Informacija

2.10: Regulacija ekspresije gena - Biologija

2.10: Regulacija ekspresije gena - Biologija



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Uvod u regulaciju gena

Regulacija se svodi na donošenje odluka. U sljedećem odjeljku raspravljamo o nekim od temeljnih mehanizama i principa koje koriste stanice za regulaciju ekspresije gena kao odgovor na promjene u staničnim ili vanjskim čimbenicima. Ova je biologija važna za razumijevanje načina na koji stanice prilagođavaju promjenjive okoline, uključujući kako neke stanice, u višestaničnim organizmima, odlučuju postati specijalizirane za određene funkcije (npr. tkiva).

Budući da je predmet regulacije i vrlo duboka i široka tema proučavanja biologije, u Bis2a ne pokušavamo pokriti svaki detalj - jednostavno ih je previše. Umjesto toga, kao što smo učinili za sve druge teme, pokušavamo se usredotočiti na (a) navođenje nekih ključnih logičkih konstrukcija i pitanja koja morate imati kada pristupite BILO KOM scenariju koji uključuje regulaciju, (b) učenje nekog uobičajenog rječnika i sveprisutnih mehanizama i (c) ispitivanje nekoliko konkretnih primjera koji ilustriraju točke iz a i b.

Ekspresija gena

Uvod

Sve stanice kontroliraju kada i koliko se svaki od njegovih gena izražava. Ova jednostavna izjava - ona koja bi se mogla izvesti jednostavno iz promatranja staničnog ponašanja - postavlja mnoga pitanja koja možemo početi postavljati koristeći Design Challenge.

Pokušavam definirati "izraz gena"

Međutim, prvo što trebamo učiniti je definirati što znači kada kažemo da je gen “izražen”. Krajnji "izraz" gena je njegov učinak na fenotip. Ako gen kodira protein, moglo bi se razumno pretpostaviti da "ekspresija" gena znači koliko je funkcionalnog proteina napravljeno i da bi mjerenje količine tog proteina moglo biti dobra mjera "ekspresije gena". Mnogi molekularni biolozi označavaju razinu transkripta tog gena kao lako mjerljiv proxy ili njegovu ekspresiju. Prema toj definiciji, moglo bi se htjeti izbrojati koliko je transkripata pune duljine prisutno u svakoj ćeliji. U praksi često nalazimo da definicija ovisi o kontekstu rasprave. Drzi to na umu. U Bis2A pokušat ćemo koristiti izraz "izraz" prvenstveno da opišemo stvaranje konačnog funkcionalnog proizvoda(a).

Dizajnerski izazov reguliranja ekspresije gena

Kako bismo ovu raspravu potaknuli iz perspektive izazova dizajna, možemo službeno odrediti da je "veliki problem" koji nas zanima reguliranje obilja proteina u stanici. Problem: Obilje svakog funkcionalnog proteina mora se regulirati. Zatim možemo početi postavljanjem podproblema:

No, uzmimo trenutak da prvo ponovno učitamo nekoliko ideja. Proces ekspresije gena zahtijeva više koraka ovisno o tome kakva će biti sudbina konačnog proizvoda. U slučaju strukturnih i regulatornih RNA (tj. tRNA, rRNA, itd.) proces zahtijeva da se gen transkribira i da se izvrši svaka potrebna post-transkripcijska obrada. U slučaju gena koji kodira protein, transkript se također mora prevesti u protein i ako je potrebno, također se moraju izvršiti modifikacije na proteinu. Naravno, i transkripcija i prijevod su procesi u više koraka, a većina tih pod-koraka također su potencijalna mjesta kontrole.

Stoga bi neki od podproblema mogli biti:

  1. Mora postojati neki mehanizam(i) za reguliranje prvog koraka ovog procesa u više koraka, pokretanja transkripcije (upravo je početak). Dakle, mogli bismo reći, "trebamo mehanizam za reguliranje pokretanja transkripcije." To bismo također mogli pretvoriti u pitanje i zapitati se "kako se može postići inicijacija transkripcije"?
  2. Možemo koristiti slično razmišljanje da kažemo, "trebamo mehanizam za reguliranje kraja transkripcije" ili da se zapitamo "kako se transkripcija završava?" (ovdje govorimo o zaustavljanju transkripcije gena - gašenju gena, ne prekidanju - određivanju posljednjeg nukleotida određene transkribirane molekule)
  3. Koristeći ovu konvenciju možemo reći, "trebamo regulirati početak prijevoda i prestanak prijevoda". (opet, uključivanje ili isključivanje prijevoda određene vrste prijepisa)
  4. Govorili smo samo o sintezi proteina i RNA. Sasvim je razumno također reći, "trebamo mehanizme za regulaciju razgradnje RNA i proteina."

Fokusiranje na transkripciju

U ovom tečaju počinjemo s fokusiranjem prvenstveno na ispitivanje prvih nekoliko problema/pitanja, regulaciju inicijacije i završetka transkripcije - od genomske informacije do funkcionalne RNA, bilo spremne kakva jest (npr. u slučaju funkcionalne RNA) ili spremne za prijevod. To nam omogućuje da ispitamo neke temeljne koncepte u vezi s regulacijom ekspresije gena i da ispitamo nekoliko stvarnih primjera tih koncepata na djelu.

Predložena rasprava

Zašto je važno regulirati ekspresiju gena - zašto jednostavno ne ekspresirati sve gene cijelo vrijeme? Zašto ih imati ako ih ne želiš izraziti?

Napravite popis hipoteza sa svojim kolegama iz razreda zašto je regulacija ekspresije gena važna za bakterije i arheje i za eukariote. Umjesto bakterija u odnosu na eukariote, možda ćete također htjeti razmotriti različite razloge zašto je regulacija gena važna za jednostanične organizme u odnosu na višestanične organizme ili zajednice jednostaničnih organizama (poput kolonija bakterija).

Aktivacija i represija transkripcije

Neke osnove

Razmotrimo gen koji kodira protein i proradimo kroz neku logiku. Znamo da će za transkripciju ovog gena trebati regrutirati RNA polimerazu do početka kodirajuće regije. Mora postojati neki mehanizam, koji se temelji na kemijskoj logici, koji bi pomogao regrutirati RNA polimerazu na početak gena koji kodira protein. Isto tako, ako se ovaj proces želi regulirati, mora postojati neki mehanizam ili mehanizmi koji će diktirati kada se RNA polimeraza treba angažirati na početku gena, kada ne, i/ili ako se regrutira u gen. DNK, treba li zapravo započeti transkripciju ili ne i koliko bi se puta taj proces trebao dogoditi. Imajte na umu da prethodna rečenica ima nekoliko različitih podproblema/pitanja (npr. kada se regrutira polimeraza?, ako se regrutira treba li započeti transkripciju? koliko često bi se to trebalo dogoditi?). Također možemo razumno zaključiti da će trebati postojati neki mehanizmi koji bi "instruirali" (više antropomorfizama) polimerazu da zaustavi transkripciju. Konačno, budući da je uloga transkripcije stvaranje RNA kopija segmenata genoma, trebali bismo razmotriti i probleme/pitanja vezana uz druge čimbenike koji utječu na obilje RNA, poput mehanizama degradacije. Mora postojati neki mehanizam za svaki od ovih koraka, a bilo koji od njih može biti uključen u regulaciju ovog procesa.

Shema koja prikazuje gen koji kodira protein i neka od pitanja ili problema koje si trebamo postaviti ili alternativno probleme za koje moramo znati rješenja ako želimo razumjeti kako je regulirana regulacija transkripcijskog dijela ekspresije gena. Atribucija: Marc T. Facciotti (vlastiti rad)

Regrutiranje RNA polimeraze na određena mjesta

Da bi se pokrenula transkripcija, RNA polimeraza mora biti angažirana u segmentu DNA blizu početka regije DNA koja kodira funkcionalni transkript. Funkcija RNA polimeraze kao što je do sada opisana, međutim, nije da veže specifične sekvence, već da se kreće duž bilo kojeg segmenta DNA. Stoga se pronalaženje načina za regrutiranje polimeraze na određeno mjesto čini proturječnim njenom uobičajenom ponašanju, koje ne pokazuje posebnu sklonost prema određenoj sekvenci. Objašnjenje ove kontradikcije zahtijeva od nas da se pozovemo na nešto novo. Transkripcija može započeti bilo gdje, a samo oni događaji koji dovode do potpunog produktivnog transkripta čine bilo što korisno ili nešto drugo osim same RNA polimeraze pomaže regrutirati enzim na početku gena. Ovo posljednje, sada uzimamo zdravo za gotovo, doista je slučaj, a to vrijedi i za prokariote i za eukariote.

Regrutiranje RNA polimeraze je posredovano proteinima tzv opći faktori transkripcije. Kod bakterija se to tzv sigma faktori.

U eukariota, važni opći čimbenici inicijacije transkripcije uključuju TATA binding protein (TBP) i TFIIB, koji funkcioniraju u sprezi s brojnim drugim proteinskim kompleksima (ukupno gotovo 100 proteina) za regrutiranje RNA polimeraze II. Archea nosi ogoljenu verziju ovog eukariota kompleks predinicijacije.

Opći čimbenici transkripcije imaju najmanje dvije osnovne funkcije: (1) Oni (kod eukariota, kao multiproteinski kompleks) su u stanju kemijski prepoznati specifičan slijed DNA i (2) oni su u stanju opteretiti RNA polimerazu na tom mjestu . Ove dvije funkcije općih transkripcijskih čimbenika zajedno rješavaju problem regrutiranja enzima koji inače nije sposoban vezati specifično DNK mjesto. U nekim tekstovima se kaže da su opći transkripcijski čimbenici (a posebno varijeteti sigma faktora) dio RNA polimeraze. Iako su svakako dio kompleksa kada pomažu u ciljanju RNA polimeraze, ne nastavljaju (obično) s RNA polimerazom nakon što ona započne transkripciju. Svaka RNA polimeraza je napunjena na promotor sigma faktorom. Bakterijski genom može kodirati nekoliko sigma čimbenika, različito ih izražavajući u različitim uvjetima, i kao rezultat odabira različitog raspona promotora koji će pomoći bakteriji da se prilagodi tim uvjetima.

DNK mjesto na koje se regrutira RNA polimeraza naziva se a promotor. Dok sekvence DNA različitih promotora ne moraju biti potpuno iste, različite promotorske sekvence obično imaju neka zajednička posebna kemijska svojstva. Očito, jedno je svojstvo da se oni mogu povezati s gore navedenim općim transkripcijskim čimbenicima. Dodatno, promotor obično ima DNA sekvencu koja olakšava disocijaciju dvolančane DNA tako da polimeraza može početi transkribirati kodirajuću regiju. (Napomena: tehnički smo mogli raščlaniti svojstva promotora na podprobleme izazova dizajna. U ovom slučaju smo to preskočili, ali i dalje biste se trebali moći povući unatrag i stvoriti izjave o problemu i/ili relevantna pitanja nakon što saznate o promotorima ).

U gotovo svim slučajevima, ali posebno u eukariotskim sustavima, kompleks proteina koji se spaja s RNA polimerazom na promotorima (obično se naziva kompleks prije inicijacije) može brojati desetke proteina. Svaki od ovih drugih proteina ima specifičnu funkciju, ali to je previše detalja da bi se uronilo u Bis2A.

Model preinicijacijskog kompleksa E. coli. Sigma faktor je obojen crvenom bojom. DNK je prikazan kao narančaste cijevi i suprotne plavo:zelene baze. Ostatak kompleksa prije inicijacije obojen je ružičastom bojom. Imajte na umu da DNK ima regije dvostruke spirale i otvorenu strukturu unutar PIC-a. Atribucija: Struktura izvedena iz PDB koordinata (4YLN) Marc T. Facciotti (vlastiti rad)

Države reguliranog promicatelja

Budući da promotori regrutiraju RNA polimerazu, ova su mjesta i sastavljanje kompleksa prije inicijacije očita mjesta za regulaciju prvih koraka ekspresije gena. Na razini inicijacije transkripcije, promotore često svrstavamo u jednu od tri klase. Prvi se zove konstitutivni. Konstitutivni promotori općenito nisu jako strogo regulirani. Njihovo osnovno stanje je "uključeno". Kada je konstitutivna transkripcija od promotora vrlo visoka (u odnosu na većinu drugih promotora), taj ćemo promotor kolokvijalno nazvati "jakim konstitutivnim" promotorom. Nasuprot tome, ako je količina transkripcije iz konstitutivnog promotora niska (u odnosu na većinu drugih promotora), taj ćemo promotor nazvati "slabim konstitutivnim" promotorom.

Drugi način klasificiranja promotora korištenjem izraza aktiviran ili ekvivalentno, inducirano. Ovi zamjenjivi pojmovi koriste se za opisivanje promotora koji su osjetljivi na neki vanjski podražaj i na navedeni podražaj reagiraju povećanjem transkripcije. Aktivirani promotori imaju bazno stanje koje općenito ne pokazuje malo ili nimalo transkripcije. Transkripcija se tada "aktivira" kao odgovor na podražaj - podražaj "uključuje" promotor.

Konačno, treći pojam koji se koristi za klasifikaciju promotora je korištenje izraza potisnuti. Ovi promotori također reagiraju na podražaje, ali to čine smanjenjem transkripcije. Osnovno stanje za ove promotore je neka bazalna razina transkripcije, a stimulans djeluje na smanjenje ili potiskivanje transkripcije. Transkripcija je "potisnuta" kao odgovor na podražaj - podražaj "isključuje" promotor.

Gore navedeni primjeri pretpostavljaju da jedan stimulans djeluje na regulaciju promotora. Iako je ovo najjednostavniji slučaj, mnogi promotori mogu integrirati različite vrste informacija i mogu se naizmjenično aktivirati nekim podražajima i potisnuti drugim podražajima.

Transkripcijski čimbenici pomažu u regulaciji ponašanja promotora

Kako su promotori osjetljivi na vanjske podražaje? I kod aktivacije i kod represije regulacija gena zahtijeva da proteini mijenjaju transkripcijski izlaz promatranog gena. Proteini odgovorni za pomoć u regulaciji ekspresije tzv transkripcijski faktori. Specifične DNA sekvence vezane faktorima transkripcije često se nazivaju operatorima i u mnogim slučajevima operatori su vrlo bliski promotorskim sekvencama.

Prijedlog: opišite razliku između "faktora transkripcije", kao što je opisano neposredno iznad, i "općeg transkripcijskog faktora" koji je prethodno opisan.

Ovdje nomenklatura postaje potencijalno zbunjujuća - osobito kada se uspoređuje bakterijska i eukariotska istraživanja. U

bakterijska istraživanja

, ako transkripcijski faktor djeluje tako što veže DNA i RNA polimerazu na način koji povećava transkripciju, tada se obično naziva aktivator. Ako, nasuprot tome, transkripcijski faktor djeluje tako što veže DNK kako bi potisnuo ili smanjio transkripciju gena, tada se naziva represor.

Zašto su klasifikacije aktivatora i represora potencijalno problematične? Ovi pojmovi opisuju idealizirane pojedinačne funkcije. Iako to može biti istina u slučaju nekih transkripcijskih čimbenika, u stvarnosti drugi čimbenici transkripcije mogu djelovati tako da aktiviraju ekspresiju gena u nekim uvjetima dok potiskuju u drugim uvjetima. Neki transkripcijski čimbenici jednostavno će djelovati tako da moduliraju ekspresiju prema gore ili prema dolje ovisno o kontekstu, umjesto da "isključe" transkripciju ili da je potpuno "uključe". Kako bi zaobišli dio ove moguće zabune, neki od vaših instruktora radije izbjegavaju korištenje izraza aktivator i represor i umjesto toga radije jednostavno raspravljaju o aktivnosti transkripcije različitih transkripcijskih čimbenika kao pozitivnom ili negativnom utjecaju na ekspresiju gena u određenim slučajevima. Ako se koriste ovi izrazi, mogli biste čuti kako vaš instruktor govori da dotični faktor transkripcije DJELUJE KAO/KAO represor ili da DJELUJE KAO/KAO aktivator, pazeći da ga ne nazovete jednostavno aktivatorom ili represorom. Međutim, vjerojatnije je da ćete ih čuti kako kažu da transkripcijski faktor djeluje tako da pozitivno ili negativno utječe na transkripciju.

Predložena rasprava

Što mislite, koje se vrste interakcija događaju između aminokiselina transkripcijskog faktora i dvostruke spirale DNK? Kako transkripcijski faktori prepoznaju svoje vezno mjesto na DNK?

Alosterički modulatori regulatornih proteina

Aktivnost mnogih proteina, uključujući regulatorne proteine ​​i različite faktore transkripcije, može se alosterički modulirati različitim čimbenicima, uključujući relativnu količinu malih molekula u stanici. Ove male molekule često se nazivaju induktori ili su-represori ili koaktivatori i često su metaboliti, kao što su laktoza ili triptofan ili male regulatorne molekule, kao što su cAMP ili GTP. Ove interakcije omogućuju TF-u da reagira na uvjete okoline i da u skladu s tim modulira svoju funkciju. Pomaže u donošenju odluke hoće li transkribirati gen ili ne, ovisno o obilju signala iz okoliša.

Zamislimo negativni regulator transkripcije. U najjednostavnijem slučaju koji smo do sada razmatrali, transkripcija gena s veznim mjestom za ovaj faktor transkripcije bila bi niska kada je TF prisutan i visoka kada je TF odsutan. Sada ovom modelu možemo dodati malu molekulu. U ovom slučaju mala molekula može vezati negativni transkripcijski regulator kroz niz komplementarnih vodikovih i ionskih veza. U ovom prvom primjeru razmotrit ćemo slučaj kada vezanje male molekule na TF izaziva konformacijsku promjenu na TF koja ozbiljno smanjuje njegovu sposobnost vezanja DNA. Ako je to slučaj, negativni regulator – jednom vezan svojom malom molekulom – oslobodio bi se DNK. Time bi se ublažio negativni utjecaj i povećala transkripcija. Ova regulatorna logika mogla bi biti prikladna da se razvila u sljedećem scenariju: hrana male molekule obično je odsutna iz okoliša. Stoga bi gene koji kodiraju enzime koji će razgraditi/upotrijebiti tu hranu većinu vremena treba držati "isključenim" kako bi se očuvala stanična energija koju bi njihova sinteza koristila. To bi se moglo postići djelovanjem negativnog transkripcijskog regulatora. Kada se hrana pojavi u okolišu, bilo bi prikladno da se eksprimiraju enzimi odgovorni za njezinu preradu. Hrana bi tada mogla djelovati tako da se veže na negativni regulator, mijenjajući konformaciju TF-a, uzrokujući njegovo oslobađanje iz DNK i time uključivanjem transkripcije enzima za obradu.

Apstraktni model generičke transkripcijske jedinice regulirane negativnim regulatorom čiju aktivnost modulira mala molekula (prikazana zvijezdom). U ovom slučaju, vezanje male molekule uzrokuje oslobađanje TF-a iz DNA. Facciotti (vlastiti rad)

Možemo razmotriti drugi model za način na koji TF negativno djeluje s malom molekulom. U ovom slučaju, sam TF nije u stanju vezati svoje regulatorno mjesto na DNK. Međutim, kada se mala molekula veže na TF dolazi do konformacijske promjene koja preorijentira aminokiseline koje se vežu na DNA u "ispravnu" orijentaciju za vezanje DNA. Kompleks male molekule TF sada se veže na DNK i djeluje tako da negativno utječe na transkripciju.

Apstraktni model generičke transkripcijske jedinice regulirane negativnim regulatorom čiju aktivnost modulira mala molekula (prikazana zvijezdom). U ovom slučaju, vezanje male molekule uzrokuje da se TF veže na DNK. Facciotti (vlastiti rad)

Obratite pažnju na to kako se aktivnost TF-a može modulirati na izrazito različite načine pomoću male molekule.Ovisno o logici regulacijskog sustava, vezanje ovog vanjskog signala može uzrokovati vezanje kompleksa male molekule TF za DNK ILI vezanje male molekule može uzrokovati oslobađanje kompleksa male molekule TF iz DNK. Iste vrste primjera mogu se obraditi za pozitivni regulator (pokušajte napraviti jedan i nacrtati komponente).

U oba gore predložena slučaja, vezanje male molekule na TF ovisit će o tome koliko snažno TF stupa u interakciju s malom molekulom. To će ovisiti o vrstama i prostornoj orijentaciji kemijskih funkcionalnih skupina proteina i komplementarnih funkcionalnih skupina na maloj molekuli. Stoga ne bi trebalo biti iznenađujuće saznanje da će vezanje male molekule na TF ovisiti o različitim čimbenicima, uključujući ali ne ograničavajući se na koncentraciju male molekule i TF.

Je li transkripcijski faktor pozitivan ili negativan regulator?

Rješavanje zajedničke točke zabune

U ovom trenutku, nije neuobičajeno da mnogi studenti Bis2a budu pomalo zbunjeni oko toga kako odrediti djeluje li transkripcijski faktor kao pozitivan ili negativan regulator. Ova zbrka često dolazi nakon rasprave o mogućim načinima na koje podražaj (tj. mala molekula) može utjecati na aktivnost transkripcijskog faktora. Ovo nije previše iznenađujuće. U gornjim primjerima, vezanje efektorske molekule na faktor transkripcije moglo bi imati jedan od dva različita učinka: (1) vezanje efektorske molekule moglo bi inducirati transkripcijski faktor vezan za DNA na

oslobađanje

sa svog veznog mjesta, derepresiju promotora, i

uključivanje

ekspresija gena. (2) vezanje efektorske molekule na faktor transkripcije moglo bi

uzrokovati da se TF veže

na svoje mjesto vezanja DNA, potiskujući promotor i stoga

Isključivanje

ekspresija gena. U prvom slučaju moglo bi se činiti da mala molekula djeluje tako da pozitivno regulira ekspresiju jer je inhibira biokemijska aktivnost TF (njegova sposobnost da veže specifičnu sekvencu i time blokira punjenje polimeraze), dok u drugom primjeru mala molekula aktivira biokemijska aktivnost TF-a (opet, vezanje DNA specifično za sekvencu koje blokira punjenje polimeraze).

U oba gornja primjera, TF djeluje kao negativni regulator. Da bi se ovo utvrdilo

gledamo što se događa kada TF veže DNK

(bez obzira je li mala molekula vezana za TF ili ne). U oba slučaja, vezanje TF-a na DNA potiskuje transkripciju. TF stoga djeluje kao negativni regulator. Slična analiza može se napraviti s pozitivno djelujućim TF-ima – to jest, TF-ovima koji pomažu u promicanju učitavanja polimeraze na promotoru i/ili inicijaciji transkripcije.

Imajte na umu da u nekim slučajevima TF može djelovati kao pozitivan regulator na jednom promotoru i negativan regulator na drugom promotoru, tako da je opisivanje ponašanja TF-a na temelju svakog slučaja često važno (previše čitanje iz imena koje mu je dodijeljeno može ponekad dovesti u zabludu). Ostali TF proteini mogu djelovati naizmjenično kao pozitivni ili negativni regulatori istog promotora ovisno o uvjetima. Opet, savjetuje se opisivanje ponašanja TF-a posebno za svaki slučaj. U ovom razredu pokušavamo izbjeći ove složenije primjere.

Genetski test za pozitivnu ili negativnu regulatornu funkciju TF

Kako se može odrediti funkcionira li regulatorni protein na pozitivan ili negativan način? Jednostavan genetski test je da se zapita "što se događa s ekspresijom ako je regulatorni protein odsutan?" To se može postići uklanjanjem kodirajućeg gena za faktor transkripcije iz genoma. Ako transkripcijski faktor djeluje pozitivno, tada je njegova prisutnost potrebna za aktiviranje transkripcije. U njegovom nedostatku, nema regulatornog proteina, dakle nema aktivacije, a ishod je niža razina transkripcije ciljnog gena. Suprotno vrijedi za transkripcijski faktor koji djeluje negativno. U njegovom nedostatku ekspresija bi se trebala povećati, jer gen koji održava nisku ekspresiju više nije tu.

Završetak transkripcije i razgradnja RNA

Razgradnja RNA

Životni vijek različitih vrsta RNA u stanici može dramatično varirati, od sekundi do sati. Prosječni životni vijek mRNA također može dramatično varirati ovisno o organizmu. Na primjer, medijan životnog vijeka za mRNA u E coli je ~5 minuta. Poluživot mRNA u kvascu je ~20 minuta i 600 minuta za ljudske stanice. Dio degradacije je "ciljani". To jest, neki transkripti uključuju kratku sekvencu koja ih cilja na enzime koji razgrađuju RNA, ubrzavajući brzinu razgradnje. Nije potrebno previše mašte da bi se zaključilo da bi ovaj proces također mogao biti evolucijski podešen za različite gene. Za Bis2a dovoljno je jednostavno shvaćanje da degradacija - i podešavanje degradacije - također može biti čimbenik u kontroli ekspresije gena.

Sažetak genske regulacije

U prethodnom tekstu ispitali smo nekoliko načina za početak rješavanja nekih od dizajnerskih izazova povezanih s regulacijom količine transkripta koji se stvara za jednu kodirajuću regiju genoma. Apstraktno smo pogledali neke od procesa odgovornih za kontrolu pokretanja transkripcije, kako se oni mogu učiniti osjetljivima na čimbenike okoline, i vrlo kratko na procese koji prekidaju transkripciju i upravljaju aktivnom razgradnjom RNA. Izbjegli smo više. Svaki od ovih procesa priroda može kvantitativno podesiti da bude "jači" ili "slabiji". Važno je shvatiti da stvarne vrijednosti "snage" (npr. snaga promotora, stope razgradnje, itd.) utječu na ponašanje cjelokupnog procesa na potencijalno funkcionalno važne načine.

Primjeri regulacije bakterijskih gena

Ovaj odjeljak opisuje dva primjera regulacije transkripcije u bakterijama. Oni su prikazani kao ilustrativni primjeri. Koristite ove primjere da naučite neke osnovne principe o mehanizmima regulacije transkripcije. Budite na oprezu u nastavi, u raspravi i u studijskim vodičima za proširenja ovih ideja i upotrijebite ih za objašnjenje regulatornih mehanizama koji se koriste za regulaciju drugih gena.

Primjeri regulacije gena u E coli

DNA bakterija i arheja obično je organizirana u jedan ili više kružnih kromosoma u citoplazmi. Gusti agregat DNK koji se može vidjeti na elektronskim mikrografijama naziva se nukleoid. Kod bakterija i arheja, geni, čija ekspresija mora biti usko koordinirana (npr. geni koji kodiraju proteine ​​koji su uključeni u isti biokemijski put) često su usko grupirani u genomu. Kada ekspresiju više gena kontrolira isti promotor i proizvede jedan transkript, te se jedinice ekspresije nazivaju operoni. Na primjer, u bakteriji Escherschia coli svi geni potrebni za korištenje laktoze kodirani su jedan pored drugog u genomu. Ovaj raspored se naziva laktoza (ili lac) operon. Često je kod bakterija i arheja da je gotovo 50% svih gena kodirano u operone dva ili više gena.

Uloga promotora

Prva razina kontrole ekspresije gena je na samom promotoru. Neki promotori regrutiraju RNA polimerazu i pretvaraju te događaje vezanja DNA-proteina u transkripte učinkovitije od drugih promotora. Ovo intrinzično svojstvo promotora, njegova sposobnost da proizvede transkript određenom brzinom, naziva se snaga promotora. Što je promotor jači, to se više RNA stvara u bilo kojem vremenskom razdoblju. Snagu promotora priroda može "podesiti" u vrlo malim ili vrlo velikim koracima promjenom nukleotidnog slijeda promotora (npr. mutiranjem promotora). To rezultira obiteljima promotora s različitim snagama koje se mogu koristiti za kontrolu maksimalne stope ekspresije gena za određene gene.

UC Davis Undergraduate Connection

Grupa studenata UC Davisa zainteresiranih za sintetičku biologiju iskoristila je ovu ideju za stvaranje knjižnica sintetičkih promotora za inženjerske mikrobe kao dio svog dizajnerskog projekta za natjecanje iGEM 2011.

Primjer #1: Trp Operaon

Logika za regulaciju biosinteze triptofana

E coli, kao i svi organizmi, treba ili sintetizirati ili konzumirati aminokiseline da bi preživjeli. Aminokiselina triptofan je jedna takva aminokiselina. E. colimože uvoziti triptofan iz okoline (jedući ono što može pokupiti iz svijeta oko sebe) ili sintetizirati triptofan de novo koristeći enzime koji su kodirani s pet gena. Ovih pet gena su kodirani jedan pored drugog u E coli genoma u ono što se zove triptofan (trp) operon (Slika ispod). Ako je triptofan prisutan u okolišu, onda E coli ne treba ga sintetizirati i prekidač koji kontrolira aktivaciju gena u trp operon je isključen. Međutim, kada je dostupnost triptofana u okolišu niska, prekidač koji kontrolira operon je uključen, transkripcija se pokreće, geni se eksprimiraju i triptofan se sintetizira. Pogledajte sliku i odlomke u nastavku za mehaničko objašnjenje.

Organizacija trp operon

Pet genomskih regija koje kodiraju enzime biosinteze triptofana poredane su uzastopno na kromosomu i pod kontrolom su jednog promotora. Svih pet enzima je kodirano jednim transkriptom – organizirani su u jedan operon. Neposredno prije regije kodiranja je početno mjesto transkripcije. Ovo je, kao što naziv implicira, mjesto gdje RNA polimeraza započinje novi transkript. Slijed promotora je dalje uzvodno od mjesta početka transkripcije.

Slijed DNA nazvan "operator" također je kodiran između promotora i prvog trp kodirajući gen. Ovaj operater je DNA sekvenca na koju će se vezati protein regulatornog transkripcijskog faktora.

Još nekoliko detalja u vezi s TF veznim mjestima

Treba napomenuti da je upotreba izraza "operater" ograničena na samo nekoliko regulatornih sustava i gotovo uvijek se odnosi na vezno mjesto za transkripcijski faktor negativnog djelovanja. Konceptualno ono što trebate zapamtiti je da postoje mjesta na DNK koja su u interakciji s regulatornim proteinima što im omogućuje da obavljaju svoju odgovarajuću funkciju (npr. potiskuju ili aktiviraju transkripciju). Ova će se tema univerzalno ponavljati u biologiji bez obzira na to koristi li se termin "operater" ili ne.

Štoviše, dok konkretni primjeri koje ćete prikazati prikazuju TF vezna mjesta na njihovim poznatim lokacijama, ta mjesta nisu univerzalna za sve sustave. Mjesta vezanja faktora transkripcije mogu varirati u odnosu na promotor. Postoje neki obrasci (npr. pozitivni regulatori su često uzvodno od promotora, a negativni regulatori se vežu nizvodno), ali ove generalizacije nisu točne za sve slučajeve. Opet, ključna stvar koju treba zapamtiti je da transkripcijski čimbenici (i pozitivno i negativno djeluju) imaju vezna mjesta s kojima su u interakciji kako bi pomogli regulirati inicijaciju transkripcije pomoću RNA polimeraze.

Pet gena koji su potrebni za sintezu triptofana u E. coli nalaze se jedan do drugog u trp operonu. Kada je triptofana u izobilju, dvije molekule triptofana vežu se na faktor transkripcije i dopuštaju kompleksu TF-triptofana da se veže na sekvenci operatora. To fizički blokira RNA polimerazu od transkripcije gena biosinteze triptofana. Kada je triptofan odsutan, faktor transkripcije se ne veže na operatera i geni se transkribiraju. Facciotti (vlastiti rad).

Uredba o trp operon

Kada je triptofan prisutan u stanici, on se veže za trp represorski protein. Kada se triptofan veže na ovaj transkripcijski čimbenik, uzrokuje konformacijsku promjenu u proteinu što sada omogućuje da se TF-triptofan kompleks veže na trp sekvenca operatora. Vezanje kompleksa triptofan-represor kod operatera fizički sprječava RNA polimerazu da se veže i transkribira nizvodno gene. Kada triptofan nije prisutan u stanici, faktor transkripcije se ne veže za operatera; dakle, transkripcija se nastavlja, geni za korištenje triptofana se transkribiraju i prevode, te se tako sintetizira triptofan.

Budući da se faktor transkripcije aktivno veže na operatera kako bi geni bio isključen, trp kaže se da je operon "negativno reguliran". Proteini koji se vežu za operatera utišaju trp izraz su negativni regulatori.

Predložena rasprava

Mislite li da je ekspresija proteina represora trp regulirana trp-om ili je protein konstitutivno izražen?

Rasprava o prijedlozima

Pretpostavimo da je priroda zauzela drugačiji pristup reguliranju trp operona. Osmisliti metodu za regulaciju ekspresije trp operona s pozitivnim regulatorom umjesto negativnim regulatorom. (motivator: profesori postavljaju ovakva pitanja cijelo vrijeme na ispitima)

Vanjska poveznica

Pogledajte ovaj video kako biste saznali više o trp operon.

Primjer 2: The lac operon

Obrazloženje za proučavanje lac operon

U ovom primjeru ispitujemo regulaciju gena koji kodiraju proteine ​​čija je fiziološka uloga uvoz i asimilacija disaharida laktoze, lac operon. Priča o regulaciji lac operon je uobičajen primjer koji se koristi u mnogim uvodnim satovima biologije za ilustraciju osnovnih principa inducibilne genske regulacije. Odlučili smo opisati ovaj primjer na drugom mjestu jer je, prema našoj procjeni, kompliciraniji od prethodnog primjera koji uključuje aktivnost jednog transkripcionog faktora negativnog djelovanja. Nasuprot tome, regulacija lac operon je, po našem mišljenju, prekrasan primjer kako se koordinirana aktivnost i pozitivnih i negativnih regulatora oko istog promotora može koristiti za integraciju više različitih izvora staničnih informacija za regulaciju ekspresije gena.

Dok prolazite kroz ovaj primjer, imajte na umu posljednju točku. Za većinu Bis2a instruktora važnije je razumjeti kako je logika lac operon nego da zapamtite dolje prikazanu ulazno/izlaznu tablicu. Prednost razumijevanja logike regulacije gena je u tome što se koncepti mogu primijeniti na mnoge različite regulatorne sustave. Ovaj cilj se može odraziti na ispite.

Korištenje laktoze

Laktoza je disaharid koji se sastoji od heksoza glukoze i galaktoze. Obično se nalazi u velikom obilju u mlijeku i nekim mliječnim proizvodima. Kao što se može zamisliti, disaharid može biti važna hrana za mikrobe koji su u stanju iskoristiti svoje dvije heksoze. coli može koristiti više različitih šećera kao izvora energije i ugljika, uključujući laktozu i lac operon je struktura koja kodira gene potrebne za dobivanje i obradu laktoze iz lokalnog okoliša. Laktoza se, međutim, nije često susrela E coli tijekom svoje evolucije i stoga geni lac operon se obično mora potisnuti (tj. "isključiti") kada je laktoza odsutna. Pokretanje transkripcije ovih gena kada je laktoza odsutna, potrošilo bi dragocjenu staničnu energiju. Nasuprot tome, kada je laktoza prisutna, logično bi bilo da se geni odgovorni za iskorištavanje šećera eksprimiraju (tj. "uključeni"). Za sada je priča slična onoj s gore opisanim triptofanskim operonom. Osim... ćelija mora prepoznati prisutnost male molekule (laktoze) kako bi se mogla prebaciti na proizvodnju enzima za njegovu razgradnju (i drugog za transport u stanicu). U trp operonu stanica mora prepoznati prisutnost male molekule (trp) na koju se može prebaciti isključeno proizvodnju enzima koji ga proizvode.

Pitanje: U oba slučaja koristi se protein represor. Kako je to moguće kada se postižu suprotni rezultati?

Međutim, postoji kvaka. Eksperimenti koje su 1950-ih proveli Jacob i Monod jasno su to pokazali E coli preferira iskoristiti svu prisutnu glukozu u okolišu prije nego što počne koristiti laktozu. To znači da mehanizam koji se koristi za odlučivanje hoće li se izraziti geni za iskorištavanje laktoze ili ne mora biti u stanju integrirati dvije vrste informacija (1) koncentraciju glukoze i (2) koncentraciju laktoze. Iako bi se to teoretski moglo postići na više načina, ispitat ćemo kako lac operon to postiže korištenjem više faktora transkripcije.

Transkripcijski regulatori lac operon

The lac represor - izravni senzor laktoze

Kao što je navedeno, lac operon normalno ima vrlo nizak ili nikakav transkripcijski učinak u nedostatku laktoze. To je zbog dva čimbenika: (1) konstitutivna snaga promotora za operon je relativno niska i (2) stalna prisutnost LacI represorskog proteina negativno utječe na transkripciju. Ovaj protein se veže na mjesto operatera u blizini promotora i blokira RNA polimerazu da transkribira lac operonski geni. Nasuprot tome, ako je laktoza prisutna, laktoza će se vezati na LacI protein, izazivajući konformacijsku promjenu koja sprječava da se kompleks LacI-laktoza veže na svoja mjesta vezanja. Stoga, kada je prisutna laktoza, negativni regulatorni LacI nije vezan za svoje vezno mjesto i može se nastaviti transkripcija gena koji koriste laktozu.

CAP protein - neizravni senzor glukoze

U E coli, kada razina glukoze padne, mala molekula ciklički AMP (cAMP) počinje se nakupljati u stanici. cAMP je uobičajena signalna molekula koja je uključena u metabolizam glukoze i energije u mnogim organizmima. Kada se razina glukoze smanji u stanici, sve veće koncentracije cAMP-a omogućuju ovom spoju da se veže na pozitivni transkripcijski regulator tzv. protein aktivator katabolita (CAP) - također se naziva CRP. cAMP-CAP kompleks ima mnoga mjesta smještena u cijelom E coli genoma i mnoga od tih mjesta nalaze se u blizini promotora mnogih operona koji kontroliraju preradu raznih šećera.

U lac operona, mjesto vezanja cAMP-CAP nalazi se uzvodno od promotora. Vezivanje cAMP-CAP-a na DNA pomaže u regrutiranju i zadržavanju RNA polimeraze na promotoru. Povećana zauzetost RNA polimeraze njezinom promotoru, zauzvrat, rezultira povećanim transkripcijskim izlazom. U ovom slučaju CAP protein djeluje kao pozitivan regulator.

Imajte na umu da kompleks CAP-cAMP može, u drugim operonima, također djelovati kao negativni regulator ovisno o tome gdje se nalazi mjesto vezanja za CAP-cAMP kompleks u odnosu na mjesto vezanja RNA polimeraze.

Stavljajući sve zajedno: Induciranje ekspresije lac operona

Za lac da bi se operon aktivirao, moraju biti ispunjena dva uvjeta. Prvo, razina glukoze mora biti vrlo niska ili nikakva. Drugo, laktoza mora biti prisutna. Samo kada je glukoza odsutna, a laktoza prisutna lac operon se transkribirati.Kada se ovo stanje postigne, kompleks LacI-laktoza odvaja negativni regulator u blizini promotora, oslobađajući RNA polimerazu za transkripciju gena operona. Štoviše, visoke razine cAMP (indirektno ukazuju na nisku razinu glukoze) pokreću stvaranje CAP-cAMP kompleksa. Ovaj par induktora TF sada se veže u blizini promotora i djeluje tako da pozitivno regrutira RNA polimerazu. Ovaj dodatni pozitivan utjecaj povećava transkripcijski učinak i laktoza se može učinkovito iskoristiti. Mehanistički učinak drugih kombinacija binarnih stanja glukoze i laktoze opisan je u donjoj tablici i na slici koja slijedi.

Tablica istine za Lac Operon: Signali koji induciraju ili potiskuju transkripciju lac Operaona
CAP se veželaktozaRepresor vežeTranskripcija
+--+Ne
+-+-Neki, ne puno
-+-+Ne
-++-Da, puno

Transkripcija lac operona pažljivo je regulirana tako da se njegova ekspresija događa samo kada je glukoza ograničena i laktoza je prisutna da služi kao alternativni izvor goriva.
Atribucija: Marc T. Facciotti (vlastiti rad)


Regulacija ekspresije snRNA gena transkribiranih humanom RNA polimerazom II

Osim gena koji kodiraju proteine, RNA polimeraza II (pol II) transkribira brojne gene za nekodirajuće RNA, uključujući gene male jezgre (sn)RNA. snRNA su važna klasa nekodirajućih RNA, od kojih je nekoliko uključeno u pre-mRNA spajanje. Molekularni mehanizmi na kojima se temelji ekspresija gena snRNA transkribiranih s pol II kod ljudi manje su dobro okarakterizirani nego kod gena koji kodiraju proteine ​​i postoje važne razlike u ekspresiji ova dva tipa gena. Ovdje pregledavamo značajke DNK i proteine ​​potrebne za učinkovitu transkripciju gena snRNA i ko-transkripcijsku formaciju 3′ kraja transkripata.

1. Uvod

RNA polimeraza II (pol II) odgovorna je za transkripciju svih 25 000 ili više gena koji kodiraju proteine ​​u ljudskom genomu. Mnoge nekodirajuće RNA, uključujući ribosomalnu (r)RNA, prijenosnu (t)RNA, 7SK RNA koja regulira produljenje transkripcije pomoću pol II, i spliceosomalne U6 i U6atac male nuklearne (sn)RNA transkribiraju se pol I ili pol III [1–4]. Međutim, nekodirajuće mikroRNA, male nukleolarne (sno)RNA i preostale snRNA transkribiraju se pol II [2,5,6]. SnRNA su kratke RNA (manje od 350 nt) koje se povezuju s proteinima kako bi tvorile male nuklearne ribonukleoproteinske čestice (snRNP) [6].

Zbog svoje uloge u pre-mRNA spajanju, pol II-transkribirane U1, U2, U4, U4atac, U5, U11 i U12 snRNA potrebne su za ekspresiju gena koji kodiraju proteine ​​koji sadrže intron. Glavni spliceosom uključuje U1, U2, U4, U5 i U6 snRNP i prepoznaje kanonska mjesta spajanja GT/AG koja okružuju introne kako bi se postupno sastavili s pre-mRNA. Neki introni su umjesto toga okruženi mjestima spajanja AT/AC, koja regrutiraju manji spliceosom koji umjesto toga sadrži U11, U12, U4atac, U5 i U6atac snRNP [7]. U7 snRNA je potrebna za formiranje 3′ kraja histonske mRNA aktivirane replikacijom [8], a U3 sn(o)RNA je potrebna za obradu rRNA [9].

2. Elementi sekvencije DNA uključeni u ekspresiju gena snRNA transkribiranih pol II

Iako su funkcije snRNA dobro shvaćene, regulacija njihove ekspresije još uvijek nije u potpunosti okarakterizirana. Ljudski snRNA geni imaju mnogo jednostavniju strukturu promotora od većine gena koji kodiraju proteine, a to se sastoji od distalnog elementa sekvence (DSE) koji djeluje kao pojačivač i esencijalnog proksimalnog elementa sekvence specifičnog za gen snRNA (PSE) koji je promotor jezgre [2 ,10,11] (slika 1). Transkripti su bez introna i nepoliadenilirani, a 3′ kutija usmjerava formiranje 3′ kraja pre-snRNA, koja se dalje obrađuje kako bi se proizvela zrela snRNA [10].

Slika 1. Ekspresija ljudskih snRNA gena. Element distalne sekvence (DSE) i proksimalni element sekvence (PSE) su elementi pojačivača i promotora. 3′ kutija je element za obradu RNA za snRNA gen. Strelica predstavlja početno mjesto transkripcije, a brojevi ispod crte označavaju približan položaj elemenata u odnosu na početno mjesto transkripcije. DSE se sastoji od Oct1 veznog mjesta ATTTGCAT [12], tri mjesta vezanja Sp1 (G/T)(G/A)GGCG(G/T)(G/A)(G/A)(G/T) [13] i STAF vezno mjesto YY(A/T)CCC(A/G)N(A/C)AT(G/C)C(A/C)YYRCR [14]. Konsenzusni slijed PSE sekvence je TCACCNTNA(G/C)NNNAA(A/T)(G/A)N [2]. Konsenzusni slijed 3′ okvira je GTTYN0-3AARRYAGA [15]. Transkript snRNA je predstavljen zelenom bojom s poklopcem na 5′ kraju. Pre-snRNA se izvozi u citoplazmu radi sazrijevanja odrezivanjem 3′ kraja, trimetilacijom kape i spajanjem s snRNP proteinima [6]. Zabilježene su funkcije različitih snRNP-a nakon ponovnog uvoza u jezgru.

Kod kralježnjaka geni za glavne snRNA (U1, U2, U4 i U5) dobro su očuvani s prepoznatljivim sekvencama DSE, PSE i 3′ box [2], i Drosophila snRNA geni također imaju sekvence slične PSE [16]. SnRNA geni kralježnjaka često su prisutni u više kopija. Na primjer, postoje četiri kopije U1 snRNA gena/ljudskog haploidnog genoma) [17] i 15 kopija U2 snRNA gena/ljudskog haploidnog genoma) [18]. Nasuprot tome, geni za manje snRNA (U11, U12 i U4atac) obično su geni u jednoj kopiji i nedostaju kod mnogih beskralježnjaka uključujući Cnidaria i Annelida [19].

Važna značajka snRNA gena je obavezno spajanje između 3′ box elementa za obradu RNA i promotora snRNA genskog tipa, zamjena promotora snRNA gena promotorom gena koji kodira protein rezultira neuspjehom formiranja kraja RNA 3′ [ 15,20].

Pol III-transkribirani geni za 7SK snRNA i U6 snRNA također imaju DSE i PSE, ali osim toga imaju TATA kutiju na -25 [2]. Postavljanje TATA kutije nizvodno od PSE u gen snRNA transkribiran s pol II pretvara transkripciju iz pol II u pol III [2], naglašavajući da DSE i PSE mogu raditi kao cis-djelujući elementi za bilo koju polimerazu.

Ovdje razmatramo ono što je trenutno poznato o ekspresiji ljudskih snRNA gena transkribiranih pol II i buduće izglede za potpuno razumijevanje uključenih mehanizama.

3. Transkripcijski čimbenici povezani s snRNA genima

Transkripcijski čimbenici Oct1, Sp1, NF1 i Staf vežu se na sekvence u DSE-u, koji ima svojstva pojačivača transkripcije [2,21]. Oct1 pojačava ekspresiju gena snRNA stabilizirajući vezanje PSE-vezujućeg proteina/PSE-vezujućeg transkripcionog faktora/snRNA aktivirajućeg proteinskog kompleksa, PTF-a (također poznatog kao PBP i SNAPc) [12,22,23], na PSE oba pol II - i pol II-transkribirani snRNA geni kroz izravnu interakciju [12,24,25]. Zauzvrat, PTF pomaže u regrutiranju TATA-vezujućeg proteina (TBP) i faktora povezanih s TBP-om (TAFs) koji čine snRNA TAF kompleks (snTAFc) za pol II-transkribirane snRNA gene [22,26,27]. snTAFc na U2 snRNA genu, koji se sastoji od TAF5, TAF6, TAF8, TAF9, TAF11 i TAF13 [27], podskup je TAF-ova pronađenih u TFIID-u, kompleksu koji sadrži TBP/TAF potrebnom za transkripciju mnogih proteina koji kodiraju geni [28]. Međutim, čini se da geni U1, U4, U5 i U11 snRNA imaju drugačiji TAF kompleks, koji uključuje TAF7 [29]. TAF7 može pomoći u regrutiranju velikog multipodjediničnog medijatorskog kompleksa, koji je potreban za učinkovitu transkripciju snRNA gena [29]. TAF7 je također bio uključen u regulaciju bijega promotora (vidi dolje). Međutim, čini se da TAF7 nema u genima U2 snRNA [27], što sugerira da ovi geni koriste drugačiji mehanizam regrutiranja medijatora i bijega promotora. Opći faktori transkripcije gena koji kodiraju proteine ​​TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF i TFIIH također su potrebni za transkripciju gena snRNA [30,31]. Slika 2 pokazuje koji su čimbenici zajednički između gena snRNA i gena koji kodiraju proteine ​​i koji su specifični za svaku klasu gena. Kao što je gore navedeno, DSE i PSE su zamjenjivi između gena snRNA transkribiranih pol II i pol III [2]. Međutim, u prisutnosti TATA kutije u promotoru, regrutira se pol III- i snRNA gen-specifičan TBP-sadrži kompleks [2].

Slika 2. Čimbenici koji reguliraju ekspresiju snRNA i gena koji kodiraju proteine. Plavom bojom su čimbenici koji imaju ulogu u istom događaju transkripcije u obje klase gena. U ružičastoj i žutoj su čimbenici jedinstveni za gene koji kodiraju proteine ​​i gene snRNA. Čimbenici koji reguliraju oba gena, ali u različitim koracima prikazani su ljubičastom bojom [22,24,26–55].

Postoje dokazi da nukleosom između DSE i PSE u genima U1, U2, 7SK i U6 snRNA spaja te dvije regije, olakšavajući interakciju između Oct1 i PTF-a [56-59]. Osim toga, PTF igra ulogu u iscrpljivanju histona iz transkripcijske jedinice gena U2 [32]. Dakle, struktura kromatina igra ulogu u regulaciji ekspresije ljudskih snRNA gena. Ekspresija gena U6 snRNA transkribirane s pol III regulirana je interakcijom proteina uključenog u modifikaciju kromatina, proteina koji veže kromodomanu-helikazu-DNA 8 (CHD8), sa Staf-om [60]. Kako se pokazalo da CHD8 djeluje i s produžujućim oblikom pol II [60], on također može regulirati transkripciju gena snRNA transkribiranih pol II.

4. Fosforilacija pol II karboksilne terminalne domene i ekspresija gena snRNA

Najveća podjedinica pol II sisavaca ima karboksilnu terminalnu domenu (CTD) koja se sastoji od 52 ponavljanja konsenzusnog heptapeptida Y1S2P3T4S5P6S7. Tijekom transkripcije, fosforilacija CTD-a pomaže u regrutiranju faktora transkripcije i obrade RNA u pravoj točki transkripcijskog ciklusa [61].

Ser7 se fosforilira tijekom transkripcije svih ljudskih gena. Međutim, čini se da je njegova fosforilacija ključna samo za ekspresiju gena snRNA [33]. Ser5 i Ser7 su fosforilirani od strane ciklin-ovisne kinaze 7 (CDK7) podjedinice TFIIH ubrzo nakon pokretanja transkripcije [34], a fosfo-Ser7 (Ser7P) posreduje u regrutaciji fosfo-Ser5 (Ser5P) RP fosfataze [62]. RPAP2 ne samo da defosforilira Ser5P ubrzo nakon iniciranja transkripcije, već također pomaže u regrutiranju podjedinica Int1, Int4, Int5, Int6 i Int7 velikog kompleksa integratora s više podjedinica [62]. Kompletan kompleks Integratora sastoji se od 14 podjedinica i odgovoran je za prepoznavanje 3′ kutije i cijepanje RNA koja proizvodi pre-snRNA [35]. Međutim, katalitička podjedinica Int11 je odsutna kada je Integrator povezan s RPAP2 [62], a Int9 će također vjerojatno biti odsutan jer snažno djeluje s Int11 [63]. Podjedinica CDK9 kinaze faktora elongacije pozitivne transkripcije b (P-TEFb), koji je uključen u ekspresiju gena koji kodiraju proteine ​​i gena snRNA, fosforilira Ser2 (Ser2P) pol II CTD [61] i Ser7 i fosforilacija Ser2 zajedno regrutiraju nedostajuće podjedinice Int9/11 da aktiviraju prepoznavanje 3′ kutije i obradu kraja RNA 3′ [64]. Sukladno tome, inhibitori CDK9 imaju drastičan učinak na 3′-krajnu obradu transkripata gena snRNA [36]. Ovaj slijed događaja prikazan je na slici 3.

Slika 3. Događaji fosforilacije Pol II CTD u transkripciji gena snRNA. U početku, ciklin-ovisna kinaza (CDK)7 podjedinica TFIIH fosforilira Ser5 i Ser7. RPAP2 je u interakciji sa Ser7P. RPAP2 zauzvrat regrutira podjedinice Integratora Int1, Int4, Int5, Int6 i Int7. RPAP2 defosforilira Ser5P, a faktor elongacije pozitivne transkripcije b (P-TEFb) se regrutira mehanizmom koji je još uvijek nepoznat. P-TEFb podjedinica CDK9 fosforilira Ser2. Dvostruka fosforilacija na Ser2 i Ser7 regrutira Int9/11, što omogućuje procesiranje RNA [62].

Ser2 se također može fosforilirati pomoću CDK12 [65,66], a srušenje CDK12 utječe na ekspresiju gena snRNA [67]. Fosforilacija faktora koji inducira osjetljivost na DRB (DSIF) i faktora negativne elongacije (NELF) pomoću P-TEFb također je potrebna za produktivno produljenje gena koji kodiraju protein [37,38,68]. Međutim, inhibitori CDK9 imaju mali učinak na transkripciju U1 i U2 gena [39].

Nakon pokretanja transkripcije gena koji kodiraju proteine, mehanizam za zatvaranje se regrutira na 5′ kraj novonastalog transkripta i alosterički aktivira Ser5P [69]. Kako su transkripti gena snRNA također ko-transkripcijski ograničeni [70], vjerojatno je da Ser5P također osigurava zatvaranje pre-snRNA.

5. Uloga medijatora u ekspresiji snRNA gena

Povezanost velikog kompleksa medijatora od 26 podjedinica s genima koji kodiraju protein je dobro proučavana. Ovaj kompleks se regrutira u preinicijacijski kompleks (PIC) i može se vezati na nekoliko transkripcijskih čimbenika u isto vrijeme. Mediator ima važnu ulogu kao vezna platforma za interakciju između transkripcijskih čimbenika vezanih na sekvence u promotorima gena koji kodiraju protein i pol II [40].

Kompleks Medijator sastoji se od modula, pri čemu se glavni modul sastoji od podjedinica Med6, Med8, Med11, Med17, Med18, Med20 i Med22 [71]. Glavni modul je odgovoran za interakciju s pol II CTD kroz Med17 [72]. Med17 je podjedinica na 'nosu' modula glave dok se Med18 i Med20 nalaze na 'čeljusti'. Predviđa se da će mutacija na alfa spirali Med18 ojačati interakciju između čeljusti i ostatka modula. Stoga se smatra da je čeljust pokretni element koji regulira vezanje za pol II CTD [71]. Ova fleksibilnost također može imati ulogu u interakcijama između medijatora i pol II te također između medijatora i transkripcijskih čimbenika kao što su TFIIH [73] i TBP [74].

Povezanost podjedinica medijatora s genima snRNA opisana je tek nedavno. Med1, Med23 i Med26 povezani su s podskupom gena snRNA (U1, U4 i U5) i to na znatno višim razinama nego u promotorskoj regiji nekih gena koji kodiraju protein [29]. Međutim, ChIP eksperimenti nisu definirali regiju snRNA gena povezanih s Mediatorom. Med26 je neophodan za ekspresiju gena U1, U2, U4, U5 i U11 [29] i neophodan je za regrutiranje malog elongacijskog kompleksa (LEC) [29]. Zanimljivo je da Med26 također stupa u interakciju s TAF7, koji potiskuje inicijaciju i blokira zapošljavanje LEC-a. Osim toga, TAF7 ima sličnosti proteinske sekvence s EAF-om, koji je dio LEC-a. Sukladno tome, sugerirano je da bi EAF mogao uzeti Med26 iz TAF7 kako bi se olakšalo produljenje [29]. Med26 stoga može djelovati kao molekularni prekidač koji pokreće produljenje nakon bijega promotora, barem za snRNA gene gdje se TAF7 regrutira.

6. Mali elongacijski kompleks i elongacija transkripcije

Ekspresija gena regulirana je ne samo pri započinjanju transkripcije, već i tijekom elongacije. Pol II pauzira ubrzo nakon početka transkripcije gena koji kodiraju proteine ​​na kontrolnoj točki ranog produljenja (EEC) zbog negativnih faktora produljenja, NELF i DSIF. Fosforilacija pol II CTD, NELF i DSIF od strane CDK9 podjedinice P-TEFb oslobađa pol II iz EEC-a kako bi se omogućilo produktivno produljenje [68]. Kompleks nazvan super elongation complex (SEC) koji se sastoji od faktora elongacije ELL, AFF1, AFF4, AF9, ENL i P-TEFb uključen je u produktivno produljenje transkripcije gena koji kodiraju protein [41].

Umjesto SEC-a, drugi kompleks koji sadrži ELL specifično regulira produljenje transkripcije pol II-transkribiranih snRNA gena. Ovaj LEC uključuje ELL, ICE1, ECE2, EAF i ZC3H8 [42]. Predloženo je da se ICE1, ICE2, ELL i EAF regrutiraju u promotor pomoću kompleksa Mediator [29]. Pokazalo se da je ICE1 temelj za formiranje LEC-a i bitan je za zapošljavanje ostalih komponenti. ELL stupa u interakciju s ICE1 N-terminalnom domenom, dok ICE2 i ZC3H8 djeluju s ICE1 C-terminalnom domenom. Osim toga, ICE1 je potreban za zapošljavanje u pol II [42]. Knockdown ELL pomiče distribuciju pol II na snRNA genima prema 5′ kraju, kao što se i očekivalo od faktora koji olakšava produljenje transkripcije [75]. Sugerirano je da je ELL nužan kako bi se osigurala visoka razina transkripcije snRNA gena [75]. Funkcija podjedinica ICE2 i ZC3H8 trenutno je nepoznata.

Pokazalo se da se LEC ko-lokalizira s coilinom [42], koji se nalazi u Cajalovim tijelima, gdje se odvija sazrijevanje malih nuklearnih ribonukleoproteina (snRNP) [6]. ICE1 regrutira drugi protein, USPL1, u Cajal tijela. USPL1 također stupa u interakciju s U1 i U2 snRNP-ima i njegovo rušenje uzrokuje smanjenje razine snRNA [43]. Međutim, molekularni mehanizam koji leži u pozadini učinka USPL1 nokdauna je nejasan.

Nedavno je pokazano da 7SK snRNP, koji se sastoji od 7SK RNA, MePCE i Larp7, igra ulogu u regrutiranju LEC u snRNA gena. Obaranje 7SK RNP komponenti narušava integritet LEC-a, utječe na regrutiranje pol II i smanjuje ekspresiju gena snRNA [76]. Ovo je bio iznenađujući nalaz budući da je 7SK RNP negativan regulator kompleksa CTD Ser2 kinaze P-TEFb [68].

7. Integrator kompleks i snRNA geni

Kompleks Integrator otkriven je novije nego Mediator. Prisutan je samo u metazoa i veliki je kompleks od 14 podjedinica i potreban je za obradu 3′ kraja pre-snRNA transkribiranih pol II kod ljudi i muha [33,35,44].

Integrator je u stanju vezati pol II CTD fosforiliran i na Ser2 i Ser7 [64]. Međutim, još uvijek je nejasno koje su podjedinice uključene u prepoznavanje Ser2P i Ser7P. Int11 je paralog CPSF-73, koji je odgovoran za cijepanje RNA usmjereno poli(A) mjestima i signal za obradu RNA u replikacijom aktiviranim histonskim pre-mRNA [77]. Smanjenje Int11 uzrokuje nakupljanje pre-U1 i pre-U2 snRNA [32,35], što je u skladu s očekivanom katalitičkom ulogom ove podjedinice.

Do sada nije pronađeno da podjedinice Integratora izravno stupaju u interakciju s kromatinom. Međutim, podjedinica Int12 ima domenu PHD (biljna homeodomena), koja je čest motiv koji veže kromatin koji prepoznaje metilirane histone [78]. Podjedinice Int3 i Int6 također su dio drugog kompleksa uključenog u otkrivanje dvolančanih prekida DNK, koji se naziva senzor jednolančane DNA (SOSS) [79–83]. Budući da su snRNA geni visoko eksprimirani i da je barem gen U2 snRNA osiromašen kanonskim histonima [45], sugerirano je da bi ove podjedinice Integratora mogle pomoći u sprječavanju oštećenja DNK koje je olakšano konstitutivno otvorenim stanjem kromatina [84].

Int5 je povezan i s promotorskom regijom snRNA gena i s 3′ kutijom, dok je Int11 povezan uglavnom s 3′ kutijom [62]. Integrator stoga može biti modularni kompleks koji se sastavlja postupno, pri čemu neke podjedinice igraju ulogu rano u transkripciji, dok su druge aktivne u obradi kraja RNA 3′.

Pokazano je da Int4 u interakciji s NELF-A, a Int6 u interakciji sa Spt5 podjedinicom DSIF-a [46]. U ekspresiji snRNA gena, DSIF se predlaže da veže pol II prije produljenja transkripcije [46]. Integrator bi stoga mogao biti angažiran i pol II CTD fosforilacijom i povezivanjem s DSIF-om.Regrutiranje NELF-a kroz interakciju s RNA i Integratorom moglo bi pridonijeti specifičnom prepoznavanju 3′ kutije sprječavanjem regrutiranja faktora stimulacije cijepanja (CstF) poliadenilacijskog faktora [46]. Ti bi događaji tada omogućili Integratoru da pravilno obradi transkript snRNA u nastajanju [46].

Donedavno se smatralo da je Integrator snRNA-specifičan procesni kompleks, no sada se pokazalo da također regulira ekspresiju gena koji kodiraju protein [47-49]. Ekspresija neposrednih ranih gena (IEG) aktiviranih epidermalnim faktorom rasta (EGF) regulirana je pauzom prije produljenja i ta se pauza prevladava indukcijom EGF-a. Indukcija EGF-a regulira zapošljavanje Integratora, koji zauzvrat zapošljava SEC [47]. Integrator također igra ulogu u oslobađanju NELF-posredovane pauze tijekom transkripcije ljudskih gena i HIV genoma [48,49]. Zanimljivo je da ljudski geni na koje cilja Integrator posjeduju sekvence nalik na 3′ kutije blizu kraja gena i pokazuju smanjenje razine transkripta nakon obaranja Int11, što sugerira da je Int11 također uključen u proizvodnju mRNA [48]. Stoga se čini da integrator igra glavnu ulogu u ekspresiji gena koji kodiraju proteine.

8. 3′ kutija i završetak transkripcije snRNA gena

3′ kutija je signal za obradu transkripata snRNA u nastajanju i pol II nastavlja s transkripcijom za nekoliko stotina parova baza nakon 3′ kutije prije nego što se transkripcija završi [39]. Kao što je već spomenuto, Integrator veže DSIF, NELF i pol II, prepoznaje 3′ box signal na RNA i obrađuje transkript u nastajanju. Formiranje kraja pre-snRNA 3′ i završetak transkripcije pol II na genima snRNA intrinzično su povezani, kao što je pokazala nedavna studija u kojoj je rušenje katalitičkih podjedinica Int9 i Int11 uzrokovalo defekte terminacije [32]. NELF je također uključen u prekid. Akumulira se nizvodno od 3′ kutije gena U2 snRNA i njegovo rušenje također uzrokuje defekt terminacije [45]. CTCF vezno mjesto nalazi se blizu regije NELF asocijacije i omeđuje područje osiromašeno nukleosomima koje obuhvaća transkripcijsku jedinicu [45]. CTCF je najpoznatiji kao transkripcijski faktor za gene koji kodiraju proteine ​​kroz svoje djelovanje kao izolator i organizator strukture kromatina [85]. Pokazalo se da CTCF pozicionira nukleosome i ometa produljenje pol II [50,86]. Djelujući na ovaj način, CTCF bi mogao kontrolirati strukturu kromatina i izazvati završetak transkripcije. U2 snRNA geni stoga mogu imati 'kasnu' kontrolnu točku produljenja gdje nukleosomi smješteni u CTCF usporavaju pol II, dopuštajući NELF-u da prekine transkripciju [45].

U skladu s ovim nalazima, novija studija implicira CTCF u regrutaciju DSIF, NELF i P-TEFb za gen U2 snRNA [51]. Nalazi sugeriraju model koji povezuje terminaciju transkripcije s prepoznavanjem 3′ kutije. U ovom modelu, NELF je neophodan za završetak transkripcije, budući da njegovo rušenje rezultira defektima završetka bez utjecaja na regrutiranje CTCF-a ili formiranje kraja RNA 3′. Dodatno, P-TEFb fosforilira pol II CTD na Ser2, što dovodi do regrutiranja podjedinica Integratora 9/11, koje mogu izazvati obradu RNA koju pokreće 3′ okvir [51]. Ovaj model bi objasnio kako su završetak transkripcije i obrada RNA čvrsto povezani tijekom ekspresije snRNA gena (slika 4).

Slika 4. Model za terminaciju transkripcije gena U2 snRNA. Transkript snRNA predstavljen je zelenom bojom s kapom na 5′ kraju, a nukleosomi su predstavljeni bačvama. Pol II nastavlja transkribirati nakon 3′ kutije, a Integrator obrađuje nastajuću RNA nakon prepoznavanja 3′ kutije. CTCF prepoznaje CTCF vezno mjesto nizvodno od 3′ kutije i kontrolira zauzetost nukleosoma. Negativni faktor elongacije (NELF) regrutira faktor koji inducira DRB-osjetljivost (DSIF) i CTCF na kraju jedinice transkripcije i uzrokuje terminaciju transkripcije [51].

Intrigantno je da se faktori obrade krajnjeg mRNA 3' Pcf11, Ssu72 i Cstf64 također povezuju s genima snRNA [32]. Međutim, pokazalo se da Pcf11 i Ssu72 utječu na završetak transkripcije snRNA gena, a ne na obradu 3′ kraja.

9. Spajanje inicijacije i formiranja kraja RNA 3′

3′ kutija se prepoznaje samo ako je transkripcija pokrenuta iz promotora gena snRNA ovisnog o pol II [15,20]. Ako je PSE zamijenjen promotorom gena koji kodira protein, transkripti postaju dulji kako se 3' box signal ignorira i pol II transkribira dok se ne postigne funkcionalno mjesto poliadenilacije [87]. Mehanizam koji leži u osnovi spajanja inicijacije transkripcije i formiranja kraja RNA 3′ još uvijek nije shvaćen, ali može uključivati ​​snRNA gen-specifični promotorski faktor PTF ili komponente LEC-a specifične za snRNA gene. Alternativno, prepoznavanje 3′ okvira može se dogoditi samo u nedostatku SEC novačenja.

10. pseudogeni snRNA i geni varijanti snRNA

S izuzetkom teleosta i ptica, svi do sada proučavani metazoani imaju pseudogene izvedene iz gena snRNA, a sisavci posjeduju veliki broj [19]. Pokazalo se da su neke sekvence u ljudskom genomu za koje se prije smatralo da su U1 snRNA pseudogeni pravi geni koji imaju prepoznatljive DSE, PSE i 3′ box sekvence i aktivno se transkribiraju [17]. Ovi geni su nazvani varijantnim (v)U1 geni [17,88]. Slijedovi DSE, PSE i 3′ box gena vU1 snRNA su, međutim, dovoljno različiti od sekvenci gena U1 snRNA da sugeriraju da su različito regulirane. Zanimljivo je da su vU1 snRNA najizraženije u embrionalnim matičnim stanicama [17]. U1b je mišja U1 varijanta gena izražena samo u ranim embrionalnim stadijima, iako se U1 i U1b snRNA razlikuju za samo sedam promjena baza [89,90]. Međutim, promotor U1b značajno se razlikuje od promotora U1 [90]. Iako je funkcija U1b još uvijek nejasna, postoje jasne paralele između mišje U1b i ljudske vU1 snRNA.

U5 snRNA varijante kod ljudi i Drosophila su također opisani [91,92]. Varijante tvore različite funkcionalne komplekse snRNP od kanonskog U5 snRNP i smatra se da igraju ulogu u spajanju [91]. Zanimljivo je da su varijante U5 različito izražene tijekom razvoja i mogu promicati tkivno specifično spajanje [92].

11. Zaključak

Uloga općih transkripcijskih čimbenika, CTD fosforilacije i kompleksa Integrator u ekspresiji snRNA gena dobro je okarakterizirana u posljednja dva desetljeća. Nedavno razjašnjenje uloga DSIF, CTCF i NELF u ekspresiji gena snRNA sugerira kako je obrada 3′ kraja snRNA transkripata povezana s terminacijom transkripcije. Također, pokazalo se da su faktori obrade krajnjeg mRNA 3′ kao što su Pcf11 i Ssu72 uključeni u završetak transkripcije snRNA gena. Sada možemo shvatiti da postoji mnogo faktora transkripcije koje dijele geni koji kodiraju proteine ​​i geni snRNA, iako neki igraju različite uloge u ekspresiji dvaju tipova gena (slika 2).

Unatoč svim ovim novim informacijama, još uvijek postoje neki važni aspekti ekspresije pol II-transkribiranih snRNA gena koji tek treba razjasniti. Na primjer, kako je inicijacija transkripcije ovih gena tako čvrsto povezana s formiranjem 3′ kraja transkripata? Zašto bi ekspresija gena U2 snRNA bila regulirana drugačijim mehanizmima od gena U1, U4 i U5 snRNA? Zašto snRNA geni zahtijevaju specifični elongacijski kompleks koji se regrutira nekodirajućom RNA? Razlikuje li se kompleks Mediator na genima snRNA od onog na genima koji kodiraju proteine? I zašto protein transaktivator herpesvirusa VP16 aktivira samo transkripciju gena koji kodiraju protein, a ne i snRNA gena [93] kada se aktivacija dogodi interakcijom s TAF9 [94] i TFIIA [95]? Međutim, VP16 također stupa u interakciju s Med25 [96] i trenutno je nejasno je li to regrutirano za snRNA gene.

Nadamo se da će buduća istraživanja pružiti odgovore potrebne za potpuno razumijevanje regulacije ekspresije ove važne klase gena transkribiranih pol II.

Konkurentni interesi

Izjavljujemo da nemamo konkurentnih interesa.

Financiranje

J.G. podržana je od strane brazilske vlade stipendijom Science Without Borders CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) (201323/2015-0). S.M. je podržan od strane Wellcome Trust Senior Investigator Award (WT106134AIA).


Pozicije voditelja grupe

Europski institut za kemiju i biologiju, Institut Européen de Chimie et Biologie (IECB, www.iecb.u-bordeaux.fr) je inkubator istraživačkog tima pod zajedničkim nadzorom Sveučilišta Bordeaux, CNRS-a i INSERM-a. Koristi od učinkovitog znanstvenog okruženja kampusa Bordeauxa na jugozapadu Francuske. Razdoblje inkubacije tima obično je 10 godina, a timove bira međunarodni Znanstveni savjetodavni odbor. Institut trenutno ima 14 istraživačkih skupina koje razvijaju svoje istraživačke projekte na sučelju kemije i biologije. IECB traži solidne kandidate za pozicije voditelja grupe, s prioritetom za sljedeće profile:

Jedan ili dva STANIČNA BIOLOGA zainteresirani za molekularne temelje, na primjer, staničnog ciklusa, stanične smrti, regulacije proliferacije, regulacije ekspresije gena, raka, imunologije, mikrobiologije…

Jedan SINTETSKI ORGANSKI KEMIČAR zainteresirana za područja kao što su, na primjer, kemijska biologija, dizajn lijekova, materijali i kataliza inspirirani biološkim djelovanjem, supramolekularna kemija, imitacija proteina, sintetski oligonukleotidi…

Također su dobrodošli prijaviti se i kandidati drugih profila i kreativnih projekata na sučelju kemije i biologije. Prioritet će imati originalnost projekta i interes za razvoj interdisciplinarnih suradnji s drugim skupinama Instituta i drugim laboratorijima kampusa Bordeauxa. U području biologije stanica raka, kandidati zainteresirani za sarkom, rak bubrega ili dojke imali bi koristi od olakšanog pristupa kliničkim uzorcima.

Voditelji grupa imat će punu autonomiju u upravljanju svojom istraživačkom grupom. Imat će pristup IECB-ovim objektima u strukturnoj biologiji, strukturnoj kemiji i biofizici (NMR, MS, krio-EM, kristalografija, sinteza peptida i proizvodnja proteina, SPR,…). Od kandidata se prvenstveno očekuje da budu u ranoj fazi svoje istraživačke karijere (s 2-10 godina postdoktorskog iskustva), iako će se razmatrati i visokokvalitetne prijave za starije osobe. Od odabranih kandidata bit će zatraženo da se prijave za početno financiranje kao što je program ATIP -Avenir, FRM “amorçage”, podrška za ANR ili ERC, a bit će podržani i za osiguranje stalnog istraživačkog mjesta u Francuskoj ako ga već nemaju . Kandidati trebaju tečno govoriti engleski jezik. Poznavanje francuskog jezika nije obavezno.

Kandidati se pozivaju da dostave prije 1. srpnja 2021:

  • propratno pismo
  • proširena bioskica koja opisuje vašu pozadinu i do pet glavnih postignuća (maks. 5 stranica)
  • prijedlog istraživanja (maks. 5 stranica)
  • puni životopis
  • Imena i kontakti 2-4 suca


Uloga acetilacije histona i acetiltransferaza u regulaciji gena

Christina Y. Lee, Patrick A. Grant, u Toxicoepigenetics, 2019.

Zaključak i perspektive

Acetilacija i deacetilacija histona kritične su za različite stanične procese uključujući sastavljanje nukleosoma, savijanje kromatina, popravak oštećenja DNK i pravilnu transkripciju. Nadalje, regulacija acetilacije i deacetilacije histona igra središnju ulogu u etiologiji bolesti i štetnim učincima izlaganja kemikalijama. Mnoge od ovih patologija proizlaze iz pogrešne regulacije acetilacije histona od strane HAT-a, ali također treba napomenuti da HAT-ovi nisu ograničeni samo na histonske supstrate. Transkripcijski faktori su dodatni supstrati za HAT acetilaciju, kao što su Smads, p53 i NF-κB (Tu i Luo, 2007. Gu i Roeder, 1997. Pejanović i sur., 2012.). Acetilacija ovih transkripcijskih čimbenika diktira sposobnost vezanja DNA, nuklearnu lokalizaciju, stabilnost proteina i interakcije s drugim transkripcijskim regulatorima. Važnost acetilacije i deacetilacije histona u ovim različitim patologijama dovela je do usklađenog fokusa na HAT-ove, HDAC-ove i proteine ​​"čitača" koji sadrže bromodomenu kao mete za terapijsku intervenciju. Trenutno se inhibitori HDAC koriste za liječenje raka, upale i raznih neuroloških poremećaja (vidi pregled, Zwergel i sur., 2016. Adcock, 2007. Didonna i Opal, 2015.). Proteini bromodomene također su se pojavili kao mete lijekova koji se mogu inhibirati s visokom specifičnošću kod ljudskih poremećaja kao što su HIV-1 i ishemija miokarda (Zeng i sur., 2005. Mujtaba i sur., 2006. Gerona-Navarro i sur., 2011.). Ciljanje HAT-a bilo je teže, budući da su oni bisupstratni enzimi i teže ih je ciljati zbog veličine, slabe metaboličke stabilnosti i nedostatka stanične propusnosti inhibitora bisupstrata (Wapenaar i Dekker, 2016.). Inhibitori HAT-ova malih molekula također su uvelike pokazali slabu ciljnu selektivnost. Sveukupno, još se treba mnogo naučiti o tome kako acetilacija/deacetilacija histona modulira transkripciju gena, odgovor na okolišne agense i u konačnici bolest. Pažljiva karakterizacija enzima HAT i HDAC omogućit će kontinuirani razvoj moćnih i selektivnih modulatora acetilacije histona koji će pomoći u daljnjem unapređenju našeg razumijevanja mehanizama koji su u osnovi učinaka kemijske izloženosti i osjetljivosti te razvoju novih terapijskih intervencija.


2.10: Regulacija ekspresije gena - Biologija

Svi članci koje je objavio MDPI odmah su dostupni širom svijeta pod licencom otvorenog pristupa. Za ponovnu upotrebu cijelog ili dijela članka koji je objavio MDPI, uključujući slike i tablice, nije potrebno posebno dopuštenje. Za članke objavljene pod licencom Creative Common CC BY otvorenog pristupa, bilo koji dio članka može se ponovno koristiti bez dopuštenja pod uvjetom da je izvorni članak jasno citiran.

Feature Papers predstavljaju najnaprednije istraživanje sa značajnim potencijalom za veliki utjecaj na tom području. Kratki radovi podnose se na individualni poziv ili preporuku znanstvenih urednika i prolaze recenziranje prije objavljivanja.

Feature Paper može biti ili originalni istraživački članak, značajna nova istraživačka studija koja često uključuje nekoliko tehnika ili pristupa, ili sveobuhvatan pregledni rad sa sažetim i preciznim ažuriranjima o najnovijem napretku u području koji sustavno razmatra najuzbudljivija dostignuća u znanstvenoj književnost. Ova vrsta rada pruža pogled na buduće smjerove istraživanja ili moguće primjene.

Članci po izboru urednika temelje se na preporukama znanstvenih urednika MDPI časopisa iz cijelog svijeta. Urednici odabiru mali broj nedavno objavljenih članaka u časopisu za koje smatraju da će biti posebno zanimljivi autorima ili važni u ovom području. Cilj je dati snimku nekih od najuzbudljivijih radova objavljenih u različitim istraživačkim područjima časopisa.


Rasprava

Sustavno smo pregledali recenziranu literaturu o ulozi epigenetske modifikacije u etiologiji uobičajenih poremećaja raspoloženja i anksioznosti te samoubojstva. Dvadeset i jedan rad objavljen je između 2001., objave projekta ljudskog genoma i 2011. Većina (12) studija koje smo pronašli bavila se dokazima o epigenetskim promjenama u post-mortem mozgu osoba koje su izvršile samoubojstvo, dok su druge studije razmatrale epigenetski čimbenici u etiologiji depresije, PTSP-a i paničnog poremećaja. Mnoštvo usredotočenih na epigenetsku regulaciju gena uključenih u metabolizam amina, glukokortikoida i serotonina u proizvodnji uobičajenih poremećaja raspoloženja i anksioznosti te studije o samoubojstvima također su razmatrale epigenetsku modifikaciju raznolikog niza drugih gena.

S obzirom na mali broj studija, donošenje suštinskih zaključaka o tome kako epigenetske modifikacije specifičnih gena mogu djelovati na etiologiju dotičnih bolesti u ovoj fazi nije moguće. Naš pregled predstavlja sintezu metodoloških ograničenja postojeće literature i preporuka o tome kako bi istraživači mogli najbolje pristupiti ovom području u budućim studijama.

Pet metodoloških ograničenja ove literature proizlazi iz našeg pregleda. Prvi je da su studije u ovom području patile od malih uzoraka, čije posljedice uključuju nedostatak snage i povećanu stopu lažnih otkrića. Drugo, postojeće studije su ograničene na procjenu epigenetskih modifikacija u postmortalnom mozgu ili perifernoj krvi nakon dijagnoze bolesti, a izvlačenje zaključaka iz bilo kojeg tipa tkiva je problematično. Treće, studije su koristile različite tehnike za procjenu epigenetskih modifikacija koje mogu proizvesti heterogene rezultate. Četvrto, nekoliko studija je procijenilo ekološke prethodnike epigenetskih modifikacija u postojećim studijama. Peto, čini se da postoji mali konsenzus u pogledu pristupa koji obuhvaća cijeli genom naspram pristupa gena kandidata.

Prvo metodološko ograničenje ove literature je korištenje malih uzoraka u većini studija, što je sveprisutan problem u molekularnoj epidemiologiji [33]. Od studija koje smo pregledali, samo je jedna uključivala više od pedeset slučajeva (npr. subjekte s ishodom). Uključujući male veličine uzoraka u sveukupne studije, mnoge od studija koje smo pregledali ograničili smo epigenetsku analizu na podskup ukupne populacije istraživanja. Male veličine uzorka ograničavaju snagu studije, stoga povećavaju vjerojatnost pogreške tipa II (npr. udio lažno negativnih nalaza) [33]. Što je još opasnije, nedovoljno snažne studije također povećavaju “stopu lažnih otkrića” ili broj značajnih nalaza koji spadaju u pogrešku tipa I (npr. udio lažno pozitivnih nalaza), kao što je prikazano u jednadžbi 1 [34–36].

^ "prijašnja" označava udio testiranih hipoteza koje su zapravo točne.

U ovoj jednadžbi, stopa lažnog otkrivanja (FDR) obrnuto je proporcionalna snazi ​​(1-beta), tako da mala snaga također dovodi do visokog FDR-a, povećavajući pogrešku tipa I. Stoga, s obzirom na male veličine uzoraka korištenih u većini studija koje smo pregledali, vjerojatno je da rezultati pate od visokih udjela pogrešaka tipa I i tipa II.

Drugo ograničenje je uporaba postmortem mozga ili tkiva perifernih stanica za epigenetske analize. Sedam od 21 studije koje smo pregledali analiziralo je epigenetsku modifikaciju u stanicama periferne krvi, a jedna studija analizirala je epigenetsku modifikaciju u usnoj sluznici. Iako sve ljudske stanice nose punu obdarenost genetskog materijala, stanice modificiraju ekspresiju gena kako bi učinkovito obavljale svoje različite funkcije dok se specijaliziraju, utišavajući neke gene dok aktiviraju druge u skladu sa svojim fiziološkim odgovornostima. Epigenetska modifikacija je fiziološki proces kojim su geni utišani ili pripremljeni za ekspresiju [37, 38].Patofiziologija poremećaja raspoloženja i anksioznosti i samoubojstva lokalizirana je u mozgu i stoga ostaje nejasno kako ekspresija gena u perifernim tkivima korelira s fiziološki značajnom ekspresijom gena u mozgu. Međutim, čak i epigenetske studije koje koriste postmortem moždano tkivo imaju izazova. Tri od 21 studije koje smo pregledali analizirale su posmrtno moždano tkivo. Dok su ove studije procjenjivale epigenetske promjene u odgovarajućem organu, procjena postmortem moždanog tkiva nosi svoje izazove. To je problematično s obzirom na temporalnost između izlaganja i ishoda, jer se postmortem mozgovi, po definiciji, mogu sakupiti tek nakon smrti, pa se stoga epigenetska modifikacija može utvrditi tek nakon pojave ishoda. Štoviše, smrt često uključuje acidozu, što može pridonijeti nestabilnosti genetskog materijala [39-41], povećavajući vjerojatnost pogrešne klasifikacije epigenetskih modifikacija i povećavajući šanse za lažne nalaze. Stoga je potrebno mnogo više rada kako bismo razumjeli fiziološki značaj uzoraka metilacije perifernog tkiva i mozga.

Treće ograničenje literature je da su objavljene studije koristile različite laboratorijske tehnike za mjerenje stupnja epigenetske modifikacije. S obzirom na samo metilaciju DNA, postoji niz gensko-specifičnih testova koji se trenutno koriste, uključujući metode sekvenciranja DNA temeljene na bisulfitnoj reakciji, koje uključuju PCR genomsko sekvenciranje bisulfita [42] i/ili metilacijski specifični PCR [43] preglede za cijeli genom , kao što su mikromrežovi CpG otoka [44] i Restriction Landmark Genomic Scanning for Methylation (RLGS-M) tehnike [45] i metilirana DNA imunoprecipitacija (MeDIP) [46]. Postoji nekoliko studija koje su uspoređivale osjetljivost i specifičnost svake metode, iako je nedavna studija usporedila dva testa bazirana na bisulfitnoj sekvenci (koja su vrlo slična) i pronašla čak 18% razlike u identifikaciji metiliranih CpG otoci u biološkim replikama ljudskih embrionalnih matičnih stanica [47]. Prema našim saznanjima, ne postoje testovi "zlatnog standarda" za većinu epigenetskih markera. Stoga, različita uporaba testova može predstavljati izvor pogrešne pristranosti u studijama, što bi u konačnici povećalo stopu pogreške tipa II u postojećoj literaturi.

Četvrto, studije u našem pregledu uglavnom nisu uspjele procijeniti izloženost okoliša za koju se smatralo da će dovesti do epigenetskih promjena. Samo tri od 21 ovdje pregledane studije uključivale su bilo kakvu procjenu uobičajenog stresora okoliša s obzirom na epigenetske modifikacije i njihov odnos s uobičajenim poremećajima raspoloženja i anksioznosti te samoubojstvom [14, 19, 20]. Ovo je važno ograničenje, budući da postoji mnogo podataka koji pokazuju važnost okolišnih stresora u etiologiji ovih poremećaja [48]. Bez procjene uobičajenih okolišnih stresora koji prethode epigenetskim modifikacijama, naše studije ne uspijevaju adekvatno testirati dominantne hipoteze o posredničkoj ulozi epigenetskih promjena između okruženja i ishoda u uobičajenim poremećajima raspoloženja i anksioznosti i samoubojstvu.

Peto ograničenje je nedostatak konsenzusa u vezi s pristupima koji obuhvaćaju cijeli genom u odnosu na pristup gena kandidata u epigenetskim studijama. Tri studije koje smo pregledali koristile su pristupe koji obuhvaćaju cijeli genom [12, 30, 32], dok je preostalih 18 studija procjenjivalo epigenetske modifikacije gena kandidata. Oba pristupa imaju ograničenja. S obzirom na studije koje obuhvaćaju cijeli genom, analize (i nalazi) često su neusredotočene. Za razliku od studija povezanosti na razini genoma, ne postoji dogovorena metoda za analizu i sintezu podataka ili za prilagodbu višestrukim usporedbama u epigenetskim studijama na razini cijelog genoma. Konkretno, odgovarajuća prilagodba za više usporedbi može biti problematična, povećavajući udio lažno pozitivnih nalaza [49]. Pristupi gena kandidata imaju koristi od toga što su vođeni hipotezama i stoga su podložniji promišljenim, modelima utemeljenim dizajnom studija. Međutim, pristupi gena kandidata suočavaju se s vlastitim ograničenjima. Studije gena kandidata vjerojatnije će dati sveukupne negativne rezultate, budući da te studije testiraju samo jednu hipotezu, u usporedbi sa studijama na razini genoma koje testiraju više globalnih hipoteza o ulozi epigenetske modifikacije bilo gdje u genomu koji utječe na rizik za ishode od interesa. Budući da će pristupi gena kandidata vjerojatnije dati negativne ukupne nalaze, postoji velika vjerojatnost pristranosti objavljivanja, pri čemu će literatura o epigenetskoj modifikaciji gena kandidata vjerojatno biti jako obogaćena pozitivnim nalazima [35].

Ograničenja pregleda

Čitatelj bi trebao biti svjestan nekoliko ograničenja kada razmatra nalaze našeg sustavnog pregleda. Prvo smo ograničili naš pregled na objavljenu recenziranu literaturu. Stoga je vjerojatno da je naš odabir studija mogao biti podložan pristranosti objavljivanja, što je utjecalo na istinitost naših zaključaka. Drugo, organizirali smo studije po ishodu. Ova je organizacijska shema također mogla djelomično oblikovati zaključke izvučene ovdje. Međutim, budući da smo svoje zaključke uglavnom ograničili na metodološke kritike literature, malo je vjerojatno da bi bilo koje ograničenje imalo značajan utjecaj na naše tumačenje naših nalaza. Treće, naš pregled bio je ograničen samo na literaturu na engleskom jeziku objavljenu u časopisima indeksiranim u dvije baze podataka. Vjerojatno je da smo propustili literaturu o epigenetici u vezi s uobičajenim poremećajima raspoloženja i anksioznosti te samoubojstvima objavljenu na drugim jezicima ili u časopisima koji nisu indeksirani u MEDLINE-u ili PSYCHINFO. Međutim, to je manje vjerojatno, budući da detaljna pretraga citata uključenih studija nije dala daljnje studije za uključivanje u pregled.


Rasprava

Riječ opreza.

The u silikonu ovdje predstavljena mjerila temelje se na mrežama sa sličnim tipovima strukturnih svojstava i regulatorne dinamike kao što se događa u mrežama bioloških gena. Konkretno, mrežne strukture odgovaraju modulima poznatih genskih mreža, a kinetički model temelji se na termodinamičkom pristupu (24), za koji se pokazalo da pruža dobru aproksimaciju različitim tipovima regulacije transkripcije (30). Međutim, ovaj prikaz je pojednostavljeni model stvarnih bioloških mehanizama. Nadalje, dodatni slojevi kontrole, kao što su posttranskripcijska regulacija i stanja kromatina, nisu modelirani. Iako ovi u silikonu mjerila ni u kojem slučaju ne zamjenjuju potrebu za pažljivom karakterizacijom izvedbe in vivo (12), ona ostaju važan alat za sustavnu i učinkovitu provjeru učinkovitosti metoda zaključivanja u mnogim mrežama. Nadalje, vjerojatno je da će metode koje ne prolaze dobro u ovim mjerilima, možda biti još gore sa stvarnim biološkim mrežama, kao što je objašnjeno u SI Tekst.

Općenito pitanje mjerila, bilo tako u silikonu ili in vivo, je da je izmjerena izvedba metoda uvijek specifična za određene mreže koje su se koristile i ne mora se generalizirati na druge, nepoznate mreže, koje mogu imati različita svojstva. Doista, jedan od glavnih zaključaka ove studije je da je izvedba trenutnih metoda mrežnog zaključivanja jako ovisna o svojstvima mreže o kojoj se zaključuje. Na primjer, budući da je utvrđeno da metode imaju vrlo različite profile pogrešaka mrežnog motiva, njihova izvedba ovisi o tome koliko je instanci svake vrste motiva prisutno u mreži.

Stoga, ukupni učinak (score) metoda zaključivanja treba uzeti u obzir s oprezom, jer može varirati na mrežama s različitim svojstvima. Međutim, očekuje se da će sustavne pogreške identificirane analizom motiva mreže biti manje varijantne na različitim mrežama. Na primjer, očekivalo bi se da će metoda koja nije uspjela razlikovati izravnu od neizravne regulacije (kaskadna pogreška) imati slične poteškoće i na biološkim genskim mrežama.

Pouzdan zaključak o mreži gena iz podataka o ekspresiji gena ostaje neriješen problem.

Dvije glavne poteškoće u obrnutom inženjeringu mreže gena često se smatraju ograničenim podacima, koji mogu ostaviti problem zaključivanja nedovoljno određenim (10) i teškoćom razlikovanja izravne od neizravne regulacije (kaskadna pogreška) (26). Razvijen je niz pristupa kako bi se prevladale te poteškoće, na primjer, parcijalna korelacija (26) i druge metode (6, 27) su predložene za nailazak na potencijalne kaskadne pogreške. Međutim, ovdje prikazani rezultati eksperimenta zajednice skreću pozornost na dodatne poteškoće koje je potrebno prevladati za pouzdano zaključivanje genskih mreža.

Dali smo više i bolje podatke nego što je obično dostupno u stvarnim biološkim eksperimentima, ali ukupna izvedba 29 primijenjenih metoda mrežnog zaključivanja nije bila zadovoljavajuća. Metoda najbolje izvedbe (29) radila je izvanredno dobro, s obzirom na to da se temelji na možda najjednostavnijem modelu svih primijenjenih metoda zaključivanja (vidi SI Tekst). Međutim, nije mogla razlikovati izravnu od neizravne regulacije. Unatoč ovoj povećanoj stopi pogreške u kaskadnom motivu, imao je znatno bolju ukupnu izvedbu od ostalih najsuvremenijih metoda temeljenih na naprednijim, vjerojatnostim ili dinamičkim modelima. Iako su neke bile otpornije na kaskadnu pogrešku, na njih su snažno utjecale druge sustavne pogreške, posebice pogreška ventilatora. Očekujemo da će ove pogreške biti još izraženije u stvarnim biološkim aplikacijama, što sugerira da je izvedba metoda zaključivanja gena-mreža prije možda bila precijenjena zbog nedostatka rigoroznih, zaslijepljenih mjerila.

Zaključak.

Predstavili smo okvir za kritičku procjenu učinkovitosti metoda gensko-mrežnog zaključivanja. Ovaj okvir nam je omogućio usporedbu velikog broja metoda zaključivanja — koje neovisno primjenjuju različiti timovi — na višestrukim referentnim mrežama. Uz procjenu ukupne točnosti, ocjenjivali smo izvedbu metoda zaključivanja na pojedinačnim motivima mreže. Ova analiza je otkrila da na postojeće metode zaključivanja u različitim stupnjevima utječu tri vrste sustavnih pogrešaka predviđanja: pogreška fan-out (netočno predviđanje interakcija između koreguliranih gena), fan-in pogreška (netočno predviđanje kombinatorne regulacije), i kaskadna pogreška (nerazlikovanje izravne od neizravne regulacije). Razlikovanje između izravne i neizravne regulacije dobro je poznata poteškoća u zaključivanju mreže (6, 26, 27), ali nikada nije kvantitativno procijenjena. Analiza mrežnih motiva omogućuje kvantifikaciju koliko se ova poteškoća rješava različitim metodama. Nadalje, otkrivene su dvije druge vrste sustavnih pogrešaka, pogreška ventilatora i pogreška fan-out, koje su jednako važne za ukupnu kvalitetu predviđanja.

Jedna od poteškoća s kojima su se sudionici DREAM izazova morali suočiti bila je ta što nisu znali detalje kinetičkog modela koji je korišten za generiranje podataka o ekspresiji gena. Ova je poteškoća još izraženija u biološkim primjenama, gdje su mehanizmi i kinetika regulacije gena na kojima se temelji podaci o ekspresiji složeniji, a također nisu poznati unaprijed. Slijedom toga, metode zaključivanja moraju donositi pojednostavljujuće pretpostavke. Međutim, pokazalo se da netočne pretpostavke izazivaju sustavne pogreške predviđanja, što je duboko utjecalo na izvedbu primijenjenih metoda mrežnog zaključivanja (vidi također SI Tekst). Stoga postoji potreba za razvojem metoda zaključivanja koje imaju robusniji učinak unatoč neizvjesnosti o vrsti mehanizama ("model") koji su u osnovi podataka. Pokazali smo da je jedan od mogućih pristupa za postizanje ovog cilja kombiniranje predviđanja iz komplementarnih metoda zaključivanja kako bi se formirala robusnija i točnija „predviđanja zajednice“. Uvjereni smo da će bolje razumijevanje mogućnosti i ograničenja postojećih metoda zaključivanja omogućiti razvoj jedinstvenih pristupa koji će u konačnici ostvariti SAN o točnom, visokopropusnom zaključivanju genskih mreža.


Regulacija ekspresije gena srednjeg filamenta

Proteini srednjeg filamenta (IF) prisutni su u gotovo svakoj stanici i svakom tkivu viših organizama i njihova ekspresija je visoko regulirana tijekom različitih faza rasta, razvoja i diferencijacije stanice. Ovo poglavlje opisuje opću pozadinu i studije o regulaciji gena K5 i K14. Također predstavlja postupke za identifikaciju regulatora cis elemenata, ispitivanje aktivnosti regul cis elemenata, te identifikaciju i analizu faktora transkripcije koji se vežu za cis elementi. Obitelj IF gena pruža zanimljiv model sustava za proučavanje različitih procesa razvoja i diferencijacije u različitim tipovima stanica. U mnogim od ovih stanica, IF proteini pružaju ne samo mehaničku skelu, već su također uključeni u mnoge dinamičke stanične procese. Iako su identificirana mnoga regulatorna područja za IF gene, većina njih ostaje neistražena, stoga su stalne studije o regulaciji ekspresije IF gena važne i trebale bi dovesti do boljeg razumijevanja regulacije važnih svojstava stanice. ili tkiva kao što je stanična sudbina, oblik, razvoj i diferencijacija.


REZULTATI

Promjena ekspresije gena u makrofagima RAW 264.7 kao odgovor na CpG-DNA

Naše prethodne studije pokazuju da CpG-DNA može sinergirati s LPS-om kako bi potaknula proizvodnju TNF-α i NO iz RAW 264.6 makrofaga [16, 17], što sugerira da CpG-DNA i LPS koriste različite signalne putove za aktiviranje ekspresije gena. Za daljnju analizu globalnih posljedica CpG-DNA i LPS signalizacije, proveli smo studije za određivanje profila ekspresije gena u RAW 264.7 makrofagima kao odgovor na CpG-DNA ili LPS pomoću tehnologije oligonukleotidnih mikromreža. Za praćenje CpG-DNA induciranih promjena u profilima ekspresije gena u makrofagima RAW 264.7, biotinilirane cRNA sonde su pripremljene korištenjem ukupne RNA izolirane iz makrofaga RAW 264.7 tretirane 6 h samo s medijem za kulturu, medij koji sadrži 30 μg/ml ODN T3 koji sadrži CpG ili ODN C3 koji ne sadrži CpG. CRNA sonde su zatim hibridizirane s Mu11K mikronizovima mišjeg genoma koji sadrže više od 11.000 gena pune duljine i EST sekvence na dva pojedinačna čipa. Nakon hibridizacije, ispiranja i skeniranja nizova, fluorescentni podaci su prikupljeni i pretvoreni u frekvencije gena (razine ekspresije) kako je opisano u Materijalima i metodama. Detektirani transkripti, nazvani "prisutni", prikazani su u dvodimenzionalnim dijagramima raspršenja s tipičnim usporedbama u dvije datoteke liječenih i kontrolnih uzoraka. Kao što je prikazano u Slika 1A, kontrolna ekspresija ne-CpG-ODN C3 gore regulirana (plavi kvadrati) ili niže regulirana (crveni kvadrati) samo vrlo malog broja [26] gena, a većina vrsta mRNA je "prisutna" (5184 gena u trostrukim uzorcima) ostaje nepromijenjena (zeleni kvadrati). Nakon statističke analize, nijedan geni nije ispunio više od dvostruke kriterije dvojne selekcije, i P < 0,05 (Tablica 1). Nasuprot tome, ODN T3 koji sadrži CpG (slika 1B) značajno je modificirao ekspresiju relativno većeg broja gena. Od prosječnih 5112 gena "prisutnih" u trostrukim uzorcima, 107 gena je identificirano kao inducirano više od dva puta, a nakon uređivanja, ukupno 106 gena ispunilo je više od dvostruke kriterije dvojne selekcije, i P < 0,05 (Tablica 1). Među njima, 79 gena je bilo regulirano naviše. To uključuje 69 poznatih gena (Tablica 2, označena ružičastom bojom) koji kodiraju citokine, kemokine, receptore na površini stanice, faktore transkripcije, intracelularne signalne proteine, proteine ​​povezane s proliferacijom/diferencijacijom stanica, enzime i druge, kao i 10 EST-ova čiji sekvence pune duljine nisu se mogle identificirati BLAST analizom (podaci nisu prikazani). Osim gena kojima je CpG-DNA naviše regulirala, tri gena (Tablica 3, označena ružičastom bojom) i jedan EST (nije prikazan) identificirani su kao niže regulirani CpG-DNA više od dva puta. Ovi podaci pružaju globalni pregled promjena u obrascima ekspresije gena nizvodno od signalnog puta CpG-DNA (TLR9). Naši podaci također po prvi put identificiraju niz novih gena koji su značajno potisnuti u makrofagima nakon stimulacije s CpG-DNA.

Ekspresija gena u makrofagima koji nisu CpG-DNA, CpG-DNA i LPS. Učestalosti gena (razine ekspresije gena, ppm) u makrofagima RAW 264.7 tretiranim s ne-CpG-DNA (A), CpG-DNA (B) i LPS (C) ucrtane su u odnosu na frekvencije gena u makrofagima tretiranim kulturom sam medij. Svaki kvadrat predstavlja poseban gen. Omjer od y-vrijednost osi na x-vrijednost osi svakog kvadrata jednaka je indukciji nabora određenog gena. Kvadrati (zeleni) koji padaju na dijagonale su geni koji nisu bili ni gore ni dolje regulirani. Plavi kvadrati predstavljaju gene koji su značajno regulirani naviše, crveni kvadrati predstavljaju gene koji su značajno smanjeni, a žuti kvadrati predstavljaju gene koji su samo marginalno potisnuti prema dualnom standardu, više od dva puta, i P < 0,05. Stoga ovi geni nisu uključeni za analizu podataka u ovom izvješću.

Ne-CpG 1 CpG-DNA 1 LPS 1
Dvostruko 26 279 749
P < 0,05 2 72 377 1277
Dvostruko + P < 0,05 0 107 511
Uređeno 3 0 83 263
  • 1 Izraz u odnosu na kontrole medija.
  • 2 Studentov t-test, dvostrani s nejednakom kovarijansom.
  • 3 Nakon uklanjanja gena koji su identificirani kao "odsutni" ili imenovani više puta na nizovima.

Promjena ekspresije gena u makrofagima RAW 264.7 kao odgovor na LPS

Mnogi istraživači smatraju LPS iz gram-negativnih bakterija prototipom sredstva za aktivaciju makrofaga. Za razliku od CpG-DNA, koja koristi TLR9 za signalizaciju, pokazalo se da je enterobakterijski LPS potpuno ovisan o TLR4. Stoga je bilo od interesa povezati ekspresiju gena makrofaga kao odgovor na CpG-DNA s onima induciranim LPS-om. Kako bi se pratile promjene u profilima ekspresije gena u makrofagima RAW 264.7 kao odgovor na LPS, makrofagi su tretirani samo medijem ili optimalnom stimulirajućom dozom od 100 ng/ml LPS tijekom 6 sati. Ukupna RNA je zatim izolirana za mikromrežne analize, uglavnom kao što je opisano za analizu gena induciranih CpG-DNA. Kao što je prikazano na slici 1C, LPS je regulirao gore (plavi kvadrati) i dolje regulirao (crveni kvadrati) veći broj gena od CpG-DNA. Od prosječnih 4947 gena otkrivenih kao "prisutno" u trostrukim uzorcima, ekspresija 511 gena promijenjena je više od dva puta s P < 0,05. Nakon uređivanja, identificirana su 263 gena koja su promijenjena više od dva puta kao odgovor na LPS (Tablica 1). Od njih je utvrđeno da su 192 gena (Tablica 2) značajno regulirana naviše, a 71 gen (Tablica 3) je značajno smanjena.Oni geni čija je ekspresija povećana uključuju 168 poznatih gena, a kao što se i očekivalo, oni kodiraju značajan broj citokina, kemokina, receptora na površini stanice, transkripcijskih faktora, intracelularnih signalnih proteina, proteina povezanih s proliferacijom/diferencijacijom stanica, enzima i tumora. srodni proteini (tablica 2). Osim toga, 24 gena bila su regulirana naviše, ali još nisu bili u mogućnosti biti identificirani BLAST analizom (podaci nisu prikazani). Od 71 gena potisnutog LPS-om, 52 su poznata gena, koji kodiraju prvenstveno proteine ​​i enzime povezane s proliferacijom/diferencijacijom stanica (Tablica 3), a preostalih 19 gena trenutno su neobilježene EST sekvence (nije prikazano). Ovi podaci ne samo da pružaju sveobuhvatan pregled profila ekspresije gena izazvanih LPS-om u RAW 264.7 makrofagima, već također identificiraju značajan broj gena koji su smanjeni LPS-om.

Usporedba profila ekspresije gena u makrofagima tretiranim CpG-DNA i LPS

Kako je prijavljeno da CpG-DNA i LPS koriste receptore na površini stanice urođenog imunološkog sustava (TLR9 ​​i TLR4) koji dijele visok stupanj homologije [24], zatim smo usporedili profile ekspresije gena u CpG-DNA - i LPS-tretirani RAW 264.7 makrofagi s očekivanjem da će ocrtati opseg u kojem CpG-DNA i LPS mogu koristiti slične ili različite signalne putove koji dovode do promjena u ekspresiji gena. Svi geni koji su modulirani više od dva puta u makrofagima tretiranim CpG-DNA i LPS navedeni su i usklađeni u tablicama 2 i 3. Kao što je prikazano u tablici 2, svi geni inducirani u RAW 264.7 makrofagima CpG-DNA također su bili induciran u sličnoj ili većoj mjeri LPS-om (označeno ružičastom bojom). Štoviše, svi geni potisnuti tretmanom CpG-DNA također su bili smanjeni u sličnom stupnju LPS tretmanom (Tablica 3, označena ružičastom bojom). Kako bismo dodatno ilustrirali ove nalaze, nasumično smo odabrali gene unutar funkcionalnih skupina "kemokini i citokini" i "imuni odgovor" (Tablica 2) i nacrtali prosječne razine ekspresije ovih gena u srednjem, ne-CpG-DNA-, CpG -DNA- i LPS-tretirani makrofagi u Slika 2Ai 2B. Svi geni inducirani CpG-DNA također su u sličnoj ili većoj mjeri inducirani LPS-om (vidi gene u lijevim dijelovima slike 2A i 2B). Ovi podaci pokazuju da u usporedbi s LPS-om, CpG-DNA ne inducira nikakav jedinstveni skup gena. CpG-DNA-inducibilni geni sadrže samo podskup LPS-stimuliranih gena, što sugerira da CpG-DNA signalizacija uključuje samo podskup signalnih puteva induciranih LPS-om.

Usporedba razina ekspresije gena u makrofagima tretiranim CpG-DNA i LPS. Razine ekspresije gena funkcionalnih skupina "kemokina i citokina" (A) i "imunog odgovora" (B) (tablica 2) u makrofagima tretiranim CpG-DNA prikazane su zajedno s razinama ekspresije tih istih gena u srednjem , makrofagi koji nisu tretirani CpG-DNA i LPS-om. Podaci predstavljaju prosječne razine ekspresije trostrukih uzoraka ± standardne devijacije iz jedne od dvije odvojene analize. CSF, faktor koji stimulira kolonije.

Promjene ekspresije gena specifične za LPS u RAW 264.7 makrofagima

Da bismo dalje potvrdili da LPS koristi različite signalne putove u usporedbi s CpG-DNA, identificirali smo one gene koji su inducirani ili potisnuti LPS-om, ali nisu značajno promijenjeni tretmanom CpG-DNA. Ovi geni su navedeni u tablicama 2 i 3 i označeni svijetlo zelenom bojom. Među 193 gena induciranih LPS-om, za 109 gena utvrđeno je da CpG-DNA nije značajno regulirano (Tablica 2, označena svijetlo zelenom bojom) od 71 gena potisnutog LPS-om, 67 gena nije značajno potisnuto CpG-DNA tretman (tablica 3, označena svijetlozelenom bojom). Stoga je značajan broj gena pokazao LPS-specifičnu regulaciju. Kako bismo dalje ilustrirali ove nalaze, nasumično smo odabrali gene unutar funkcionalnih skupina "kemokini i citokini" i "imuni odgovor" (tablica 2) i ucrtali razine ekspresije ovih gena u srednjoj, ne-CpG-DNA-, CpG-DNA -, i makrofagi tretirani LPS-om na slici 2, A i B. Iako su CpG-DNA i LPS inducirali ekspresiju nekih uobičajenih gena (vidi lijeve dijelove slike 2A i 2B), brojni geni pokazuju LPS-specifičnu indukciju [npr. , reguliran aktivacijom, normalan T eksprimiran i izlučen (RANTES), interleukin (IL)-1A, IFN-inducibilni protein 10 (IP-10), PBEF i IL-18 na slici 2A IFN-induciran tetratrikopeptidom (IFIT) 1, IFIT2, IFIT3 i mišji IFN-gama-inducirani (MG)11 na slici 2B]. Ovi rezultati dodatno jačaju hipotezu da LPS aktivira dodatne signalne putove koji nisu uključeni CpG-DNA (TLR9-posredovanom) signalizacijom.

Provjera rezultata mikromreža pomoću RT-PCR

Iako su naše prethodne studije pokazale da je analiza mikromreža oligonukleotida visoke gustoće moćna, osjetljiva i točna tehnika kojom se određuje ekspresija gena regulirana signalnim molekulama [33], proveli smo dodatne eksperimente kako bismo potvrdili ekspresiju nekih od otkrivenih gena korištenjem semikvantitativne RT-PCR. Utvrđeno je da su svi rezultati RT-PCR (podaci nisu prikazani) u skladu s rezultatima mikromreža. Podaci u Slika 3 pokazuju neke od ovih reprezentativnih RT-PCR rezultata. Geni identificirani kao gore ili niže regulirani CpG-DNA i LPS u studijama mikromreža također su na sličan način regulirani u RT-PCR analizama (usp. gene na slici 3 s istim genima u tablicama 2 i 3).

Indukcija različitih gena pomoću CpG-DNA, ne-CpG-DNA i LPS-a. Makrofagi su stimulirani samo s podlogom kulture, medijem koji je sadržavao 30 μg/ml CpG- ili ne-CpG-DNA, ili 100 ng/ml LPS-a tijekom 6 sati prije izolacije RNA za RT-PCR analizu razina mRNA za različite gene kako je opisano u Materijalima i Metode. Podaci pokazuju da su 4 od 14 gena pojačana RT-PCR-om. mRNA gena β-aktina je pojačana i korištena kao interna kontrola.


Istraživačka stranica fakulteta

Moj laboratorij proučava kako funkcioniraju i evoluiraju genomske sekvence koje kontroliraju ekspresiju gena. Pokreće nas želja za razumijevanjem molekularne osnove raznolikosti organizama i uvjerenje da mnoge razlike u fiziologiji, morfologiji i ponašanju proizlaze iz promjena u regulaciji gena. Naš krajnji cilj je biti u stanju interpretirati regulatorne informacije kodirane u genomskoj DNK, tako da možemo rutinski identificirati regulatorne sekvence, uočiti njihovu funkciju, predvidjeti posljedice njihove perturbacije i rekonstruirati kako su evoluirali.

Mi smo hibridni računski i eksperimentalni laboratorij koji spaja računsku i eksperimentalnu analizu genske regulacije na razini genoma u Drosophila melanogaster i Saccharomyces cerevisiae uz opsežnu analizu usporednih podataka o slijedu i eksperimentalnu analizu vrsta usko povezanih s tim modelskim sustavima. Fokusiramo se na kratke evolucijske vremenske okvire u kojima je moguće spojiti specifične promjene u sekvencama genoma s promjenama u regulaciji i ekspresiji gena.

Trenutni projekti

Eksperimentalna karakterizacija regulacije gena u D. melanogaster embrija

Kako bismo pružili solidnu eksperimentalnu osnovu za naše evolucijske studije, radimo s nekoliko drugih laboratorija u Berkeleyju kako bismo sustavno analizirali ekspresiju i regulaciju gena u ranim fazama. D. melanogaster embrij. Za svaki od približno 40 transkripcijskih čimbenika kritičnih u oblikovanju prednje-stražnjih i dorzalno-ventralnih uzoraka, naši su ciljevi: 1) izmjeriti in vitro afinitet faktora prema svakoj od njegovih potencijalnih ciljnih sekvenci, 2) identificirati povezana genomska područja po svakom faktoru u živim embrijima, 3) odrediti obrazac ekspresije faktora i njegovih ciljeva u trodimenzionalnoj rezoluciji. Ja i članovi mog laboratorija aktivno smo uključeni u eksperimentalne dijelove projekta i provodimo analize tih podataka.

Modeliranje evolucijskih ograničenja na eukariotske regulatorne sekvence

Sada imamo opsežne usporedne podatke o sekvenciji za voćne mušice (12 genoma Drosophila) i kvasce (mnogi genomi gljivica) i koristimo te podatke za karakterizaciju pojedinačnih građevnih blokova regulatornih sekvenci (mjesta vezanja faktora transkripcije) i struktura višeg reda (npr. razvojne pojačivači) evoluirati. Posebno nas zanima razumijevanje kako odabir za održavanje mjesta vezanja faktora transkripcije utječe na evoluciju ciljnih sekvenci i kako je opsežna plastičnost koja se vidi u organizaciji razvojnih pojačivača povezana s njihovom funkcijom.

Karakterizacija i modeliranje varijacije transkripcijske mreže unutar i između vrsta Drosophila

Moj laboratorij primjenjuje metode fluorescentne slike visoke rezolucije razvijene za D. melanogaster sustavno analizirati ekspresiju gena i secirati regulatorne mreže, u drugom Drosophila vrsta i u nekoliko inbred linija D. melanogaster. Detaljni eksperimentalni podaci za koje generiramo D. melanogaster, a sekvence genoma 12 vrsta Drosophila ogroman su resurs za proučavanje evolucije regulacije gena. Međutim, teško je proučavati promjene u slijedu bez razumijevanja konteksta u kojem ti nizovi postoje i kako te promjene utječu na funkciju. Iako je nepraktično ponavljati svaki izveden eksperiment D. melanogaster u svakom drugom soju i vrsti, proširujemo nekoliko klasa pokusa na odabrane sojeve i vrste kako bismo bolje razumjeli regulatornu varijaciju na svakoj od njezinih više razina: kako varijacija sekvence utječe na vezanje, kako varijacija vezanja utječe na ekspresiju i kako varijacija ekspresije utječe na fenotip.

Korištenje evolucije regulatornog slijeda za razjašnjavanje mehanizama regulacije gena

Kako bismo iskoristili raznolikost sekvenci izvan roda Drosophila, sekvenciramo razvojno važne lokuse iz nekoliko obitelji ne-drozofilnih muha kako bismo pružili uvid u temeljne principe regulacije gena. Osobito smo zainteresirani za regulatorne sekvence koje su doživjele opsežne promjene u repertoarima svojih veznih mjesta bez promjene njihove funkcije. Iako se uočava opsežna preustroja među regulatornim sekvencama Drosophle, moraju postojati ograničenja za ovu plastičnost. S vremenom će regulatorne sekvence akumulirati samo one promjene u repertoarima svojih veznih mjesta koje su kompatibilne sa složenim biokemijskim događajima potrebnim za proizvodnju njihovog specifičnog regulatornog učinka. Stoga vjerujemo da će prikupljanje i karakterizacija regulatornih sekvenci sa sličnim funkcijama, ali različitim sekvencama u konačnici dovesti do boljeg razumijevanja biokemijskih principa koji povezuju sastav i organizaciju regulatornih sekvenci s njihovom funkcijom. Kako bismo izvršili takvu analizu, trenutno sekvenciramo 20 ciljanih lokusa od po 6 vrsta u obiteljima Sepsidae (zastavne muhe), Tephritidae (prave voćne mušice) i Diopsidae (muhe stabljike). Odabrali smo ove svojte, koje su se odvojile od Drosophile prije između 100 i 150 milijuna godina, kako bismo osigurali optimalnu ravnotežu između divergencije sekvence i funkcionalne divergencije. Analizu sekvence nadopunjujemo eksperimentalnom analizom razvoja odabranih vrsta iz svake svojte, ispitivanjem aktivnosti pojačivača ovih vrsta u D. melanogaster embrije, te opsežno testiranje hipoteza u vezi s funkcijom i evolucijom regulatornog slijeda.

Odabrane publikacije

[kopije svih radova dostupni su na rana.lbl.gov]

Pollard DA, Moses AM, Iyer VN i Eisen MB (2006). Široko rasprostranjena nesklad stabala gena sa stablom vrste u Drosophila: dokaz za nepotpuno sortiranje loze. PLoS genetika 2(10):e173.

Moses AM, Pollard DA, Nix DA, Iyer VN, Li XY, Biggin MD, Eisen MB (2006.). Veliki promet veznih mjesta funkcionalnih transkripcijskih faktora u Drosophila. PLoS računalna biologija 2(10):e130.

Pollard DA, Moses AM, Iyer VN i Eisen MB. Detekcija granica očuvanja regulatornih elemenata i procjena divergencije korištenjem višestrukih parova i višestrukih poravnanja. BMC Bioinformatički 7(1):376.

Chiang DY, Nix DA, Shultzaberger RK, Gasch AP, Eisen MB (2006). Zahtjevi fleksibilne arhitekture promotora za regrutiranje koaktivatora. BMC molekularna biologija 7(1):16.

Gasch AP, Moses AM, Chiang DY, Fraser HB, Berardini M i Eisen MB (2004). Očuvanje i evolucija cis-regulacijski sustavi u gljivama Ascomycete. PLoS biologija 2(12): e398.

Moses AM, Chiang DY, Pollard DA, Iyer VN i Eisen MB (2004). MAJMUN: identificiranje konzerviranih mjesta vezanja faktora transkripcije u višestrukim poravnanjima korištenjem evolucijskog modela specifičnog za mjesto vezanja. Biologija genoma 5(12): R98.

Berman BP, Pfeiffer BD, Laverty TR, Salzberg SL, Rubin GM, Eisen MB i Celniker SE (2004). Računalna identifikacija pojačivača razvoja: očuvanje i funkcija klastera mjesta vezanja faktora transkripcije u Drosophila melanogaster i Drosophila pseudoobscura. Biologija genoma 5(9): R61.

Moses AM, Chiang DY, Kellis M, Lander ES i Eisen MB (2003). Pozicionirajte specifične varijacije u brzini evolucije na mjestima vezanja faktora transkripcije BMC evolucijska biologija 3(19).

Berman BP, Nubu Y, Pfeiffer BD, Tomancak P, Celniker SE, Levine M, Rubin GM i Eisen MB (2002). Iskorištavanje grupiranja mjesta vezanja faktora transkripcije za identifikaciju cis-regulatorni moduli uključeni u formiranje uzoraka u Drosophila genom. Proc Natl Acad Sci SAD 99, 757-62.


Gledaj video: Regulacija ćelijskog ciklusa (Kolovoz 2022).