Informacija

Kako provjeriti ima li fastq datoteka jedno ili upareno krajnje čitanje

Kako provjeriti ima li fastq datoteka jedno ili upareno krajnje čitanje



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pokušavam provjeriti ima li fastq datoteka jedno ili upareno krajnje čitanje. Kako to mogu postići metodom otpornom na pogreške?

Provjerio sam wikipedia i MAQ, ali želim znati postoji li pouzdan dokument koji opisuje sve moguće varijante u ID-u sekvence za provjeru pojedinačnih/uparenih krajnjih čitanja.

Tražim i biblioteku, bolju u Pythonu, da to postignem.

Hvala


Do sada sam dobio neke zanimljive odgovore na ovo pitanje na Biostarsu

U osnovi ono što sam napravio je sljedeće:

  • Prije svega, provjerio sam sadrži li ID sekvence upareni kraj. Kao što je opisano na ovoj stranici wikipedije, za čitanje Illumina postoje dvije moguće oznake za jednostruko/upareno čitanje:

    @HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1

    Ako je posljednji broj/2u nekim čitanjima tada su čitanja upareni kraj; inače mogu biti jednokrajni.

    Druga oznaka je:

    @EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG

    Ako je prvi broj u drugoj skupini2u nekim čitanjima tada su čitanja upareni kraj; inače mogu biti jednokrajni;

  • Zatim sam provjerio ima li više datoteka. Ako uzorak ima dvije fastq datoteke, vjerojatno je da su čitanja uparena. Međutim, potrebno je napomenuti da s jednom datotekom nije moguće isključiti da se uparena krajnja čitanja mogu ispreplitati u jednoj datoteci, čak i ako to nije uobičajeno (po mom mišljenju);

  • Najopćenitija metoda je unakrsna provjera svakog pojedinačnog čitanja s cijelim skupom čitanja. Ako prvi dio ID-a slijeda (u ovom slučaju polje koje počinje od@i završava prije#- u prvom zapisu - ili razmak - u drugom zapisu) je jedinstven među svim čitanjima (za svako čitanje) vjerojatno je da su čitanja pojedinačna čitanja, inače - ako se može pronaći duplikat za svako čitanje - čitanja su upareni kraj. U ovom slučaju, na *nix sustavima to se može postići sljedećom naredbom (zahvaljujući biostars odgovorima):

    grep --no-filename @HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973 *.fastq | rez -d"-f1 | sortiranje | uniq -c | sortiranje -rgk 1,1 | glava

    Ako se rezultat prikazuje u prvim recima, rezultat je ovakav:

    1 read1_ID

    1 read2_ID

    Vjerojatno se radi o jednom kraju. Inače:

    2 read1_ID

    2 read2_ID

    to je upareni kraj.

Prebrzo čitam dokumentaciju BioPython API-ja, ali ne mogu pronaći nešto korisno za to.

Prijedlozi i ispravci su dobrodošli.

Hvala


Ovo je komplementaran odgovor na ono što je @gc5 pružio.

za slučajeve koji koriste "drugu notaciju" koja izgleda ovako:

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG' ^ |________________ono što pokušavamo izdvojiti

Sljedeći kod će iterativno proći kroz sve datoteke i proizvesti jedan izlaz po datoteci:

grep -P "^@" *.fastq | grep -oP "sd+" | sortirati | jedinstven -c

ili ako imate.fastq.gzdatoteke:

zgrep -e "^@" *.fastq.gz | grep -oP "sd+" | sortirati | jedinstven -c

ako imate jedan kraj vidjet ćete samo jedan, a ako imate upareni kraj vidjet ćete jedinice i dva. Također kao provjera razumnosti, možete vidjeti koliko od svakog od njih imate:

zgrep --max-count=10000 -e "^@" *.fastq.gz | grep -oP "sd+" | sortirati | jedinstven -c
6333652 1 6333652 2

Bilješka koju sam dodao--max-count=10000do posljednjeg. Ovo je osobito korisno ako imate uparene krajeve u zasebnim datotekama jer ćete sve dobiti iz jednog, a sve dvije iz drugog. Ovo će proći samo kroz prvih 10'000 redaka što čini ovaj jednoliner puno brže.


Kako provjeriti ima li fastq datoteka jedno ili upareno krajnje čitanje - Biologija

Illumina tehnologija sekvenciranja koristi generiranje klastera i sekvenciranje kemijom sinteze (SBS) za sekvenciranje milijuna ili milijardi klastera na protočnoj ćeliji, ovisno o platformi za sekvenciranje. Tijekom SBS kemije, za svaki klaster, obavljaju se i pohranjuju osnovni pozivi za svaki ciklus sekvenciranja pomoću softvera za analizu u stvarnom vremenu (RTA) na instrumentu. RTA pohranjuje podatke o osnovnom pozivu u obliku pojedinačnih datoteka osnovnog poziva (ili BCL). Kada se sekvenciranje završi, osnovni pozivi u BCL datotekama moraju se pretvoriti u podatke sekvence. Taj se proces naziva pretvorba BCL u FASTQ.

FASTQ datoteka je tekstualna datoteka koja sadrži podatke o slijedu iz klastera koji prolaze filter na protočnoj ćeliji (za više informacija o klasterima koji prolaze filtar, pogledajte odjeljak "dodatne informacije" ovog biltena). Ako su uzorci multipleksirani, prvi korak u generiranju FASTQ datoteke je demultipleksiranje. Demultipleksiranje dodjeljuje klastere uzorku, na temelju indeksnih sekvenci klastera. Nakon demultipleksiranja, sastavljene sekvence se zapisuju u FASTQ datoteke po uzorku. Ako uzorci nisu bili multipleksirani, korak demultipleksiranja se ne događa i, za svaku traku protočne ćelije, svi klasteri se dodijeljuju jednom uzorku.

Za rad s jednim čitanjem kreira se jedna datoteka Read 1 (R1) FASTQ za svaki uzorak po traci protočne ćelije. Za upareni kraj, jedna R1 i jedna FASTQ datoteka Read 2 (R2) kreiraju se za svaki uzorak za svaku traku. FASTQ datoteke se komprimiraju i stvaraju s ekstenzijom *.fastq.gz.

Kako izgleda datoteka FASTQ?

Za svaki klaster koji prođe filtar, jedna sekvenca se upisuje u R1 FASTQ datoteku odgovarajućeg uzorka, a za izvođenje uparenog kraja, jedna sekvenca se također upisuje u datoteku R2 FASTQ uzorka. Svaki unos u FASTQ datoteci sastoji se od 4 retka:

  1. Identifikator sekvence s informacijama o sekvenciranju i klasteru. Točan sadržaj ovog retka ovisi o korištenom softveru za pretvorbu BCL u FASTQ.
  2. Slijed (baza poziva A, C, T, G i N).
  3. Razdjelnik, koji je jednostavno znak plus (+).
  4. Osnovne ocjene kvalitete poziva. Oni su kodirani Phred +33, koristeći ASCII znakove za predstavljanje numeričkih ocjena kvalitete.

Evo primjera jednog unosa u R1 FASTQ datoteci:

Detaljnije informacije o formatu datoteke FASTQ sekvence možete pronaći ovdje.

Kako pogledati FASTQ datoteku

FASTQ datoteke mogu sadržavati do milijune unosa i mogu biti veličine nekoliko megabajta ili gigabajta, što ih često čini prevelikim za otvaranje u normalnom uređivaču teksta. Općenito, nije potrebno pregledavati FASTQ datoteke, jer su to posredne izlazne datoteke koje se koriste kao ulaz za alate koji provode nizvodnu analizu, kao što je poravnanje prema referentnoj ili novoj montaži.

Ako trebate pogledati FASTQ datoteku u svrhu rješavanja problema ili iz radoznalosti, trebat će vam ili uređivač teksta koji može rukovati vrlo velikim datotekama ili pristup Unix ili Linux sustavu gdje se velike datoteke mogu pregledavati putem naredbenog retka.

Kako generirati FASTQ datoteke

Generiranje FASTQ datoteke prvi je korak za sve tijekove rada analize koje koriste MiSeq Reporter na MiSeq-u i Local Run Manager na MiniSeq-u. Kada se analiza završi, FASTQ datoteke se nalaze u <run mapi>DataIntensitiesBaseCalls na MiSequ i <output mapi>Alignment_#<subfolder>Fastq na MiniSequ.

Za sva testiranja prenesena u BaseSpace Sequence Hub, generiranje FASTQ datoteke automatski se događa nakon što se pokretanje u potpunosti prenese, a FASTQ datoteke se koriste kao ulaz za različite aplikacije za analizu na BaseSpace Sequence Hubu. Na BaseSpace Sequence Hubu možete pronaći svoje FASTQ datoteke u projektima povezanim s vašim pokretanjem.

Softver za pretvorbu bcl2fastq može se koristiti za generiranje FASTQ datoteka iz podataka generiranih na svim trenutnim sustavima sekvenciranja Illumina.

Za informacije o različitim postavkama koje se mogu primijeniti tijekom generiranja FASTQ datoteke, pogledajte upute za korisnike softvera u nastavku.


Sada ulazimo u stvarnu pretprocesu. Koristit ćemo fastq-mcf da skratimo adapter iz naših čitanja i izvršimo kvalitetno filtriranje. Moramo podrezati adapter, jer ako je fragment dovoljno kratak, sekvencirati ćemo cijelim putem kroz fragment do adaptera. Očito se sekvencija adaptera ne nalazi u genomu i može spriječiti ispravno poravnanje očitanja. Da bismo izvršili obrezivanje, moramo generirati datoteku adaptera.

Prvi korak je dobivanje slijeda adaptera. To možemo dobiti iz priručnika, ali sekvence iz PDF-a mogu pokupiti čudne znakove, pa je bolje da sekvence adaptera dobijemo iz Primera uzorka.

Možemo preuzeti i prikazati tablicu uzorka koristeći curl:

Želimo sekvence adaptera iz uzorka:

Sada moramo napraviti datoteku adaptera koja mora biti u FASTA formatu.

Pregledajte do scratch/bioinf_intro/myinfo

Kliknite na jupyterov izbornik "Datoteka" i odaberite "Otvori".

Kada se otvori novi prozor/kartica preglednika, kliknite karticu "Datoteke" ako već nije aktivna.

Kliknite na simbol “doma” da biste otišli na direktorij najviše razine, a zatim kliknite na “myinfo”

U izborniku "Novo" odaberite "Text File".

U ovu tekstualnu datoteku zalijepite linije adaptera odozgo.

Također želimo uključiti obrnutu nadopunu adaptera, u slučaju da je kontaminacija adaptera kako je sekvencirana obrnuti završetak onoga što je dano. Najlakši način za to je korištenje https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html za generiranje obrnutog komplementa, a zatim ga nazvati nešto poput "Adapter_RC"

Sada očistite pazeći da…

Svaka sekvenca je na svojoj liniji

Svaka sekvenca ima ime na retku ispred sebe

Ime niza prethodi ">"

Potrebno je ukloniti sve zareze i razmake, a znakove koji nisu u nizu potrebno je ukloniti iz redova niza Sada bi to trebalo izgledati ovako:

Kliknite na "untitled.txt" da promijenite naziv datoteke u "neb_e7600_adapters.fasta"


Upareni kraj u odnosu na sekvenciranje pojedinačnog čitanja

Shvatite ključne razlike između ovih vrsta čitanja sekvencioniranja

Što je upareni kraj sekvenciranja?

Sekvenciranje uparenih krajeva omogućuje korisnicima da slijedu oba kraja fragmenta i generiraju visokokvalitetne podatke o sekvenciji koje je moguće poravnati. Sekvenciranje uparenih krajeva olakšava otkrivanje genomskih preuređivanja i ponavljajućih elemenata sekvence, kao i fuzije gena i novih transkripata.

Osim što proizvode dvostruko veći broj čitanja za isto vrijeme i trud u pripremi knjižnice, sekvence poravnate kao parovi čitanja omogućuju točnije poravnanje čitanja i mogućnost otkrivanja varijanti umetanja-brisanja (indel), što nije moguće s jednim čitanjem podaci. 1 Svi sustavi sekvenciranja sljedeće generacije Illumina (NGS) sposobni su za upareno sekvenciranje.

Što je upareni kraj sekvenciranja?

Istaknute točke sekvenciranja uparenog kraja

  • Jednostavne biblioteke uparenog kraja: Jednostavan tijek rada omogućuje generiranje jedinstvenih raspona veličina umetaka
  • Učinkovito korištenje uzorka: Zahtijeva istu količinu DNK kao i sekvenciranje genomske DNK ili cDNA s jednim čitanjem
  • Širok raspon primjena: Ne zahtijeva metilaciju DNA ili restrikcijsku probavu može se koristiti za sekvenciranje bisulfita
  • Jednostavna analiza podataka: Omogućuje visokokvalitetne sklopove sekvenci s knjižnicama kratkih umetanja. Jednostavna modifikacija standardnog procesa pripreme knjižnice za jedno čitanje olakšava čitanje i naprijed i nazad predloška niti svakog klastera tijekom jednog čitanja uparenog kraja. Oba očitanja sadrže informacije o položaju dugog dometa, što omogućuje vrlo precizno poravnanje očitanja.
Uvod u sekvenciranje Illumina

Ovaj pregled opisuje glavni napredak tehnologije sekvenciranja, ključne metode, osnove kemije sekvenciranja Illumina i još mnogo toga.

Sekvenciranje uparenog kraja DNK

Čitanja sekvenciranja DNK na uparenom kraju osiguravaju visokokvalitetno poravnanje u DNK regijama koje sadrže ponavljajuće sekvence i proizvode duge kontige za de novo sekvenciranje popunjavanjem praznina u konsenzusnom nizu. Sekvenciranje DNK uparenih krajeva također otkriva uobičajene preraspodjele DNK kao što su umetanja, brisanja i inverzije.

Metode za sekvenciranje DNK

Sekvenciranje DNK može se primijeniti na male, ciljane regije ili cijeli genom kroz razne metode.

Duljina čitanja sekvencioniranja

Odabir prave duljine čitanja sekvencioniranja ovisi o vrsti uzorka, zahtjevima primjene i pokrivenosti. Naučite kako izračunati ispravnu duljinu čitanja za vaše sekvenciranje.

Sekvenciranje RNA uparenog kraja

Sekvenciranje RNA uparenog kraja (RNA-Seq) omogućuje primjene otkrića kao što je otkrivanje fuzije gena u raku i karakteriziranje novih izoforma spajanja. 2

Za RNA-Seq uparenog kraja upotrijebite sljedeće komplete s alternativnim protokolom fragmentacije, nakon čega slijedi standardna generacija i sekvenciranje klastera uparenog kraja Illumina.

Za pripremu biblioteke mRNA-Seq koristite:
Za pripremu biblioteke ukupne RNA upotrijebite:
Pregled RNA-Seq

Ova metoda nudi prikaz u visokoj razlučivosti kodirajućih i nekodirajućih regija transkriptoma za dublje razumijevanje biologije.

NGS otkriva tajanstveni svijet mikroba

Istraživači koriste 16sRNA kako bi istražili genome mikroba i poboljšali naše razumijevanje ljudskog zdravlja, bolesti i mikrobne evolucije.

Slijed pojedinačnog čitanja

Sekvenciranje s jednim čitanjem uključuje sekvenciranje DNK samo s jednog kraja i najjednostavniji je način korištenja Illumina sekvenciranja. Ovo rješenje donosi velike količine visokokvalitetnih podataka, brzo i ekonomično. Sekvenciranje s jednim čitanjem može biti dobar izbor za određene metode kao što je sekvenciranje male RNA-Seq ili imunoprecipitacije kromatina (ChIP-Seq).

Priprema knjižnice

Inovativna, sveobuhvatna rješenja za pripremu knjižnice ključni su dio procesa sekvenciranja Illumina.

Zainteresirani ste za primanje biltena, studija slučaja i informacija od Illumine na temelju vašeg područja interesa? Prijavi se sad.

Dodatna sredstva

Video o tehnologiji sekvenciranja

Pogledajte SBS tehnologiju na djelu.

Video o tehnologiji sekvenciranja

Alat za odabir platforme za sekvenciranje

Usporedite brzinu i propusnost Illumina sustava sekvenciranja kako biste pronašli najbolji instrument za svoj laboratorij.

Reference
  1. Nakazato T, Ohta T, Bono H. Funkcionalno rudarenje temeljeno na eksperimentalnom dizajnu i karakterizacija podataka sekvenciranja visoke propusnosti u arhivi čitanja sekvenci. PLoS One. 20138 (10): e77910.
  2. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: revolucionarni alat za transkriptomiju. Nat Rev Genet. 200910:57–63.

Inovativne tehnologije

U Illumini, naš je cilj primijeniti inovativne tehnologije na analizu genetskih varijacija i funkcija, čineći moguće studije koje prije samo nekoliko godina nisu bile niti zamislive. Za nas je ključna misija isporučiti inovativna, fleksibilna i skalabilna rješenja koja će zadovoljiti potrebe naših kupaca. Kao globalna tvrtka koja visoko cijeni međusobne interakcije, brzu isporuku rješenja i pružanje najviše razine kvalitete, nastojimo odgovoriti na ovaj izazov. Illumina inovativne tehnologije sekvenciranja i niza potiču revolucionarni napredak u istraživanju znanosti o životu, translacijskoj i potrošačkoj genomici i molekularnoj dijagnostici.

Samo za istraživačku upotrebu. Nije za upotrebu u dijagnostičkim postupcima (osim kako je posebno navedeno).


Kako provjeriti ima li fastq datoteka jedno ili upareno krajnje čitanje - Biologija

NGmerge: spajanje čitanja uparenih krajeva i uklanjanje adaptera za sekvenciranje

Gašpar JM. BMC Bioinformatika. 2018. prosinac 2019. (1): 536. [PubMed] [BMC] [PDF]

NGmerge radi na uparenom krajnjem slijedu visoke propusnosti čitanja u dva različita načina (slika 1).

U zadanom načinu spajanja, NGmerge kombinira čitanja uparenih krajeva koja se preklapaju u jedno čitanje koje obuhvaća punu duljinu izvornog fragmenta DNA (slika 1A). Krajevi spojenog čitanja definirani su 5' krajevima izvornog čitanja. Čitanja koja ne uspijevaju u procesu spajanja (zbog nedostatka dovoljnog preklapanja ili prekomjernih grešaka u sekvenciranju) stavljaju se u sekundarne izlazne datoteke, ako ih korisnik zahtijeva.

Alternativni način uklanjanja adaptera vraća izvorna čitanja kao parove, uklanjajući 3' previse onih očitavanja čije valjano spojeno poravnanje ima ovu karakteristiku (slika 1B). Čitanja čija poravnanja nemaju takve previse (ili se uopće ne poravnavaju) također će biti ispisana u izlazne datoteke, nepromijenjena.

Slika 1. Načini analize NGmerge. Dijagrami pokazuju očitanja uparenog kraja (R1, R2) izvedena iz sekvenciranja fragmenata DNA (bijele kutije) s adapterima za sekvenciranje (sive kutije) na oba kraja.

  • sample_R1.fastq.gz , sample_R2.fastq.gz (datoteke uparene sekvence za uzorak)
  • NGmerge (preuzeto i sastavljeno kako je opisano u nastavku)

Za izradu spojenih očitanja (slika 1A): sample_merged.fastq.gz

Za proizvodnju čitanja s uklonjenim adapterima (slika 1B): sample_noadapters_1.fastq.gz i sample_noadapters_2.fastq.gz

Softver se može preuzeti s GitHuba. (i već ste ovdje! čestitam!)

Makefile je osiguran za kompilaciju s GCC-om, a potrebni su i zlib i OpenMP. Program je testiran nakon kompilacije s GCC 6.3.0, zlib 1.2.8 i OpenMP 4.0.

Za kompajliranje pokrenite make u mapi u koju je softver preuzet. Izvršni NGmerge bi trebao biti proizveden.

U bilo kojem načinu analize (slika 1), NGmerge procjenjuje sva moguća poravnanja para čitanja bez razmaka u pokušaju pronalaženja optimalnog. Odredbe o tome koja se poravnanja razmatraju, a zatim koje je poravnanje (ako postoji) i valjano i optimalno, vrše se prema nekoliko parametara: -m , -p , -d , -e i -s .

NGmerge počinje poravnavanjem para čitanja (R1, R2) tako da je zadovoljen minimalni parametar preklapanja ( -m , zadano 20 bp). Zatim provjerava svako moguće poravnanje očitanja sve dok se ne preklapaju bez prepusta od 3' (slika 2A). Ako je odabrana opcija -d (ili u načinu uklanjanja adaptera [ -a , koji automatski postavlja -d ]), NGmerge dodatno procjenjuje poravnanja u obliku repa (s prevjesima od 3'), do minimalne duljine postavljene parametrom -e ( Slika 2B).

Slika 2. Poravnanja koja razmatra NGmerge. O: Zadana poravnanja kreću se od onih s minimalnom duljinom preklapanja (postavljena pomoću -m ), do potpunih preklapanja bez prevjesa. B: Kada se odabere opcija -d, NGmerge također procjenjuje poravnanja koja su usklađena.

Za svako poravnanje, NGmerge izračunava neusklađenost frakcija (broj nepodudaranja između čitanja R1 i R2, podijeljen s duljinom preklapanja). Poravnanja s izračunatim vrijednostima ne većim od praga postavljenog parametrom -p (zadano 0,10) smatraju se važećim. Ako se pronađe više valjanih poravnanja, ono s najmanjim nepodudaranjem ulomaka odabire se kao optimalno poravnanje. U rijetkim slučajevima kada višestruka poravnanja imaju identične nepodudarnosti razlomaka, najduže se preferira prema zadanim postavkama (osim ako nije postavljeno -s). U svim ovim izračunima, dvosmislene baze (Ns) se ne smatraju ni podudaranjima ni nepodudarnostima.

Daljnji opisi ovih parametara dani su u nastavku.

NGmerge analizira neusklađena čitanja uparenih krajeva u FASTQ formatu. Ulazne datoteke mogu se gzip komprimirati. Može se navesti više skupova ulaznih datoteka, odvojenih zarezima (ili razmacima, u navodnicima).

Ulazne datoteke moraju navesti čitanja istim redoslijedom. Program zahtijeva da se zaglavlja uparenih čitanja podudaraju, barem do prvog znaka razmaka.

Ulazna datoteka s isprepletenim čitanjima može se analizirati bez navođenja -2 datoteke. Također, moguće je čitati iz stdin koristeći - , npr. -1 - .

Budući da su spojena očitanja definirana 5' krajevima poravnanja uparenih čitanja (slika 1A), treba biti oprezan s kvalitetnim šišanjem očitanja na tim krajevima. Na primjer, kada koristite program kao što je qualTrim, treba navesti -3 kako bi se osiguralo da se kvalitetno obrezivanje događa samo na 3' krajevima, prije korištenja NGmerge.

Primarna izlazna datoteka u načinu spajanja je datoteka spojenih čitanja, u FASTQ formatu. Moguće je pisati u stdout s -o - (vidi također -y , dolje).

Kada je navedeno, sva čitanja koja nisu uspjela u postupku spajanja bit će zapisana u izlazne datoteke, kako su se pojavile u izvornim ulazima.

Prema zadanim postavkama, sve FASTQ izlazne datoteke bit će komprimirane u gzip ako i samo ako su ulazne datoteke (s više skupova ulaznih datoteka, izlazi će biti komprimirani ako je bilo koji od prvog skupa ulaza). Navođenje -z će jamčiti da su izlazi gzip komprimirani, dok će -y jamčiti da nisu, bez obzira na formate ulaza. Imajte na umu da će svi gzip-komprimirani izlazi automatski imati '.gz' dodan njihovim nazivima datoteka, ako je potrebno.

U načinu uboda, ovo se odnosi samo na izborni izlaz iz -f (gore). Umjesto dva izlaza, proizvest će se jedan isprepleteni izlaz (i nikakav '.fastq' sufiks neće biti dodat imenu datoteke).

Ova datoteka zapisnika navodi sljedeće za svaki par čitanja u ulaznim datotekama:

Čitati pročitajte zaglavlje, ne uključujući @
OverlapLen ukupna duljina preklapanja čitanja, uključujući Ns NA ako čitanja nisu spojena (a preostali stupci ostaju prazni)
StitchedLen ukupna duljina spojenog čitanja
Neusklađenost dio neusklađenih baza (broj neusklađenosti podijeljen s duljinom preklapanja [ne uključujući Ns]) mora biti manji ili jednak -p vrijednosti (vidi dolje)

Ova datoteka zapisnika navodi sljedeće za svaki par čitanja čije optimalno valjano poravnanje ima 3' prevjesa:

Čitati pročitajte zaglavlje, ne uključujući @
Adapter_R1 3' prepusta R1 očitati - ako nema prepusta
Adapter_R2 3' prepusta R2 očitati - ako nema prepusta

Stupci su označeni kao 'Adapter' jer, ako očitavanja nisu obrezana na krajevima od 5', ove bi dodatne sekvence trebale biti adapteri. Ako sekvence koje se pojavljuju u stupcima 'Adapter' nisu dosljedne, mogu biti lažno pozitivni i treba razmotriti smanjenje -p ili povećanje -e .

Za svaki par čitanja koji je uspješno spojen, ova datoteka zapisnika navodi poravnanja sekvenci čitanja i ocjene kvalitete, zajedno s rezultirajućim spojenim slijedom i ocjenama kvalitete. Na primjer:

Ovo je minimalna duljina preklapanja (u bp) za valjana poravnanja para očitavanja (vidi sliku 2A). Imajte na umu da se dvosmislene baze (Ns) ne ubrajaju u ovu minimalnu duljinu.

Ovaj parametar određuje koliko je stroga procjena poravnanja. Vrijednost mora biti u intervalu [0, 1), pri čemu niže vrijednosti predstavljaju povećanu strogost. Navođenje -p 0 znači da su važeća samo savršena poravnanja (bez nepodudaranja) zadana vrijednost 0,10 znači da valjano poravnanje može imati najviše 10% nepodudaranja (izračunato kao broj nepodudaranja podijeljen s duljinom preklapanja [ne računajući Ns] ).

Kada se odabere ova opcija, procijenit će se poravnanja u kojima se kraj čitanja od 3' proteže dalje od kraja njegovog para 5', sve do minimalne duljine (vidi sliku 2B). Prema zadanim postavkama, takva se poravnanja niti ne razmatraju. Budući da je spojeno čitanje definirano krajevima izvornog čitanja 5', prevjesi od 3' se automatski uklanjaju. Ovi prevjesi, koji su obično adapteri, mogu se ispisati u zasebnu datoteku dnevnika (pogledajte -c gore).

Ovo je minimalna duljina preklapanja (u bp) za poravnanja s prevjesima od 3' (vidi sliku 2B). Ovu vrijednost treba postaviti na duljinu apsolutno najkraćeg fragmenta DNA koji je možda sekvenciran. Korištenje preniske vrijednosti može rezultirati lažno pozitivnim rezultatima, osobito ako čitanja sadrže nizove koji se ponavljaju.

S obzirom na višestruka valjana poravnanja s identičnim rezultatima nepodudarnosti frakcija, NGmerge će prema zadanim postavkama odabrati najduže spojeno čitanje. Uz -s, umjesto toga će se preferirati najkraće spojeno čitanje.

Opcije profila ocjene kvalitete

Prema zadanim postavkama, NGmerge koristi tvrdo kodirane profile kada određuje ocjene kvalitete preklapajućih baza. Postoje zasebni profili za slučajeve u kojima se baza R1 i baza R2 podudaraju i za slučajeve kada se ne podudaraju. Oni koji ne žele koristiti ove profile imaju dvije alternativne opcije:

S ovom opcijom, NGmerge će koristiti profile ocjene kvalitete u priloženoj datoteci. Datoteka mora navesti dvije matrice vrijednosti odvojenih zarezom ili tabulatorom koje slijede redove zaglavlja #match i #mismatch . Treba slijediti predložak dane datoteke qual_profile.txt, koja oponaša tvrdo kodirane profile NGmerge s rasponom ocjene kvalitete [0, 40].

Uz ovu opciju, NGmerge će koristiti metodu sličnu onoj u programu fastq-join. U slučajevima kada se baza R1 i baza R2 podudaraju, za spojenu bazu koristi se viša ocjena kvalitete. Kada se ne podudaraju, ocjena kvalitete spojene baze izračunava se kao razlika u dvije ocjene kvalitete.

Ova opcija mora biti naveden da NGmerge radi u načinu uklanjanja adaptera. Kao što je naznačeno, on automatski postavlja opciju -d za provjeru poravnanja s ravnim repom.

Formatiranje ulaznih datoteka opisano je gore.

U načinu uklanjanja adaptera, sva očitanja se ispisuju u izlazne datoteke. Jedine izmjene su izrezivanje 3' prevjesa čitanja čija poravnanja imaju takve prevjese.

S ovom opcijom, umjesto dva izlaza, proizvest će se jedan isprepleteni izlaz (i nazivu datoteke neće biti dodan sufiks '.fastq').

Ove su opcije opisane gore.

Ova datoteka zapisnika je gore opisana.

U načinu uklanjanja adaptera, sljedeće datoteke ne mogu biti proizveden:

Ovi parametri su gore opisani.

Kao što je već spomenuto, opcija -d se automatski postavlja u načinu uklanjanja adaptera.

Da biste smanjili vrijeme računanja, možete pokrenuti NGmerge na više jezgri putem ove opcije. Imajte na umu da gzip kompresija i dekompresija nisu paralelizirani, tako da računske uštede nisu linearne.

Ova dva parametra postavljaju raspon ocjena kvalitete za ulazne FASTQ datoteke. Zadane vrijednosti odgovaraju formatu Sanger, s ocjenama kvalitete u rasponu [0, 40] koji obuhvaća ASCII vrijednosti [33, 73].

Umjesto ispisa potpunih poravnanja, datoteka zapisnika specificirana s -j će navesti pojedinosti nepodudaranja: zaglavlje čitanja, položaj i osnovnu i ocjenu kvalitete za čitanja R1 i R2. Ovo je korisno za izračun zasebnih stopa pogreške za podudaranja i nepodudaranja.

  • NGmerge ne može gzip komprimirati više izlaznih datoteka koje su stdout . Na primjer, sljedeće će proizvesti pogrešku:
    • -o - -a bez -i
    • -f - bez -a i bez -i


    Kako sortirati fastq datoteke kako bi se poravnala uparena krajnja čitanja pomoću BWA.

    Pokušavam uskladiti uparena krajnja čitanja koristeći BWA, ali budući da fastq datoteke nisu sortirane, žali se da "uparena čitanja imaju različita imena". Ovako: "M01628:49:000000000-D06TG:1:1102:25364:18377", "M01628:49:000000000-D06TG:1:1101:163877:169

    Postoji li prikladan alat za sortiranje ili moram napraviti skriptu za to?

    Uzorak čitanja izgleda ovako:

    Da, već sam pogledao najbolje rezultate pretraživanja prije postavljanja pitanja. Nažalost, nije ga ispravno sortirao i zato sam se pitao postoji li alat ili alternativna metoda za to.

    Jesu li vaša čitanja u isprepletenim fastq datotekama ili podijeljenim fastq datotekama? Ako su čitanja isprepletena, na Googleu postoje neki odgovori koji će vam ukloniti vaše datoteke. Ako su čitanja već podijeljena u mate1 i mate2 datoteku, onda s malo Pythona ili Perla možete jednostavno sortirati datoteke ispravno s pristupom dovoljnom ram-u. Vjerojatno nije najučinkovitija metoda, ali ako želite nešto što možete napisati vrlo brzo i što trebate koristiti samo da biste dobili svoje rezultate, ovo će biti dobro.

    Napravite popis čitanja pomoću BioPython SeqRecords

    Sortirajte popise prema ID-ovima čitanja 3a) Iterirajte kroz oba popisa, povlačeći 1 pročitano sa svakog popisa. 3b) Usporedite ID-ove čitanja (ne zaboravite /1 i /2 ili jedinstveni identifikator za čitanja mate1 i mate2) 3c) Ako se pronađe podudaranje, upišite mate1 read u vašu sortiranu datoteku mate1 i mate2 read u vaša sortirana datoteka mate2. (Bolje je imati popise mate1_paired i mate2_paired koje koristite kao međuspremnike. Zatim upišite u svoju datoteku svaki put kada dobijete 10k ili 50k čitanja u međuspremnicima koje ćete isprazniti nakon pisanja i ponovno početi puniti. Vratite se na korak 3a. 3d) Ako nije pronađeno podudaranje, uzmite niži ID čitanja i dodajte ga međuspremniku id-a pojedinačnog čitanja kako biste ga upisali u datoteku za jednostruko čitanje. 3e) Povucite novo čitanje s popisa za čitanje s kojeg je došlo jednostruko čitanje i ponavljajte korake 3b-3e dok se ne pronađe podudaranje

    Kada završite, imat ćete datoteke mate1_sorted.fq i mate2_sorted.fq koje bi sada trebale biti savršeno poredane jedna s drugom. Također ćete imati datoteku singleton.fq koja sadrži čitanja koja su izgubila svoj par u nekom trenutku između sekvenciranja i koraka mapiranja.

    Uz to, nemojte koristiti BWA za mapiranje čitanja osim ako nemate drugog izbora. Programer je poznat po svom radu na mapiranju kratkog čitanja, sam program vam nikada ne daje ono što stvarno želite. Raščlanjivanje BWA podataka jedna je od najzamornijih stvari koje sam morao raditi s NGS podacima. Toplo preporučam da ga koristite samo ako su alati koje koristite već postavljeni za izravan rad s izlazom BWA. U suprotnom, potražite u BBMAP svoje potrebe za mapiranjem za kratko čitanje. Zaljubit ćete se u fleksibilnost ulaznih i izlaznih opcija i formata. Statistike koje možete zatražiti da generira kao dio trčanja su nevjerojatne i radi ono što želite.


    Trimmomatic

    Trimmomatic je popularan alat za obrezivanje sekvenci adaptera iz Illumina čitanja. Priručnik Trimmomatic opisuje kako instalirati ovu aplikaciju, kako je pokrenuti i opisuje sve potrebne i neobavezne parametre naredbenog retka. Ako odlučite koristiti Trimmomatic za obrezivanje sekvenci adaptera iz čitanja Illumina, minimalna naredba koja izvodi samo obrezivanje adaptera može izgledati ovako:

    • Većina izvođenja sekvenciranja koristi čitanje uparenog kraja, pa navodimo “PE” u naredbenom retku.
    • Kako bismo ubrzali aplikaciju, navodimo broj niti koje treba koristiti, do maksimalnog broja dostupnih niti procesora.
    • Uvijek postoje dvije FASTQ datoteke u uparenom izvođenju: jedna datoteka za naprijed čitanje i jedna datoteka za obrnuto čitanje. Navodimo obje datoteke u popisu parametara.
    • Za svaku pročitanu datoteku navodimo naziv uparene izlazne datoteke i neuparene izlazne datoteke.
    • Slijed(e) adaptera je/su sadržane u FASTA formatiranoj datoteci. Parametar ILLUMINACLIP navodi naziv ove datoteke. Ovaj parametar također zahtijeva tri dodatna polja: seedMismatches, palindromeClipThreshold, simpleClipThreshold. Pogledajte priručnik za više informacija o tome kako postaviti ova tri polja.

    U našem primjeru, pomoću kompleta za pripremu biblioteke Nextera XT, datoteka “adapters.fasta” izgledala bi ovako:

    Ovo je standardna datoteka formatirana FASTA. Prvi zapis sadrži znak desnog pokazivača nakon kojeg slijedi proizvoljni niz. Drugi zapis sadrži slijed adaptera. Ova datoteka može sadržavati više sekvenci adaptera korištenjem multi-FASTA formata datoteke. Trimmomatic izlazne datoteke pokazat će koja su čitanja (ako ih ima) obrezana.


    Potrebne su samo dvije manje promjene za pokretanje fastq-mcf-a na uparenim podacima, moramo mu reći da također učita datoteku read 2, i također kako nazvati skraćeni izlaz iz ove datoteke.

    1. neb_adapters.fasta
    2. r1.8A_pilot.fq.gz
    3. r2.8A_pilot.fq.gz : NOVO za uparene podatke
    4. -q 20
    5. -x 0,5
    6. -o r1.8A_pilot.trim.fastq.gz
    7. -o r2.8A_pilot.trim.fastq.gz : NOVO za uparene podatke

    Napomena: Sada, budući da sada uključujemo obrnuta čitanja, sada se uočava kontaminacija s Univerzalnim adapterom


    Darencard / ekstrakt_fastq_bam.md

    Ponekad se FASTQ podaci poravnavaju s referencom i pohranjuju kao BAM datoteka, umjesto normalnih FASTQ datoteka za čitanje. To je u redu, jer je moguće ponovno kreirati neobrađene FASTQ datoteke na temelju BAM datoteke. Sljedeće opisuje ovaj proces. Potrebni su korisni softverski alati i bedtools.

    Iz svakog bam-a trebamo izdvojiti:

    1. čita to ispravno mapirano kao parove
    2. čita koje nije ispravno mapirano u parovima (obojica nisu mapirana ili jedan nije mapiran)

    Za #1, sljedeća naredba će raditi. Ovo je preuzeto s ove web stranice.

    Filtriranje -f i -F koristeći zastavice u stupcu 2 BAM datoteke. Oni nisu uvijek intuitivni i neću ih ovdje više opisivati, ali možete koristiti ovaj praktični alat za bolje razumijevanje. Također imajte na umu da oznaka -u stvara nekomprimirani BAM izlaz umjesto zadanog komprimiranog BAM izlaza, tako da će datoteke biti veće. To pomaže bržem čitanju u kasnijim koracima, ali nije potrebno to uključiti ako želite uštedjeti prostor na disku. samtools je super brz u svakom slučaju.

    Rješavanje #2 je kompliciranije, jer postoje tri načina na koje se čitanje možda nije mapiralo kao pravi par. A. Prvo čitanje je mapirano, ali upareno čitanje nije. B. Prvo čitanje nije mapirano, ali upareno čitanje jest. C. Niti jedno upareno čitanje uopće nije mapirano. Opet, zastavice će se koristiti za filtriranje izvorne BAM datoteke. Ova informacija je pronađena na ovoj web stranici.

    Kao što možete očekivati, tada morate spojiti tri datoteke koje sadrže barem jedan nemapirani par.

    Zatim se ove BAM datoteke moraju pribjeći tako da budu poredane prema ID-u čitanja umjesto prema lokaciji u referenci.

    U ovom trenutku, dobro je provjeriti imate li točan broj čitanja i nemate suvišnosti. Možete sažeti izvornu BAM datoteku da biste dobili ideju o tome gdje ste počeli.

    Obratite pažnju na ukupan broj čitanja ulaza koji se nalazi u prvom retku. Želite biti sigurni da je broj nemapiranih i mapiranih čitanja ukupan ovaj broj. Lako je provjeriti pomoću sljedećih naredbi.

    Imajte na umu da se jedno upareno čitanje ovdje računa kao dva čitanja. If you sum these two numbers, they should equal the number you noted above, as they do here.

    If all is good, you can now extract the FASTQ reads into two paired read files, as follows.

    And then it also makes sense to combine both the first and paired reads together from the mapped and unmapped files.

    These two files should now have the same number of reads that are exactly as you would have received them if they had come directly from the sequencer as FASTQ.

    Please also note that all of the commands above can be piped together in bash using | , which will save on disk space and time. So it is best to combine commands where possible.


    NextSeq 500

    The NextSeq 500 is different from the other Illumina sequencers in two important ways that impact the FASTQ files it generates.

    The NextSeq 500 has 4 lanes. Each lane gets the same sample or pool, but they are imaged by different cameras. Therefore, the data is tagged with lane numbers 1 to 4. However, the data in each file is for the same sample and represents distinct set of fragments for the sample. We generally keep these files separate, but not always.

    The NextSeq 500 sequences the second read of a dual-indexed library in the reverse direction from the other sequencers. We reverse complement the second barcode in the file name, but not in the FASTQ deflines.

    So for example, a barcode pair TAAGGCGA and TAGATCGC would be sequenced as TAAGGCGA and GCGATCTA . The defline for a read would contain TAAGGCGA-GCGATCTA but we would rename the FASTQ file to TAAGGCGATAGATCGC .


    Gledaj video: How to Draw the Lewis Structure for the Sulfate Ion (Kolovoz 2022).