Informacija

5.15: Fiksacija dušika - Biologija

5.15: Fiksacija dušika - Biologija



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

5.15: Fiksacija dušika

N2 fiksiranje i cikliranje u Alnus glutinosa, Betula pendula i Fagus sylvatica šuma izložena slobodnom zraku CO2 obogaćivanje

Mjerili smo učinak povišenog atmosferskog CO2 na atmosferski dušik (N2) fiksacija u vrstama drveća Alnus glutinosa raste u monokulturi ili u mješavini s ne-N2-fiksiranje vrsta drveća Betula pendula i Fagus sylvatica. Bavili smo se hipotezama da (1) N2 fiksacija u A. glutinosa će se povećati kao odgovor na povećanje atmosferskog CO2 koncentracije, pri uzgoju u monokulturi, (2) utjecaj povišenog CO2 na N2 fiksacija u A. glutinosa je isti u smjesi i u monokulturi i (3) utjecaji povišenog CO2 na N ciklus će biti vidljivo smanjenjem lista δ 15 N i faktorom obogaćivanja tla i lista (EF), te da se ti utjecaji neće razlikovati između sastojina mješovitih i pojedinačnih vrsta. Stabla su uzgajana u šumskom nasadu na nekadašnjim poljoprivrednim poljima četiri vegetacijske sezone, nakon čega su stabla bila u prosjeku visoka 3,8 m i došlo je do zatvaranja krošnje. Atmosferski CO2 koncentracije su se održavale na ambijentalnim ili povišenim (za 200 ppm) koncentracijama pomoću CO u slobodnom zraku2 sustav obogaćivanja (FACE). List δ 15 N je izmjeren i korišten za procjenu količine (Ndfa) i udio (%Ndfa) od N dobivenog atmosferskom fiksacijom. U prosjeku, 62% N in A. glutinosa lišće je bilo od fiksacije. %Ndfa i Ndfa za A. glutinosa stabla u monokulturi nisu porasla pod povišenim CO2, unatoč većim stopama rasta. Međutim, N2 fiksacija se povećala za stabla koja rastu u mješavini, unatoč izostanku značajne stimulacije rasta. Bilo je dokaza da je N2 je prebačen iz A. glutinosa do F. sylvatica i B. pendula, ali nema dokaza da je to utjecalo na njihov CO2 odgovor. Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je N2 fiksacija u A. glutinosa može biti viši u budućem povišenom CO2 svijeta, ali da će se taj učinak dogoditi samo tamo gdje stabla rastu u sastojinama mješovitih vrsta.

Ovo je pregled sadržaja pretplate, pristup preko vaše institucije.


BIOGEOKEMIJA DUŠIKA U OLIGOHALINSKOJ ZONI NOVE ENGLESKOG USTUARA.

Sažetak. Istraživali smo kruženje dušika u zoni oligohalina (područje niske slanosti gdje riječna voda prvi put ulazi u estuarij) ušća rijeke Parker u sjeveroistočnom Massachusettsu. Uveli smo izotopski tragač ([N.sup.15]-[[NO.sub.3].sub.-]) tijekom 27 dana u kolovozu 1996. kako bismo pomogli utvrditi kako se dušik iz vododjelnice kreće kroz gornji estuarij. Količina dodanog obilježivača bila je dovoljna za izotopsko obogaćivanje nitrata za [tilde]100% [MATEMATIČKI IZRAZ NIJE REPRODUKTIVAN U ASCII] u blizini dodatka, ali nije značajno utjecao na koncentraciju nitrata. Tijekom tipičnih ljetnih uvjeta niskog protoka koji su se dogodili tijekom razdoblja dodavanja, u osnovi su svi riječni nitrati (uključujući tragač nitrata) brzo uklonjeni iz vodenog stupca od strane planktonske dijatomeje Actinocyclus normanii. Izvoz tragova dolje u ušće bio je nizak tijekom razdoblja dodavanja izotopa, dijelom zbog niskog protoka rijeke. Umjesto toga, većina dušika koji je izvorno asimilirao A. normanii prebačen je u sedimente u oligohalnoj zoni. Potreba za dušikom u fitoplanktonu tijekom ljeta premašila je riječnu opskrbu za red veličine. Dodatni dušik dolazi uglavnom iz regeneracije bentoskog dušika, iako je dio možda došao iz podzemnih voda. Ovdje primijenjen pristup praćenja izotopa cijelog ekosustava bio je moćno sredstvo za istraživanje sudbine dušika dobivenog iz sliva u gornjem estuariju.

Ključne riječi: Actinocyclus normanii dijatomeje estuarij kopno-rubni ekosustav Massachusetts (SAD) [N.sup.15] kruženje dušika oligohalna zona fitotankton silika stabilni izotop kopneno-vodena veza.

Unosi dušika u slivove na sjeveroistoku Sjedinjenih Država uvelike su se povećali od europskog naseljavanja početkom 1600-ih. Primarni izvori dodanog dušika su atmosfersko taloženje, poljoprivredna gnojiva i otpadne vode (Nixon i Pilson 1983, Lee i Olsen 1985, Valiela i sur. 1997). Velik dio ovog dodatnog dušika zadržava se ili denitrificira u slivu, ali znatna količina ulazi u podzemne vode i rijeke i na kraju se isporučuje u estuarije i ocean (Galloway et al. 1995., Howarth et al. 1996.).

Utjecaj povećanog unosa dušika može biti osobito značajan u estuarijima. Budući da se hranjive tvari dobivene iz sliva transportiraju u te ekosustave i fokusiraju na njih, ušća su među najgnođenijim ekosustavima na zemlji (Nixon i sur. 1986., Valiela i sur. 1997.). Produktivnost u estuarijima često je ograničena dušikom, pa povećani unos dušika može potaknuti rast algi i zauzvrat utjecati na druge aspekte funkcioniranja ekosustava (Hopkinson i Vallino 1995.). Na primjer, visoko opterećenje dušikom povezano s proljetnim otjecanjem u zaljevu Chesapeake podržava cvjetanje fitoplanktona, a recikliranje dušika zadržanog u cvatu dovodi do odgođenog maksimuma produktivnosti ljeti (Malone i sur. 1988., Harding 1994.). Iako povećana proizvodnja algi koja je rezultat antropogenog punjenja dušikom može imati korisne posljedice kao što je povećana proizvodnja ribe (Keller i sur. 1990.), ona također može dovesti do hipoksije u pridnenim vodama, što može biti razorno za ribu i drugu biotu (Dauer i sur. 1992, Justic i dr. 1993, Breitburg i dr. 1994, Justic i dr. 1995).

Budući da interakcije hidrologije, geomorfologije i biologije uvelike kompliciraju kruženje dušika u estuarijima, nedostaje potpuno razumijevanje biogeokemije dušika u estuarijima. Iako je postignut veliki napredak, nesigurnosti u detaljima obrade dušika ometaju našu sposobnost predviđanja učinaka povećanog opterećenja dušikom. Ove neizvjesnosti naglašavaju nužnost daljnjeg istraživanja dinamike dušika u obalnim ekosustavima i sugeriraju da bi mogli biti potrebni novi pristupi.

Cilj ove studije bio je istražiti kruženje dušika u gornjem estuariju, ili oligohalnoj zoni, ušća rijeke Parker u sjeveroistočnom Massachusettsu (slika 1). Studija se sastojala od dodatka traga za cijeli ekosustav [N.sup.15]-[[NO.sub.3].sup.-] dizajniranog da istraži (1) biogeokemijsko kruženje dušika i (2) trofičke puteve u gornjim estuarija. Ovaj se rad usredotočuje na biogeokemijske aspekte studije, a prateći rad naglašava strukturu mreže hrane (Hughes et al. 2000). Usredotočili smo se na gornji estuarij jer je to područje koje je najtješnje povezano sa slivnim područjem i stoga je prvi doseg za obradu unosa riječnog dušika. U usporedbi s morskim dijelovima ušća, oligohalnoj zoni je posvećeno relativno malo pažnje (Anderson 1986., Schuchardt et al. 1993.). Osim biogeokemijskog značaja oligohalne zone kao tampon ili ekoton između razvodnog područja i donjeg ušća i oceana, nisko salinitetne vode gornjeg estuarija kritične su za životnu povijest mnogih organizama u estuariju (Odum 1988, Deegan i Garritt 1997). Povećano proučavanje gornjeg ušća donijet će bolje razumijevanje funkcioniranja estuarija u cjelini, kao i olakšati učinkovito upravljanje tim vodama.

Ušće rijeke Parker (slika 1) dio je estuarskog sustava Plum Island Sound (42°44' N, 70°50' W) u sjeveroistočnom Massachusettsu. Sliv ušća rijeke Parker, 65 [km.sup.2] iznad brane na vrhu ušća, pretežno je pošumljen i ima umjerenu stambenu razvijenost. Ukupna duljina ušća je [tilde] 24 km, s tim da oligohalna zona nominalno zauzima početnih 5 km. Naša definicija oligohalne zone ili gornjeg estuarija temelji se na razmatranjima kao što su distribucija saliniteta i sastav vrsta. Salinitet u gornjem estuariju je općenito [manji od] 10 (slanost je data kao omjer [UNESCO 1985], vodljivost [tilda] 15 mS/cm) i biota uključuje tipično slatkovodne organizme, kao i estuarijske i morske vrste. Srednja amplituda plime i oseke u gornjem estuariju je [tilda] 2,7 m, a plimna ekskurzija je 2-4 km. Prosječni godišnji unos slatke vode iz rijeke Parker je 1,2 [m.sup.3]/S, ali je tijekom ljeta protok niži (općenito 0,1-0,5 [m.sup.3]/s).

Gornji estuarij ima jedan glavni kanal koji vijuga kroz opsežne slatke i slane močvare (slika 1.). Površina gornjih 5 km estuarskog kanala je [tilde]223 650 [m.sup.2] (J. Vallino, osobno priopćenje). Močvarna vegetacija uglavnom se sastoji od rogoza (Typha latifolia) i šaša (Scirpus americana i Carex sp.), a uz obalu potoka javlja se slana močvarna trava (Spartina alterniflora). Primarna proizvodnja u kanalu je pretežno fitoplankton, a pelagična dijatomeja Actinocyclus normanii dominira primarnom proizvodnjom tijekom ljetnog cvjetanja, a sekundarno mikrofitobentos. Najzastupljeniji zooplankton su Eurytemora affinis i Acartia tonsa, a među uobičajene ribe spadaju mumičog (Fundulus heteroclitus), bijela sisa (Catostomus commersoni), bijeli smuđ (Morone americana) i atlantski srebrnjak (Menidia menidia). Potpuniji opis biote oligohalne zone ušća rijeke Parker nalazi se u Hughes et al. (2000) i Deegan i Garritt (19 97).

Prvi pokušaj eksperimenta započeo je 10. srpnja 1996., ali je prekinut nakon 4 dana zbog velike oluje. Uspješno dodavanje [N.sup.15]-[[NO.sub.3].sup.-] počelo je 6. kolovoza 1996. i nastavilo se do 1. rujna 1996. Izotop je dodavan kontinuirano preko peristaltičke pumpe osim [tilde]24 -h prekid (26-27 kolovoza) kada je crpka otkazala. Izotopski tragač bio je u obliku [N15]-obogaćenog [KNO3] i dodan je brzinom od 4,8 g [N15]/d (128 g [N.sup. 15] ukupno). Rhodamine WT, fluorescentna boja, dodana je s izotopom kako bi se omogućila usporedba ponašanja relativno konzervativnih (rodamin) i reaktivnih (nitrat) otopljenih tvari. Otopina rodamina/izotopa dodana je 2 km prema moru od male brane koja definira vrh estuarija (slika 1). Volumen vode u koju je dodan izotop, tj. "plimna prizma" na mjestu dodavanja izotopa, je [tilde] 130 000 [m.sup.3]. Uzorkovanje je započelo prije dodavanja izotopa kako bi se utvrdile osnovne zalihe dušika i izotopske vrijednosti i nastavilo se [tilde] 1 mjesec nakon završetka dodavanja [N.sub.15].

Unosi rijeke u gornji estuarij određeni su korištenjem podataka Geološkog zavoda Sjedinjenih Država (USGS) s mjerne postaje na rijeci Parker [tilda] 2 km uzvodno od vrha ušća (USGS broj postaje 01101000). Uzimali smo u obzir ulazne podatke iz neizmjerenog dijela sliva između brane i kolosijeka pretpostavkom konstantnog omjera površine i otjecanja. Unosi nitrata, amonijaka i silicija u gornji estuarij procijenjeni su povremenim uzorkovanjem riječne vode koja teče preko brane. Kada koncentracije amonija i nitrata nisu mjerene istovremeno, tok otopljenog anorganskog dušika (DIN) izračunat je interpolacijom koncentracija amonija između uzastopnih uzoraka ili uz pretpostavku da je koncentracija amonija konstantna na 1,2 [mikro]mol/L nakon 19. rujna.

Uzorkovanje i analitički postupci

Sastojci vodenog stupa uzorkovani su u intervalima od 1 km duž uzdužnog transekta od 10 km koji počinje na vrhu ušća. Lokacije uzoraka označene su udaljenosti u kilometrima duž toka rijeke, počevši odmah ispod brane (0 km) i povećavajući se u smjeru dolje-estuarija. U razdoblju od 2 mjeseca provedeno je 15 transekata uzorkovanja. Uzorci za koncentracije hranjivih tvari, koncentracije organskog dušika u česticama (PON) i izotopsko obogaćivanje te klorofil a (chla) prikupljeni su na svakoj stanici za uzorkovanje, dok su druge vrste uzoraka (fitoplankton, [N.sup.15]-[[NO.sub .3].sup.-] i [N.sup.15]-[[NH.sup.4].sup.+] su prikupljani rjeđe. Osim ovih uzoraka, temperatura i vodljivost, te povremeno koncentracija rodamina Hidrološko vrijeme zadržavanja u gornjih 5 km estuarija izračunato je iz riječnog protoka (Vallino i Hopkinson 1998).

Otopljeni kisik (DO), dubina, vodljivost i temperatura mjereni su i bilježeni u intervalima od 15 minuta na mjestu dodavanja izotopa pomoću ISCO/YSI autosampler/data logger. Ove varijable su zabilježene tijekom 2-mjesečnog razdoblja studije, osim 19-satnog razdoblja od 2. do 3. kolovoza i 4-dnevnog razdoblja od 23. do 27. kolovoza kada bilježenje podataka nije uspjelo.

Uzorci vode iz transekta prikupljeni su pomoću peristaltičke pumpe na baterije i opremljene inline GF/F filterom. Uzorci su pohranjeni na ledu do povratka u laboratorij. Klorofil i PON sakupljeni su na filterima od staklenih vlakana (Whatman GF/F, promjera 47 i 25 mm). Fitoplankton je sakupljen vučenjem mreže (promjer 25 cm, otvor mreže 20 µm) 2 minute iza malog čamca.

Nutrijenti su analizirani u privremenom laboratoriju na akademiji Governor Dummer, Byfield, Massachusetts, 1 km od mjesta istraživanja. Svi uzorci hranjivih tvari analizirani su na nitrate, a odabrani uzorci također su analizirani na amonij, DON i silicij. Nitrat je analiziran detekcijom kemiluminiscencije nakon redukcije nitrata u NO korištenjem vanadijevog klorida (Garside 1982, Braman i Hendrix 1989). Amonij je mjeren ručno (Solorzano 1969), DON je određen nakon UV-oksidacije (Walsh 1989), a chla je analiziran kolorimetrijski (Strickland i Parsons 1972). Otopljeni silicij analiziran je u laboratoriju za okoliš Horn Point na Sveučilištu Maryland, koristeći molibdatno plavu metodu (Strickland i Parsons 1972) modificiranu za korištenje s autoanalizatorom. Koncentracija PON-a izračunata je spektrometrijskim određivanjem sadržaja dušika na GFIF filterima.

Izotopski sastavi dušika amonija i nitrata mjereni su modifikacijama postupka difuzije amonijaka (Sigman i sur. 1997., Holmes et al. 1998.). Za procjenu izotopskog sastava DON-a, izmjerili smo [delta][N.sup.15]-TDN i izračunali [delta][N.sup.15]-DON koristeći izmjerene vrijednosti (vidi sljedeći odlomak) i koncentracije nitrata i amonijaka . Izotopski sastav PON-a određen je izgaranjem cijelog filtera od 25 mm. Fitoplankton je odvojen od detritusa prije izotopske analize korištenjem kombinacije postupaka uključujući diferencijalnu filtraciju, centrifugiranje i ručno uklanjanje detritusa.

Izotopni sastav dušika izmjeren je u Laboratoriju za stabilne izotope Morskog biološkog laboratorija. Izotopski sastavi su izraženi standardnim 8 oznakama, gdje je 8 [N.sup.15] = [([R.sub.SA]/[R.sub.ST]) - 1] X [10.sup. 3], R = [N.sup.15]/[N.sup.14], a rezultati su izraženi kao % [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] odstupanja uzorka (SA) od standarda (ST), [ N.sub.2] u atmosferskom zraku ([delta][[N.sup.15]sub.AIR] = 0%[MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII]). U ovom radu, 8 vrijednosti su standardizirane oduzimanjem vrijednosti prirodnog obilja 8 [N.sup.15] sličnih uzoraka prikupljenih prije dodavanja izotopa, osim ako nije drugačije naznačeno. Prema tome, standardizirane vrijednosti ([delta][[N.sup.15].sub.t], s podskriptom "t" koji se odnosi na "tracer") odražavaju sadržaj traga.

Kako bismo procijenili sudbinu dodanog obilježivača, procijenili smo trajne zalihe traga dušika u gornjih 5 km estuarija za glavne komponente ekosustava koji su postali obogaćeni u [N.sup.15]. Procjene su napravljene za nitrate, PON, zooplankton, ribe (žir, bijela sisa, mumičog), škampe, bentoske konzumente (grupirana klasa uključujući blatne rakove, amfipode, oligohete, polihete, ostrakode i druge bentoške organizme) i bentoske sedi. Procjene izotopskog obogaćivanja biote rađene su u razdoblju maksimalnog obogaćivanja i dostižu prosjek (0-5 kin). Obogaćivanje sedimentima tragovima procijenjeno je iz površinskih sedimentnih struganja i izotopskog obogaćivanja jezgri sedimenata. Uzorci površinskog sedimenta dobiveni su struganjem gornjih 2-3 mm sedimenta s 50-100 [cm.sup.2] međuplimnih obala mulja ili subplimnih uzoraka zahvata, pomoću lopatice. Ostruge sedimenta dobivene su prije i na kraju dodavanja tragača.

Zalihe tragova dušika u PON-u detaljno su ispitane kako bi nam pomogle razlučiti sudbinu tragača koji je jednom asimilirao fitoplankton. Koristimo izotopsko obogaćivanje PON-a kao zamjenu za fitoplankton (koristeći odgovarajuće funkcije skaliranja) jer je naš skup podataka za [[N.sup.15].sub.t]-PON daleko opsežniji nego za [[N.sup. 15].sub.t]-fitoplankton. Usporedba trajne zalihe tragača N u PON-u s kumulativnom količinom tragača koji je ušao u PON omogućuje nam da izračunamo, ravnotežom mase, stopu gubitka [[N.sup.15].sub.t]-PON-a od plankton.

Da bismo procijenili advektivni tok traga dolje u ušću, izračunali smo srednju koncentraciju i [[N.sup.15]sub.t] različitih komponenti vodenog stupca na granici dosega (5 km) i pomnožili proizvod ovih vrijednosti riječnim protokom. Udvostručili smo advektivni tok da bismo procijenili ukupni tok (advektivni plus disperzivni). Općenito, ovaj protokol donekle precjenjuje transport tragača niz estuarij, budući da kod riječnih ispusta većih od 0,1 [m.sup.3]/s, advektivni tok premašuje disperzivni tok na 5 km lokaciji gornjeg ušća (J. Vallino, osobna komunikacija).

Protok slatkovodne rijeke Parker varirao je od [manje od]0,1 [m.sup.3]/s do [veće od]2,5 [m.sup.3]/s od 1. kolovoza do 1. listopada 1996. (slika 2A). Tijekom dodavanja izotopa (6. kolovoza-1. rujna), riječni protok se postupno smanjivao od 0,26 do 0,03 [m.sup.3]/s. Koncentracija nitrata u slatkovodnoj rijeci Parker bila je obrnuto povezana s riječnim protokom i kretala se od [tilde]4 do 16 [mikro]mol/L, dok je koncentracija amonija uvijek bila [manja od]4 [mikro]mol/L (slika 2B) . Opsežniji, višegodišnji skup podataka prikupljen u sklopu projekta istraživanja ekosustava ekosustava na području rijeke Parker/Plum Island Sound Land Margin (LMER, sada LTER) [5] također je otkrio da je amonij konstantno [manji od]4 [mikro]mol/L. Riječni DIN tok tijekom razdoblja od 2 mjeseca kretao se od 86 do 1262 mol/d (slika 2C). Koncentracije otopljenog silicija u riječnoj vodi tijekom ljeta 1996. kretale su se od 107 do 196 [mikro]mol/L (n = 4, srednja vrijednost = 129,5 [mikro]mol/L). Uz pretpostavku srednje koncentracije DIN od 13,9 [mikro]mol/L, prosječni omjer Si:DIN u riječnoj vodi bio je 9,3:1.

Vrijeme zadržavanja, dubina, vodljivost i otopljeni kisik na mjestu dodavanja tragača

Hidrološko vrijeme boravka u gornjem estuariju variralo je između 1 i 16 dana tijekom 2-mjesečnog razdoblja studije, a prosječno je [tilde] 12 dana tijekom razdoblja dodavanja izotopa (slika 3A). Hidrološko vrijeme zadržavanja doseglo je vrhunac krajem kolovoza kada je riječni protok bio najmanji, ali je brzo pao na 1 dan nakon oluje sredinom rujna.

Zapis o dubini vodenog stupa pokazuje da je poplava močvara bila rijetka tijekom razdoblja dodavanja izotopa (slika 3B). Dubina vodenog stupa također ilustrira asimetriju plime i oseke u gornjem estuariju, kako u smislu visine tako i vremena plime. Uzastopne plime varirale su u visini, često i do 20-30 cm. Od 1. kolovoza do 1. rujna 1996. srednje vrijeme od oseke do oseke iznosilo je 6 h, 52 min, dok su plime i oseke u prosjeku bile 5 h, 33 min. U tom istom vremenskom razdoblju, srednja amplituda plime i oseke bila je 2,68 m, raspon 2,08-3,13 m. Mala amplituda plime i oseke od 2,08 m 18. rujna bila je povezana s velikom olujom (slika 3B).

Protok rijeke, stadij i amplituda plime, kontroliraju sadržaj soli (električnu vodljivost) vode na mjestu dodavanja izotopa (slika 3C). Tijekom većeg dijela kolovoza, voda prisutna na mjestu dodavanja izotopa za vrijeme oseke bila je u biti slatkovodna, dok je vodljivost tijekom plime bila varijabilnija. Početkom kolovoza, visoka vodljivost plime dosegnula je [tilde] 10 mS/cm, ali je opala sljedećih nekoliko dana kako su se amplitude plime smanjile i manje oceanske vode se transportiralo u smjeru gore-estuarija. Do kraja kolovoza, kombinacija velikih plima i malog unosa slatke vode (dugo hidrološko vrijeme zadržavanja) dovela je do najveće vodljivosti u razdoblju istraživanja, [tilde]22 mS/cm (gotovo 50% morske vode). Malo nevrijeme u prvom tjednu rujna donekle je skratilo vrijeme boravka i potisnulo malo soli iz gornjeg ušća, a veliko nevrijeme od 18. rujna gotovo je potpuno zamijenilo vodenu masu gornjeg ušća slatkovodnom.

Koncentracija otopljenog kisika u vodi na mjestu dodavanja izotopa varirala je od [tilde]4 do 11 mg/L (slika 3D). Tijekom većeg dijela razdoblja dodavanja [N.sup.15], postojao je jedan veliki vrh DO svakog poslijepodneva, što odgovara razdoblju maksimalne fotosintetske proizvodnje kisika. Međutim, od 1. do 4. kolovoza, 27. kolovoza do [tilde] 7. rujna i 18. rujna do kraja studije, diel DO ljuljanja su bila uvelike oslabljena i umjesto jednog velikog popodnevnog maksimuma, bila su dva manja DO vrha svaki dan. Ovi vrhovi bili su neovisni o dobu dana, ali su umjesto toga bili povezani s niskim plimama. Smanjene promjene diel DO-a početkom kolovoza i krajem rujna bile su povezane s hidrološkim vremenima boravka u gornjem estuariju od [manje od] 6 d. Od kraja kolovoza do početka rujna, oslabljene promjene diel DO bile su u korelaciji s poplavama močvare i jakim naoblakom uragana Eduardo.

Prostorni raspored hranjivih tvari, klorofila i PON-a u gornjem estuariju

Uzorci transekata sažeti su korištenjem podataka iz četiri reprezentativna razdoblja: prije dodavanja (30. srpnja do 4. kolovoza), sredinom dodavanja (13. kolovoza), kasnog dodavanja (1. rujna) i naknadnog dodavanja (12. rujna). Nitrat je općenito ulazio u estuarij u koncentracijama od 5-15 [mikro]mol/L, ali se smanjio na [manje od]1 [mikro]mol/L unutar prvih nekoliko kilometara ušća (slika 4.). Niže od ušća, općenito na 5-7 km od brane, koncentracija nitrata se često povećavala na 3-5 [mikro]mol/L, što je vidljivo 13. kolovoza i 12. rujna. Tijekom eksperimenta koncentracija nitrata na mjestu dodavanja izotopa bila je [manja od]1 [mikro]mol/L (slika 5). Koncentracija amonija je općenito bila [manja od]2 [mikro]mol/L u gornjih nekoliko kilometara ušća, ali je porasla u donjem estuariju (slika 4). Podaci o amonijaku nisu dostupni za 1. i 12. rujna, ali podaci za četiri dodatna transekta snimljena tijekom dodavanja pokazuju uzorak sličan onom koji je uočen 13. kolovoza.

Koncentracija PON-a općenito je bila najviša (maksimalno [tilde]50 [mikro]mol/L na gornjem kraju ušća i prostorno i vremenski usko praćena chla (slika 4). Klorofil a općenito je dostigao maksimum na 20-100 [mikro]g /L i smanjio se na [tilde]5 [mikro]g/L na nizvodnom kraju istraživačkog dosega (slika 4).

Izotopski sastav nitrata, amonijaka, PON-a i fitoplanktona

Značajno obogaćivanje tragom izmjereno je u nitratu, ali ne i u amoniju. Prirodne razine obilja bile su slične za amonij i nitrat prije eksperimentalnog dodavanja [delta][N.sup.15]-[[NO.sub.3].sup.-] u rasponu od 0,4 do 4,4% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE MOŽE REPRODUCITIRANO U ASCII] (26. srpnja, n = 3 uzorka) i [delta][N.sup.15]-[NH.sub.4].sup.+] kretali su se od -1,4% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] do 2,1 %[MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] (4. kolovoza, n = 3 uzorka). Kako bi se izbjeglo uzimanje "nepomiješanog" uzorka otopine izotopa/rodamina u blizini točke dodavanja tragača, uzorci prikupljeni na 2 km uvijek su prikupljani na strani "gore struje" točke dodavanja tragača. Posljedično, nismo uočili iznimno visoke vrijednosti [delta][N.sup.15].sub.t]-[NO.sub.3].sup.-] na stanici od 2 km kao što bi se moglo očekivati ​​da smo uzorkovali odmah nizvodnu struju kapaljke. Tijekom plime i oseke (6. i 19. kolovoza), visoka koncentracija [[N.sup.15].sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] bila je očita na stanici za uzorkovanje neposredno prema moru od izotopa mjesto dodavanja (slika 6A). Osim toga, na najvišoj stanici za uzorkovanje 19. kolovoza pronađeno je obogaćivanje traga niske razine od [tilde]6% [MATEMATIČKI IZRAZ NIJE REPRODUKTIVAN U ASCII-u]. Tijekom poplave 13. kolovoza uspjeli smo analizirati samo izotopski sadržaj nitrata u uzorcima prema moru od mjesta dodavanja izotopa jer su preostali uzorci imali preniske koncentracije nitrata za analizu, a niti jedan od onih uzoraka koje smo uspjeli analizirati imao značajno [[N.sup.15]sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] obogaćivanje. Za plimu od 21. kolovoza, [[N.sup.15]sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] je obogaćen na sva tri mjesta gdje su koncentracije nitrata bile dovoljne za analizu. [N.sup.15]-[[NH.sub.4].sup.+] uzorci prikupljeni gotovo 2 tjedna nakon početka dodavanja traga pokazali su malo ili nikakvo obogaćivanje u gornja 4 km ušća, ali je postignuto očito obogaćivanje tragovima 9,5% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE MOŽE REPRODUKCIJI U ASCII] na 5 km i ostao je povišen u donjih 5 km mjesta istraživanja (slika 6B). Međutim, nismo sigurni odražava li ovo obogaćivanje naš dodatak tragača ili su prirodni procesi kao što je frakcioniranje tijekom nitrifikacije odgovorni.

Prirodna količina [delta][N.sup.15]-PON prije dodavanja tragača (uzorci prikupljeni 4. kolovoza) smanjena je sa 5,4% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] na 2,3% [MATEMATIČKI IZRAZ NIJE REPRODUCIBILNO U ASCII] na 10 km ispod brane. Da bismo odredili obogaćivanje zbog tragača ([delta][[N.sup.15].sub.t]-PON), pretpostavljamo prirodno obilje od 2,3% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] za [delta][N. sup.15]-PON. To može dovesti do precijenjenja [delta][[N.sup.15].sub.t]-PON-a na vrhu ušća za 2-3% [MATEMATIČKI IZRAZ NE REPRODUKCIJI U ASCII], ali to neće utjecati na rezultate i zaključci u bilo kojoj velikoj mjeri s obzirom na relativno veliku oznaku u PON-u.

Dodani [[N.sup.15]sub.t]-[[NO.sub.3]sup.-] brzo je ugrađen u PON (slika 7). Do 10 h nakon početka dodavanja, [delta] [[N.sup.15].sub.t]-PON dosegao je 11% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] i povećao se na 19% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] nakon još 10 h. Unutar 54 h od početka dodavanja, [[N.sup.15]sub.t]-PON dosegao je vršnu vrijednost od 61% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE MOŽE REPRODITIVITI U ASCII]. Općenito, tijekom sljedeća tri tjedna, [delta] [[N.sup.15].sub.t]-PON bio je [veći od]30% [MATEMATSKI IZRAZ SE NE MOŽE REPRODUCITIRAJUĆI U ASCII] u gornjih 3-4 km estuariju i pao ispod 15% [MATEMATIČKI IZRAZ NIJE REPRODUCIBILNO U ASCII] obogaćenju za 5 km. Nakon završetka dodavanja traga 1. rujna, [delta] [[N.sup.15]sub.t]-PON je brzo opao, iako je određeno obogaćivanje bilo očito u gornjem estuariju najmanje do 20. rujna.

Naš najopsežniji skup uzoraka transekata prikupljen je 19. kolovoza 1996., a mi predstavljamo te podatke kako bismo olakšali usporedbu između različitih uzoraka koji su prikupljeni istovremeno. Uzorkovanje je započelo na postaji od 10 km tijekom posljednjeg sata plime i završeno je [tilde] 2 h nakon oseke. Temperatura vode bila je relativno konstantna ([tilda]25°C) u cijelom dosegu, ali vodljivost se kretala od one slatke vode na najgornjem mjestu uzorkovanja do [tilda]75% sadržaja morske vode na 10 km (slika 8A). Cvjetanje (pretežno A. normanii) bilo je prisutno u gornjem estuariju, a chla je dostigla vrhunac [tilde]30 [mikro]g/L na 1-km mjestu uzorkovanja (slika 8B). Otopljeni silicij ušao je u estuarij pri 196 [mikro]mol/L. ali je njegova koncentracija pala na [manje od]2 [mikro]mol/L u prvom kilometru estuarija, pri čemu je položaj minimuma silicijevog dioksida odgovarao maksimumu chla. Većina ukupnog dušika u gornjem estuariju bio je DON, a PON je općenito drugi najzastupljeniji oblik (slika 8C). Koncentracija ukupnog dušika (PON, DON, DIN) pala je sa [tilde]70 [mikro]mol/L u slatkovodnoj rijeci Parker na [manje od]25 [mikro]mol/L na 10 km. Koncentracije anorganskog dušika bile su vrlo niske u blizini cvjetanja fitoplanktona, ali su porasle na postajama od 5 do 10 km.

Očigledna su tri prostorna obrasca obogaćivanja tragovima, a primjer su (1) nitrati, (2) fitoplankton i PON i (3) amonij (slika 8). Distribucija rodamina pokazuje kako bi se [delta] [[N.sup.15]sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] distribuirao da nije došlo do biološkog preuzimanja ili regeneracije. [delta] [[N.sup.15].sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] pokazao je oštar vrh na mjestu uzorkovanja od 3 km, ali relativno malo ili nikakvo obogaćivanje drugdje (sl. 8D). Usporedba s rodaminom pokazuje da se [[N.sup.15].sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] nije ponašao konzervativno (slika 8D), a sličan zaključak ukazuje brzi pad u koncentraciji nitrata u najgornjem kilometru estuarija (slika 8C). Obogaćivanje fitoplanktona i PON-a u tragovima dostiglo je vrhunac na 1 km i brzo je opadalo u smjeru gore-dolje-estuarija (slika 8E). Dana 19. kolovoza, pročišćeni uzorci fitoplanktona dosegnuli su vrhunac obogaćivanja traga od [tilde]43% veće od PON-a. Amonij pokazuje malo ili nimalo obogaćenja u gornja 4 km ušća, iako je nešto obogaćenja moglo biti prisutno u donjim dijelovima ušća (slika 8D). [delta][N.sup.15]-TDN dosegao je 11,2% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] na 3 km (podaci nisu prikazani), ali izračun [delta][[N.sup.15]sub. t]-DON koji uzima u obzir delta vrijednosti i koncentracije amonijaka i nitrata pokazao je da je [delta][[N.sup.15].sub.t]-DON [manji od]3% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII].

Na kraju razdoblja dodavanja izotopa najveći dio traga bio je prisutan u oligohalnim sedimentima (Tablica 1, Slika 9). Najveća zaliha tragača u vodnom stupu bio je PON, a trajna zaliha tragača u bentoskim potrošačima bila je otprilike ista kao i u PON-u. Zoološki plankton, škampi i ribe bili su relativno nevažni u pogledu skladištenja tragača.

Tijekom razdoblja dodavanja izotopa, koncentracija PON je općenito bila 20-30 [mikro]mol/L (slika 10A) i prosječni doseg [delta][[N.sup.15]sub.t]-PON (isključujući prva 2 dana dodavanja) iznosila je 29,3% [MATEMATIČKI IZRAZ NIJE REPRODUKTIVAN U ASCII] (slika 10B). Za usporedbu, prosječni doseg [delta][[N.sup.15]sub.t]-fitoplanktona bio je 49,3% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE MOŽE REPRODUKCIJALI U ASCII]. Na sve datume uzorkovanja osim jednog, masa tragača u PON-u bila je manja ili jednaka količini dodanog [[N.sup.15].sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] svaki dan (slika 10C). Iznimka je bio 8. kolovoza, kada je masa tragača u PON-u dosegla [veća od] 9 g. Osim prvih nekoliko dana dodavanja, samo je mali dio kumulativne mase dodanog tragača [N.sup.15] bio prisutan u PON-u (slika 10D). Izvoz [[N.sup.15]sub.t]-PON u donji estuarij bio je [manji od] 6 g tijekom razdoblja dodavanja izotopa, što sugerira da se PON brzo sedimentirao u gornjem estuariju.

Eksperimentalni dodatak [N.sup.15]-[[NO.sub.3]sub.-] ušću rijeke Parker dao je nekoliko novih uvida o funkcioniranju ekosustava. Prvo, uspjeli smo pokazati da je većina riječnog nitrata koji ulazi u estuarij u početku bila obrađena planktonskim dijatomejima (uglavnom Actinocyclus normanii) koje čine osnovu produktivne oligohalne mreže hrane. Štoviše, veličina i prostorna raspodjela izotopski obogaćenih nitrata pokazali su da je promet nitrata bio vrlo brz, čak i nakon što je riječni nitrat u početku bio povučen. Potražnja za dušikom od strane fitoplanktona uvelike je premašila riječnu ponudu, a tokovi bentoskog dušika činili su većinu razlike. Bez dolje navedenih dokaza da dodatni dušik nije izotopski obogaćen, precijenili bismo značaj recikliranja u vodenom stupcu. Također smo uspjeli istražiti podrijetlo dušika koji se izvozi iz gornjeg estuarija kao DIN, DON i PON. Iako je većina riječnih nitrata (i indikatora nitrata) zadržana u gornjem estuariju tijekom ljeta, najveći dio traga koji je izvezen bio je u obliku PON-a. Eksperiment s dodavanjem izotopa pomogao nam je u procjeni koji su odjeljci u gornjem estuariju najvažniji za skladištenje riječnog nitrata-N, a bentoški sedimenti bili su primarna zona skladištenja. Konačno, naše razumijevanje trofičke strukture ekosustava uvelike je napredovalo praćenjem traga kroz prehrambenu mrežu (Hughes et al. 2000).

Početna obrada tracera

Iako bi riječni nitrat mogao slijediti brojne putove kroz ekosustav ušća, njegova početna sudbina i sudbina tragača [N.sup.15] u tipičnim ljetnim uvjetima niskog protoka u gornjem estuariju rijeke Parker bila je asimilacija fitoplanktonom. Ostali putovi, uključujući asimilaciju bentoskim dijatomejima, makroalgama, bakterijama i močvarnom vegetacijom, te gubitak denitrifikacijom i izvozom u donji tok ušća, bili su relativno mali tijekom vremenskog raspona ovog eksperimenta.

Izotopsko obogaćivanje i fitoplanktona (slika 4) i PON-a (slika 7) pokazuje da su pelagične dijatomeje brzo uključile tragač nitrata. Tri dana nakon dodavanja izotopa, uspjeli smo uzeti u obzir [tilde] 75% dodanog tragača u PON (slika 10D). Nasuprot tome, drugi izmjereni skupovi imali su beznačajnu akumulaciju traga ubrzo nakon što je dodavanje traga počelo. Budući da je vrijeme obrta dijatomeja bilo [tilde]1 d, do trećeg dana dodavanja fitoplankton bi već izgubio znatnu količinu traga. Stoga je čak više od 75% traga [N.sup.15]-[[NO.sub.3]sup.-] moralo biti u početku asimilirano fitoplanktonom.

Brzi pad koncentracije silicijevog dioksida (slika 8B) ukazuje na veliku potražnju za silicijevim dioksidom (srednji pad koncentracije silicijevog dioksida u gornjem 1 km ušća iznosio je 182 [mikro]mol/L 19. kolovoza i 27. kolovoza). Koristeći vodljivost za procjenu miješanja između riječne i oceanske vode, otkrivamo da je samo [tilde]10-20 [mikro]mol/L smanjenja posljedica miješanja s oceanskom vodom s niskim sadržajem silicija. Budući da je koncentracija DIN-a u slatkovodnoj rijeci Parker bila [tilde]16 [mikro]mol/L kada su uzorci silicijevog dioksida bili sakupljeni, i uz pretpostavku da dijatomeje imaju molarni omjer Si:N od 1:1 (Redfield et al. 1963.), na dijatomeje su zahtijevale najmanje 146 [mikro]mol/LN uz riječne DIN unose kako bi se objasnilo uočeno smanjenje silicijevog dioksida. Stoga bi samo [tilde] 10% potražnje za planktonskim dušikom bilo zadovoljeno izravnim korištenjem riječnih DIN ulaza.

Stehiometrijska procjena potražnje dušika od strane fitoplanktona, temeljena na koncentraciji chla, također ukazuje na potražnju DIN-a koja je daleko veća od isporuke rijekom. Tijekom dodavanja izotopa, srednja koncentracija chla u vodi koja je prolazila pored mjesta dodavanja sa svakom plimom bila je 34,8 [mikro]g/L. Uz pretpostavku da je vrijeme obrtanja dušika u fitoplanktonu 1 d (Eppley 1972), omjer mase C-to-chla od 50:1 (Antia et al. 1963, Eppley 1972) i molarni omjer C:N u fitoplanktonu od 7: 1 (Redfield 1958), potražnja za dušikom od strane fitoplanktona u plimnom volumenu od 130 000 [m.sup.3] bila je 2693 mol/d. Prosječni protok DIN-a preko brane tijekom dodavanja izotopa bio je 240 mol/d (slika 2C), što sugerira da je samo [tilde] 9% potražnje za fitoplanktonom za N bilo zadovoljeno izravnim unosom DIN-a iz vododjelnice.

Konačna procjena potražnje za DIN-om od strane fitoplanktona temelji se na GPP-u. Tijekom cvatnje A. normanii u gornjem estuariju, GPP u prosjeku iznosi [tilde]2 g C [m.sup.-2]*[d.sup.-1] (J. Vallino, osobna komunikacija). Ako pretpostavimo da je neto primarna proizvodnja (NPP) bila polovica GPP-a (Peterson 1980.) i da je molarni omjer C:N u fitoplanktonu bio 7:1, izračunavamo potražnju za DIN-om po fitoplanktonu na 2282 mol/d samo [tilde]10% od kojih bi se moglo zadovoljiti izravnim korištenjem riječnog DIN-a.

Iako prethodne procjene pokazuju da izravan unos riječnog DIN ulaza zadovoljava samo [tilde] 10% potražnje dušika od strane fitoplanktona, unos riječnog DIN-a tijekom ljeta mogao bi biti dovoljan da zadovolji potrebe fitoplanktona ako se dijatom N brzo reciklira u vodenom stupcu neovisno od silicija. Kada bi se silicijski testovi dijatomeje otapali samo polako dok se dušik brzo reciklirao, koncentracija silicija bi se mogla smanjiti u većoj mjeri nego što bi to bilo moguće da dušik i silicij kruže istom brzinom (Schelske i Stoermer 1971., Schelske et al. 1983. , Doering i dr. 1989., Conley i dr. 1993.). Mnogi takvi ciklusi mogli bi se završiti unutar tipičnog vremena boravka dijatomeja u gornjem estuariju, a silicij bi se mogao iscrpiti brzim recikliranjem riječnog DIN-a. Bez izotopskog tragača, bilo bi teško pobiti ovu hipotezu. Međutim, da je ova hipoteza istinita, predvidjeli bismo da bi izotopsko obogaćivanje amonijem i/ili nitratom usko oponašalo obogaćivanje fitoplanktona, bilo koji DIN prisutan u blizini cvjetanja dijatomeje bio bi recikliran iz izotopski obogaćenih dijatomeja. Podaci izotopa ne podržavaju ovu hipotezu (sl. 5, i 8D, E). Umjesto toga, amonij je pokazao malo ili nikakvo obogaćivanje u gornjem estuariju, a nitrati su bili znatno obogaćeni samo na mjestima uzorkovanja koja su nedavno prošla pored mjesta dodavanja izotopa.Oštar vrh u [delta] [[N.sup.15]sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] ukazuje da se nitrat vrlo brzo asimilirao i da nitrat koji se obnavlja nije bio izotopski obogaćen. Stoga brzo recikliranje diatomeja-N i sporije otapanje testova silicijevog dioksida ne objašnjavaju veliko smanjenje količine silicija. Umjesto toga, diatomejski-N zajedno s obilježivačem-N mora biti učinkovito i brzo uklonjen iz vodenog stupca.

Daljnji pokazatelj da su planktonske dijatomeje bile glavni doprinos metabolizmu cijelog ekosustava i unosu dušika u gornjem estuariju je zapis koncentracije otopljenog kisika na mjestu dodavanja izotopa, što se čini da je povezano s obiljem fitoplanktona. Kada je chla nakon 5. kolovoza bila visoka, varijacija diel DO bila je izražena (slika 3D). Nasuprot tome, prije 4. kolovoza i nakon 18. rujna, koncentracije chla u gornjem estuariju bile su niske ([manje od]10 [mikro]g/L) i varijacije diela u DO bile su uvelike oslabljene. Osim toga, kada je cvjetanje dijatomeje isprano iz gornjeg estuarija ranije u ljeto tijekom događaja visokog ispuštanja, promjene diel DO-a i smanjenje nitrata u gornjem estuariju također su se uvelike smanjile (R. M. Holmes, neobjavljeni podaci).

Čak i uz očitu korelaciju između obilja fitoplanktona i DO u vodenom stupcu, moguće je da su primarni proizvođači osim fitoplanktona igrali važnu ulogu u metabolizmu cijelog sustava i unosu DIN-a. Na primjer, bentoske dijatomeje bile su prisutne na međuplimnim muljevitim obalama. Međutim, izotopsko obogaćivanje bentoskih dijatomeja zaostajalo je za fitoplanktonom za 2 tjedna (Hughes et al. 2000). S obzirom na ovo značajno kašnjenje, oni nisu mogli biti važni u početnom uklanjanju traga [N.sup.15]-[[NO.sub.3].sup.-] iz vodenog stupca i umjesto toga vjerojatno su dobili svoju oznaku nakon remineralizacija obogaćene, taložene organske tvari koja se oslobađa [[N.sup.15]sub.t]-[[NH.sub.4].sup.+] u površinske porne vode sedimenta. Ovaj zaključak je u skladu s gotovo potpunim unosom traga od strane PON-a (fitoplanktona) u vodenom stupcu. Ostali primarni proizvođači u ekosustavu mogu se odbaciti jer ili nisu bili prisutni u značajnim količinama (npr. makroalge) ili nisu bili izloženi izotopu sve dok močvara nije poplavljena na kraju eksperimenta (npr. Typha).

Preostali procesi koji bi mogli objasniti brzo iscrpljivanje riječnog nitrata su denitrifikacija i mikrobna asimilacija. Denitrifikacija uklanja znatan dio dolaznog dušika u mnogim estuarijima (Seitzinger 1988), a postotak uklonjenog je povezan s hidrološkim vremenom zadržavanja (Nixon et al. 1996). Međutim, dva čimbenika govore protiv toga da je denitrifikacija odgovorna za brzo početno iscrpljivanje nitrata dobivenog iz sliva u gornjem estuariju rijeke Parker. Prvo, koncentracija nitrata u vodenom stupcu iznad je općenito niska, pa je difuzni tok nitrata u anoksične sedimente, vjerojatno mjesto denitrifikacije, također nizak. Drugo, malo područje i kratko vrijeme u kojem je obogaćeni [[N.sup.15]sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] prisutan u vodenom stupcu ograničava kontaktno razdoblje između [ [N.sup.15].sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-] i sedimenti. Ovi argumenti su u skladu s opaženim unosom većine obilježivača od strane fitoplanktona tijekom prvih nekoliko dana dodavanja. Stoga zaključujemo da je izravno uklanjanje nitrata iz vodenog stupca i tragača-nitrata putem denitrifikacije sedimenta bilo malo. Iako nije relevantno za početno uklanjanje [[N.sup.15].sub.t]-[[NO.sub.3].sup.-], još uvijek je moguće da je konačna sudbina većeg dijela oznake bila denitrifikacija, nakon asimilacije fitoplanktonom, sedimentacija, remineralizacija i nitrifikacija.

Maksimalno opaženo obogaćivanje traga u planktonskim bakterijama bilo je [tilde]15% [MATEMATSKI IZRAZ NIJE REPRODUKTIVAN U ASCII] (M. Hullar i D. Pakulski, osobna komunikacija), mnogo manje nego za fitoplankton. Na temelju procjena proizvodnje bakterija u estuariju rijeke Parker (Wright et al. 1987.), izračunali smo da je unos nitrata od strane bakterija bio [manje od] 5% unosa fitoplanktona. Stoga bakterije nisu bile glavni ponor za tragač nitrata.

Kontrola cvjetanja fitoplanktona

U gornjem estuariju rijeke Parker, tijesan odnos između riječnog oticaja i hidrološkog vremena boravka naglašava ukupnu važnost hidrologije u kontroli dinamike fitoplanktona u oligohalnoj zoni. Tijekom 2-mjesečnog razdoblja istraživanja, utjecaj riječnog protoka na fitoplankton najjasnije je ilustriran olujom 18. rujna. Prije oluje, riječni protok je bio nizak ([manje od]0,25 [m.sup.3]/s), a hidrološko vrijeme zadržavanja u gornjem estuariju prelazilo je 10 dana. Vrijeme udvostručenja za planktonske dijatomeje je tipično 1-2 d (Eppley 1972), tako da je bilo dovoljno vremena da dijatomeje dovrše nekoliko generacija tijekom svog boravka u oligohalnoj zoni, što je u skladu s uočenom prisutnošću maksimuma klorofila. Oluja sredinom rujna, međutim, povećala je protok rijeke na [tilde]2,5 [m.sup.3]/s, a hidrološko vrijeme zadržavanja smanjilo se na [manje od] 2 d (slike 2A i 3A). Zapis DO (slika 3D), te koncentracije nitrata i klorofila u gornjem estuariju 20. rujna (podaci nisu prikazani), ukazuju na to da je cvat dijatomeje ispran niz ušće. Dodatni podaci iz ranijeg ljeta upućuju na to da se cvjetanje dijatomeje razvilo samo kada su unos slatke vode bio manji od [tilde]0,5 [m.sup.3]/s, što znači hidrološko vrijeme boravka od [veće ili jednako]5 d. Dugoročni podaci o ispuštanju pokazuju da su ti uvjeti ispunjeni [tilde]150 d/god, otprilike od sredine lipnja do listopada. Stoga je u prosjeku stvaranje cvjetanja izvedivo tijekom ljeta i rane jeseni, ali ne i drugih godišnjih doba, pa se stoga ne očekuje da će fitoplankton u gornjem estuariju transformirati riječne nitrate tijekom proljetne sezone otjecanja.

Što ograničava cvjetanje dijatomeje kada hidrološko vrijeme boravka u gornjem estuariju prelazi 5 d? Mogućnosti uključuju biotičku kontrolu od strane pasa, ograničenje svjetlosti, ograničenje hranjivih tvari i taloženje stanica u bentoskim sedimentima. Čini se da je najvjerojatnija mogućnost ograničenje hranjivih tvari, bilo dušikom ili silicijevim dioksidom. Ograničenje rasta fitoplanktona fosforom je još jedna mogućnost, ali otopljeni anorganski N:P (molarni omjer) u gornjem estuariju ljeti je općenito [manji od] 5 (pogledajte istraživanje ekosustava na margini kopna Parker River/Plum Island [LMER, sada LTER ] web stranica), [6] što ukazuje na obilje P u odnosu na N. I nitrat i silicij ulaze u estuarij u relativno visokim koncentracijama, ali se brzo spuštaju do potencijalno ograničavajućih razina u blizini vrha klorofila (slike 4 i 8). Budući da silicij može ograničiti samo dijatomeje, drugi oblici fitoplanktona mogli bi dominirati ako se dušik brže regenerira.

Budući da je DIN veći od onog koji isporučuje slatkovodna rijeka Parker potrebna da se uzme u obzir veliki pad silicijevog dioksida, regeneracija bentoskog dušika, unosa podzemne vode ili disperzije iz oceana ili donjeg estuarija mora osigurati dodatni dušik potreban fitoplanktonu. Unosi podzemne vode, iako nisu dobro okarakterizirani u ovom sustavu, vjerojatno nisu značajni, budući da su unos slatke vode preko brane dovoljni za modeliranje transporta otopljene tvari u gornjem estuariju (Vallino i Hopkinson 1998.). Bentoski sedimenti su bogati N, a izmjereni tokovi, iako promjenjivi, često su veliki (Hopkinson i sur., u tisku). Stoga zaključujemo da je regeneracija dušika sadržanog u sedimentima gornjih estuarija glavni izvor dodatnog DIN-a koji zahtijevaju oligohalinske dijatomeje, ali da podzemne vode mogu dati određeni doprinos. Zbroj ovih izvora je otprilike za red veličine veći od protoka DIN-a koji dolazi preko brane kada je prisutno cvjetanje. Dok promatramo oligohalinski doseg kao relativno otvoren ekosustav, većina potražnje za dušikom primarnih proizvođača ljeti i rane jeseni zadovoljava se recikliranjem iz bentoskih sedimenata.

Do izvoza dušika za praćenje moglo bi doći u bilo koju komponentu vodenog stupca koja sadrži dušik ili putem migracije biote dolje u ušće. Budući da je zaliha traga u bioti bila niska (Tablica 1), malo je vjerojatno da je migracija ili advekcija tragača u fauni bila značajna. Štoviše, izotopski obogaćeni nitrati u biti nisu izvoženi iz gornjeg estuarija jer nitrat na postaji od 5 km nije bio mjerljivo obogaćen tracerom (slika 6). PON i DON bili su preostali vektori izvoza tragova dolje u ušće. Advektivni plus disperzivni transport [[N.sup.15]sub.t]-PON iz gornjeg estuarija tijekom razdoblja istraživanja bio je [manje od] 6 g (od 128 g [N.sup.15] [[ N.sub.3].sup.-] dodan). Nadalje, budući da je koncentracija DON-a bila slična PON-u, ali je njegovo izotopsko obogaćivanje bilo mnogo manje ([manje od]3% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUKCIJI U ASCII] vs. 30% [MATEMATIČKI IZRAZ SE NE REPRODUCIRA U ASCII]), beznačajna količina traga je izvezeno iz dosega kao DON. Posljedično, čini se da je relativno dugo hidrološko vrijeme zadržavanja u gornjem estuariju tijekom dodavanja izotopa rezultiralo malim prijenosom traga prema donjem sustavu u bilo kojem obliku, vjerojatno zbog ispadanja PON-a (uključujući dijatomeje) u sedimente, gdje je pronađena većina tragova. (Stol 1).

Usporedba stajaće zalihe tragača u PON-u u vodenom stupcu s protokom tragača u PON podržava hipotezu da je većina [[N.sup.15].sub.t]-PON-a transportirana u sedimente. Tijekom prvih nekoliko dana dodavanja, možemo objasniti većinu tragača [N.sup.15] u PON-u (slika 10D). Međutim, stajaća zaliha traga u plimnom volumenu brzo doseže plato i relativno je niska, općenito [manje od] 5 g [[N.sup.15].sub.t], (slika 10C), što ukazuje da vrijeme obrta PON-a je kratko ([manje od]1 d). Budući da se relativno malo dušika u tragovima zadržava u potrošačima (Tablica 1.) ili se izvozi u donje ušće, čini se da se većina dušika u PON prenosi u bentoske sedimente (Slika 11.).

Oligohalne zone estuarija su područja brzih promjena u mnogim fizičkim, kemijskim i biološkim varijablama (Morris i sur. 1978., Anderson 1986., Schuchardt i Schirmer 1991., Fichez i sur. 1992., Rehbehn i sur. 1993., Schuchardt i sur. 1993. ). Procesi koji se odvijaju na ovoj granici rijeke i ušća utječu na vrijeme, veličinu i oblik materijala i energije koji se transportiraju niz estuarij i ocean. U estuariju rijeke Parker tijekom ljeta, mnoge važne transformacije hranjivih i organskih tvari događaju se u gornjim 2-4 km ušća. Slična opažanja zabilježena su i za druge estuarije uključujući zaljev San Francisco (Alpine i Cloern 1992, Cloern 1996), podestuarije zaljeva Chesapeake (Anderson 1986), ušće rijeke North u Massachusettsu (Bowden et al, 1991) i nekoliko europskih sustava ( Schuchardt i Schirmer 1991, Rehbehn i dr. 1993, Schuchardt i dr. 1993, Sanders i dr. 1997). Tehnika dodavanja tragova korištena u ovoj studiji komplementarna je drugim pristupima proučavanju kruženja dušika u estuarijima i olakšava detaljno razumijevanje kruženja dušika u ovim složenim ekosustavima. Posebna snaga pristupa praćenja cijelog ekosustava je u tome što omogućuje istovremeno ispitivanje transporta i obrade dušika u netaknutom ekosustavu, nešto što je nemoguće postići u tradicionalnim eksperimentima s bocom ili mezokozmosom.

Od 128 g [N.sup.15] dodanih u estuarij tijekom 27 dana, samo [tilde]5 g bilo je prisutno u fitoplanktonu u bilo kojem trenutku (slika 11A). Slična količina traga zarobljena je kod bentoskih potrošača. Ostale biote sadržavale su daleko manje obilježivača (Tablica 1), iako su možda obradile značajnu količinu obilježivača zbog brzog prometa N putem procesa kao što je ispaša zooplanktona. I riječni DIN i tragač nitrata u početku su asimilirani fitoplanktonom, a zatim transportirani u sedimente dok su se fitoplankton i fekalne kuglice taložile iz vodenog stupca (slika 11.). Budući da je stajaća zaliha tragača u PON-u brzo dosegnula visoravan (slika 10C), protok traga u sedimente bio je gotovo jednako velik kao tok u PON (slika 11A) jer je transport niz estuarij bio minimalan. S obzirom na veliku količinu dušika i dugo vrijeme zadržavanja dušika u bentoskim sedimentima, čini se da je tijekom istraživanja malo traga pobjeglo iz sedimenata nakon taloženja fitoplanktona. Iako postoji nesigurnost u našoj procjeni količine traga pohranjenih u bentoskim sedimentima, jasno je da su sedimenti bili primarna zona skladištenja [[N.sup.15].sub.t] (Tablica 1). Dio tog dušika mogao je biti prebačen u atmosferu kao [N.sub.2] putem spojene asimilacije-mineralizacije-nitrifikacije-denitrifikacije, ali nismo bili u mogućnosti kvantificirati ovaj tok zbog visoke stajaće zalihe [N.sub.2 ] u vodenom stupcu i njegova brza izmjena s atmosferom, što je [[N.sup.15].sub.t]-obogaćivanje bazena [N.sub.2] ispod naše granice detekcije. Stoga je protok dušika iz oligohaline zone kroz denitrifikaciju velika nepoznanica koja zahtijeva daljnje istraživanje.

Protok traga unutar ekosustava gornjeg estuarija (slika 11A) osvijetlio je masovno kretanje dušika kroz sustav (slika 11B). Otkrili smo da je potražnja za dušikom u fitoplanktonu tijekom ljeta daleko nadmašila izravnu ponudu iz sliva, a recikliranje dušika u vodenom stupcu je bilo relativno beznačajno. Umjesto toga, najveći dio DIN-a koji je potreban fitoplanktonu došao je iz regeneracije u bentoskim sedimentima. Dio fitoplanktona-N prenesen je u pelagične konzumente, no većina se sedimentirala u bentos. Tijekom ljetnog razdoblja cvatnje, tok taloženja N iz vodenog stupca u bentos bio je približno uravnotežen DIN tokom iz sedimenata u vodeni stupac.

Iako je riječna ponuda DIN-a puno manja od potražnje fitoplanktona tijekom ljeta, na godišnjoj razini riječna ponuda uvelike premašuje potražnju primarnih proizvođača u gornjem estuariju. Međutim, većina riječne opskrbe N na godišnjoj razini događa se tijekom ispuštanja koji zabranjuje razvoj fitoplanktona i stoga se DIN prenosi niz ušće do Plum Island Sounda i zaljeva Maine. Dok je godišnja perspektiva relevantna za neka pitanja kao što je postotak zadržavanja dušika na godišnjoj razini, dušik koji se obrađuje tijekom ljeta pokreće produktivnu oligohalnu mrežu hrane. Obrada svih DIN dobivenih iz sliva u gornjem estuariju tijekom ljeta naglašava važnost ove zone za ciklus dušika cijelog ušća. Posljedično, temeljito razumijevanje biogeokemije ekosustava estuarija zahtijeva uključivanje procesa i transformacija koje se događaju u relativno nedovoljno proučavanoj oligohalnoj zoni.

Istraživanje su podržali NSF-DEB-9407829, EPAR824767010 i NSF-OCE-921446l. Zahvaljujemo Susan Oleszko-Szuts i akademiji guvernera Dummer za korištenje laboratorijskih objekata na terenu, Billu Morrisonu na korištenju njegovog doka i Geneu Stoermeru za identifikaciju vrsta dijatomeja. Također zahvaljujemo Krisu Tholkeu na vođenju uzoraka izotopa u Centru za ekosustave i na pomoći na terenu, kao i Joeu Vallinu, Chucku Hopkinsonu, Jimu McClellandu, Hapu Garrittu, Anne Giblin, Chrisu Neillu, Meredith Hullar, Deanu Pakulskom, Deani Erdner , Charlie Vorosmarty, Bobbie Sichol, Matt Distler, Raquel Machas, Mike Buchalski i Claire Peterson za pomoć pri uzorkovanju i važne uvide tijekom mnogih rasprava o projektu. Konačno, zahvaljujemo Thermo Environmental Instruments za pružanje [NO.sub.x] analizatora za analizu nitrata i dva anonimna recenzenta za konstruktivne komentare na rukopis.

(1.) The Ecosystems Center, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts 02543 SAD

(2.) Odjel za biologiju, Florida International University, Miami, Florida 33199 SAD

(4.) Sadašnja adresa: Coastal Ecology Institute, Louisiana State University, Baton Rouge, Louisiana 70803-7503 SAD.

Alpine, A. E. i J. E. Cloern. 1992. Trofičke interakcije i izravni fizički učinci kontroliraju biomasu fitoplanktona i proizvodnju u estuariju. Limnologija i oceanografija 37:946-955.

Anderson, G. F 1986. Silicij, dijatomeje i maksimum produktivnosti slatke vode u estuarijima obalnih ravnica Atlantika, zaljev Chesapeake. Estuarine, Coastal and Shelf Science 22:183-197.

Bowden, W. B., C. J. Vorosmarty, J. T. Morris, B. J. Peterson, J. E. Hobbie, P. A. Steudler i B. Moore. 1991. Transport i obrada dušika u močvarnom području slatke vode. Istraživanja vodnih resursa 27:389-408.

Braman, R. S. i S. A. Hendrix. 1989. Određivanje nanograma nitrita i nitrata u okolišnim i biološkim materijalima redukcijom vanadija (III) s detekcijom kemiluminiscencije. Analitička kemija 61:2715-2718.

Breitburg, D. L., N. Steinberg, S. DuBeau, C. Cooksey i E. D. Houde. 1994. Učinci malo otopljenog kisika na grabežljivce na ličinke riba u estuariju. Serija napretka ekologije mora 104:235-246.

Cloern, J. E. 1996. Dinamika cvjetanja fitoplanktona u obalnim ekosustavima: pregled s nekim općim poukama iz kontinuiranog istraživanja zaljeva San Francisco, Kalifornija. Pregled geofizike 34:127-168.

Conley, D. J., C. L. Schelske i E. F. Stoermer. 1993. Modifikacija biogeokemijskog ciklusa silicija s eutrofikacijom. Serija napretka ekologije mora 101:179-192.

Dauer, D. M., A. J. Rodi i J. A. Ranasinghe. 1992. Učinci događaja niske razine otopljenog kisika na makrobentos donjeg zaljeva Chesapeake. Estuari 15:384-391.

Deegan, L. A. i R. H. Garritt. 1997. Dokazi za prostornu varijabilnost u hranidbenim mrežama estuarija. Serija o napretku morske ekologije 147:31-47.

Doering, P. H., C. A. Oviatt, L. L. Beatty, V. F Banzon, R. Rice, S. P. Kelly, B. K. Sullivan i J. B. Frithsen. 1989. Struktura i funkcija u modelnom obalnom ekosustavu: silicij, bentos i eutrofikacija. Serija Napretka ekologije mora 52:287-299.

Eppley, R. W. 1972. Temperatura i rast fitoplanktona u moru. Ribarski bilten 70:1063-1085.

Fichez, R., T. D. Jickells i H. M. Edmunds. 1992. Alge cvjetaju u visokoj zamućenosti, što je rezultat proturječnih posljedica turbulencije na kruženje hranjivih tvari u plitkovodnom estuariju. Estuarine, Coastal and Shelf Science 35:577-592.

Galloway, J. N., W. H. Schlesinger, H. Levy, A. Michaels i J. L. Schnoor. 1995. Fiksacija dušika: antropogeno poboljšanje - odgovor okoliša. Globalni biogeokemijski ciklusi 9:235-252.

Garside, C. 1982. Kemiluminiscentna tehnika za određivanje nanomolarnih koncentracija nitrata i nitrita u morskoj vodi. Kemija mora 11:159-167.

Harding, L.W. 1994.Dugoročni trendovi u distribuciji fitoplanktona u zaljevu Chesapeake: uloge svjetlosti, hranjivih tvari i strujanja. Serija napretka ekologije mora 104:267-291.

Holmes, R. M., J. W. McClelland, D. M. Sigman, B. Fry i B. J. Peterson. 1998. Mjerenje [N.sup.15]-[[NH.sub.4].sup.4] u morskim, estuarijskim i slatkim vodama: prilagodba metode difuzije amonijaka za uzorke s niskom koncentracijom amonija. Kemija mora 60:235-243.

Hopkinson, C. S., A. E. Giblin, J. Tucker i R. H. Garritt. U tisku. Bentoški metabolizam i kruženje hranjivih tvari duž gradijenta slanosti ušća. Estuari.

Hopkinson, C. S. i J. J. Vallino. 1995. Odnos među ljudskim aktivnostima u slivovima i ušćima: model utjecaja otjecanja na obrasce metabolizma estuarijske zajednice. Estuari 18:598-621.

Howarth, R.W., et al. 1996. Regionalni proračuni dušika i riječni N i P tokovi za odvodnju sjevernog Atlantika: prirodni i ljudski utjecaji. Biogeokemija 35:75-139.

Hughes, J., L. A. Deegan, B. J. Peterson i R. M. Holmes i B. Fry. 2000. Protok dušika kroz hranidbenu mrežu u oligohalnoj zoni ušća Nove Engleske. Ekologija 81:433-452.

Jorgensen, S. E. 1979. Priručnik podataka o okolišu i ekoloških parametara. Pergamon, Oxford, UK.

Justic, D., N. N. Rabalais, R. E. Turner i Q. Dortch. 1995. Promjene u strukturi hranjivih tvari obalnih voda kojima dominiraju rijeke: stehiometrijska ravnoteža hranjivih tvari i njezine posljedice. Estuarine, Coastal and Shelf Science 40:339-356.

Justic, D., N. N. Rabalais, R. E. Turner i W. J. Wiseman. 1993. Sezonska sprega između riječnih hranjivih tvari, neto produktivnosti i hipoksije. Bilten o onečišćenju mora 26: 184-189.

Keller, A. A., P. H. Doering, S. P. Kelley i B. K. Sullivan. 1990. Rast juvenilnog atlantskog menhadena, Brevoortia tyrannus (Pisces: Clupeidae) u MERL mezokozmima: učinci eutrofikacije. Limnologija i oceanografija 35:109-122.

Lee, V. i S. Olsen. 1985. Inicijative za eutrofikaciju i upravljanje za kontrolu unosa hranjivih tvari u obalne lagune Rhode Islanda. Ušća 8: 191-202.

Malone, T. C., L. H. Crocker, S. E. Pike i B. W. Wendler. 1988. Utjecaj riječnog toka na dinamiku proizvodnje fitoplanktona u djelomično slojevitom estuariju. Serija napretka ekologije mora 48:235-249.

Morris, A. W., R. F. C. Mantoura, A. J. Bale i R. J. M. Howland. 1978. Područja estuarija s vrlo niskim salinitetom: važna mjesta za kemijske i biološke reakcije. Nature 274:678-680.

Nixon, S.W., et al. 1996. Sudbina dušika i fosfora na rubu kopna - mora sjevernog Atlantskog oceana. Biogeokemija 35:141-180.

Nixon, S. W., C. A. Oviatt, J. Frithsen i B. Sullivan. 1986. Hranjive tvari i produktivnost ekosustava ušća i obalnog mora. Časopis Limnološkog društva Južne Afrike 12:43-71.

Nixon, S. W., i M. E. Q. Pilson 1983. Dušik u estuarijskim i obalnim morskim sustavima. Stranice 565-648 u E. J. Carpenter i D. G. Capone, urednici. Dušik u morskom okolišu. Academic Press, New York, New York, SAD.

Odum, W. E. 1988. Usporedna ekologija plimnih slatkovodnih i slanih močvara. Godišnji pregled ekologije i sistematike 19:147-176.

Peterson, B. J. 1980. Primarna produktivnost vode i metoda [C.sup.14]-[CO.sub.2]: povijest problema produktivnosti. Godišnji pregled ekologije i sistematike 11:359-385.

Redfield, A. C. 1958. Biološka kontrola kemijskih čimbenika u okolišu. American Scientist 46:205-221.

Redfield, A. C., B. H. Ketchum i F. A. Richards (1963). Utjecaj organizama na sastav morske vode. Stranice 26-77 u M. N. Hillu, urednik. more. Svezak 2. John Wiley i sinovi, New York, New York, SAD.

Rehbehn, R., B. Schuchardt, M. Schirmer i G. O. Kirst. 1993. Rasprostranjenost Actinocyclus normanii (Bacillariophyceae) u estuarijima: terenska promatranja i laboratorijska istraživanja. Nizozemski časopis za vodenu ekologiju 27: 205-214.

Sanders, R., C. Klein i T. Jickells. 1997. Biogeokemijsko kruženje nutrijenata u gornjem estuariju Great Ousea, Norfolk, U.K. Estuarine, Coastal and Shelf Science 44:543-555.

Schelske, C. L. i E. F. Stoermer. 1971. Eutrofikacija, iscrpljivanje silicija i predviđene promjene u kvaliteti algi u jezeru Michigan. Znanost 173:423-424.

Schelske, C. L., E. F. Stoermer, D. J. Conley, J. A. Robbins i R. M. Glover. 1983. Rana eutrofikacija u donjim Velikim jezerima: novi dokazi iz biogenog silicija u sedimentima. Znanost 222:320-322.

Schuchardt, B., U. Haesloop i M. Schirmer. 1993. Plimni slatkovodni doseg ušća Weser: riječni ili estuarski? Nizozemski časopis za vodenu ekologiju 27:215-226.

Schuchardt, B. i M. Schirmer. 1991. Maksimumi fitoplanktona u plimnim slatkovodnim područjima dvaju obalnih ravničarskih ušća. Estuarine, Coastal and Shelf Science 32:187-206.

Seitzinger, S. P. 1988. Denitrifikacija u slatkovodnim i obalnim morskim ekosustavima: ekološki i geokemijski značaj. Limnologija i oceanografija 33:702-724.

Sigman, D. M., M. A. Altabet, R. Michener, D. C. McCorkle, B. Fry i R. M. Holmes. 1997. Mjerenje razine prirodnog obilja izotopskog sastava dušika oceanskog nitrata: prilagodba metode difuzije amonijaka. Kemija mora 57:227-242.

Solorzano, L. 1969. Određivanje amonijaka u prirodnim vodama fenolhipokloritnom metodom. Limnologija i oceanografija 14:799-801.

Strickland, J. D. H. i T. R. Parsons (1972). Praktični priručnik za analizu morske vode. Ottawa, Kanada, Odbor za istraživanje ribarstva Kanade.

UNESCO-a. 1985. Međunarodni sustav jedinica (SI) u oceanografiji. UNESCO-ov tehnički papir broj 45. IAPSO Publication Scientifique broj 32, Pariz, Francuska.

Valiela, I., G. Collins, J. Kremer, K. Lajtha, M. Geist, B. Seely, J. Brawley i C. H. Shaw. 1997. Opterećenje dušikom od obalnih slivova do prihvatnih estuarija: nova metoda i primjena. Ekološke primjene 7:358-380.

Vallino, J. J. i C. S. Hopkinson. 1998. Procjena disperzije i karakterističnih vremena miješanja u estuariju Plum Island Sounda. Estuarine, Coastal and Shelf Science 46:333-350.

Walsh, T. W. 1989. Ukupni otopljeni dušik u morskoj vodi: nova metoda izgaranja pri visokim temperaturama i usporedba s fotooksidacijom. Kemija mora 26:295-311.

Wright, R. T., R. B. Coffin i M. E. Lebo. 1987. Dinamika planktonskih bakterija i heterotrofnih mikroflagelata u Parker Estuariju, sjeverni Massachusetts. Istraživanje Continental Shelf 7:1383-1397.


Uvod

Razvoj korijena u biljkama složen je proces koji uključuje visok stupanj morfološke plastičnosti, što odražava inherentne mehanizme prilagodbe na vrlo varijabilne uvjete okoliša. Iako se molekularne determinante morfologije i funkcioniranja korijena tek počinju shvaćati, klasični fiziološki eksperimenti jasno su uključili i lokalne i sistemske regulatorne krugove u određivanje plastičnosti korijena. Uz svoju ulogu u selektivnom iskorištavanju specifičnih domena tla za raspoložive izvore hranjivih tvari i vode, važna uloga razvojne plastičnosti korijena je osigurati biljkama sposobnost prepoznavanja i reagiranja na različite biotičke signale mikroorganizama iz tla. Diskriminatorno prepoznavanje i odgovarajući odgovori na te biotičke znakove ključni su za opstanak biljaka, au slučaju simbiotskih interakcija biljka-mikrob pruža dodatno sredstvo za selektivno iskorištavanje inače nedostupnih izvora hranjivih tvari. Simbioze biljaka mahunarki koje fiksiraju dušik predstavljaju zanimljiv primjer potonjeg fenomena (Vance, 1998.). Nakon infekcije specifičnim sojevima rizobije, kortikalne stanice korijena mahunarki podliježu dediferenciji, pokreću diobe stanica i preusmjeravaju svoju razvojnu sudbinu prema stvaranju primordija kvržica. Nakon toga, kroz visoko organizirani i kontrolirani niz događaja, primordija kvržica se razvija u potpuno funkcionalne organe koji fiksiraju dušik, korijenske nodule (za nedavne preglede vidi Hadri et al. 1998. Hirsh, 1992.). Organogeneza nodula aktivira se kao odgovor na specifične lipo-hitooligosaharidne signalne molekule (Nod faktori) sintetizirane kompatibilnim sojevima rizobije (Hadri & Bisseling, 1998. Spaink, 1996.). Strukturne i funkcionalne prilagodbe korijena na Nod čimbenike i rizobijalnu infekciju kontrolira biljka domaćin i pokazalo se da ih moduliraju različiti čimbenici okoliša, uključujući dostupnost kombiniranog dušika, kao i razvojne znakove povezane s rastom biljke (Caetano- Anolles & Gresshoff, 1991. Francisco & Harper, 1995. Nutman, 1952. Parsons et al. 1993. Streeter, 1988.). Jedan važan aspekt ovog procesa kontrole je biljka posredovana regulacija opsega nodulacije kao odgovor na infekciju rizobijama. Domaćin biljke aktivno kontrolira broj uspješnih događaja nodulacije na najmanje dvije različite razine. Jedna razina uključuje prerano zaustavljanje većine rizobialnih infekcija, tako da se samo ograničen broj kvržica formira unutar vrlo specifične osjetljive zone, smještene odmah iza vrha korijena koji raste (Vase et al. 1993.). U Medicago truncatula, the srp pokazalo se da mutacija uzrokuje dramatično povećanje broja perzistentne rizobialne infekcije, što rezultira hipernodulacijom osjetljive zone mutantnog korijena (Penmetsa & Cook, 1997.). Potonji fenotip pripisan je drugom učinku iste mutacije, odnosno ukupnoj neosjetljivosti mutantne biljke na hormon etilen (Penmetsa & Cook, 1997.). Ovi rezultati upućuju na to da uz svoje dobro okarakterizirane funkcije u razvoju biljaka, etilen je također uključen u signalni put koji kontrolira rizobijalnu nodulaciju mahunarki. Uloga biljnog hormona etilena u nekoliko drugih aspekata simbiotskog razvoja dobro je dokumentirana za barem neke biljne vrste mahunarki (Fernandez-Lopez et al. 1998 Grobbelaar et al. 1970. Heidstra et al. 1997. za noviju recenziju vidi Hirsch & Fang, 1994.). Međutim, pokazalo se da mutanti soje neosjetljivi na etilen pokazuju uzorak nodulacije divljeg tipa (Schmidt et al. 1999.). Trenutno nije jasno odražava li razlika između učinaka osjetljivosti na etilen i/ili etilen na nodulaciju u soji i drugim vrstama mahunarki različitu ulogu ovog hormona u regulaciji razvoja kvržica.

Osim što ograničava broj perzistentnih rizobialnih infekcija unutar osjetljive zone korijena, biljka također vrši prostornu i vremensku kontrolu osjetljivosti korijena na nodulaciju. Ovaj mehanizam se naziva autoregulacija ili povratna regulacija nodulacije, a uključuje inhibiciju stvaranja kvržica na mlađim tkivima korijena prethodnim događajima nodulacije u starijim regijama korijena (Kosslak & Bohlool, 1984. Nutman, 1952. Pierce & Bauer, 1983.). Autoregulacija čini stanice korijena samo prolazno osjetljivima na rizobijalnu infekciju, što rezultira uskom zoni infekcije i diferencijacijom nodula (zona osjetljivosti Bhuvaneswari et al. 1981.). Biljke defektne u ovom mehanizmu nastavljaju kvržiti na novorazvijajućim korijenima i stvaraju veliki broj kvržica po cijelom korijenskom sustavu (fenotip hipernodulacije ili supernodulacije). Na temelju eksperimenata koji uključuju podijeljeni korijenski sustav i cijepljenje između divljih i supernodulacijskih mutantnih biljaka, pretpostavljena je interakcija između lokalnih i sistemskih signalnih događaja u uspostavljanju autoregulacijske kontrole nodulacije (Caetano-Anolles et al. 1991. Sheng & Harper, 1997.). Slični pokusi identificirali su tkiva lista kao glavni izvor sistemskog signala, što implicira komunikaciju na daljinu između korijena i izdanka u autoregulaciji broja nodula. Također je pretpostavljena lokalna, nesistemska kontrola koju vrše potpuno zreli noduli nad izrastanjem mlađih nodulacijskih događaja (Caetano-Anolles et al. 1991. Nutman, 1952.). Točna priroda mehanizama uključenih u autoregulaciju nije shvaćena, a identitet pretpostavljenih sistemskih i lokalnih signalnih spojeva ostaje nepoznat. Međutim, primamljivo je nagađati da se autoregulacijski odgovor barem djelomično oslanja na mehanizam osjeta i reguliranja staničnih dioba, te stoga može činiti dio općenitijeg mehanizma koji regulira rast biljaka. U ovom kontekstu zanimljivo je primijetiti da se pokazalo da razvojni procesi biljaka osim nodulacije, kao što su oni povezani s stvaranjem meristema apikalnog korijena, utječu na stvaranje kvržica putem mehanizma koji nalikuje autoregulaciji (Gresshoff et al. 1989. Nutman, 1952.). Suprotno tome, utvrđeno je da mutacije koje narušavaju autoregulacijski odgovor imaju različite pleiotropne učinke na rast biljaka i, gotovo uvijek, dovode do visoke simbioze tolerantne na nitrate (učinkovita nodulacija u prisutnosti visokih nitrata nts fenotip). Nitrat (BR3 – ) modulira rast biljaka i ima složene učinke na razvoj korijena, prepoznavanje simbionata i nodulaciju (Dazzo & Brill, 1978. Gresshoff, 1993. Zhang et al. 1999.). Uobičajeni čimbenici mogu biti uključeni u mehanizme koji reguliraju opseg nodulacije, inhibiciju nitrata i druge povezane reakcije rasta biljaka (npr. formiranje bočnog korijena). Alternativno, bliske interakcije između specifičnih regulacijskih putova (npr. autoregulacijskih i puteva inhibicije nitrata) mogu biti dovoljne da se uzmu u obzir pleiotropni učinci jedne mutacije u jednom od kontrolnih elemenata. Razumijevanje prirode regulatornih procesa koji kontroliraju diferencijaciju kvržica i broj kvržica te njihovo integriranje u sveukupne mehanizme koji upravljaju rastom i razvojem korijena predstavljaju važne elemente naše potrage za razumijevanjem simbiotske fiksacije dušika u mahunarkama.

Prethodno smo identificirali biljne mutante iz diploidne mahunarke Lotus japonicus koji definiraju lokus koji kontrolira normalan razvoj korijena. Utvrđeno je da iste mutacije daju aberantni odgovor mutantne biljke na izazov simbiotske rizobije, što rezultira hipernodulacijom i abnormalnim fenotipovima rasta biljaka (de Bruijn et al. 1998. Schauser et al. 1998. Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b). Ovdje predstavljamo detaljnu karakterizaciju ovih mutantnih linija i pokazujemo da temeljne mutacije utječu na razvoj biljaka mijenjajući položaj i trajanje rasta stanica korijena.


Rezultati

Izolacija i genetska analiza mutanata hipernodulirane aberantne formacije korijena (Har). L. japonicus

Prethodno smo opisali izolaciju dvije alelne EMS-inducirane mutantne linije L. japonicus ekotip Gifu (Ljsym34-1 i Ljsym34-2), koji pokazuju neobične simbiotske (hipernodulirane) kao i drastično promijenjene fenotipove razvoja korijena (aberantni korijen) (de Bruijn et al. 1998. Szczyglowski et al. 1998a vidi sl. 1). Osim toga, identificirali smo nezavisnu mutantnu liniju iz eksperimenta mutageneze T-DNA (sym16) s vrlo sličnim fenotipom, ali je utvrđeno da je fenotip mutanta genetski nepovezan s umetanjem T-DNA (Schauser et al. 1998.). Alelski Ljsym34-1 i Ljsym34-2 utvrđeno je da su mutacije monogene recesivne s obzirom na fenotip aberantnog korijena i nepotpuno dominantne u smislu fenotipa simbiotske hipernodulacije (Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b, podaci nisu prikazani). The sym16 mutacija je bila monogena recesivna za sve fenotipove (Schauser et al. 1998.). Uzajamni križevi otkrili su da je Ljsym34-1/2 i sym16 mutanti pripadaju istoj komplementacijskoj skupini (podaci nisu prikazani). U skladu s nedavno predloženim smjernicama za genetsku nomenklaturu za L. japonicus (Stougaard et al. 1999.), odgovarajući aleli su preimenovani har1-1 (bivši Ljsym34-1), har1-2 (ranije Ljsym34-2), i har1-3 (ranije sym16), i imenovan je odgovarajući gen divljeg tipa Har1. Na temelju svog nešto jačeg mutantnog fenotipa, the har1-1 alel je odabran za daljnju detaljnu analizu.

Fenotipovi korijena i nodulacije divljeg tipa i har1 mutantni L. japonicus bilje.

Biljke su uzgajane 21 dan u prisutnosti (divlji tip i b har1-1) ili odsutnosti (c har1-1) od Mezorhizobium loti NZP2235, sa 0,5 m m KNO3 u otopini za zalijevanje. Ploče (d) i (e) prikazuju krupni plan noduliranih korijena prikazanih u (a) i (b), redom. Ploča (f) prikazuje har1-3 uzgaja se 3 tjedna u prisutnosti rizobije i dodatnih 8 tjedana u mediju za rast Hornum bogatom dušikom koji sadrži 8 m m KNO3 i 5 m NH4 + ( Thykjaer et al. 1998 ).

Simbiotski (hipernodulirani) fenotip har1-1 mutantni

Inokulacija od L. japonicus har1-1 biljke sa Mesorhizobium loti soj NZP2235 rezultirao je gotovo potpunom inhibicijom rasta biljaka i prethodno opisanim neobičnim fenotipom hipernodulacije (Szczyglowski et al. 1998a vidi sl. 1). Strukture nalik kvržicama koje pokrivaju gotovo cijeli kratki korijenski sustav razvile su se istodobno s inhibicijom rasta biljaka i pogoršanjem ukupne vitalnosti biljke (hipernodulacijska reakcija, HNR, fenotip Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b). Da bismo dalje ispitali ovaj novi fenotip hipernodulacije, derivat od M. loti soj NZP2235, koji nosi konstitutivno izražen hemA::lacZ reporter gen fusion, korišten je za analizu ranih događaja tijekom infekcije divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke. Mikroskopskim analizama utvrđeno je da je način primarnog ulaska rizobija u har1-1 mutantni korijeni su inficirani niti pokrenuti unutar deformiranih korijenskih dlačica, kao kod biljaka divljeg tipa. Drugi rani događaji infekcije, kao što su deformacija korijenske dlake (Had), uvijanje kose (Hac) i formiranje niti infekcije (Inf) također su bili slični u har1-1 mutantne biljke i biljke divljeg tipa (podaci nisu prikazani). Međutim, utvrđeno je da se sljedeće faze simbiotskog razvoja značajno razlikuju. U biljkama divljeg tipa utvrđeno je da je većina primarnih infekcijskih događaja zaustavljena rano tijekom simbiotskog razvoja, bez napredovanja dalje od stadija nekoliko dioba kortikalnih stanica, što je rezultiralo 9-15 čvorića koji fiksiraju dušik na gornjem dijelu potpuno izduženog star 21 dan L. japonicus korijenje divljeg tipa (vidi sliku 1a,d). Nasuprot tome, korijeni har1-1 mutantne biljke, 11 dana nakon inokulacije rizobijom, imale su mnogo više žarišta dioba kortikalnih stanica od korijena divljeg tipa koji se proteže gotovo cijelom dužinom korijena (slike 2 i 3a,b). Ove početne diobe kortikalnih stanica dovele su do primordija kvržica, a potom do mase kvržica koje pokrivaju gotovo cijeli korijen (slike 1e,f i 3c,d). Osim toga, morfogeneza nodula na har1-1 Utvrđeno je da su mutantne biljke neosjetljive na normalno inhibitorne koncentracije kombiniranog dušika (5-15 m m NO3 – ). Šest tjedana nakon inokulacije rizobijom, har1-1 mutantne biljke razvile su otprilike 40-60 kvržica, u prisutnosti visokih koncentracija nitrata (5-15 m m ) ili amonijaka (1-3 m m ). Nasuprot tome, razvoj nodula u kontroli divljeg tipa L. japonicus utvrđeno je da su biljke jako inhibirane kombiniranim izvorima dušika. Na primjer, u prisutnosti 15 m m KNO3 uočeno je samo nekoliko malih kvržičastih struktura (izbočina). Kada se uzgaja u prisutnosti niske koncentracije KNO3 (0,5 m m ), kvržice stare 21 dan har1-1 mutantne biljke bile su značajno manje od kvržica divljeg tipa iste starosti (podaci nisu prikazani). Unatoč razlici u veličini, svjetlosni i transmisijski elektronski mikroskopski pregled inficirane zone nodula nastalih na har1-1 biljke su otkrile normalnu (sličnu divljem tipu) citologiju i histologiju (slika 3e,f). Štoviše, noduli su se formirali na har1-1 mutantni korijeni imali su sposobnost fiksiranja dušika (reduciranja acetilena) na razinama usporedivim s kvržicama divljeg tipa kada su izračunate na bazi po biljci (podaci nisu prikazani).

Događaji infekcije i nodulacije kod divljeg tipa i har1-1 biljke nakon inokulacije s M. loti soj NZP2235 koji nosi a hemA:lacZ fuzija reporterskih gena.

Korijeni su obojeni na aktivnost β-galaktozidaze i ispitani pomoću mikroskopije svijetlog polja. Otvorene trake označavaju broj korijenskih dlačica s vidljivim nitima infekcije čvrste trake označavaju broj nodula i primordija kvržica. Svaka vrijednost predstavlja srednju vrijednost mjerenja od 7 do 15 biljaka. Trake grešaka predstavljaju intervale pouzdanosti od 95%.

Mikroskopska analiza simbiotskog razvoja kod divljeg tipa i har1-1 bilje.

(a,b) Brightfield mikrofotografije očišćenog divljeg tipa i har1-1 mutantnih korijena 11 dana nakon infekcije s M. loti NZP2235. Primordija nodula označena su strelicama. (c,d) Montaže nodulacijskih fenotipova divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke 14 dana nakon inokulacije s M. loti NZP2235 koji nosi a hemA:lacZ fuzija reporterskih gena. Korijeni su obojeni na aktivnost β-galaktozidaze i ispitani pomoću mikroskopije svijetlog polja. (e,f) Transmisione elektronske mikrofotografije središnje zone divljeg tipa i har1-1 mutantne nodule koje pokazuju inficirane stanice domaćina ispunjene bakterijskim endosimbiontima i dio susjednih visoko vakuoliranih neinficiranih stanica.

Nesimbiotski (aberantno formiranje korijena) fenotip har1-1 mutantni

Neinokuliran L. japonicus har1-1 mutantne biljke razvijaju značajno skraćeni korijenski sustav i povećan broj bočnih korijena u usporedbi s biljkama divljeg tipa (Szczyglowski et al. 1998a). Za daljnju analizu ovog fenotipa, ispitali smo formiranje lateralnog korijena u neinokularnom har1-1 i primarnih korijena divljeg tipa i nisu našli značajne razlike u njihovom položaju u odnosu na vrh korijena, budući da su gotovo svi LRP-ovi pronađeni u području koje se nalazi 0,75–4,5 cm od vrha korijena. Međutim, gustoća primordija bočnih korijena i izniklih bočnih korijena (broj po jedinici duljine korijena) bila je najmanje tri puta veća u har1-1 mutant nego kod biljaka divljeg tipa (podaci nisu prikazani). Detaljno ispitivanje srednjih uzdužnih presjeka neokuliranih har1-1 uzorci korijena otprilike 2 cm iznad vrha korijena otkrili su značajno višu razinu mitotičke aktivnosti u sloju pericikla korijena har1-1 u odnosu na korijenje divljeg tipa (slika 4a,b). U 9 ​​dana starim korijenima har1-1 mutantne, periklinske diobe stanica u periciklu, kao i razvoj dva ili tri nova stanična sloja, otkriveni su u svim ispitivanim presjecima. Obilne antiklinalne diobe stanica u periciklu, kao iu susjednim slojevima kortikalnih stanica, također se mogu otkriti u dijelovima har1-1 mutantni korijeni, au nekoliko slučajeva uočeni su dobro razvijeni bočni korijeni primordija. Nasuprot tome, korijeni divljeg tipa slične starosti pokazali su samo ograničenu mitotičku aktivnost u periciklu, koji je uglavnom bio sastavljen od jednog staničnog sloja (slika 4a,b). Primordija bočnog korijena rijetko je opažena u dijelovima korijena divljeg tipa.

Mitotička aktivnost periciklusa korijena u divljeg tipa i har1-1 mutantnih korijena.

(a,b) Medijan uzdužnog presjeka segmenata 9-dnevnih neokuliranih korijena divljeg tipa (a) i har1-1 (b) mutantne biljke približno 2 cm iznad vrha korijena. Strelice označavaju sloj periciklične ćelije.

Fenotip korijena i izdanka har1-1 mutantni

Fenotip kratkog korijena L. japonicus har1-1 biljke je prethodno dokumentirano (de Bruijn et al. 1998. Szczyglowski et al. 1998a Szczyglowski et al. 1998b). Za daljnju kvantitativno procjenu ovog fenotipa, longitudinalni rast neokuliranih i inokuliranih har1-1 a izmjereno je korijenje divljeg tipa. Uočena je prosječna duljina korijena od 61,3 ± 0,2 mm za neinokulirane har1-1 biljke 21 dan nakon sjetve u odnosu na 131,9 ± 1,0 mm za divlje neinokulirane kontrolne biljke (slika 5a). Osim toga, korijenska masa neinokulirana har1-1 21 dan nakon sjetve (26 ± 2 mg svježe mase) bio je značajno manji od biljaka divljeg tipa (45 ± 6 mg). Aberantno har1-1 Fenotip rasta korijena bio je još ekstremniji kada su biljke inokulirane s M. loti soj NZP2235. Rast korijena har1-1 biljke su u potpunosti prestale u prvim danima nakon inokulacije, a korijenje nije prelazilo prosječnu duljinu od 20 ± 1,5 mm (slika 5b). Masa mladica inokulirana har1-1 biljaka također je značajno smanjen u zaraženim biljkama, dok je bio usporediv u neinokuliranim har1-1 naspram izbojaka divljeg tipa (slika 5c,d).

Kinetika rasta korijena i izdanaka divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke u prisutnosti ili odsutnosti M. loti.

(a,b) Kinetika rasta korijena neokuliranih (a) i inokuliranih (b) divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke. (c,d) Kinetika rasta izbojaka neinokuliranih (c) i inokuliranih (d) divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke. Sve biljke su uzgojene u poklonima od 0,5 m m KNO3. Svaka vrijednost predstavlja srednju vrijednost mjerenja najmanje 30 biljaka. Trake grešaka predstavljaju intervale pouzdanosti od 95%.

Citologija od har1-1 mutantnih korijena

Utvrdivši da je nekoliko parametara razvoja korijena (duljina/izduženje korijena, bočno formiranje korijena i ukupna akumulacija korijenske mase) značajno izmijenjeno u har1-1 mutantna linija, fenotip har1-1 mutantni korijeni su dalje analizirani. Prvo, stanična organizacija divljeg tipa L. japonicus ispitano je korijenje. Primarni L. japonicus Utvrđeno je da korijeni sadrže vanjski jedan sloj epidermalnih stanica, 3-5 nepravilno oblikovanih slojeva kortikalnih stanica koji okružuju jedan sloj endodermalnih stanica, unutarnju regiju koja se sastoji od jednog sloja pericikličnih stanica koje zatvaraju vaskularni cilindar i distalno smješteno područje stanica korijenske kapice. Ista opća organizacija slojeva korijenskih stanica pronađena je u har1-1 mutantni korijeni (slika 6). Međutim, uočeno je nekoliko značajnih razlika. Vakuolacija, koja obično prati širenje stanice, dogodila se bliže vrhu korijena u har1-1 naspram korijena divljeg tipa (slika 6a,b). Osim toga, promjer mutanta har1-1 korijena (0,23 ± 0,03 mm), mjereno pomoću digitaliziranih mikrosnimaka živih korijena na 3-6 mm od vrha korijena, bio je značajno manji od prosječnog promjera odgovarajuće regije divljeg tipa L. japonicus korijenje (0,31 ± 0,02 mm vidi također sliku 6c,d). Na temelju ovih rezultata formulirane su i testirane sljedeće dvije hipoteze: (1) har1-1 mutacija utječe na radijalnu organizaciju L. japonicus korijen, i/ili (2) smanjena duljina i promjer korijena rezultat je abnormalnog (smanjenog) širenja stanica.

Histologija nesimbiotskog razvoja korijena.

(a,b) Medijan uzdužnih presjeka područja vrhova korijena 9-dnevnog divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke koje pokazuju cjelokupnu anatomiju meristematske regije i položaj zone produljenja/vakuolacije stanice. (c,d) Poprečni presjeci korijena biljaka starih 22 dana na približno 600 μm iznad vrha korijena, pokazujući razlike u opsegu stanične vakuolacije i promjeru korijena. (e,f) Poprečni presjeci zrelih područja korijena 6-dnevnih biljaka približno 1 cm iznad vrha korijena.

The har1-1 mutacija rezultira smanjenim radijalnim širenjem stanica korijena

Za provjeru prve hipoteze (defekt u radijalnoj organizaciji korijena) mikroskopski je ispitan veliki broj presjeka korijena. Nema jasnih dokaza za jedan ili više nedostajućih staničnih slojeva ili smanjen broj stanica korijena har1-1 pronađeni su mutantni korijeni (slika 6). Stoga smo testirali drugu hipotezu (promjene u ekspanziji stanica korijena), analizirajući dijelove potpuno diferencirane regije primarnih korijena (slika 6e,f). Prosječna ukupna površina poprečnog presjeka har1-1 mutantni korijeni bili su gotovo dva puta manji od korijena divljeg tipa (Tablica 1). Pojedinačni slojevi stanica (epidermis, korteks, endodermis i korijenska stela) har1-1 mutantni korijeni pokazali su slično smanjenje veličine, pridonoseći gotovo jednako ukupnom smanjenju promjera korijena (Tablica 1). Nakon toga, analizirana je predviđena površina poprečnog presjeka pojedinačnih stanica korijena kako bi se utvrdilo je li radijalno širenje stanice promijenjeno u har1-1 mutantnih korijena. Radijalne površine pojedinih stanica epiderme, korteksa i endoderme korijena imale su frekvencijsku raspodjelu koja je bila ograničena na mnogo manji raspon veličina za har1-1 mutant (slika 7), što sugerira da je har1-1 mutacija ograničava sposobnost širenja stanica korijena.

Tkivo Divlji tip (a) har1-1 (b) b/a omjer
Ukupno odjeljak 62357 ± 14772 33786 ± 4845 0.54
Epidermis 10073 ± 2250 5626 ± 760 0.56
Korteks 45228 ± 11283 24433 ± 3820 0.54
Endodermis 2097 ± 373 1387 ± 175 0.66
Stele 5070 ± 1033 2655 ± 513 0.52

Radijalna ekspanzija korijenske stanice kod divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke.

Prikazana je frekvencijska raspodjela površine poprečnog presjeka epidermalnih (a), kortikalnih (b) i endodermalnih (c) stanica 6-dnevnih biljaka izmjerena na mjestu približno 1 cm iznad vrha korijena. Analizirano je deset biljaka divljeg tipa i mutantnih biljaka i svaka točka predstavlja vrijednost frekvencije za povećanje raspona veličine stanica od 35 μm (epidermis), 200 μm (korteks) i 20 μm (endodermis) n, predstavlja broj izmjerenih ćelija.

Duljina meristematskog područja se skraćuje u har1-1 mutantnih korijena

Ispitati je li fenotip kratkog korijena har1-1 mutantne biljke uzrokovane su promjenom primarnog smjera stanične ekspanzije duž apikalno-bazalne osi, duljine har1-1 mjerene su epidermalne stanice korijena. Prosječna duljina potpuno proširenih epidermalnih stanica har1-1 mutantni korijeni (138 ± 30 μm) bili su gotovo jednaki korijenima divljeg tipa (132 ± 30 μm), što ukazuje da har1-1 mutacija nije utjecala na longitudinalno širenje stanica epiderme (slika 8a). Ovi rezultati sugeriraju da je malo vjerojatno da će fenotip kratkog korijena mutantne biljke biti posljedica abnormalnog uzdužnog širenja stanica korijena. Međutim, u skladu s našim ranijim zapažanjima (vidi gore), epidermalne stanice har1-1 mutantni korijeni pokazali su dokaze produljenja duž uzdužne osi znatno bliže vrhu korijena (dakle ranije u razvoju) od korijena divljeg tipa (slika 8a). Transmitirana mikroskopija svijetlog polja i laserska skenirajuća mikroskopija cijelih očišćenih korijena obojenih acetokarminom otkrili su područje gusto citoplazmatskih stanica koje čine meristematsku regiju korijena čije se granice mogu definirati interaktivnim tehnikama držanja praga korištenjem digitalne obrade slike. U neovisnim eksperimentima korištenjem obje vrste mikroskopije, približno 2,6 puta smanjenje projicirane površine har1-1 otkrivene su meristematske regije korijena mutanta naspram divljeg tipa (45082 ± 4373 μm 2 n = 11 naspram 121635 ± 12545 μm 2 , n = 19 vidi također sliku 8b). Ovo smanjenje veličine meristematske regije korijena uvijek je bilo povezano s akropetalnim pomakom zona produljenja/vakuolizacije i vaskularizacije korijenskih stanica (slika 8b). har1-1 mutantni korijeni su također pokazali inferiornu strukturu klobuka korijena u usporedbi s divljim tipom, ali su ostali gravitropni (podaci nisu prikazani). Osim toga, mjeren je mitotički indeks kako bi se procijenio udio mitotičkih stanica u meristematskim regijama korijena har1-1 u odnosu na divlje vrste biljaka iste starosti, ali nisu pronađene značajne razlike (har1-1 mutantni MI = 3,8 ± 0,8 u odnosu na MI divljeg tipa = 3,96 ± 0,7).

Elongacija korijenske stanice i veličina meristematske regije kod divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke.

(a) Dužina epidermalne stanice duž osi korijena. Svaka točka predstavlja srednju vrijednost duljine ćelije za prirast od 250 μm (za prvih 4 mm od vrha korijena) i 500 μm (između 4 i 11 mm od vrha korijena), duž osi korijena. Jednostruke i dvostruke strelice pokazuju značajne razlike između srednje duljine epidermalnih stanica na dva uzastopna i ekvivalentna položaja u divljem tipu i har1-1 mutantnih korijena. (b) Netaknuto korijenje biljaka starih 14 dana obojeno acetokarminom. Crveno obojene meristematske regije divljeg tipa i har1-1 mutantni korijeni pojavljuju se kao tamna područja, a njihov opseg je označen zagradama.

Utjecaj hormona na har1-1 mutantno produljenje korijena

Bruto promjene u har1-1 morfologija korijena sugerirala je da bi hormonska regulacija razvoja mutantnog korijena mogla biti poremećena. Kako bi se testirala ova hipoteza, učinci primjene egzogenih hormona na produljenje korijena divljeg tipa i har1-1 mutantni korijeni istraženi su pomoću biološke analize ploče posebno razvijene za tu svrhu. Utvrđeno je da je saharoza potrebna u relativno visokoj koncentraciji (4,5%) kako bi se podržalo maksimalno i jednolično produljenje korijena i divljeg tipa i har1-1 mutantnih korijena. Korijenje biljaka divljeg tipa izdužilo se brže u mraku nego na svjetlu, osobito tijekom prva 2-3 dana rasta, nakon čega je razlika u brzini rasta nestala (slika 9a). har1-1 mutantne biljke formirale su kratke korijene kada su rasle u mraku u uvjetima koji su osiguravali maksimalan rast korijena divljeg tipa. Nakon 2 dana inkubacije u mraku uočena je dramatična inhibicija ili retardacija produljenja korijena. Zanimljivo je da je fenotip kratkog korijena djelomično potisnut kada har1-1 mutantne biljke uzgajane su na svjetlu (slika 9b).

Utjecaj svjetlosti na stope produljenja divljeg tipa i har1-1 mutantnih korijena.

(a) Stope produljenja korijena divljeg tipa. (b) Stope od har1-1 mutantno produljenje korijena. Svaka vrijednost je srednja vrijednost mjerenja na 20 biljaka. Trake grešaka predstavljaju intervale pouzdanosti od 95%.

Od har1-1 korijeni su pokazali abnormalni uzorak radijalnog širenja stanica korijena, kao i hipernodulacijski odgovor (vidi slike 1, 3d i 6), a budući da je fenotip hipernodulacije Medicago truncatula mutant (srp) bila je povezana s promjenom osjetljivosti na etilen (Penmetsa & Cook, 1997.), osjetljivošću divljeg tipa i har1-1 ispitivane su sadnice prekursora etilena 1-aminociklopropan-1-karboksilne kiseline (ACC). Kad se uzgaja okomito u mraku na agar pločama koje sadrže rastuće koncentracije ACC, divljeg tipa i har1-1 mutantne sadnice pokazale su isti ukupni uzorak osjetljivosti na etilen inhibiciju rasta korijena (slika 10a). Međutim, u dva neovisna eksperimenta, har1-1 mutantni korijeni pokazali su blago povećanu otpornost na određene koncentracije ACC u usporedbi s korijenjem divljeg tipa (npr. 1 × 10 -7 do 1 × 10 -6 M ACC na slici 10a). Za daljnju procjenu uočenog smanjenja osjetljivosti har1-1 mutantne linije na ACC, ispitali smo odgovore cijelih sadnica na egzogeno primijenjeni ACC. Kada se uzgaja u mraku u prisutnosti ACC-a, divljeg tipa i har1-1 sadnice su pokazale tipičan trostruki odgovor (Guzman & Ecker, 1990.), koji se sastojao od skraćivanja hipokotila, inhibicije produljenja korijena i preuveličavanja apikalne zakrivljenosti kuke (slika 11.). Oba genotipa su pokazala sličnu razinu osjetljivosti na ACC u smislu duljine hipokotila (podaci nisu prikazani).

Divljeg tipa i har1-1 rast korijena u prisutnosti rastućih koncentracija egzogeno primijenjenih biljnih hormona.

Relativno produljenje divljeg tipa i har1-1 prikazani su mutantni korijeni u prisutnosti (a) 1-aminociklopropan-1-karboksilne kiseline (ACC) (b) α-naftalen-octene kiseline (NAA) ili 6-benzilaminopurina (BA). Svaka vrijednost je srednja vrijednost mjerenja na 20 biljaka. Trake grešaka predstavljaju intervale pouzdanosti od 95%. Srednja vrijednost 100% rasta korijena kod (a) divljeg tipa, 44,5 ± 3,4 mm har1-1 21,8 ± 1,2 mm u (b) divlji tip, 56,9 ± 2,4 mm har1-1, 25,8 ± 1,6 mm u (c) divlji tip 37,1 ± 1,9 har1-1, 21,6 ± 1,1 mm.

Trostruki odgovor na ACC divljeg tipa i har1-1 mutantne biljke.

Divljeg tipa i har1-1 mutantno sjeme klijalo je na MS mediju u mraku na 28°C u odsutnosti (0) ili prisutnosti rastućih koncentracija (1-100 m m ) ACC. Fotografija je snimljena 6 dana nakon inkubacije u mraku. Trostruki odgovor karakteriziraju skraćeni hipokotili, korijeni i pretjerano formiranje apikalnih udica.

Nakon toga je ispitan učinak auksina α-naftalen-octene kiseline (NAA) na rast korijena. Divljeg tipa i har1-1 Utvrđeno je da mutantni korijeni pokazuju sličan ukupni obrazac osjetljivosti NAA, ali, kao što je uočeno s ACC, korijeni har1-1 mutantne biljke pokazale su blagi fenotip neosjetljiv na NAA pri višim koncentracijama NAA (slika 10b).

U Arabidopsis, citokinin inhibira produljenje korijena kod svijetlih i tamnih presadnica zbog stimulacije proizvodnje endogenog etilena (Cary et al. 1995.). Stoga je osjetljivost divljeg tipa i har1-1 također su ispitani mutantni korijeni na egzogeno primijenjeni citokinin (na taj način endogeno proizveden etilen). Prisutnost čak i vrlo niskih koncentracija (10-50 nm ) sintetskog citokinina, 6-benzilaminopurina (BA), značajno je smanjila rast korijena u oba genotipa. Međutim, opet har1-1 mutantni korijeni pokazali su umjereno veću otpornost na širok raspon koncentracija BAP od korijena divljeg tipa (slika 10c). Ovaj blago povišeni otpor od har1-1 mutantni korijen mogao bi biti posljedica ili promijenjenog etilen neovisnog odgovora na citokinin, smanjene proizvodnje etilena stimulirane citokininom i/ili oslabljenog odgovora na endogeno proizveden etilen. Kako bi se razlikovale ove mogućnosti, ispitan je utjecaj egzogeno dodanog citokinina na inhibiciju rasta korijena u prisutnosti iona srebra, primijenjenih kao srebrni tiosulfat, da inhibira vezanje etilena (Beyer, 1979.) ili aminoetoksivinilglicina (AVG, Yang19 & Hoffman). ) za inhibiciju biosinteze etilena. Budući da je 50 nanomolarni BA gotovo maksimalno inhibirao produljenje korijena u oba genotipa, koristili smo ovu koncentraciju citokinina u kombinaciji s promjenjivim koncentracijama inhibitora.

U nedostatku BA, Ag + je imao samo ograničeni stimulativni učinak na rast/produženje divljeg tipa i har1-1 mutantni korijeni (slika 12a). Pet μM Ag+ bilo je dovoljno da se prevladaju svi inhibicijski učinci citokinina na har1-1 mutantnih korijena, dok je 5 μ m Ag + obnovio rast korijena divljeg tipa na razinu od oko 60% od razine neobrađenog kontrolnog korijena (slika 12b).

Učinak BA na produljenje divljeg tipa i har1-1 mutantnih korijena u prisutnosti inhibitora percepcije/sinteze etilena.

Relativno produljenje divljeg tipa i har1-1 prikazani su mutantni korijeni u prisutnosti (a) Ag + (b) BA plus Ag + (c) AVG i (d) BA plus AVG. Srednja vrijednost 100% rasta korijena u (a) i (b) divljeg tipa, 41,6 ± 3,0 mm har1-1, 23,3 ± 1,2 mm u (c) i (d) divlji tip, 47,5 ± 4,0 mm har1-1, 23,2 ± 1,6 mm. Za daljnje detalje pogledajte legendu na slici 10.

Sličan skup eksperimenata proveden je s inhibitorom sinteze etilena, AVG. U kontrolnim pokusima, AVG koncentracija jednaka ili niža od 0,1 μm nije imala mjerljiv učinak na rast korijena u oba genotipa (Slika 12c), dok su više koncentracije bile snažno inhibirajuće (podaci nisu prikazani). Za razliku od fenotipske supresije posredovane srebrom, utvrđeno je da niska koncentracija AVG-a (0,1 μm) ublažava svu inhibiciju uzrokovanu citokininom i vraća normalan fenotip dugog korijena biljkama divljeg tipa (slika 12d ). Međutim har1-1 mutantne biljke različito su reagirale na isti tretman, ne samo obnavljanjem kratkog fenotipa korijena, već i dodatnom stimulacijom rasta korijena. Potonji učinak doveo je do toga da su mutantne biljke razvile dugačko korijenje koje se izdužilo istom brzinom kao i korijenje divljeg tipa. Međutim, produljena inkubacija (više od 10 dana) i divljeg tipa i mutanta har1-1 biljke u prisutnosti citokinina i AVG rezultiralo je potpunim zaustavljanjem rasta njihovog korijena. Utvrđeno je da je ovaj učinak povezan s terminalnom diferencijacijom korijenskog meristema, čime se isključuju eksperimenti s dužim vremenom tretmana (podaci nisu prikazani).


5.15: Fiksacija dušika - Biologija

Napredna kemija A/AS razine: Više o oblicima anorganskih molekula i iona

Doc Brown's Advanced A Level Chemistry

Bilješke o reviziji teorijske fizičke kemije

Oblici molekula i iona i kutovi veze povezani su s njihovom elektroničkom strukturom

2. dio Neke druge molekule i ioni ugljika, dušika, sumpora i klora

Opis, objašnjenje, oblici i kutovi veze karbonatnog iona, nitrat(III) iona (nitrit ion), nitrat(V) iona (nitrat ion), dušikov(IV) oksid (dušikov dioksid), nitronijev ion, sumpor(IV) ) oksid (sumpor dioksid), sumpor(VI) oksid (sumporov dioksid), sulfat(IV) ion (sulfatni ion), sumpor(VI) ion (sulfatni ion), klorat(III) ion, ClO2 - (kloritni ion), klorat(V) ion, ClO3 - (kloratni ion) i klorat(VII) ion, ClO4 - (perkloratni ion) su sve opisane i raspravljene. Sve je opisano i objašnjeno!

Oblici molekula, dijagrami točaka i križa, kutovi veze za odabrane molekule i ione dušika, sumpora i klora korištenjem modela odbijanja elektron-parova valentne ljuske (VSEPR) i dijagrama točkica i križa (ox) prikazani su u 'Lewisovom stilu' 'Škrabotine' će s vremenom biti zamijenjene zgodnim dijagramima!

  • Karbonatni ion, CO3 2- je trigonalnog planarnog oblika s veznim kutom O-C-O od 120 o zbog tri skupine veznih elektrona i nema usamljenih parova elektrona.
  • Oblik je izveden u nastavku pomoću dijagrama točaka i križa i teorije VSEPR i ilustriran u nastavku.
  • Imajte na umu da su sve C-O veze identične zbog delokalizacije nekih elektrona ( σ sigma i π pi veza)

valentna veza točka i križni dijagram za karbonatni ion

    Dušikov(IV) oksid, NO2 (dušikov dioksid) je savijenog oblika (kutni), O-N-O vezni kut

dijagrami točaka i križa valentne veze za dušikove okside i dušikove oksianione

  • Imajte na umu da su sve N-O veze unutar molekule ili iona identične zbog delokalizacije nekih elektrona ( σ sigma i π pi veza)

    Sumpor(IV) oksid, SO2 (sumpor dioksid/sumpor dioksid) molekula je savijenog oblika (kutni), O-S-O vezni kut

dijagrami točaka i križa valentne veze za sumporove okside i sumporove oksianione

  • Imajte na umu da su sve S-O veze unutar molekule ili iona identične zbog delokalizacije nekih elektrona ( σ sigma i π pi veza)

    Klorat(III) ion, ClO2 - (kloritni ion) , je savijenog oblika (kutnog) , vezni kut O-Cl-O

dijagrami točke i križa valentne veze za odabrane kloratne ione

  • Imajte na umu da su sve Cl-O veze unutar molekule ili iona identične zbog delokalizacije nekih elektrona ( σ sigma i π pi veza)

Napomene o reviziji za GCE Advanced Subsidiary Level AS Advanced Level A2 IB Revise AQA GCE Chemistry OCR GCE Chemistry Edexcel GCE Chemistry Salters Chemistry CIE Chemistry, WJEC GCE AS A2 Chemistry, CCEA/CEA GCE AS A2 Chemistry revisory tečajevi za studente (pre-uequanil Tečajevi za 11. i 12. razred u SAD-u i AP Honours/honours)


1. Uvod

Reaktivni dušik (Nr), kao što su nitrati, nitrit i amonij, bitan je za funkcije, procese i dinamiku ekosustava (Vitousek i Howarth 1991). Zajedno s pojavom neograničene industrijske fiksacije dušika uz niske troškove Haber-Boschovim procesom, antropogene aktivnosti su barem udvostručile godišnje globalne unose Nr u ekosustave u usporedbi s unosima Nr tijekom predindustrijskih vremena (Galloway et al 2004). Povećani Nr podržava potrebe za hranom i gorivom rastuće ljudske populacije, ali također uzrokuje brojne štetne utjecaje na ljudsko zdravlje i održivost okoliša, uključujući eutrofikaciju vodenih ekosustava i povećanje N2O emisije — snažan staklenički plin i plin koji oštećuje ozonski omotač (Vitousek et al 1997., Galloway et al 2008., Sobota et al 2013.). Međutim, povećani Nr nije ravnomjerno raspoređen na prostornim ljestvicama. U Africi – regiji s premalo Nr – poljoprivredni sektor nije bio u stanju proizvesti dovoljno hrane za brzo rastuće stanovništvo, a nedostatni unos N može dovesti do iskopavanja organskih zaliha dušika iz tla (Davidson 2009.). Stoga, kompenzacija negativnih utjecaja povezanih s antropogenim unosima Nr predstavlja važan izazov s kojim se suočavaju upravitelji zemljišta i voda diljem svijeta.

Bolje razumijevanje unosa i izvora Nr ključno je za poboljšanje ravnoteže između njihovih pozitivnih i negativnih učinaka (Bouwman et al 2009., Hong et al 2011, Swaney et al 2012.). Do sada su napravljene regionalne procjene antropogenog Nr za Europsku uniju (Sutton et al 2011.), Sjeverna Amerika (Sobota et al 2013) i Kina (Ti et al 2012.). Jedina postojeća sinteza Nr u Africi dovršena je za zapadnu Afriku prije tri desetljeća (Robertson i Rosswall 1986). Vjerujemo da bi antropogeni Nr u Africi trebao biti uključen u globalne procjene Nr posredovanog ljudima.

Viktorijino jezero u istočnoj Africi drugo je najveće slatkovodno jezero na svijetu, a sliv je jedno od najgušće naseljenih regija u Africi. Brzo širenje stanovništva i gospodarstva unutar sliva (Muyodi et al 2010.), rezultiralo je značajnim promjenama fizičkog, kemijskog i biološkog režima jezera tijekom posljednjih 50 godina (Juma et al 2014.), uključujući obogaćivanje Nr (Lung'ayia et al 2001). Prethodne studije u bazenu jezera Victoria uglavnom su bile usmjerene ili na koncentraciju N u vodi (Gikuma-Njuru i Hecky 2005.) ili na procjenu opterećenja na relativno maloj skali (Lindenschmidt et al 1998.). Međutim, ne postoje studije o regionalnom proračunu dušika u bazenu, što je ključno za poboljšanje regionalnog upravljanja Nr i uravnoteženje njegovih negativnih i pozitivnih učinaka.

Ovdje sintetiziramo postojeće podatke za razvoj regionalnog proračuna Nr u bazenu jezera Victoria koristeći neto antropogeni unos dušika (NANI) pristup. NANI pristup učinkovita je metoda za procjenu unosa Nr u krajolik uzrokovanih ljudskim djelovanjem i za procjenu njihovog potencijalnog utjecaja na riječni izvoz iz velikih slivova (Hong et al 2013.). Ciljevi ovog rada su (1) ocijeniti regionalni proračun Nr, naglašavajući njegove temeljne nesigurnosti, i (2) identificirati nedostatke u istraživanju i predložiti načine za poboljšanje budućih procjena.


Analitički profili ljekovitih supstanci i ekscipijenata

4. Metode analize

4.1 Identifikacija

Identitet zileutona može se potvrditi usporedbom spektra infracrvene apsorpcije uzorka s onim prikazanim na slici 9.

4.2 Elementarna analiza

Tipična elementarna analiza uzorka zileutona je sljedeća:

4.3 Kromatografske metode analize

4.3.1 Tankoslojna kromatografija

Nekoliko tankoslojnih kromatografskih sustava istraženo je kako bi se procijenila čistoća zileutona. Utvrđeno je da dva od njih daju najbolje odvajanje zileutona, njegovih nečistoća i produkata razgradnje.

Sustav I koristi etil acetat da izvrši analitičko odvajanje na silika gelu 60 F254, pri čemu se detekcija vrši kratkovalnim UV zračenjem. N-(l-benzo[b]tien-2-iletil)-urea (Rf, 0,12), (Z)-1-benzo[b]tien-2-iletanon oksim (Rf, 0,59), (E)-1-benzo[b]tien-2iletanon oksim (Rf, 0,65), i N-1benzo[b]tien-2-iletil) hidroksilamin se može odvojiti od zileutona (Rf, 0.21).

Sustav II koristi mobilnu fazu koja se sastoji od 50:50 1 kloroforma / metilen klorida / amonijevog hidroksida, a odvajanje se izvodi na silika gelu 60 F254, a detekcija se vrši kratkovalnim UV zračenjem. Ovaj se sustav može koristiti za odvajanje (Z)-1-benzo[b]tien-2-iletanon oksima (Rf, 0,06) (E)-1-benzo[b]tien-2-iletanon oksim (Rf, 0,17), 1-benzo[b]tien-2-iletanon (Rf, 0,56), 1-benzo[b]tien-2-iletiamin (Rf, 0,07), i 0-(1-benzo[b]tien-2-iletil)-1-benzo[b]tien-2-iletanon oksim (Rf, 0,33) iz zileutona (Rf, porijeklo).

4.3.2 Tekuća kromatografija visoke učinkovitosti

Razvijeno je nekoliko HPLC metoda za procjenu kvalitete zileuton ljekovite tvari. Sustav I se koristi za kvantificiranje potentnosti rasutih tvari, dok se sustavi II i III koriste za kvantificiranje nečistoća i produkata razgradnje u rasutom stanju tvari. Karakteristike sustava II i III su takve da pokrivaju raspon polariteta povezanih s različitim nečistoćama u zileutonu. Sustav II koristi se za praćenje produkata razgradnje.

Sustav I
Mobilna faza:0,1 M otopina amonijevog acetata koja sadrži 0,025 % acetohidroksamske kiseline (podesite otopinu s perklornom kiselinom na pH 2,0)/acetonitril (72:28)
Stupac:30 cm × 1/4″ (o.d.) × 4,6 mm (i.d.) pakirano sa Spherisorb S10 ODS
Protok:približno 1,5 ml/min
Detektor:260 nm, 0,1 AUFS
Sustav II
Mobilna faza:0,1 M otopina amonijevog acetata koja sadrži 0,025 % acetohidroksamske kiseline (podesite otopinu s perklornom kiselinom na pH 2,0)/acetonitril (82:18)
Stupac:30 cm × 1/4″ (o.d.) × 4,6 mm (i.d.) pakirano sa Spherisorb S10 ODS
Protok:2,2 mL/minuti
Detektor:260 nm, 0,01 AUFS
Sustav III
Mobilna faza:1:1 acetonitril/0,5% perklorne kiseline
Stupac:30 cm × 1/4″ (o.d.) × 4,6 mm (i.d.) pakirano sa Spherisorb S10 ODS
Protok:približno 1,5 ml/min
Detektor:260 nm, 0,01 AUFS

Osim toga, razvijena je metoda izravne kiralne kromatografije za odvajanje enantiomera zileutona, koja koristi sljedeće uvjete:

Mobilna faza:92:8:0,1 heksan/2-propanol/trifluvooctena kiselina
Stupac:Daicel Chiralpak AD, 250 × 4,6 mm (i.d.) (Regis) - radi na 25°C
Volumen ubrizgavanja:10 μL (0,1 mg/mL)
Protok:1,0 mL/minuti
Detektor:260 nm, 0,02 AUFS

4.4 Određivanje u farmaceutskim oblicima doziranja

Potentnost i proizvodi primarne razgradnje u formulacijama tableta zileuton mogu se analizirati postupkom tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti koristeći metil 4-hidroksibenzoat (metilparaben) kao interni standard. Metoda koristi Spherisorb S10 ODS, 10 μm kolonu, mobilnu fazu koja se sastoji od 72 dijela 0,1 M otopine amonijevog acetata koja sadrži 0,025 % acetohidroksamske kiseline (prilagođena perklornom kiselinom na pH 2,0) i 28 n dijelova acetonitrila.

4.5 Određivanje u tjelesnim tekućinama

Istodobno određivanje zileutona i njegovog N-dehidroksiliranog metabolita u neobrađenom urinu štakora micelarnom tekućinskom kromatografijom razvili su Thomas i Albazi [23]. Odvajanje ovih spojeva postiže se korištenjem natrijevog dodecil sulfata (SDS) kao mobilne faze, CN-vezanog stupca silicijevog dioksida i UV detekcije na 262 nm. Zbog solubilizirajuće moći micelarne mobilne faze, uzorci urina su ubrizgani u sustav bez ikakvih dugotrajnih koraka precipitacije proteina i/ili ekstrakcije lijeka.

Također je razvijena HPLC metoda za određivanje zileutona i njegovog neaktivnog N-dehidroksiliranog metabolita u plazmi [24].


RASPRAVA

Indeks klorofila u lišću i koncentracija dušika u listovima kukuruza

Primijenjene stope N apsorbirao je kukuruz, što je dokazano povećanom koncentracijom N listova i LCI kada je N jedna od komponenti molekule klorofila (Galindo i sur., 2016.). Bilo je nekoliko studija koje su izvijestile o pozitivnoj linearnoj korelaciji s LCI i povećanjem stope N u usjevima kukuruza. Kappes i sur. (2013a) primijenjen do 90 kg ha-1 N kao urea, a Kappes i sur. (2014) koristili su 0, 50, 100 i 150 kg ha-1 N kao ureu i oba su izvijestila o linearnom odnosu između mjerenja količine N i LCI. Iako su vrijednosti LCI relativno visoke u našem istraživanju, čak iu kontrolnim usjevima (u rasponu od 61 do gotovo 71, respektivno), rezultati su usporedivi s onima iz literature. Kappes i sur. (2013a) izvijestili su o vrijednostima LCI u rasponu od 45,8 do 62,9, a Kappes i sur. (2014) izvijestili su o vrijednostima LCI u rasponu od 55,3 do 62,1.

S obzirom na koncentraciju N listova, slične rezultate su dobili Costa i sur. (2012.), koji su uočili linearan i pozitivan učinak stopa N na koncentraciju N u tkivu lista. Vrijedi napomenuti da je koncentracija N lista bila u rasponu koji se smatra primjerenim (27-35 g kg -1) (Cantarella i sur., 1997.), čak i u kontrolnim usjevima (27,21 g kg -1). Međutim, vrijedan je pažnje veći zahtjev za N kod hibrida kukuruza ranijeg ciklusa i veći proizvodni potencijal.

Sličan rezultat između izvora N za LCI može se pripisati sličnim koncentracijama N u listovima dobivenim s ureom i ureom s inhibitorom ureaze NBPT. To bi moglo biti posljedica slabe učinkovitosti NBPT-a u neutraliziranju enzima ureaze u tlu. Neki od razloga neučinkovitosti NBPT-a u kontroli aktivnosti ureaze mogu biti zato što je dio slame iz prošlogodišnjeg uroda pšenice ostao na površini tla, a godina je bila iznimno vruća (slika 1.). Slično, druge studije nisu izvijestile o značajnim razlikama u prinosu između uree i poboljšanih izvora N s polimerima sporog otpuštanja u kukuruzu (Queiroz i sur., 2011., Valderrama i sur., 2011., Galindo i sur., 2016.).

Što se tiče pozitivnih rezultata inokulacije u LCI, slično, Müller i sur. (2016.) i Galindo i sur. (2016) utvrdili su da biljke kukuruza koje su cijepljene s A. brasilense imao veći LCI od biljaka koje nisu inokulirane. Pozitivni odgovori na cijepljenje s ovom dijazotrofnom bakterijom dobiveni su čak i kada se usjevi uzgajaju u uvjetima koji osiguravaju adekvatnu količinu N za optimalan rast (Galindo i sur., 2017.c). To sugerira da se pozitivni odgovori biljaka na inokulaciju ne javljaju isključivo zbog BNF-a u travama, već i zbog proizvodnje hormona rasta biljaka, uključujući indoleoctenu kiselinu, giberelin i citokinin (Galindo i sur., 2017c.), koji mogu igrati bitnu ulogu ulogu u promicanju rasta biljaka (Bashan i de-Bashan, 2010.). Prema Pankieviczu i sur. (2015.), cijepljenje s A. brasilense može poboljšati razvoj i rast korijenskog sustava Setaria viridis trava zbog većeg CO2 fiksacija i manja akumulacija fotoasimiliranog ugljika u lišću, što je dovelo do većeg nadzemnog rasta, većeg sadržaja vode u tkivu i manjeg stresa. Osim toga, povećana proizvodnja indoleoctene kiseline može poboljšati unos hranjivih tvari većim rastom korijenskog sustava (Hungria i sur., 2010.).

Biometrijske procjene i proizvodne komponente kukuruza

Castro i sur. (2008) izvijestili su da na visinu biljke utječe dostupnost N u tlu budući da ovaj hranjivi sastojak izravno sudjeluje u fotosintetskom procesu te diobi i širenju stanica. Gross i sur. (2006) preporučuju da se N primjenjuje samo u jednoj ili dvije primjene tijekom sezone, zbog pozitivnih učinaka na visinu biljke i prinos zrna kukuruza. Međutim, vrijedno je napomenuti da visina biljke nije uvijek u korelaciji s produktivnošću budući da su moderni hibridi s visokim produktivnim potencijalom uglavnom niže visine (Cruz i sur., 2008.). U našem istraživanju uočeno je da povećanje količine N dovodi do povećane dostupnosti N, što je vjerojatno povećalo akumulaciju N zrna i posljedično povećalo visinu biljke, promjer klipa, broj zrna po klasu, masu od 100 zrna i prinos zrna kukuruza.

S obzirom na masu 100 zrna, masa zrna je karakteristika na koju utječu genotip, klimatski uvjeti i dostupnost hranjivih tvari tijekom faza punjenja zrna (Chen i sur., 2012.). Dodatno, za Mello i sur. (2017.), ova produktivna komponenta vrlo je ovisna o unosu N kukuruzom, koji dostiže vrhunac unosa u razdoblju između početka cvatnje i početka formiranja zrna. Nedostatak dušika u ovom razdoblju može pridonijeti stvaranju zrna manje specifične mase zbog netranslokacije adekvatnih količina hranjivih tvari, što opravdava povećanu masu 100 zrna uočenu u ovom istraživanju uz primijenjeno povećanje doze N.

Na temu inokulacije sjemena s A. brasilense, povećanje promjera stabljike s inokulacijom je zanimljivo jer je ova morfološka karakteristika ona koja je više povezana s postotkom polijeganja ili lomljenja biljaka u kukuruzu. Osim toga, zabilježeno je da je promjer stabljike važan pokretač visokog prinosa jer što je veći promjer, to je veći kapacitet biljke za pohranjivanje fotoasimilata koji doprinose punjenju zrna (Cruz i sur., 2008. Lana i sur., 2009.), što također opravdava povećanje LCI-a, duljine klipa i prinosa zrna verificirano u ovoj studiji kao funkcija inokulacije s A. brasilense. Cijepljenje s A. brasilense također povećana duljina uha u usporedbi s neinokularnim tretmanima. Moguće je da cijepljenje s A. brasilense pogodovao razvoju poboljšanog korijenskog sustava, što je dovelo do većeg unosa vode i hranjivih tvari, što pozitivno utječe na nutritivni status biljke. Količina vode i hranjivih tvari koje se šalju u klasu izravno je povezana s nutritivnim statusom biljke, bolje hranjena biljka kukuruza ima tendenciju boljeg razvoja svog klasja, što se vidi u dužini.

Moguće je da je nedostatak odgovora na izvore N posljedica činjenice da se pri navodnjavanju površine značajno smanjuje N-NH3 do isparavanja je vjerojatno došlo kao rezultat povećanog kontakta između gnojiva i čestica tla što dovodi do većeg NH4 + adsorpcija tlom (Silva i sur., 1995.), a učinak NBPT-a u smanjenju gubitaka isparavanja smanjen je pod visokim stopama N (Silva i sur., 2017.). Osim toga, veličina pozitivnih učinaka povezanih s upotrebom uree s NBPT uvelike varira ovisno o karakteristikama tla, gospodarenju usjevima i klimatskim uvjetima koji mijenjaju NH3 isparavanje u vrijeme primjene gnojiva i u ranim danima nakon ove prakse (Cantarella i sur., 2008. Tasca i sur., 2011.). Nekoliko studija izvješćuje da dodavanje inhibitora ureaze urei usporava NH3 vrhunac isparavanja koji se, za konvencionalnu ureu, koncentrira u prvom tjednu nakon primjene gnojiva na površinu tla (Cantarella i sur., 2008. Rochette i sur., 2009. Tasca i sur., 2011.). Na taj način, navodnjavanje pokusnog područja ubrzo nakon gnojidbe dušikom povezano je s padalinama koje su se dogodile u tjednu u kojem su gnojiva primijenjena u prvoj godini (45 mm oborina između 11. i 16. siječnja 2014., 3 dana nakon primjene dušičnih gnojiva Slika 1A) i druge godine (19 mm oborina 14. siječnja 2015. i 21 mm 21. siječnja 2015., 10. i 17. dana nakon primjene dušičnih gnojiva, odnosno Sl. 1B) učinkovito su pridonijeli. kako bi se minimizirali gubici uree isparavanjem, dajući učinak sličan urei s NBPT. Stoga bi uporaba uree s NBPT u vrućim danima i tjednima sa suhim uvjetima, uobičajenim klimatskim uvjetima između travnja i rujna u brazilskoj savani, mogla biti vrlo korisna, razjašnjavajući nova istraživanja.

Studije koje uključuju upotrebu uree obložene polimerom u usporedbi s konvencionalnom ureom pokazale su sličan učinak (Queiroz i sur., 2011. Mello i sur., 2017.). Dodatno, Valderrama i sur. (2011.), uspoređujući učinak konvencionalne uree i uree obložene topljivim polimerom, nisu pronađene prednosti kod inkapsulacije uree s polimerima za kukuruz uzgojen u brazilskom Cerradu. Kako izvori nisu utjecali na glavne provedene procjene, urea postaje povoljnija zbog boljeg omjera troškova i koristi, u dogovoru s Queirozom i sur. (2011.) i Maestrelo i sur. (2014.) .

S druge strane, za razliku od ove studije, Abalos i sur. (2014) podržavaju hipotezu da je uporaba inhibitora uree NBPT najprikladnija opcija ako gubici kroz NH3 očekuje se da će volatilizacija biti visoka. Prema Abalos i sur. (2014.) , u uvjetima u kojima se primjenjuju visoki unosi N gnojiva i koji pogoduju visokoj drenaži, kod sustava navodnjavanja učinkovitost uree s inhibitorom NBPT može biti veća. Međutim, autor je zaključio da su potrebne nove studije kako bismo poboljšali naše razumijevanje uvjeta pod kojima su gnojiva poboljšane učinkovitosti ekonomski isplativa i da bismo usporedili njihovu učinkovitost s učinkovitošću drugih opcija, kao što su poboljšano upravljanje vodom i N gnojivima.

Učinkovitost korištenja dušika, prinos zrna kukuruza i ekonomična analiza

Smanjenje NUE kao funkcija povećanja broja N može se pripisati gubitku N, kao što je jasno opisano u literaturi. Veće stope N rezultiraju većim gubicima i manjim korištenjem usjeva budući da je biljna nutritivna potražnja ograničena (Galindo i sur., 2016.). Biljke su sposobne apsorbirati određenu količinu hranjivih tvari u određenom vremenu. N koji se primjenjuje, a ne apsorbira, može se izgubiti, smanjujući učinkovitost gnojidbe s višim stopama N, što je u literaturi navedeno kao zakon opadajućeg prinosa.

Povećanje NUE zbog inokulacije s A. brasilense bio naglašen. U prosjeku, NUE dobiven inokulacijom bio je 3,5 puta veći od NUE necijepljenih. Prema Cormieru i sur. (2013) mogu se osmisliti dvije strategije za poboljšanje NUE: održavanje visokog prinosa pri smanjenju opskrbe N i/ili povećanje prinosa pri konstantnoj opskrbi N. Na temelju dobivenih rezultata, inokulacija s Azospirillum brasilense je vrlo zanimljiva strategija u poboljšanju učinkovitosti N i može se koristiti za smanjenje primijenjenih stopa N gnojiva, održavajući isti NUE i bez negativnog utjecaja na prinos zrna.

Što se tiče prinosa zrna, u nekoliko studija zabilježeno je povećanje prinosa zrna kukuruza primjenom rastućih stopa N (Kitchen i sur., 2009. Holland i Schepers, 2010. Venterea i sur., 2011. Kappes i sur., 2014. Galindo i sur. , 2016.), podupirući rezultate uočene u ovoj studiji. Također, Galindo i sur. (2016.) potvrdili su da je najveći prinos zrna kukuruza postignut kada je N isporučen u većim količinama u vrijeme prihrane, te da je NH3 gubici uree zbog isparavanja koji se javljaju u navodnjavanom usjevu kukuruza nisu umanjili prinos zrna. Prema autorima, u otopini tla je bio dostupan N u razdoblju u kojem biljka zahtijeva veće količine hranjiva. Objašnjenje bi vjerojatno bilo da je N primijenjen pri sjetvi već u otopini tla, a kada se doda N, biljka ima veću količinu hranjivih tvari koju treba apsorbirati.

Provjereno je da je povećanje prinosa zrna kukuruza u funkciji inokulacije u usporedbi s necijepljenim tretmanima verificiranim u ovoj studiji iznosilo 1012,05 kg ha-1 (ekvivalentno 14,3%). Osim toga, na temelju dobivenih rezultata, čak i uz primjenu visokih stopa N povezanih s inokulacijom s A. brasilense na prinos zrna kukuruza nije negativno utjecalo, što ukazuje da visoke stope N ne eliminiraju prednosti cijepljenja s A. brasilense. Kappes i sur. (2013b) izvijestili su da je kukuruz cijepljen s A. brasilense imao je porast prinosa od 9,4%. Cavallet i sur. (2000.) izvijestili su o povećanju prinosa kukuruza za 17% kada je sjeme inokulirano s Azospiril spp. Galindo i sur. (2018.) potvrdili su povećanje prinosa zrna kukuruza za 5,7% inokulacijom sjemena s A. brasilense, koristeći pet doza N u prihranjivanju, s prosječnim prinosom zrna iznad 9826 kg ha -1 . Slične rezultate dobili su Müller i sur. (2016.), gdje je prinos kukuruza bio 3,8% veći uz inokulaciju sjemena A. brasilense u usporedbi s kontrolom, s prosječnim prinosom zrna iznad 11.000 kg ha −1 . Hungria i sur. (2010.) također su dobili povećanje prinosa kukuruza za 27%, što odgovara 743 kg ha −1.

Prema Hungrii (2011.), učinci inokulacije sjemena kukuruza na prinos zrna ovise i o genetskim karakteristikama biljaka i sojeva (bakterija) uz uvjete okoliša. U tom smislu, interakcija između genotipova s ​​učinkovitim sojevima bakterija ključna je činjenica za uspjeh biološke fiksacije N na travama (Lana i sur., 2012.), a može objasniti varijacije u povećanju prinosa zrna kukuruza verificirane u književnost.

Prinos zrna kukuruza porastao je kao rezultat inokulacije s A. brasilense se obično pripisuju višestrukim mehanizmima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sintezu fitohormona (na primjer auksin, citokinin i giberelin), poboljšanje prehrane i upotrebe N, poboljšanje fotosintetskih parametara lista, smanjenje/minimiziranje stresa i biološke kontrolu nekih patogenih agenasa (Bashan i de-Bashan, 2010.). U ovoj studiji, glavne ocjene na koje je inokulacija pozitivno utjecala bile su LCI, promjer stabljike, duljina klipa i NUE, što se pozitivno odrazilo na povećanje prinosa zrna kukuruza, te posljedično povećanje profitabilnosti proizvodnje kukuruza kada se cijepi A. brasilense.

Što se tiče ekonomske analize, najviši TOC-i tretmana primjenom uree s NBPT i inokulacijom s A. brasilense nastaju zbog cijene ovih poljoprivrednih inputa. Prosječna cijena koju su poljoprivrednici platili bila je 599,33 USD i 673,40 USD po toni za ureu i ureu s NBPT, respektivno. Za cijepljenje s A. brasilense, rashod je bio oko 3,37 USD po dozi, a korištene su dvije doze po hektaru u oba usjeva kukuruza, ukupno 6,74 USD. Kako urea s NBPT nije dovela do povećanja prinosa zrna, ni OP nije bio favoriziran, međutim, inokulacija s A. brasilense povećan je prinos zrna za 15,7% u prosjeku za 2 godine uzgoja, a zbog niskog troška nabave i primjene (samo 0,71% TOC-a 6,74 USD po ha) rezultiralo je povećanjem OP s proizvodnjom kukuruza, bez obzira na izvor N i primijenjena stopa.

Uzimajući u obzir trošak primijenjenih stopa N i OP koji su im dali, primjena 100 kg ha -1 N kao izvora uree povezanog s A. brasilense omogućio je veću isplativost u proizvodnji kukuruza (360,84 USD), dok je u nedostatku inokulacije najveća profitabilnost ostvarena bez gnojidbe dušikom (174,88 USD), razlika od 106,34% u OP-u, što ponavlja važnost inokulacije s A. brasilense povećanje NUE, prinos zrna i profitabilnost s usjevom kukuruza.

Brazil je treći najveći proizvođač i drugi najveći izvoznik kukuruza u svijetu, s oko 16,5 milijuna ha obrađenih (CONAB, 2018.). Dakle, na temelju povećanja profitabilnosti dobivenog inokulacijom s A. brasilense u uzgoju kukuruza, usvajanjem ove tehnologije od strane poljoprivrednika i zbog velikog obujma i područja proizvodnje, moguće je povećati dobit ostvaren ovom djelatnošću u iznosu od milijuna dolara godišnje, što pozitivno utječe na brazilsku poljoprivrednu proizvodnju sustav. To se može ekstrapolirati na tropske uvjete u budućnosti i proširiti u nekoliko zemalja, od koristi svjetskoj poljoprivredi.

Dobiveni rezultati pokazuju korist u prinosu zrna kukuruza u funkciji inokulacije sjemena A. brasilense. U funkciji niske ekonomske cijene, jednostavnosti primjene, netoksične za okoliš i s visokim potencijalom odgovora usjeva kukuruza, čak i uz primjenu stopa N koje se smatraju visokim za BNF, inokulacija s A. brasilense vjerojatno će biti tehnologija koju poljoprivrednici sve više koriste.


Gledaj video: Najmocniji Prirodni Lek na Svetu za Sve Bolesti (Kolovoz 2022).