Informacija

Koja je važnost puštanja neizrezanog plazmida na gel za elektroforezu?

Koja je važnost puštanja neizrezanog plazmida na gel za elektroforezu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Koja je važnost puštanja neizrezanog plazmida na gel za elektroforezu?

U ovom slučaju govorimo o umetanju gena u plazmid, koji zatim ide pod PCR, a zatim elektroforezu.


Koristi se za određivanje je li neiskorištena/viška količina plazmida kontaminirala konačnu otopinu željene rekombinantne DNA ili ne. Elektroforeza se izvodi na "praznom" (neizrezanom) plazmidu kako bi se definirale njegove vrpce. Ako rezultat elektroforeze sadrži trake i "prazne" i rekombinantne DNA, to pokazuje da vaša otopina nije 100% čista.


Svrhe nerazrezane plazmidne DNK - (28. srpnja 2007.)

hi!! radio sam elektroforezu u gelu nakon ekstrakcije plazmida prošlog tjedna, jedan stariji student objasnio nam je važnost nerazrezane plazmidne DNK. ali još uvijek ne shvaćam svrhu ove superzamotane, izrezane i linearne plazmidne DNK. prilično zbunjujuće. bilo bi mi jako drago ako bi mi netko mogao pomoći riješiti moje probleme. Ja sam biotehnološki student druge godine, ali sam još uvijek vrlo tvrdoglav u raspravi o rezultatima mog eksperimenta

Zbunjen sam kao i ti. Za većinu svrha kloniranja, plazmidna DNK u svom neizrezanom obliku nije baš informativna. Ne možete čak ni reći veličinu plazmida. Linearna DNK (na ljestvici) radi drugačije od supersmotane DNK (koju će plazmid ubaciti)

Možda je vaš stariji objašnjavao različite oblike plazmida u kontekstu kontrole kvalitete. Ako je tako, razmislite o tome na ovaj način. Od koristi vam je samo potpuno netaknut plazmid, kao u supercoilled plazmidu. Oštećena i slomljena plazmidna DNA je od male koristi, ne repliciraju se točno, uglavnom beskorisna za PCR i neupotrebljiva za daljnji rad podvezivanja. Dakle, izbacivanjem sirovog plazmida možete reći je li vaša priprema DNK uspješno provedena.

Sada, s druge strane, gotovo svi moderni sojevi e coli za kloniranje su konstruirani tako da je proizvodnja nativnih endonukleaza i rekombinaza uglavnom eliminirana. Stoga više nije toliko važno niti teško provesti dobru DNK pripremu.

to ima smisla, ja ću sudjelovati tat kaže abt `oštećena plazmidna DNK i problemi s replikacijom` hvala 4 odgovora

Moj stari PI je prije kloniranja sugerirao provođenje neprobavljene DNK kako bi imao ideju radi li ligacija ili ne. Ali umetak mora biti više od 10% veličine izvornog plazmida, mislim. Na ovaj način možete uštedjeti neke enzime i ne morate raditi puno minipripremnih proba. Ali može biti dugotrajno.


Neizrezana plazmidna DNK - (26. studenog 2006.)

Da li se nerazrezana plazmidna DNA odvaja pomoću elektroforeze u agaroznom gelu, vidljiva je samo 1 traka superzamotane DNA ili 3 vidljive trake otvorenog kruga, linearne i superzamotane?

Da li se nerazrezana plazmidna DNA odvaja pomoću elektroforeze u agaroznom gelu, vidljiva je samo 1 traka superzamotane DNA ili 3 vidljive trake otvorenog kruga, linearne i superzamotane?

Najviši - izrezani ili opušteni kružni plazmid
Srednja - linearna
Najniži - supernamotan

Tada možete dobiti sve one druge kombinacije dimera i one su veće od izrezane ili opuštene kružne plazmidne trake.

Najviši - izrezani ili opušteni kružni plazmid
Srednja - linearna
Najniži - supernamotan

Tada možete dobiti sve one druge kombinacije dimera i one su veće od izrezane ili opuštene kružne plazmidne trake.

Dvije moje miniprep DNK. Lijevo je DOBAR u kojem imate veliku supernamotanu DNK, a desno je loša mini priprema koja ima sve vrste DNK spomenute u gornjem citatu!

u redu. mogu li pitati qn: zašto netko može pronaći 3 oblika iako se plazmid smatra "uncut"!!!

Jer jednostavno nije bilo dovoljno ljubavi. tako da ti DNK ne uzvrati ljubav.

Uglavnom, operateru je trebalo predugo da dovrši ekstrakciju DNK i naknadnu deproteinaciju i/ili je prestrogo postupao s DNK, što je rezultiralo velikim razbijanjem plazmida.

Previše vrtloženja i/ili je trebalo previše vremena za uklanjanje svih nukleaza.


Savjeti i trikovi za sažetak ograničenja:

Sljedeći savjeti olakšat će vam dobivanje korisnog i informativnog dijagnostičkog sažetka ograničenja.

Za vaš sažetak:

  • Pokušajte odabrati jedinstvene enzime. Enzimi koji se režu samo jednom omogućuju vam lakšu i točniju vizualizaciju pune veličine vašeg konstrukta.

Za vaš gel:

  • Dodajte etidijev bromid (EtBr) u svoj gel prije nego što ga ulijete. EtBr se veže za DNK i omogućuje vam vizualizaciju DNK pod ultraljubičastim (UV) svjetlom.

Nadam se da ovi savjeti pokazuju da provjera plazmida nije samo neophodna, već i jednostavan proces. Posjetite Addgeneov resurs za provjeru plazmida kako biste pronašli dodatne savjete i detaljne protokole o temama kao što su kako postaviti svoje digeste i ulijevanje/pokretanje DNK gela.


Kako bismo vizualizirali rezultate eksperimenta, izvršit ćemo elektroforezu agaroze na našim probavljenim uzorcima. Ispitivanje gela može nam omogućiti da otkrijemo neuspjele probave plazmida jer razlike u fizičkom obliku izrezanih i nerazrezanih plazmida uzrokuju da oni migriraju različitim brzinama kroz gel čak i kada su iste duljine. Nerazrezani plazmidi mogu biti u dva oblika: opušteni i superzamotan (ili superhelikalni). Ova dva oblika mogu se razumjeti usporedbom s gumenom trakom. Normalna gumica je poput opuštene forme. Ako uhvatite jednu stranu trake između palca i kažiprsta i zamotate tu stranu, traka će se uvrnuti u kompaktan oblik sličan supersmotanom plazmidu. Presiječete li traku škarama, više neće ostati uvrnuta.

U gel elektroforezi DNA, obično smatramo da brzina migracije dijela DNA ovisi prvenstveno o njegovoj veličini (za razliku od proteina koji imaju brzinu migracije na koju također može značajno utjecati pH gela). Međutim, to ne vrijedi za nelinearne fragmente DNA jer njihov oblik ima važan utjecaj na njihovu brzinu migracije. Zbog svoje kompaktne veličine, supersmotani plazmidi mogu se kretati kroz gel mnogo brže od linearnog fragmenta DNA s istim brojem parova baza. Isto tako, nerazrezani opušteni plazmidi obično se kreću različitom brzinom od izrezanog fragmenta iste mase.

Slika 5. Gel trake izrezanih (lijevo) i nerazrezanih (desno) plazmida. Svi imaju istu masu u parovima baza, ali su u različitim položajima jer njihov različit oblik uzrokuje da se kreću kroz gel različitim brzinama.

Na slici 5, traka s lijeve strane sadrži plazmid koji je na jednom mjestu probavljen restrikcijskim enzimom. Traka s desne strane sadrži isti neprobavljeni plazmid. Traka s probavljenim uzorkom ima jednu traku, dok traka s neprobavljenim uzorkom ima tri trake. Da se donja traka pomicala najbrže jer je bila manja od ostalih, onda bismo očekivali da bi bila mnogo tamnija od ostalih jer je, općenito, manje fluorescentna boja interkolirana manjim fragmentima. Međutim, u ovom slučaju donja traka je mnogo svjetlija od ostalih traka, bilo zato što supersmotani oblik bolje drži boju ili zato što je veći udio molekula u toj traci bio u superzamotanom obliku nego u drugim oblicima. Blijeda traka je jedva vidljiva u desnoj traci na istoj visini kao i traka u stazi s digestiranim plazmidom. Vjerojatno se radi o linearnim molekulama plazmida koje su mehanički razbijene (nijedan enzim nije dodan tom uzorku) - slabost vrpce je pokazatelj da je tih molekula relativno malo. Eliminacijom možemo zaključiti da je gornji pojas nerazrezani plazmid u opuštenom obliku. Neki aspekti njegovog oblika uzrokuju da se kreće sporije od linearnih molekula. S obzirom da sve tri trake u desnoj traci sadrže komadiće DNK s istim brojem baznih parova, jasno je da oblik molekule ima važan utjecaj na brzinu njezine migracije.


Kako protumačiti rezultate gel elektroforeze

  1. Ako je moguće, stavite neprobavljene, linearizirane i UV zračene plazmide jedan pored drugog u agarozni gel, tada možete usporediti trake između tih uzoraka.
  2. Općenito, monomerni superzamotani CCC oblici kreću se brže od bilo kojeg drugog oblika, jer imaju kompaktnu supernamotanu DNK strukturu. Stoga će se pojaviti niže u gelu.
  3. Otvoreni kružni (OC) i linearni monomeri kreću se sporije od supersmotanog CCC monomera. Oni imaju više borbe pri prolazu kroz pore u matrici gela nego CCC oblik. Stoga će se OC oblici pojaviti više u gelu. Redoslijed migracije je obično monomerni CCC oblik (najbrži), zatim linearni oblik i OC oblik.
  4. Potpuno digestirana plazmidna DNA obično pokazuje samo jednu traku, linearni oblik plazmida, u svojoj traci očekivane veličine. Neprobavljeni plazmid može imati dva oblika koja se pojavljuju u svojoj stazi: CCC dimer i CCC monomerni oblici. Oblici dimera, zbog svoje veće i udvostručene veličine u usporedbi s monomerima, obično se kreću sporije od monomera. Stoga će se činiti višim u gelu nego u monomeru. CCC monomerni oblik radi brže od linearnog oblika probavljene plazmidne DNA.

Primjeri gel elektroforeze za plazmidne oblike. Traka 1: DNK ljestve. Traka 2: Neprobavljeni plazmid A. Traka 3: Potpuno probavljeni plazmid A. Traka 4: UV-ozračena plazmidna DNA.

Sada, kao praksa, možete li pogoditi svaki oblik plazmida iz ovih traka iz agaroznog gela ispod?

Gel elektroforeza. Traka 1: DNK ljestve. Traka 2: Neprobavljeni plazmid A. Traka 3: Potpuno probavljeni plazmid A.

Za traku 2 možda ćete moći vidjeti dva pojasa. Blijeda traka na vrhu je OC, a donja je CCC oblik. Za Lane 3, to je potpuno probavljeni plazmid, tako da bend ima linearni oblik.

Kako prepoznajete svoje trake iz vaših agaroznih gelova?

Tijekom gel elektroforeze, možda ćete morati u jažice ubaciti nerazrezanu plazmidnu DNA, probavljeni fragment DNA, PCR proizvod i vjerojatno genomsku DNK koju koristite kao PCR šablon. Vaš probavljeni DNA fragment je probavljeni PCR proizvod. Sljedeći korak je identificirati te trake kako biste shvatili koji rezati.

Gel elektroforeza. Traka 1: DNK ljestve. Traka 2: Neprobavljeni plazmid A. Traka 3: Potpuno probavljeni plazmid A. Traka 4: Probavljeni PCR proizvod (ili DNA fragment). Traka 5: PCR proizvod (sa slabom vrpcom dimera primera). Traka 6: Genomska DNK. Bijele strelice označavaju trake koje želite izrezati.

Savjeti za određivanje točne trake za trošarinu s vašeg gela

  • Neizrezanu plazmidnu DNK na agaroznom gelu lako je identificirati jer može imati dva oblika plazmida (OC i CCC oblici).
  • Probavljeni plazmid, probavljeni fragment DNA, PCR proizvod i genomska DNA mogu imati jednu traku. Da biste identificirali ove trake, morat ćete provjeriti njihovu veličinu konzultiranjem DNK ljestvica. Vaš probavljeni plazmid ima linearni oblik s veličinom između OC i CCC oblika nerazrezanog plazmida. Genomska DNK ima veliku veličinu. Dakle, genomska DNK se obično pokazuje na samom vrhu vašeg gela (vrlo blizu vašeg bunara).
  • Probavljeni fragment DNA može imati jednu traku gotovo slične veličine s vašim PCR proizvodom. Ovo je vaša ciljna veličina, a traka u ovom probavljenom DNK fragmentu je ona koju želite izrezati.
  • Na dnu trake za PCR proizvod možete vidjeti blijedu traku koja ukazuje na male molekule. Ove male molekule su vaše početničke molekule koje se povezuju s drugim početnim molekulama kako bi tvorile dimer početnika. Veličina ovih malih molekula nije vaša ciljna veličina, tako da ne želite izrezati ovu traku.

Da biste saznali više o tome kako protumačiti elektroforezu DNK gela, pogledajte naš video u nastavku:


Agarozni gel Elektroforeza plazmidne DNA - Agarozni gel Elektroforteza plazmidne DNA (06.03.2005.)

Imam pBSK+ fagemid veličine 2958bp. Kloniram gen veličine 1167bp u ovom fagemidu. Sada podvrgavam sljedeće elektroforezi u agaroznom gelu:
(1) Neizrezan, nativni pBSK+, bez umetka.
(2) Neizrezan, pBSK, s mojim kloniranim umetkom.
Dakle, oni su u osnovi zatvoreni kružni DNK.
Koje bi bile veličine bendova prema kojima bih promatrao gornja 2 uzorka?
Molim pomoć. Ovo je studentski projekt.
---Thivaharan([email protected])

Možete pokrenuti ove uzorke protiv drugih zatvorenih kružnih plazmida kako biste usporedili veličine, ali bi vjerojatno bilo bolje prvo linearizirati plazmid. Zatvoreni kružni plazmid dat će brojne trake ovisno o stupnju supersmotanja. Ono što bih učinio bilo bi izrezati oba plazmida restrikcijskim enzimima koje ste koristili za kloniranje tako da ćete moći vidjeti da je fragment koji ste klonirali ispravne veličine.


Alkalna liza:

Alkalna liza je metoda koja se koristi u molekularnoj biologiji, za izolaciju plazmidne DNA ili drugih staničnih komponenti kao što su proteini razbijanjem stanica. Bakterije koje sadrže plazmid od interesa najprije su uzgojene, a zatim ostavljene da se liziraju s puferom za alkalnu lizu koji se sastoji od deterdženta natrijevog dodecil sulfata (SDS) i jake baze natrijevog hidroksida. Deterdžent cijepa fosfolipidni dvosloj membrane, a lužina denaturira proteine ​​koji sudjeluju u održavanju strukture stanične membrane. Kroz niz koraka koji uključuju miješanje, precipitaciju, centrifugiranje i uklanjanje supernatanta, stanični debris se uklanja, a plazmid se izolira i pročišćava.


Široki koraci uključeni u uobičajeni protokol elektroforeze DNA gela:

1. Priprema uzoraka za rad

2. Pripremljena je otopina agaroznog TAE gela

TAE pufer osigurava izvor iona za postavljanje električnog polja tijekom elektroforeze. Za pripremu otopine koristi se koncentracija mase prema volumenu agaroze u TAE puferu. Na primjer, ako je potreban 1% agarozni gel, 1 g agaroze se dodaje u 100 mL TAE. Korišteni postotak agaroze određen je koliko se očekuje da će DNK biti velika ili mala. Ako se promatra odvajanje skupa manjih DNK vrpci (<500bp), priprema se veći postotak agaroznog gela (>1%). Veći postotak agaroze stvara gušće sito za povećanje odvajanja malih razlika u duljini DNK. Otopina agaroze-TAE se zagrijava da se agaroza otopi.

3. Lijevanje gela

Otopina agaroze TAE je izlivena u pladanj za lijevanje da, nakon što se otopina gela ohladi i skrutne, stvara ploču gela s nizom jažica na vrhu.

4. Postavljanje komore za elektroforezu

Čvrsti gel se stavlja u komoru napunjenu s TAE pufer. Gel je postavljen tako da su komore najbliže negativnoj elektrodi komore.

5. Punjenje gela

The jažice gel komore učitavaju se uzorcima DNK i obično se učitavaju i DNK ljestve kao referenca za veličine.

6. Elektroforeza

Negativni i pozitivni vod spojeni su na komoru i na napajanje gdje se postavlja napon. Uključivanjem napajanja postavlja se električno polje a negativno nabijeni DNA uzorci počet će migrirati kroz gel i dalje od negativne elektrode prema pozitivnoj.

7. Zaustavljanje elektroforeze i vizualizacija DNK

Nakon što plava boja u DNK uzorcima migrira kroz gel dovoljno daleko, napajanje se isključuje i gel se uklanja i stavlja u otopinu etidijevog bromida. Etidijev bromid interkalira između DNK i vidljiv je u UV svjetlu. Ponekad se etidijev bromid dodaje izravno u otopinu agaroznog gela u koraku 2. Gel obojen etidijevim bromidom zatim se izlaže UV svjetlu i snima se slika. DNA trake se vizualiziraju u svakoj stazi koja odgovara komori. DNK ljestve koje su bile učitane su također vizualizirane i može se procijeniti duljina DNK traka. Primjer je dat na donjoj slici.


Kako radi elektroforeza

U elektroforezi postoje dva primarna čimbenika koji kontroliraju koliko brzo se čestica može kretati i u kojem smjeru. Prvo, bitna je naplata uzorka. Negativno nabijene vrste privlače se na pozitivni pol električnog polja, dok se pozitivno nabijene vrste privlače na negativni kraj. Neutralna vrsta može biti ionizirana ako je polje dovoljno jako. Inače, nema tendenciju da bude pogođen.

Drugi faktor je veličina čestica. Mali ioni i molekule mogu se kretati kroz gel ili tekućinu mnogo brže od većih.

Dok nabijenu česticu privlači suprotan naboj u električnom polju, postoje i druge sile koje utječu na kretanje molekule. Trenje i sila elektrostatičkog usporavanja usporavaju prolazak čestica kroz tekućinu ili gel. U slučaju gel elektroforeze, koncentracija gela se može kontrolirati kako bi se odredila veličina pora matrice gela, što utječe na pokretljivost. Prisutan je i tekući pufer koji kontrolira pH okoliša.

Kako se molekule provlače kroz tekućinu ili gel, medij se zagrijava. To može denaturirati molekule, kao i utjecati na brzinu kretanja. Napon se kontrolira kako bi se pokušalo minimizirati vrijeme potrebno za odvajanje molekula, uz održavanje dobrog odvajanja i održavanje kemijskih vrsta netaknutima. Ponekad se elektroforeza provodi u hladnjaku kako bi se kompenzirala toplina.


Gledaj video: Innovating to zero! Bill Gates (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Beadurof

    Ne mogu sada sudjelovati u raspravi - jako je zauzeto. Bit ću slobodan - nužno ću napisati da mislim.

  2. Nef

    Bravo, koja je prava fraza... divna misao

  3. Teucer

    Mislim, da počinite pogrešku. Pišite mi u PM, razgovarat ćemo.

  4. Shakagrel

    Vjerujem da pogriješite. Razgovarajmo o tome. Pošaljite mi e -poštu u PM.

  5. Ridpath

    Bravo, koje su prave riječi...sjajna misao



Napišite poruku