Informacija

Gen od interesa broj kopija u transformiranoj K. pastoris

Gen od interesa broj kopija u transformiranoj K. pastoris



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Prilikom transformacije a K. pastoris soj, postoji li način da se predvidi koliko će kopija gena biti integrirano nakon homologne rekombinacije? Točnije, je li to nešto što molekularni biolog može kontrolirati na jednostavan način, ili je to obično prepušteno slučaju (i naknadno određeno pomoću sekvenciranja gena)?

Alternativno: ako želim transformirati elektrokompetentni soj divljeg tipa kao što je Pichia X33 pomoću plazmidnog vektora, je li višestruka integracija iterativni proces koji kontroliram ili je slučajan?)

Edit: Hvala svima na odgovorima. Konačno, ako dobro razumijem, proces je prilično nasumičan, ali ga donekle možete kontrolirati. @gaspanic: Zadržavam ideju korištenja fluorescentnih reportera i FACS-a za to ;)


Predvidjeti integracije brojeva vjerojatno nije moguće, ali možete dati prednost višestrukim integracijama, ako je to ono što želite. Barem u Saccharomyces cerevisiae čini se da integracija prvog plazmida stimulira umetanje dodatnih plazmida na isto mjesto (1). Stoga je moguće dati prednost višestrukim integracijama (2) povećanjem omjera DNK-stanica u transformaciji, čime se povećava mogućnost da bilo koja kompetentna stanica primi više od jedne kopije plazmida, koji bi se zatim mogli integrirati u tandemu. Najlakši način je jednostavno upotrijebiti više DNK, ali ovisno o vašoj staničnoj sposobnosti, možda ćete morati nadoknaditi to povećanje korištenjem manje stanica za svoju transformaciju (ili jednostavno staviti manje stanica na svaku ploču) jer ćete vjerojatno povećati i ukupni prinos kolonije .

Jedan od načina aktivnog odabira za višestruke integracije je korištenje kompetitivnog inhibitora za selekcioni marker. Opet, u Saccharomyces cerevisiae transformacije s HIS3 odabir se može kombinirati s 3-AT (3). To vam omogućuje inhibiciju HIS3 aktivnost tek toliko da dopusti rast stanica koje su integrirale željeni broj kopija plazmida. Naravno, ova metoda je daleko od bezopasne, jer možete odabrati i za mutante koji su se povećali HIS3 izražavanje iz drugih razloga. Uredi: Zapravo sam pronašao jedan papir koji to radi K. pastoris (4).

Konačno, ako vaša implementacija to dopušta, možete olakšati probir za višestruke integracije uključivanjem kasete za ekspresiju fluorescentnog proteina u vaš plazmid. Na taj način možete jednostavno pregledati različite brojeve integracija pomoću fluorescentne mikroskopije ili FACS-a.

Izvori:

  1. Orr-Weaver i sur. (1983): https://mcb.asm.org/content/3/4/747
  2. Plessis i Dujon (1993.): https://doi.org/10.1016/0378-1119(93)90172-Y
  3. Wikipedia (preuzeto 15. kolovoza 2020.): https://en.wikipedia.org/wiki/3-Amino-1,2,4-triazole
  4. Menéndez i sur. (2018.): https://doi.org/10.2144/00295rr05

Pichia pastoris kao domaćin ekspresije za strukturnu biologiju membranskih proteina

Pichia pastoris je dobro uspostavljen rekombinantni ekspresijski sustav.

U ovom sustavu proizveden je niz integralnih membranskih proteina.

Protein je korišten za rješavanje nekoliko struktura visoke rezolucije.

Ključne značajke P. pastoris opisani su ekspresijski sustavi.

Uključen je sažetak dostupnih alata za ekspresiju membranskih proteina.

Metilotrofni kvasac Pichia pastoris je široko korišten rekombinantni ekspresijski domaćin. P. pastoris kombinira prednosti jednostavnosti upotrebe, relativno brzog vremena ekspresije i niske cijene s eukariotskim kotranslacijskim i posttranslacijskim sustavima obrade i sastavom lipida. Prikladnost od P. pastoris za kontroliranu kulturu visoke gustoće u bioreaktorima znači da se velike količine proteina mogu dobiti iz malih volumena kulture. Ova recenzija detaljno opisuje ključne značajke P. pastoris, što ga je učinilo osobito korisnim sustavom za proizvodnju membranskih proteina, uključujući receptore, kanale i transportere, za strukturne studije. Osim toga, ovaj pregled daje pregled svih konstrukta i staničnih sojeva koji se koriste za proizvodnju membranskih proteina, koji su dali strukture visoke rezolucije.


Vodič za pročišćavanje proteina, 2. izdanje

James M. Cregg,. Thomas Chappell, u Methods in Enzymology, 2009

Sažetak

Kvasac Pichia pastoris je postao prvi primjer vrsta kvasca koje se koriste za proizvodnju rekombinantnih proteina. Prednosti ovog kvasca za ekspresiju uključuju strogo regulirane i učinkovite promotore i snažnu tendenciju respiratornog rasta za razliku od fermentativnog rasta. Ovo poglavlje pretpostavlja da je čitatelj vješt u molekularnoj biologiji i detaljno opisuje postupke specifičnije za kvasac koji su uključeni u korištenje P. pastoris sustav za ekspresiju gena. Postupci koji se ovdje mogu pronaći uključuju: konstrukciju soja klasičnom genetikom kvasca, logiku odabira vektora i soja, pripremu elektrokompetentnih stanica kvasca i transformaciju elektroporacijom, te Western blot ili Yeastern blot metodu za vizualizaciju izlučenih proteina oko kvasca. kolonije.


Vodič za pročišćavanje proteina, 2. izdanje

James M. Cregg,. Thomas Chappell, u Methods in Enzymology, 2009

Sažetak

Kvasac Pichia pastoris je postao prvi primjer vrsta kvasca koje se koriste za proizvodnju rekombinantnih proteina. Prednosti ovog kvasca za ekspresiju uključuju strogo regulirane i učinkovite promotore i snažnu tendenciju respiratornog rasta za razliku od fermentativnog rasta. Ovo poglavlje pretpostavlja da je čitatelj vješt u molekularnoj biologiji i detaljno opisuje postupke specifičnije za kvasac koji su uključeni u korištenje P. pastoris sustav za ekspresiju gena. Postupci koji se ovdje mogu pronaći uključuju: konstrukciju soja klasičnom genetikom kvasca, logiku odabira vektora i soja, pripremu elektrokompetentnih stanica kvasca i transformaciju elektroporacijom, te Western blot ili Yeastern blot metodu za vizualizaciju izlučenih proteina oko kvasca. kolonije.


Romanos, M.A., Strijelac, C.A. i Clare, J.J. 1992. Ekspresija stranih gena u kvascu: pregled. Kvasac 8: 423–488.

Cregg, JM, Tschopp, JF, Stillman, C., Siegel, R., Akong, M., Craig, WS, Buckholz, RG, Madden, KR, Kellaris, PA, Davies, GR, Smiley, BL, Cruze, J ., Torregrossa, R., Velicelebi, G. i Thill, GP 1987. Visoka razina ekspresije i učinkovito sastavljanje površinskog antigena hepatitisa B u metilotrofnom kvascu Pichia pastoris. Biotehnologija 5: 479–485.

Sreekrishna, K., Nelles, L., Potenz, R., Cruze, J., Mazzaferro, P., Fish, W., Motohiro, F., Holden, K., Phelps, D., Wood, P. i Parker, K. 1989 Ekspresija visoke razine, pročišćavanje i karakterizacija rekombinantnog humanog faktora nekroze tumora sintetiziranog u metilotrofnom kvascu Pichia pastoris. Biokemija 28: 4117–4125.


Uvod

Nekonvencionalni kvasac Pichia pastoris je popularan domaćin za proizvodnju rekombinantnog proteina, zbog visoko učinkovitog mehanizma sekrecije i mogućnosti postizanja visokih titara proizvoda za jednostavnije enzime kao što su fitaza i složeni proteini koji sadrže višestruke post-translacijske modifikacije, npr. monoklonska antitijela 1,2,3,4,5 . Istraživanje Kurtzmana et al. 6,7 rezultiralo je reklasifikacijom P. pastoris rod kao Komagatella, uključujući podvrste K. phaffii i K. pastoris. Međutim, još uvijek se obično nazivaju P. pastoris. Posljednjih godina genetski alat za P. pastoris je značajno proširen s nekoliko novootkrivenih prirodnih promotora, sintetskih promotora i drugih regulatornih elemenata 8,9,10,11. Izgradnja optimiziranih sojeva i vektora omogućila je nove primjene, npr. proizvodnja metabolita ili ekspresija proteina koji nemaju specifične obrasce hipermanozilacije kvasca 12,13. Osim toga, u vrlo nedavnoj publikaciji Weninger et al. 14 prijavio prvi sustav CRISPR/Cas9 za P. pastoris otvarajući nove mogućnosti za pristupe genetskog inženjeringa.

Ipak, najčešće korišteni pristup za uvođenje ciljnog gena u P. pastoris još uvijek je integracija ekspresijske kasete u genom preko homologna rekombinacija. Najpopularnija meta za integraciju je AOX1 (alkohol oksidaza 1) lokus koji predstavlja jaču izraženu od dvije alkoholne oksidaze u P. pastoris. Ovaj pristup obično uključuje korištenje AOX1 promotor (strAOX1) kao homologna sekvenca i kao promotor ciljnog gena, jer nudi vrlo visoke razine ekspresije i čvrstu regulaciju 15 . Nakon uspješne integracije, ekspresija gena se može inducirati metanolom. Međutim, klon s netaknutim AOX1 može metabolizirati metanol višom brzinom, označenom kao “utilizacija metanola plus” (Mut + ), što komplicira održavanje stalne indukcije 16,17 . Stoga je primjena ekspresijskih kaseta s dvije homologne sekvence usmjerene na posredovanje zamjene AOX1 je jedna moguća tehnika. Knock-out mutacija AOX1 dovodi do fenotipa “sporo iskorištavanje metanola” (Mut S) koji olakšava kontrolu procesa i omogućuje odabir za ispravnu integraciju na temelju fenotipa.

Unatoč korištenju relativno dugih homolognih sekvenci (oko 1000 bp), uočena je velika varijacija u učinkovitosti ciljanja, što ukazuje na prevalenciju nehomolognog puta spajanja kraja (NHEJ) u P. pastoris 18,19,20 . Kao rezultat, nakon transformacije je pronađena visoka klonska varijabilnost, što zahtijeva vremenski i radno intenzivan proces probira za klon sa željenim karakteristikama 21,22. Što se tiče karakteristika produktivnosti, različite razine ekspresije klonova obično potječu od različitog broja kopija gena 23,24. Klonska varijabilnost smatra se inherentnim svojstvom P. pastoris koji je nusproizvod dostupnih i uspostavljenih tehnika transformacije u kombinaciji s jakim NHEJ putem u ovoj vrsti kvasca. Mnogi drugi kvasci, filamentozne gljive i viši eukarioti koji se koriste u biotehnološkim primjenama pokazuju slične ili izraženije klonske varijabilnosti zbog prevladavajućeg NHEJ puta 25,26,27, dok u modelu kvasca Saccharomyces cerevisiae homologna rekombinacija je dominantna nad NHEJ stazom 28 . Različite tehnike za smanjenje klonske varijabilnosti u P. pastoris predloženi su 14,18,20,29 . Međutim, nedostaci kao što su visoka složenost, niža sposobnost naprezanja ili još neu potpunosti realizirane metode za integraciju donorskih kaseta spriječile su ove tehnike da zamjene uvriježene za učinkovitu konstrukciju sojeva proizvođača. Stoga se uzastopni koraci genetske manipulacije, na pr. za izgradnju biosintetskih puteva, bili su razmjerno zahtjevni u P. pastoris a do sada je prijavljeno tek nekoliko prijava 30,31,32,33,34 . Do danas je humanizacija puta N-glikozilacije u P. pastoris putem višestrukih uzastopnih koraka kloniranja bio je najsofisticiraniji i najuspješniji poduhvat genetskog inženjeringa 13,35 . Slična su zapažanja napravljena i za druge nekonvencionalne kvasce poput Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis i Yarrowia lipolytica 25,36,37 .

U našoj prethodnoj studiji 24 usredotočili smo se na analizu klonske varijabilnosti pronađene u 845. P. pastoris sojevi transformirani s GFP ekspresijskom kasetom ciljanom za AOX1 zamjena. Probirom svih klonova na njihov Mut-fenotip, GFP produktivnost i broj kopija gena odabran je 31 klon sa zanimljivim značajkama za sekvenciranje genoma. Kombinacija eksperimentalnih i genomskih podataka omogućila je otkrivanje novih uvida u korelaciju između produktivnosti i integracijskog događaja. U većini slučajeva varijacije u produktivnosti mogu se pratiti do učinaka povezanih s brojem kopija gena. U klonovima s visokom produktivnošću nisu pronađene integracije izvan cilja, što sugerira da je utjecaj takvih događaja na produktivnost bio nizak.

Tijekom testa Mut-fenotipa otkriveni su sojevi koji su pokazali abnormalnu morfologiju kolonije na ploči. Neki od ovih klonova također su odabrani za sekvenciranje genoma. Ovdje raspravljamo o rezultatima za ove sojeve, razjašnjavajući niz još neprijavljenih događaja integracije izvan cilja. Osim poremećaja slučajnih gena, kointegracija DNA elemenata iz plazmida domaćina E coli KRX kao i preseljenje AOX1 otkriven je lokus na drugom kromosomu. Štetan učinak ovih događaja na genetski integritet i morfologiju soja predstavlja dodatno opterećenje za proces probira. Ova su zapažanja posebno relevantna za metabolički inženjering ili eksperimente nokautiranja u P. pastoris, dok su integracijski događaji detaljno opisani u našoj prethodnoj studiji 24 važniji za eksperimente usmjerene na stvaranje sojeva s visokim proizvođačem.

Posljednjih godina, metabolički inženjering nekonvencionalnog kvasca općenito i P. pastoris posebno je zadobio veći interes 11,38 . Stoga će razmatrani integracijski događaji i predložene teorije koje objašnjavaju njihovo podrijetlo omogućiti znanstvenicima koji rade na ovom području da modificiraju postojeće protokole transformacije i mutageneze kako bi izbjegli te događaje. Na temelju ove strategije može se smanjiti klonska raznolikost i realizirati složeniji procesi genetskog inženjeringa.


5. DRUGE BIOMOLEKULE KOJE PROIZVODI P. pastoris

The P. pastoris je također uspostavljena kao svestrana tvornica stanica za proizvodnju tisuća biomolekula kako u laboratorijskim tako iu industrijskim razmjerima. Neke od novih rekombinantnih bioloških molekula koje su eksprimirane u P. pastoris sustava navedeni su u tablici  6 .

Tablica 6

Pichia pastoris kao pogodan domaćin za proizvodnju rekombinantnih bioloških molekula

ProizvodKorišteni sojKorišteni vektorKorištenjeReferenca
Likopen i β‐karotenX�pGAPZADodaci hraniAraya‐Garay, Feijoo‐Siota, Rosa𠄍os‐Santos, Veiga𠄌respo i Villa (2012.)
PlektazinX�pPICZ㬚Antibakterijski peptidJ. Zhang i sur. (2011.)
Goveđi laktoferinKM71HpJ902Transferin i antibakterijski proteinIglesias𠄏igueroa i sur. (2016.)
Goveđi IFN‐αGS115pPIC9KPrevencija i terapija virusnih bolestiTu i sur. (2016.)
ApidaecinSMD1168pPIC9KAntibakterijski peptidX. Chen i sur. (2017.)
hPAB‐βGS115pPIC9KAntibakterijski peptidZ. Chen i sur. (2011.)
Tahiplesin IGS115pGAPZ㬛Antibakterijski peptidH. Li i sur. (2019.)
Snakin𠄁GS11pPIC9Antimikrobni peptidKuddus i sur. (2016.)
PAF102X�pGAPZAAntifungalni peptidPopa, Shi, Ruiz, Ferrer i Coca (2019.)
Pisum sativum obrambeni 1GS115pPIC9KAntifungalni peptidCabral, Almeida, Valente, Almeida i Kurtenbach (2003.)
Hitinaza I klaseKM71HpPICZ㬚Antifungalni peptidLandim i sur. (2017.)
Ch‐penaeidinKM71HpPIC9KAntimikrobni peptidL. Li i sur. (2005.)
HispidalinGS115pPICZ㬚Antimikrobni peptidMeng i sur. (2019.)
Fowlicidin𠄂X�pPICZ㬚Antimikrobni peptidXing i sur. (2016.)
Parasin IX�pPICZ㬚Antimikrobni peptidH. Zhao i sur. (2015.)
CecropinA‐thanatinX�pPICZ㬚Antimikrobni peptidZ. Liu i sur. (2018.)
Kolagen tipa I Vezivno tkivoNokelainen i sur. (2001.)
Ljudski serumski albuminGS115pPIC9KOdržavanje osmolarnosti i nosača u krviW. Zhu i sur. (2018.)
LegumainX�pPICZ㬚Lizosomska proteazaT. Zhao i sur. (2018.)
Kozji kimozinX�pPICZ㬚Hidroliza κ‐kazeinaTyagi i sur. (2016.)
Protein protiv smrzavanja mrkveGS115pPIC9KInhibicija propadanja glutenaM. Liu i sur. (2018.)
ProinzulinSuperMan5pPICZ㬚Liječenje dijabetes melitusaBaeshen i sur. (2016.)
hIFN‐γX�, GS115, KM71H, CBS7435pPICZα, pPIC9, pPpT4aSKritični citokin za urođeni i adaptivni imunitetRazaghi i sur. (2017.)
IL𠄁βGS115, SMD1168, X�pPICZ𠄊Proupalni citokinLi i sur. (2016.)
IL𠄃X�pPICZ㬚Multipotentni hematopoetski citokinDagar i Khasa (2018.)
IL�GS115pPINKαHCTrombopoetski faktor rastaYu i sur. (2018.)
IL�X�pPICZ㬚Diferencijacija i proliferacija T, B i NK stanicaW. Sun i sur. (2016.)
Cijanat hidratazaGS115pPICZ㬚Detoksikacija cijanata i cijanidaRanjan, Pillai, Permaul i Singh (2017.)
Ljudsko antitrombocitno scFv protutijeloX�pPICZ㬚Liječenje aterosklerozeVallet𠄌ourbin et al. (2017.)
α𠄊milazaX�pPICZ㬚Saharifikacija škrobaParashar i Satyanarayana (2017.)
Ljudski epidermalni faktor rastaGS115pPIC9KStvaranje novih epitelnih i endotelnih stanicaEissazadeh i sur. (2017.)
bromelainKM71HpPICZ㬚Edematozne oteklineLuniak, Meiser, Burkart i Müller (2017.)
Faktor rasta keratinocitaX�pPICZ㬚Epitelizacija�za cijeljenja raneKalhor (2016.)
DM64X�pPICZ㬚Anti‐miotoksičnoVieira, da Rocha, da Costa Neves�rreira, Almeida i Perales (2017.)
TripsinGS115pPIC9KHidroliza proteina u probavnom sustavuY. Zhang i sur. (2018.)
Ljudska sijaliltransferazaKM71HpPICZ㬛Farmakološke primjeneLuley‐Goedl i sur. (2016.)
transglutaminazaGS115pPIC9KRestrukturirani proizvodi od mesaX. Yang i Zhang (2019.)
StreptokinazaX�pPICZ㬚Trombolitički lijekDagar, Devi i Khasa (2016.)
StafilokinazaGS115, KM71HpPICZ㬚Trombolitički lijekFaraji i sur. (2017.)
TFPR1X�pPICZ㬚AdjuvansNing i sur. (2016.)

Kratice: hIFN‐γ, ljudski interferon γ IL, interleukin NK, prirodni ubojica.


Koraci u kloniranju gena

Osnovnih 7 koraka uključenih u kloniranje gena su:

  1. Izolacija fragmenata DNA [gena od interesa] za kloniranje.
  2. Umetanje izolirane DNA u odgovarajući vektor za stvaranje rekombinantne DNA.
  3. Uvođenje rekombinantne DNA u odgovarajući organizam poznat kao domaćin.
  4. Odabir transformiranih stanica domaćina i identifikacija klona koji sadrži gen od interesa.
  5. Umnožavanje/ekspresija unesenog gena u domaćina.
  6. Izolacija višestrukih kopija gena/proteina izraženog genom.
  7. Pročišćavanje izolirane kopije gena/proteina

A. Izolacija DNA fragmenta ili gena

  • Ciljna DNK ili gen koji se kloniraju moraju se prvo izolirati. Gen od interesa je fragment gena čiji nas proizvod (protein, enzim ili hormon) zanima. Na primjer, gen koji kodira hormon inzulin.
  • Željeni gen može se izolirati korištenjem enzima restrikcijske endonukleaze (RE), koji reže DNA na specifičnim prepoznavajućim nukleotidnim sekvencama poznatim kao restrikcijska mjesta prema unutarnjoj regiji (dakle endonukleaza) stvarajući tupe ili ljepljive krajeve.
  • Ponekad se također može koristiti enzim reverzne transkriptaze koji sintetizira komplementarni lanac DNA željenog gena koristeći njegovu mRNA.

B. Odabir prikladnog vektora za kloniranje

  • Vektor je molekula nosača koja može prenijeti gen od interesa (GI) u domaćina, tamo se replicirati zajedno s GI čineći svoje višestruke kopije.
  • Vektori za kloniranje ograničeni su na veličinu umetka koju mogu nositi. Ovisno o veličini i primjeni umetka odabire se odgovarajući vektor.
  • Različite vrste vektora dostupnih za kloniranje su plazmidi, bakteriofagi, bakterijski umjetni kromosomi (BAC), umjetni kromosomi kvasca (YAC) i umjetni kromosomi sisavaca (MAC).
  • Međutim, najčešće korišteni klonirajući vektori uključuju plazmide i bakteriofage (fag λ) pored svih drugih dostupnih vektora.

C. Bitne karakteristike vektora za kloniranje

Svi klonirajući vektori su molekule DNA nosača. Ove molekule nosača trebale bi općenito imati nekoliko zajedničkih značajki kao što su:

  • Mora se samoreplicirati unutar stanice domaćina.
  • Mora posjedovati jedinstveno restriktivno mjesto za RE enzime.
  • Uvođenje donorskog fragmenta DNA ne smije utjecati na replikacijska svojstva vektora.
  • Mora posjedovati neki markerski gen tako da se može koristiti za kasniju identifikaciju rekombinantne stanice (obično gen otpornosti na antibiotike koji je odsutan u stanici domaćinu).
  • Treba ih lako izolirati iz stanice domaćina.

D. Stvaranje rekombinantne DNA

  • Plazmidni vektor se otvara istim RE enzimom koji se koristi za izolaciju fragmenta donora DNA.
  • Mješavina donorskog DNA fragmenta i plazmidnog vektora se pomiješaju.
  • U prisutnosti DNA ligaze dolazi do sparivanja baza donora DNA fragmenta i vektora plazmida.
  • Rezultirajuća molekula DNK je hibrid dviju molekula DNK – GI i vektora. U terminologiji genetike ovo miješanje različitih lanaca DNK naziva se rekombinacija.
  • Stoga se ova nova hibridna molekula DNA također naziva rekombinantna molekula DNA, a tehnologija se naziva tehnologija rekombinantne DNK.

E. Transformacija rekombinantnog vektora u pogodnog domaćina

  • Rekombinantni vektor se transformira u prikladnu stanicu domaćina uglavnom, bakterijsku stanicu.
  • To se radi iz jednog ili oba sljedeća razloga:
    • Replicirati rekombinantnu molekulu DNA kako bi se dobile višestruke kopije GI.
    • Omogućiti ekspresiju GI tako da proizvodi svoj potrebni proteinski proizvod.
    • Neke bakterije su prirodno transformabilne i automatski preuzimaju rekombinantni vektor.

    Na primjer: Bacil, Haemophilus, Helicobacter pylori, koji su prirodno kompetentni.


    Ekspresija rekombinantnih proteina u Pichia Pastoris

    Pichia pastoris se intenzivno i uspješno koristi za ekspresiju rekombinantnih proteina. U ovom pregledu sažimamo elemente potrebne za ekspresiju heterolognih proteina i raspravljamo o različitim čimbenicima u primjeni ovog sustava za ekspresiju proteina. Ovi elementi uključuju vektore, sojeve domaćina, integraciju heterolognih gena u genom, faktore sekrecije i profil glikozilacije. Konkretno, raspravljamo i ocjenjujemo nedavni napredak u optimizaciji procesa fermentacije radi poboljšanja prinosa i stabilnosti eksprimiranih proteina. Optimizacija se može postići kontrolom sastava medija, pH, temperature i otopljenog kisika, kao i indukcijom metanola i načinom napajanja.

    Ovo je pregled sadržaja pretplate, pristup preko vaše institucije.


    Rezultati i rasprava

    ZlatniPiCS, naš Golden Gate P. pastoris klonirajući sustav, sastoji se od tri razine hijerarhijske okosnice (BB) za fleksibilno stvaranje prekomjerno ekspresijskih plazmida koji sadrže više transkripcijskih jedinica (do osam po plazmidu), četiri različita selekcijska markera i pet lokusa bilo za ciljanu integraciju genoma ili epizomalno održavanje plazmida (slika 1. ). Sustav smo uglavnom dizajnirali kako bismo omogućili napredni stanični inženjering ili ekspresiju cijelih metaboličkih putova. U najnižoj razini kloniranja, pojedinačni dijelovi kao što su promotori, kodirajuće sekvence (npr. reporteri ili GOI) i terminatori transkripcije su ugrađeni u plazmide okosnice 1 (BB1), koji se zatim spajaju u jednu transkripcijsku jedinicu u BB2. Nakon toga slijedi sastavljanje višestrukih ekspresijskih jedinica u jedan BB3, koji je dizajniran za naknadnu integraciju genoma u P. pastoris (dostupna su četiri različita selekcijska markera i četiri lokusa za ciljanu integraciju genoma). Suprotno drugim tehnikama kloniranja, Golden Gate Assembly izbjegava potrebu za pretjeranim sekvenciranjem, jer se konstrukti BB2 i BB3 sklapaju ligacijom umjesto PCR-om s preklapanjem (samo BB1 umetci zahtijevaju sekvenciranje nakon sklapanja). Ispravna ligacija je osigurana definiranim fuzijskim mjestima (vidi sliku 1): Mjesta fuzije Fs1 do Fs4 povezana su s pojedinačnim dijelovima PCR-om i potrebna za njihovo sklapanje u transkripcijsku jedinicu (BB2), npr. promotori s kodirajućim sekvencama ('CATG', fuzijsko mjesto Fs2). Mjesta fuzije FsA do FsI koriste se za sklapanje višestrukih ekspresijskih jedinica u BB3, npr. za spajanje prve jedinice transkripcije s drugom („CCGG”, mjesto fuzije FsB). Različiti BB3 vektori s fuzijskim mjestima FsA-FsC, FsA-FsD, do FsA-FsI dizajnirani su za sastavljanje dvije, tri, … do osam transkripcijskih jedinica u jednom plazmidu. Unutarnji Bsaja i BpiI restrikcijska mjesta moraju se ukloniti u svim modulima uvođenjem točkastih mutacija, s obzirom na korištenje kodona P. pastoris.

    Strategija montaže i razine hijerarhijske okosnice sustava kloniranja GoldenMOCS i GoldenPiCS. U općoj platformi GoldenMOCS neovisnoj o mikroorganizmima, DNK proizvodi (sintetička DNK, PCR proizvodi ili oligonukleotidi) integrirani su u BB1 pomoću BsaI Golden Gate montažna i fuzijska mjesta Fs1, Fs2, Fs3 i Fs4. Mjesta fuzije označena su kao okviri u boji s odgovarajućim brojem ili slovom fuzijskog mjesta. Osnovni genetski elementi sadržani u kralježnici 1 (BB1) mogu se sastaviti u primatelju BB2 izvođenjem BpiI GGA reakcija. Jedinice za transkripciju u BB2 se dalje koriste za BsaSastavljam u multigenske BB3 konstrukte. Pojedinačne transkripcijske jedinice mogu se dobiti izravno BpiSastavljam u primatelja BB3 s fuzijskim mjestima Fs1-Fs4. Mjesta fuzije određuju položaj modula i transkripcijskih jedinica u sastavljenim konstrukcijama. Stoga se fuzijska mjesta Fs1 do Fs4 koriste za konstruiranje pojedinačnih ekspresijskih kaseta u BB2 i potrebna su između promotora (Fs1-Fs2), CDS (Fs2-Fs3) i terminatora (Fs3-Fs4). Mjesta fuzije FsA do FsI dizajnirana su za konstruiranje BB3 plazmida i odvajanje različitih ekspresijskih kaseta jedna od druge. FS-ovi su gotovo nasumično odabrani nizovi i samo FS2 ima posebnu funkciju, jer uključuje početni kodon ATG. ZlatniPiCS dodatno uključuje module koji sadrže BB1 ​​specifične za P. pastoris: 20 promotora, 1 reporter gen (eGFP) i 10 terminatora transkripcije, i primateljski BB3 vektori koji sadrže različite lokuse integracije za stabilnu integraciju genoma u P. pastoris i prikladne kasete za otpornost (dodatna datoteka 2)

    Ranije je inženjering deformacija pristupao s P. pastoris često se oslanjaju na pGAPz, pPIC6 (Invitrogen) ili srodne ekspresijske vektore, koji sadrže samo jednu transkripcijsku jedinicu (slika 2). Pokazalo se da je kloniranje konkatemera koji sadrže više od dvije transkripcijske jedinice dugotrajno, a također je dovelo do nepredvidivih integracijskih događaja pri korištenju ponavljajućih sekvenci promotora i terminatora [23, 24]. Stoga konvencionalna prekomjerna ekspresija n geni zahtijevaju n ciklusi pripreme kompetentnih stanica i njihove transformacije te korištenje n različiti odabirni markeri. Za prekomjernu ekspresiju tri čimbenika plus skrining korištenjem uzastopnih transformacija, postupak bi trajao najmanje 31 dan (četiri dana za transformaciju i ponovni niz, pet dana za probir i dva dana za pripremu kompetentnih stanica, slika 2, gornja ploča). Nadalje, selekcioni markeri se mogu ukloniti i reciklirati, uz trošak dodatnog ciklusa kompetentne izrade i transformacije (slika 2, srednja ploča). Uz to, mora se uključiti korištenje različitih lokusa integracije kako bi se spriječili incidenti 'loop-out' integrirane DNK. Alternativno, može se razmotriti ko-transformacija više vektora, ali to zahtijeva korištenje nekoliko neovisnih selekcijskih markera, inače je prema našem iskustvu učinkovitost transformacije niska i vrlo je nepredvidivo ako se svi vektori integriraju u genom [25]. Naši okosnici BB3 Golden Gate plazmidi mogu nositi više transkripcijskih jedinica i stoga značajno pojednostaviti i skratiti proceduru na jedan jedini korak transformacije. Integracija više transkripcijskih jedinica plus skrining traje samo devet dana (slika 2, donja ploča). Tako nastali sojevi imaju koristi od smanjenog broja generacija i blažih selekcijskih postupaka.

    Usporedba konvencionalnih i Golden Gate strategija inženjeringa sojeva za P. pastoris. Prekomjerna ekspresija višestrukih gena (GOI) u P. pastoris korištenje konvencionalnih plazmida za kloniranje zahtijeva nekoliko krugova kompetentne izrade (2 dana), transformacije (4 dana uključujući drugu traku) i kloniranja (5 dana) i traje najmanje 31 dan za tri gena s tri selekcijska markera. Alternativno, više vektora može se ko-transformirati odjednom, ali rezultirajuća učinkovitost transformacije obično je vrlo niska, a klonska varijacija se povećava. Odgovarajuća bočna mjesta za odabir markera (loxP ili FRT mjesta) omogućuju recikliranje markera rekombinazama (Cre ili Flp, respektivno), ali zahtijevaju još jedan krug kompetentne izrade i transformacije koja traje najmanje osam dodatnih dana. Plazmidi Golden Gate nose nekoliko transkripcijskih jedinica odjednom i na taj način omogućuju transformaciju i skrining u samo devet dana

    Događaji rekombinacije ponavljajućim sekvencama remete punu integraciju vektora u P. pastoris

    U početku smo započeli s vektorima Golden Gate koji nose do četiri transkripcijske jedinice s istim promotorom i terminatorom transkripcije (P GAP i ScCYC1tt). Visoka klonska varijacija potaknula nas je da analiziramo brojeve kopija gena (GCN) integriranih gena i otkrili smo da su pojedinačne transkripcijske jedinice izgubljene. Slični rezultati dobiveni su sa P GAP ili P AOX1 temeljeni na višekopijskim vektorima [24], pokazujući na taj način da nepotpuna integracija vektora nije posljedica okosnice Golden Gatea. Pozitivno smo potvrdili post-transformacijsku integracijsku stabilnost za tri transformanta u tri uzastopna kultiviranja u tikvici za protresanje bez selekcijskog pritiska (brojevi kopija gena bili su stabilni za više od 15 generacija Dodatna datoteka 1: Tablica S1). Stoga zaključujemo da se ponavljajuće homologne sekvence unutar ekspresijskog vektora (P GAP i ScCYC1tt sekvence) rezultirale su događajima rekombinacije (unutarnji 'loop out') tijekom transformacije.

    Velika pojava nepotpune integracije vektora potaknula nas je da uspostavimo kolekciju od 20 različitih promotora i 10 terminatora transkripcije (Tablica 1), kako bismo izbjegli ponavljanje sekvenci pri stvaranju konstrukta koji nose više ekspresijskih jedinica. Promotori i terminatori odabrani su na temelju regulacije transkripcije i snage ekspresije njihovih nativno kontroliranih gena u objavljenim eksperimentima s mikromrežama [26]. Svi su pregledani u nekoliko uvjeta relevantnih za proizvodnju (Dodatna datoteka 1: Tablica S2). Uz etablirane promotore [3, 12], odabrali smo nove, još nekarakterizirane sekvence promotora na temelju njihovog ponašanja ekspresije u transkriptomskim podacima iz P. pastoris stanice kultivirane na različitim izvorima ugljika [26]. Primjenom ove zbirke željeli smo steći sposobnost finog podešavanja ekspresije integriranih gena. U idealnom slučaju, promotori za potrebe staničnog inženjerstva trebali bi pokrivati ​​širok raspon ekspresijskih snaga i omogućiti konstitutivnu, kao i podesivu ekspresiju. Terminatori transkripcije odabrani su od konstitutivno visoko eksprimiranih gena [26], od kojih su mnogi izvedeni iz gena ribosomskih proteina. Također je zabilježeno da su ribosomski geni regulirani na razini stabilnosti mRNA [27], što je jedna od glavnih funkcija 3’UTR sadržanog u fragmentima terminatora transkripcije.

    Validacija mutacija Kozakove sekvence u P GAP slijed od P. pastoris

    U GoldenMOCS postavci, fuzijsko mjesto Fs2 koje povezuje promotor s GOI sadrži početni kodon ATG i dio Kozakove sekvence, što je važno za inicijaciju translacije u eukariota. Budući da je ovo mjesto fuzije fiksna varijabla u sustavu Golden Gate, procijenili smo učinak položaja '-1' P GAP promotor (položaj ispred startnog kodona, slika 3d) o ekspresiji reporterskog gena u P. pastoris. Zbog "CATG" mjesta fuzije, izvorno "A" na poziciji "-1" P GAP promotor ('-8' do '-1': AAAACACA) se mijenja u 'C' (AAAACACC). Dok P GAP varijante s 'A', 'T' i 'C' na poziciji '-1' bile su slične, varijanta s 'G' rezultirala je nižom razinom eGFP (P GAP_GATG oko 40% niži u odnosu na ostale varijante). Kozakov konsenzusni slijed od P. pastoris je analiziran i utvrđeno je da je sličan onom od S. cerevisiae, which is rich in ‘A’ and poor in ‘G’ bases (Fig. 4). Based on these results, eight bases of the A-rich Kozak consensus sequence were tested in an additional P GAP variant (P GAP_A8ATG position ‘-4’ and ‘-2’ replaced by ‘A’: AAAAAAAA) and a slightly increased expression of eGFP was found (Fig. 3d). Nevertheless, we chose the ‘CATG’ fusion site for our GoldenPiCS system and kept the ‘GCTT’ fusion site for the GOI-terminator assembly.

    Relative eGFP levels obtained with various elements of the GoldenPiCS toolbox. Expression strength of different promoters in comparison to P GAP tested on different carbon sources (a, b), expression levels for P GAP-controlled expression in combination with different transcriptional terminators (c), and comparison of P GAP variants with alternative ‘-1’ nucleotides (d). Najmanje 10 P. pastoris clones were screened to test promoter and terminator function in up to four different conditions: glycerol and glucose excess as present in batch cultivation (“G”, “D”), limiting glucose (“X”) and methanol feed (“M”), both representing fed batch. P GAP do P SHB17 were tested in ‘G’, ‘D’, ‘X’ and ‘M’ (A). P TEF2 do P PFK300 were validated in ‘D’, while P GUT1, P THI11 and MUT-related promoters were tested in putative repressed and induced conditions (‘D’/‘G’, ‘D’+/−100 μM thiamine and ‘D’/M, respectively) (B). P GAP variants with alternative ‘-1’ bases were analyzed in glucose excess (‘D’). Relative eGFP levels are related to P GAP- controlled expression (A, B), terminator ScCYC1tt (B), or presented as relative value (C)


    Gledaj video: CAPRICORN NOVEMBER 2021-OBSESSIVELY STALKING YOU CAUSE THEY DONT HAVE A LIFE IN THE REAL WORLD (Kolovoz 2022).