris-HCl
10 mM MgCl2
1 mM ATP
10 mM DTT
(pH 7.5 @ 25°C)

Storage Buffer

10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50% Glycerol
pH 7.4 @ 25°C

Heat Inactivation

Companion Products

Materials Sold Separately

  1. ATP is an essential cofactor for the reaction. This contrasts with E coli DNA ligase which requires NAD.
  2. To dilute T4 DNA Ligase that will subsequently be stored at -20°C, 50% glycerol storage buffer (Diluent Buffer A,NEB #B8001S) should be used to dilute for immediate use, 1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer can be used.
  3. Ligation can also be performed in any of the four restriction endonuclease NEBuffers or in T4 Polynucleotide Kinase Buffer if they are supplemented with 1 mM ATP.
  4. Room Temperature Ligation
    For convenience, ligations may be done at room temperature (20-25°C). For cohesive (sticky) ends, use 1 µl of T4 DNA Ligase in a 20 µl reaction for 10 minutes. For blunt ends, use 1 µl of T4 DNA Ligase in a 20 µl reaction for 2 hours or 1 µl high concentration T4 DNA Ligase for 10 minutes. Alternatively, NEB's Quick Ligation Kit (#M2200S) [30 reactions] or (#M2200L) [150 reactions]) is uniquely formulated to ligate both blunt and cohesive (sticky) ends in 5 minutes at room temperature.
  1. Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). P.D. Boyer(Ed.), 5, 3. San Diego: Academic Press.
  2. Remaut, E., Tsao, H. and Fiers, W. (1983). Gen. 22, 103-113.
  3. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd Ed.). 1.53-1.73.
  • M0202Datasheet-Lot1011202
  • M0202Datasheet-Lot1021203
  • M0202Datasheet-Lot1021205
  • M0202Datasheet-Lot1021207
  • M0202Datasheet-Lot1071206
  • M0202Datasheet-Lot1071207
  • M0202Datasheet-Lot1071209
  • M0202Datasheet-Lot1071211
  • M0202Datasheet-Lot1081302
  • M0202Datasheet-Lot1081304
  • M0202Datasheet-Lot1081306
  • M0202Datasheet-Lot1081308
  • M0202Datasheet-Lot1081310
  • M0202Datasheet-Lot1081312
  • M0202Datasheet-Lot1081402
  • M0202Datasheet-Lot1081406
  • M0202Datasheet-Lot1091411
  • M0202Datasheet-Lot1111412
  • M0202Datasheet-Lot1111502
  • M0202Datasheet-Lot1151503
  • M0202Datasheet-Lot1151505
  • M0202Datasheet-Lot1151506
  • M0202Datasheet-Lot0161508
  • M0202Datasheet-Lot1161511
  • M0202Datasheet-Lot1171602
  • M0202Datasheet-Lot1171605
  • M0202Datasheet-Lot1181608
  • M0202Datasheet-Lot1201612
  1. What are some potential problems with the ligation reaction using T4 DNA Ligase that can lead to transformation failure?
  2. What are some other problems that should be considered when troubleshooting a transformation problem?
  3. What problems can be encountered in the restriction digest that can cause ligation using T4 DNA Ligase or subsequent transformation to fail?
  4. What controls should be run to test the cells and DNA when using T4 DNA Ligase?
  5. When should T4 DNA Ligase be the enzyme of choice?
  6. Can the T4 DNA Ligase be used with the Quick Ligase buffer?
  7. What is the definition of a Weiss Unit and a Cohesive End Unit?
  8. What is the difference between the two definitions and why does NEB use the Cohesive End Unit?
  9. How much DNA should be used in a ligation using T4 DNA Ligase?
  10. Can T4 DNA Ligase be used in other NEBuffers, including rCutSmart?
  11. Can T4 DNA Ligase be heat inactivated?

Product Citation Tool

Additional Citations

  • Sexton T, Kurukuti S, Mitchell JA, Umlauf D, Nagano T, Fraser P (2012) Sensitive detection of chromatin coassociations using enhanced chromosome conformation capture on chip Nat Protoc 7(7), 1335-50. PubMedID: 22722369, DOI: 10.1038/nprot.2012.071
  • Thuronyi, B.W., Koblan, L.W., Levy, J.M. et al (2019) . Continuous evolution of base editors with expanded target compatibility and improved activity Nat Biotechnol. 37, 1070-1079.. DOI: 10.1038/s41587-019-0193-0

Tehnički podaci

  • M0202S_L_v1_1191702
  • M0202S_L_v1_1201612
  • M0202S_L_v1_1211707
  • M0202T_M_v1_1221707
  • M0202S_L_v1_1191703
  • M0202T_M_v1_1211610
  • M0202T_M_v1_1231711
  • M0202S_L_v1_1271711
  • M0202T_M_v1_1211712
  • M0202S_L_v1_1301804
  • M0202T_M_v1_1281804
  • M0202L_v1_10010638
  • M0202M_v1_10011308
  • M0202S_v1_10010639
  • M0202T_v1_10011309
  • M0202L_v1_10009351
  • M0202S_v1_10008056
  • M0202L_v1_10011714
  • M0202S_v1_10013518
  • M0202M_v1_10013335
  • M0202S_v1_10013339
  • M0202L_v1_10013334
  • M0202S_v1_10016588
  • M0202L_v1_10016587
  • M0202M_v1_10018725
  • M0202T_v1_10016589
  • M0202S_v1_10018061
  • M0202L_v1_10018060
  • M0202S_v1_10021616
  • M0202L_v1_10022977
  • M0202S_v1_10022976
  • M0202L_v1_10021617
  • M0202M_v1_10021618
  • M0202S_v1_10024944
  • M0202S_v1_10025787
  • M0202T_v1_10022978
  • M0202L_v1_10024945
  • M0202L_v1_10028243
  • M0202S_v1_10028245
  • M0202S_v1_10030177
  • M0202L_v1_10030175
  • M0202M_v1_10022979
  • M0202S_v1_10031303
  • M0202L_v1_10032774
  • M0202S_v1_10032134
  • M0202T_v1_10030176
  • M0202L_v1_10034812
  • M0202S_v1_10033294
  • M0202L_v1_10034917
  • M0202M_v1_10030178
  • M0202S_v1_10034918
  • M0202L_v1_10035818
  • M0202M_v1_10035817
  • M0202S_v1_10035819
  • M0202L_v1_10039211
  • M0202S_v1_10039212
  • M0202T_v1_10038375
  • M0202L_v1_10040134
  • M0202S_v1_10040135
  • M0202L_v1_10042433
  • M0202M_v1_10041521
  • M0202S_v1_10041522
  • M0202T_v1_10041523
  • M0202L_v1_10044753
  • M0202L_v1_10045861
  • M0202L_v1_10045862
  • M0202M_v1_10044338
  • M0202S_v1_10045406
  • M0202L_v1_10046337
  • M0202S_v1_10047108
  • M0202L_v1_10047107
  • M0202T_v1_10045551
  • M0202S_v1_10048549
  • M0202M_v1_10047793
  • M0202L_v1_10050060
  • M0202S_v1_10050061
  • M0202L_v1_10049119
  • M0202L_v1_10052609
  • M0202S_v1_10052208
  • M0202T_v1_10051901
  • M0202M_v1_10051900
  • M0202S_v1_10054339
  • M0202L_v1_10054632
  • M0202S_v1_10055724
  • M0202S_v1_10056300
  • M0202L_v1_10054835
  • M0202M_v1_10054836
  • M0202T_v1_10054843
  • M0202L_v1_10057909
  • M0202S_v1_10056448
  • M0202S_v1_10058650
  • M0202S_v1_10059598
  • M0202L_v1_10059051
  • M0202M_v1_10058298
  • M0202S_v1_10061727
  • M0202T_v1_10058684
  • M0202L_v1_10062296
  • M0202S_v1_10062299
  • M0202S_v1_10064743
  • M0202L_v1_10064877
  • M0202T_v1_10062298
  • M0202M_v1_10062297
  • M0202S_v1_10065865
  • M0202L_v1_10066725
  • M0202S_v1_10066724
  • M0202L_v1_10068931
  • M0202S_v1_10068930
  • M0202L_v1_10070961
  • M0202S_v1_10070962
  • M0202T_v1_10068006
  • M0202M_v1_10068408
  • M0202L_v1_10073287
  • M0202S_v1_10073290
  • M0202L_v1_10077021
  • M0202M_v1_10075385
  • M0202L_v1_10077027
  • M0202S_v1_10077023
  • M0202L_v1_10079360
  • M0202M_v1_10077030
  • M0202S_v1_10080074
  • M0202T_v1_10077026
  • M0202S_v1_10081463
  • M0202L_v1_10080075
  • M0202S_v1_10082479
  • M0202L_v1_10083328
  • M0202S_v1_10083329
  • M0202T_v1_10082482
  • M0202M_v1_10082481
  • M0202L_v1_10085167
  • M0202S_v1_10085166
  • M0202L_v1_10087067
  • M0202S_v1_10087276
  • M0202L_v1_10088270
  • M0202M_v1_10088268
  • M0202S_v1_10088269
  • M0202L_v1_10090698
  • M0202S_v1_10091339
  • M0202T_v1_10089391
  • M0202L_v1_10091340
  • M0202S_v1_10093447
  • M0202L_v1_10095211
  • M0202S_v1_10096313
  • M0202M_v1_10096314
  • M0202S_v1_10098272
  • M0202T_v1_10097688
  • M0202L_v1_10098675
  • M0202M_v1_10101695
  • M0202S_v1_10101698
  • M0202M_v1_10103422
  • M0202T_v1_10101696
  • M0202L_v1_10105394
  • M0202S_v1_10106611
  • M0202S_v1_10108673
  • M0202L_v1_10108424
  • M0202L_v1_10111200
  • M0202M_v1_10109397
  • M0202T_v1_10109391
  • M0202Datasheet-Lot1011202
  • M0202Datasheet-Lot1021203
  • M0202Datasheet-Lot1021205
  • M0202Datasheet-Lot1021207
  • M0202Datasheet-Lot1071206
  • M0202Datasheet-Lot1071207
  • M0202Datasheet-Lot1071209
  • M0202Datasheet-Lot1071211
  • M0202Datasheet-Lot1081302
  • M0202Datasheet-Lot1081304
  • M0202Datasheet-Lot1081306
  • M0202Datasheet-Lot1081308
  • M0202Datasheet-Lot1081310
  • M0202Datasheet-Lot1081312
  • M0202Datasheet-Lot1081402
  • M0202Datasheet-Lot1081406
  • M0202Datasheet-Lot1091411
  • M0202Datasheet-Lot1111412
  • M0202Datasheet-Lot1111502
  • M0202Datasheet-Lot1151503
  • M0202Datasheet-Lot1151505
  • M0202Datasheet-Lot1151506
  • M0202Datasheet-Lot0161508
  • M0202Datasheet-Lot1161511
  • M0202Datasheet-Lot1171602
  • M0202Datasheet-Lot1171605
  • M0202Datasheet-Lot1181608
  • M0202Datasheet-Lot1201612

This product is covered by one or more patents, trademarks and/or copyrights owned or controlled by New England Biolabs, Inc (NEB).

While NEB develops and validates its products for various applications, the use of this product may require the buyer to obtain additional third party intellectual property rights for certain applications.

For more information about commercial rights, please contact NEB's Global Business Development team at [email protected]

This product is intended for research purposes only. This product is not intended to be used for therapeutic or diagnostic purposes in humans or animals.

New England Biolabs (NEB) is committed to practicing ethical science &ndash we believe it is our job as researchers to ask the important questions that when answered will help preserve our quality of life and the world that we live in. However, this research should always be done in safe and ethical manner. Saznajte više.



Komentari:

  1. Absyrtus

    Po mom mišljenju, na krivom ste putu.

  2. Juzil

    Mislim da griješim. Moramo razgovarati. Napiši mi u pm, govori.

  3. Vudokus

    And what should you do in this case?

  4. Dumuro

    Vjeruj mi.

  5. Tojajin

    Izvrsna varijanta



Napišite poruku