Informacija

12.2H: Fluorescentna antitijela - biologija

12.2H: Fluorescentna antitijela - biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Fluorescentna antitijela su antitijela koja su označena fluorescentnim spojem kako bi se olakšalo njihovo otkrivanje u laboratoriju.

ciljevi učenja

  • Opišite kako se konjugati fluorescentnih protutijela mogu koristiti u imunotestovima za detekciju proteina

Ključne točke

  • Fluorescentno obilježavanje antitijela koristi se umjesto radioizotopa i enzima kako bi se povećala osjetljivost i specifičnost imunoloških testova.
  • Fluorescentna antitijela mogu se koristiti za bojenje proteina iz pacijentovog seruma ili dijelova tkiva fiksiranih na stakalcu ili živih stanica u suspenziji.
  • Fluorescentna antitijela mogu se otkriti fluorescentnim mikroskopom ili razvrstavanjem protočnih ćelija.

Ključni uvjeti

  • radioizotop: Radioaktivni izotop elementa.

Fluorescentno obilježavanje je još jedna metoda dokazivanja složenosti antigena i antitijela. Fluorescentne molekule koriste se kao zamjena za oznake radioizotopa ili enzima. Tehnika fluorescentnog antitijela sastoji se od obilježavanja antitijela bojama kao što je fluorescein izotiocijanat (FITC). Ovi spojevi imaju visok afinitet za proteine ​​s kojima se konjugiraju.

Fluorescentne tehnike su vrlo specifične i osjetljive, tako da tehnike temeljene na fluorescentnim antitijelima zahtijevaju fluorescentni mikroskop. Fluorescentna tvar apsorbira svjetlost jedne valne duljine i emitira svjetlost duže valne duljine. Fluorescein fluorescira intenzivnu jabučno-zelenu boju kada je pobuđen pod fluorescentnom mikroskopijom. Kemijska manipulacija u označavanju antitijela fluorescentnim bojama kako bi se omogućilo otkrivanje izravnim mikroskopskim pregledom ne narušava aktivnost antitijela.

Nakon obilježavanja specifičnog protutijela fluorescentnom molekulom, ono se još uvijek može reagirati sa svojim antigenom i mikroskopski identificirati. Konjugati fluorescentnih antitijela obično se koriste u imunotestovima. Osnovne metode koje koriste fluorescentna antitijela uključuju izravni, inhibicijski i neizravni imunofluorescentni test.

U izravnoj tehnici, fluorescentno antitijelo se koristi za otkrivanje reakcija antigen-antitijelo na mikroskopskoj razini. Inhibicijski imunofluorescentni test je test blokiranja u kojem se antigen prvo izlaže neobilježenom antitijelu, zatim fluorescentnom antitijelu i na kraju se ispere i ispituje. Indirektni test imunofluorescencije temelji se na sposobnosti protutijela da reagiraju s antigenima, kao i da djeluju kao antigeni i reagiraju s anti-antitijelima (anti-imunoglobulinima). Ova tehnika se intenzivno koristi za detekciju autoantitijela i antitijela na tkivne i stanične antigene. Opisane metode uglavnom se izvode na staklenim predmetima s serumom pacijenta ili presjecima tkiva. Imunofluorescencija se također može provesti za identifikaciju specifičnih antigena na živim stanicama u suspenziji. Ova metoda je poznata kao protočna citometrija i zahtijeva razvrstavanje protočnih stanica, a ne fluorescentni mikroskop.


Savjeti za optimizaciju protokola imunofluorescencije da biste dobili najbolju sliku

Primjene za imunofluorescenciju (IF)—gdje je protutijelo konjugirano s molekulom koja fluorescira kada je pobuđena laserima— uključuje lokalizaciju proteina, potvrdu post-translacijske modifikacije ili aktivacije i blizinu/kompleksiranje s drugim proteinima. Imunocitokemija (ICC) je dobro uspostavljena tehnika koja koristi antitijela da se vežu na mete u uzorcima stanica, a Coons et al prvi je opisao imunodetekciju korištenjem fluorescentne reporterske molekule 1942. Uz pružanje informacija o supstaničnim ciljevima, kombiniranje imunofluorescencije s imunocitokemijom proizvodi neke od najuvjerljivijih vizualnih podataka u znanostima o životu. U ovom vodiču znanstvenici za antitijela dijele ono što smo naučili o dobivanju najbolje moguće slike iz vaših IF-ICC eksperimenata.

Slika 1. Imunocitokemija (ICC) locira proteine ​​povezane s neuronskim jezgrama, soma i aksona (lijevo). Desno, imunofluorescentno bojenje ljudske stanične linije U-251 MG.


Translokacije enzima tijekom aktivacije glatkih mišića

Raouf A. Khalil, Kathleen G. Morgan, u Biochemistry of Smooth Muscle Contraction, 1996.

1 Fluorescentna mikroskopija u živim stanicama

Fluorescentna mikroskopija omogućuje proučavanje substanične distribucije enzima u netaknutim stanicama. Relativno je malo sondi dostupno za izravno praćenje distribucije kinaza u živim stanicama. Jedan primjer je derivat fluorescentnog estera forbola Bodipy phorbol, koji je korišten za praćenje distribucije PKC u živim stanicama (Khalil i Morgan, 1991.). Ovaj spoj je membranski permeantan, ali ima nedostatak što zadržava aktivnost PKC agonista. Skupina spojeva koji pokazuju suprotan nedostatak, odnosno zadržavanje PKC antagonističke aktivnosti, postala je dostupna (Chen i Poenie, 1993.). Opisana je uporaba omjernog indikatora za praćenje distribucije i aktivnosti protein kinaze ovisne o cAMP u živim stanicama (Bacskai et al, 1993.), ali u ovom trenutku nije prijavljena njegova uporaba u glatkim mišićima. Drugi srodni pristup je uvođenje obilježenih antitijela u permeabilizirane fiziološki netaknute stanice (Iizuka et al, 1994.). Poteškoća ovog pristupa je problem da li se nespecifična vezna mjesta mogu "blokirati" u intaktnoj stanici.


INSTRUMENTACIJA

Tradicionalni protočni citometri

Tradicionalni protočni citometri sastoje se od tri sustava: fluidike, optike i elektronike. Fluidični sustav sastoji se od tekućine u omotaču (obično puferirane slane otopine) koja je pod tlakom za isporuku i fokusiranje uzorka do točke laserskog presretanja ili ispitivanja gdje se uzorak analizira. Optički sustav se sastoji od uzbudne optike (lasera) i optike za prikupljanje (fotomultiplikatorske cijevi ili PMT i fotodiode) koja generira vidljive i fluorescentne svjetlosne signale koji se koriste za analizu uzorka. Niz dikroičnih filtara usmjerava fluorescentno svjetlo na određene detektore, a propusni filtri određuju valne duljine svjetlosti koje se očitavaju tako da se svaki pojedini fluorokrom može detektirati i izmjeriti. Točnije, dikroični filtri su filtri koji prolaze svjetlost kraće ili duže valne duljine i reflektiraju preostalo svjetlo pod kutom. Na primjer, 450 Dichroic Long Pass filter (DLP) propušta svjetlost valne duljine veće od 450 nm kroz filter i odbija kraće valne duljine svjetlosti pod kutom kako bi se poslala drugom detektoru. Pojasni filteri detektiraju mali prozor određene valne duljine svjetlosti. Na primjer, propusni filtar 450/50 propušta fluorescentno svjetlo valne duljine od 450 nm +/− 25 nm kroz filter da bi ga detektor očitao. Elektronički sustav pretvara signale iz detektora u digitalne signale koje može očitati računalo.

Višestruki laserski sustavi uobičajeni su kod instrumenata koji često imaju 20 parametara (FSC, SSC i 18 fluorescentnih detektora). Predstavljaju se nove platforme instrumenata s pet ili više lasera i 30� parametara, ali su rjeđe. Najčešći laseri koji se koriste u tradicionalnim protočnim citometrima su 488 nm (plava), 405 nm (ljubičasta), 532 nm (zelena), 552 nm (zelena), 561 nm (zeleno-žuta), 640 nm (crvena) i 355 nm (ultraljubičasta) . Dodatne valne duljine lasera dostupne su za specijalizirane primjene. Osim toga, postoje instrumenti koji su PMT zamijenili lavinskim fotodiodama (APD) za detekciju fluorescencije s ciljem povećanja osjetljivosti.

Citometri za akustično fokusiranje

Ovaj citometar koristi ultrazvučne valove za bolje fokusiranje stanica za lasersko ispitivanje. Ova vrsta akustičnog fokusiranja omogućuje veći unos uzorka i manje začepljenja uzorka. Ovaj citometar može koristiti do 4 lasera i 14 fluorescentnih kanala.

Razvrstivači ćelija

Specifičan tip tradicionalnog protočnog citometra je sorter stanica koji može pročistiti i prikupiti uzorke za daljnju analizu. Razvrstavanje stanica omogućuje korisniku da odabere (vrati) populaciju stanica ili čestica koja je pozitivna (ili negativna) za željene parametre i zatim te stanice usmjeri u posudu za prikupljanje. Uređaj za razvrstavanje stanica odvaja stanice oscilirajući struju uzorka tekućine na visokoj frekvenciji kako bi se stvorile kapi. Kapljice zatim dobivaju pozitivan ili negativan naboj i prolaze kroz metalne otklonske ploče gdje se usmjeravaju u određenu posudu za prikupljanje na temelju njihovog naboja. Posude za sakupljanje mogu biti epruvete, stakalca ili ploče (česte su 96 ili 384 jažice).

Postoje dvije vrste razvrstavača ćelija, kvarcna kiveta i “jet-in-air” koji se razlikuju po tome gdje se nalazi laserska točka za ispitivanje. Kvarcne kivetne ćelije za sortiranje imaju fiksno lasersko poravnanje i lakše se pripremaju za sortiranje. “jet u zraku” razvrstivači stanica moraju imati lasere svakodnevno poravnati i teže ih je postaviti, ali su prilagodljiviji za detekciju malih čestica.

Citometri za snimanje

Slikovni protočni citometri (IFC) kombiniraju tradicionalnu protočnu citometriju s fluorescentnom mikroskopijom. To omogućuje brzu analizu uzorka za morfologiju i višeparametarsku fluorescenciju na razini jedne stanice i populacije (Barteneva, Fasler-Kan, & Vorobjev, 2012.). IFC može pratiti distribuciju proteina unutar pojedinačnih stanica poput konfokalnog ili fluorescentnog mikroskopa, ali i obraditi veliki broj stanica poput protočnog citometra. Oni su osobito korisni u višestrukim aplikacijama kao što su signalizacija stanica, studije ko-lokalizacije, interakcije između stanice, oštećenja i popravak DNK te u bilo kojoj primjeni koja mora biti u stanju koordinirati staničnu lokaciju s ekspresijom fluorescencije na velikim populacijama stanica.

Maseni citometri

Maseni citometri kombiniraju masenu spektrometriju vremena leta i protočnu citometriju. Stanice su označene antitijelima obilježenim ionima teških metala (obično iz serije lantanida) umjesto fluorescentno obilježenim antitijelima i detektiraju se pomoću masene spektrometrije vremena leta. Maseni citometri nemaju FSC ili SSC svjetlosnu detekciju što ne dopušta konvencionalnu metodu detekcije staničnih agregata. Međutim, druge metode kao što je barkodiranje stanica mogu se koristiti u tu svrhu (Leipold, Newell, & Maecker, 2015.). Također, masovna citometrija nema stanične autofluorescirajuće signale i reagensi nemaju spektralno preklapanje emisije povezano s fluorescentnim oznakama pa kompenzacija nije potrebna. Međutim, uzorak se uništava tijekom analize tako da sortiranje stanica nije moguće, a stopa stjecanja je mnogo niža od standardnog protočnog citometra (1000 stanica/sekundi umjesto 10000 stanica/sekundi). Trenutno postoje komercijalno dostupni reagensi za 40 kanala, ali taj će se broj povećati s uvođenjem drugih metalnih iona kao što je platina za konjugaciju s antitijelima (Mei, Leipold, & Maecker, 2016.).

Citometri za analizu niza kuglica

Multipleksni nizovi kuglica postali su popularni za analizu velikih količina analita u malim količinama uzoraka. Ukratko, ovi testovi koriste zrnca za hvatanje s poznatom količinom fluorescencije u specifičnom kanalu i reportersku molekulu detektiranu posebnim laserom za kvantificiranje količine zarobljenog analita povezanog sa specifičnom kuglom. To je u biti ekvivalent 100 ELISA testova.

Za analizu ovih testova razvijeni su mali protočni citometri s obično 2 lasera i punjačima s 96 jažica. Ovi instrumenti imaju male otiske i dizajn optičkih stolova koji su optimizirani za otkrivanje i razlikovanje kuglica s različitim količinama fluorescencije duž dva kanala. Razvijeni su instrumenti koji mogu detektirati 100� različitih kombinacija zrna.

Spektralni analizatori

Jedan od izazova višeparametarske protočne citometrije je kompenzacija (ili brisanje spektralnog preklapanja) između flurokroma. Nova vrsta protočnog citometra, spektralni analizator, posebno je dizajniran za rješavanje ovog problema. Spektralni analizator mjeri cjelokupne spektre fluorescentne emisije za svaki fluorokrom u višebojnom uzorku kako bi se stvorio spektralni otisak prsta. Zatim se tijekom analize svaki spektar ne miješa kako bi se dobio čisti signal za svaki fluorokrom (Sony, 2017.). Spektralna analiza počinje zamjenjivati ​​tradicionalne PMT kao metodu detekcije za visokodimenzionalnu protočnu citometriju.

Nove detektorske tehnologije

Fotomultiplikatorske cijevi (PMT) ostaju standardna tehnologija detektora za protočnu citometriju. Njihova visoka osjetljivost i niska pozadina čine ih korisnim za fluorescentnu tehnologiju. Međutim, detektori čvrstog stanja počinju se pojavljivati ​​u nekim citometrima. Lavinske fotodiode (APD) su jeftine, osjetljive i visoko linearne, te su spektralno osjetljivije u dugom crvenom području. Silicijske fotodiode (SiPD) također su obećavajuća opcija za detektore u čvrstom stanju.


Fluorescencija

2005. Active Motif je kupio Chromeon GmbH, njemačku tvrtku koju je 2001. osnovao profesor Otto Wolfbeis, svjetski lider u fluorescentnim biosenzorima. Chromeon GmbH je rano identificirao potrebu za razvojem poboljšanih bioloških testova temeljenih na fluorescenciji.

Uparujući razvoj testa Active Motif s fluorescentnom kemijom Chromeona, nastojimo razviti inovativne testove stanične i molekularne biologije koji uključuju vlasničke fluorescentne boje i supstrate razvijene u Chromeon GmbH. Pružajući osjetljivost i fleksibilnost, Active Motif Chromeo boje pokazuju vrhunska svojstva luminiscencije, uključujući širok raspon fluorescentne ekscitacije i emisije, velike Stokesove pomake, ograničeno fotoizbjeljivanje i široku toleranciju pH vrijednosti.

Fluorescentna mikroskopija s fluorescentno obilježenim antitijelima (Imunofluorescencija, ili IF) naširoko se koristi za otkrivanje specifičnih proteina u njihovom staničnom okruženju i za odgovor na pitanja u vezi s njihovom lokalizacijom, modifikacijom, interakcijama i životnim ciklusom. Međutim, donedavno je uporaba fluorescentne mikroskopije u istraživanju stanične biologije bila ograničena razlučivosti koja se može postići u slikovnim eksperimentima.

Razlučivost slika ograničena je na veličinu točke na koju se može fokusirati ekscitacijski snop mikroskopa. To ovisi o valnoj duljini emitirane svjetlosti i parametrima instrumenta. Najviša moguća razlučivost definirana je Abbeovim zakonom:

Slika 1: Abbeov zakon opisuje rezoluciju koja se može postići mikroskopskim putem.

x = prostorna razlučivost lambda = valna duljina pobuđene svjetlosti
2n sin &alpha = numerički otvor mikroskopa

The Abbe granica ograničava sposobnost promatrača da vizualno razriješi objekte razdvojene manje od

200 nm. To onemogućuje proučavanje manjih bakterija, virusa, ribosoma ili proteinskih klastera pomoću fluorescentne mikroskopije. Međutim, tijekom posljednjih nekoliko godina razvijeno je nekoliko novih tehnologija koje su prevladale ovo ograničenje.

Fluorescentna mikroskopija super rezolucije (također poznat kao mikroskopija visoke rezolucije) opisuje skupinu tehnika koje &ldquobrekiraju&rdquo difrakcijsku barijeru, omogućujući da razlučivost bude čak 20-30 nm. Ove tehnike iskorištavaju prednosti posebnih postavki fizike i pojačala, te svojstva visokokvalitetnih fluorescentnih boja za dramatično poboljšanje rezolucije. Iako se ove tehnike mogu razdvojiti u dva različita pristupa, one imaju jednu zajedničku osnovu: sposobnost isključivanja fluorescentnih molekula kada se to želi.

Slika 2: Primarna antitijela Active Motifa i fluorescentna sekundarna antitijela u konfokalnoj i STED mikroskopiji.

HeLa stanice su obojene alfa tubulinskim mišjim mAb (klon 5-B-1-2) i ATTO 647N (STED/GSD) kozjim antimišjim IgG (kataloški br. 15038). Histon H3 je obojen s histonskim H3 trimetil Lys4 zečjim poliklonskim protutijelom (kataloški br. 39159) i Chromeo 488 kozjim anti-zečjim IgG (kataloški broj 15041) sekundarnim protutijelom. Konfokalne (lijevo) i STED (desno) slike su ljubaznošću Leica Microsystems, Njemačka.

Super-razlučivost izravnom optičkom slikom

Prvi pristup temelji se na konfokalnoj mikroskopiji, gdje su molekule u vanjskim područjima žarišne točke isključene. To smanjuje veličinu fluorescentne mrlje, jer samo boje u središtu područja pobude smiju emitirati fluorescenciju. STED (SVsimulirani Emisija Discrpljenost) i STED CW (Ckontinuirano Wave) pripadaju ovim tehnikama izravne optičke slike. Ne zahtijevaju nikakvu računsku evaluaciju jer se uzorci skeniraju na normalan način. Za više informacija posjetite naše stranice STED mikroskopskih proizvoda.

Super-razlučivost po lokalizaciji

U ovom pristupu većina molekula unutar pobuđenog područja se pretvara u tamno stanje samo je nekim pojedinačnim molekulama boje dopušteno emitirati fluorescentno svjetlo. Položaj tih pojedinačnih molekula određen je matematičkim algoritmom, a svaka se vizualizira. Ponavljanjem ciklusa isključivanja boja i otkrivanja fluorescencije preostalih pojedinačnih emitera, stvaraju se tisuće slika koje se kombiniraju kako bi se formirala konačna slika visoke razlučivosti. Nekoliko tehnika pripada ovoj klasi stohastičkog očitanja lokalizacije pojedinačne molekule: OLUJA (SVohastičan Optical Rekonstrukcija Mikroskopija), DLAN (PhotoAaktiviran Lokalizacija Mikroskopija) i GSDIM (Gkrug State Depletion with japojedinac Mpovratak olekule). Za više informacija o mikroskopiji temeljenoj na lokalizaciji, posjetite naše stranice proizvoda za mikroskopiju GSDIM.

Uz mikroskopiju visoke razlučivosti moguće je prekoračiti Abbeovu granicu i postići poboljšanja rezolucije do 12 puta u odnosu na klasičnu konfokalnu mikroskopiju. Mogućnost izvođenja slikovnih eksperimenata pri razlučivosti ispod 50 nm olakšava odvajanje substanične strukture koji se prije nije mogao riješiti, te povećava povjerenje u biološke uloge proteina i struktura koje se ko-lokaliziraju.


Otkrivanje

Otkrivanje obično se postiže pomoću jedne od dvije metode: (a) kolorimetrijska ili enzimski posredovana detekcija i (b) detekcija temeljena na fluorescenciji.

U kolorimetrijska metoda, vezano primarno ili sekundarno protutijelo konjugira se na supstrat koji daje precipitirajući proizvod kada se enzim pretvara. Ovaj precipitat je vidljiv kao obojena boja kada se promatra svjetlosnim mikroskopom.

U detekcija temeljena na fluorescenciji Metoda, antitijelo vezano na antigen od interesa u tkivu je izravno ili neizravno konjugirano s fluoroforom (koji se također ponekad naziva fluorokrom), molekulom koja fluorescira u prisutnosti svjetlosti određene valne duljine.


12.2H: Fluorescentna antitijela - biologija

Otkriće zelenog fluorescentnog proteina u ranim 1960-ima u konačnici je najavilo novu eru u biologiji stanice omogućivši istraživačima primjenu metoda molekularnog kloniranja, spajajući fluoroforni dio s širokim spektrom meta proteina i enzima, kako bi pratili stanične procese u živim sustavima. korištenjem optičke mikroskopije i srodne metodologije.U kombinaciji s nedavnim tehničkim napretkom u širokopojasnoj fluorescenciji i konfokalnoj mikroskopiji, uključujući ultrabrze digitalne kamere niske razine osvjetljenja i sustave laserske kontrole s višestrukim praćenjem, zeleni fluorescentni protein i njegovi genetski derivati ​​s pomakom u boji pokazali su neprocjenjivu uslugu u mnogim tisućama eksperimenata snimanja živih stanica. .

Slika 1 - Fluorescentne proteinske oznake u živim stanicama

Osamu Shimomura i Frank Johnson, koji su radili u Friday Harbour Laboratories Sveučilišta Washington 1961., prvi su izolirali bioluminiscentni protein ovisan o kalciju iz Aequorea victoria meduza, kojoj su dali ime aequorin. Tijekom postupka izolacije uočen je drugi protein kojemu nedostaju bioluminiscentna svojstva equorina koji emitira plavo, ali je bio u stanju proizvesti zelenu fluorescenciju kada je osvijetljen ultraljubičastim svjetlom. Zbog ovog svojstva, protein je na kraju kršten nesvečanim imenom zeleni fluorescentni protein (GFP). Tijekom sljedeća dva desetljeća, istraživači su utvrdili da equorin i zeleni fluorescentni protein rade zajedno u svjetlosnim organima meduze kako bi pretvorili luminiscentne signale inducirane kalcijem u zelenu fluorescenciju karakterističnu za tu vrstu.

Iako je gen za zeleni fluorescentni protein prvi put kloniran 1992. godine, značajan potencijal kao molekularne sonde nije ostvaren sve do nekoliko godina kasnije kada su fuzijski proizvodi korišteni za praćenje ekspresije gena u bakterijama i nematodama. Od ovih ranih studija, zeleni fluorescentni protein je konstruiran za proizvodnju velikog broja mutanata različitih boja, fuzijskih proteina i biosenzora koji se općenito nazivaju fluorescentnim proteinima. Nedavno su identificirani i izolirani fluorescentni proteini drugih vrsta, što je rezultiralo daljnjim širenjem palete boja. Uz brzu evoluciju tehnologije fluorescentnih proteina, korisnost ovog genetski kodiranog fluorofora za širok spektar primjena izvan jednostavnog praćenja označenih biomolekula u živim stanicama sada postaje potpuno cijenjena.

Ilustrirano u Slika 1 su dva primjera višestrukog obilježavanja fluorescentnog proteina u živim stanicama korištenjem fuzijskih proizvoda usmjerenih na substanične (organele) lokacije. Epitelna stanica proksimalnog tubula korteksa bubrega oposuma (u redu linija) predstavljena u Slika 1(a) transficiran je koktelom varijanti fluorescentnih proteina spojenih na peptidne signale koji posreduju u transportu bilo u jezgru (pojačani cijan fluorescentni protein ECFP), mitohondrije (DsRed fluorescentni protein DsRed2FP), ili mreža mikrotubula (pojačani zeleni fluorescentni protein EGFP). Sličan uzorak koji se sastoji od epitelnih stanica humanog adenokarcinoma vrata maternice (HeLa linija) prikazana je u Slika 1(b). HeLa stanice su kotransficirane s vektorima substanične lokalizacije spojenim na cijan (mTirkizna) i žuta (mVenera) fluorescentne sekvence koje kodiraju protein (Golgijev kompleks i jezgra), kao i protein "Voće", mCherry, ciljajući na mitohondrijsku mrežu.

Zeleni fluorescentni protein i njegovi mutirani alelni oblici, plavi, cijan i žuti fluorescentni proteini koriste se za konstruiranje fluorescentnih himernih proteina koji se mogu eksprimirati u živim stanicama, tkivima i cijelim organizmima, nakon transfekcije s konstruiranim vektorima. Crveni fluorescentni proteini izolirani su iz drugih vrsta, uključujući organizme koraljnog grebena, i slično su korisni. Tehnika fluorescentnih proteina izbjegava problem pročišćavanja, označavanja i uvođenja obilježenih proteina u stanice ili zadatak proizvodnje specifičnih antitijela za površinske ili unutarnje antigene.

Svojstva i modifikacije zelenog fluorescentnog proteina Aequorea victoria

Među najvažnijim aspektima zelenog fluorescentnog proteina koji treba cijeniti je da je cjelokupna nativna peptidna struktura od 27 kiloDaltona neophodna za razvoj i održavanje njegove fluorescencije. Izvanredno je da je glavni fluorofor izveden iz tripleta susjednih aminokiselina: ostataka serina, tirozina i glicina na mjestima 65, 66 i 67 (koji se nazivaju Ser65, Tyr66, i Gly67 vidjeti Slika 2). Iako se ovaj jednostavni motiv aminokiselina obično nalazi u prirodi, on općenito ne rezultira fluorescencijom. Ono što je jedinstveno za fluorescentni protein je da se lokacija ovog peptidnog tripleta nalazi u središtu izuzetno stabilne bačvaste strukture koja se sastoji od 11 beta- listovi presavijeni u cijev.

Unutar hidrofobnog okruženja u središtu zelenog fluorescentnog proteina događa se reakcija između karboksilnog ugljika Ser65 i amino dušika Gly67 što rezultira stvaranjem imidazolin-5-on heterocikličkog dušikovog prstenastog sustava (kao što je ilustrirano u Slika 2). Daljnja oksidacija rezultira konjugacijom imidazolinskog prstena s Tyr66 i sazrijevanjem fluorescentne vrste. Važno je napomenuti da prirodni zeleni fluorescentni protein fluorofor postoji u dva stanja. Protonirani oblik, prevladavajuće stanje, ima ekscitacijski maksimum na 395 nanometara, a manje rasprostranjen, neprotonirani oblik koji apsorbira na približno 475 nanometara. Međutim, bez obzira na valnu duljinu pobuđivanja, fluorescentna emisija ima maksimalnu vršnu valnu duljinu na 507 nanometara, iako je vrh širok i nije dobro definiran.

Slika 2 - Sazrijevanje fluorofora zelenog fluorescentnog proteina

Dvije prevladavajuće značajke fluorescentnog proteinskog fluorofora imaju važne implikacije za njegovu korisnost kao sonde. Prvo, fotofizička svojstva zelenog fluorescentnog proteina kao fluorofora su prilično složena i stoga molekula može prihvatiti znatnu količinu modifikacija. Mnoga su se istraživanja usredotočila na fino podešavanje fluorescencije prirodnog zelenog fluorescentnog proteina kako bi se osigurao širok raspon molekularnih sondi, ali značajniji i golem potencijal korištenja proteina kao početnog materijala za izgradnju naprednih fluorofora ne može se podcijeniti. Druga važna značajka zelenog fluorescentnog proteina je da fluorescencija jako ovisi o molekularnoj strukturi koja okružuje tripeptidni fluorofor.

Denaturacija zelenog fluorescentnog proteina uništava fluorescenciju, kao što se moglo očekivati, a mutacije ostataka koji okružuju tripeptidni fluorofor mogu dramatično promijeniti svojstva fluorescencije. Pakiranje aminokiselinskih ostataka unutar beta bačva je iznimno stabilna, što rezultira vrlo visokim kvantnim prinosom fluorescencije (do 80 posto). Ova čvrsta struktura proteina također daje otpornost na varijacije fluorescencije zbog fluktuacija pH, temperature i denaturansa kao što je urea. Visoka razina stabilnosti općenito je promijenjena na negativan način mutacijama u zelenom fluorescentnom proteinu koje remete fluorescenciju, što rezultira smanjenjem kvantnog prinosa i većom osjetljivošću okoliša. Iako se neki od ovih nedostataka mogu prevladati dodatnim mutacijama, derivati ​​fluorescentnih proteina općenito su osjetljiviji na okoliš od domaćih vrsta. Ova ograničenja treba ozbiljno razmotriti pri osmišljavanju eksperimenata s genetskim varijantama.

Kako bi se fluorescentni proteini prilagodili za upotrebu u sustavima sisavaca, poduzeto je nekoliko osnovnih modifikacija zelenog fluorescentnog proteina divljeg tipa i sada se nalazi u svim uobičajeno korištenim varijantama. Prvi korak bio je optimizirati sazrijevanje fluorescencije na okolinu od 37 stupnjeva Celzija. Sazrijevanje fluorofora divljeg tipa prilično je učinkovito na 28 stupnjeva, ali povećanje temperature na 37 stupnjeva značajno smanjuje ukupno sazrijevanje i rezultira smanjenom fluorescencijom. Mutacija fenilalaninskog ostatka na poziciji 64 (Phe64) do leucina rezultira poboljšanim sazrijevanjem fluorescencije na 37 stupnjeva, što je najmanje ekvivalentno onom promatranom na 28 stupnjeva. Ova mutacija je prisutna u najpopularnijim vrstama fluorescentnih proteina dobivenih iz Aequorea victoria, ali nije jedina mutacija koja poboljšava savijanje na 37 stupnjeva jer su otkrivene druge varijante.

Osim poboljšanja sazrijevanja na 37 stupnjeva, optimizacija korištenja kodona za ekspresiju sisavaca također je poboljšala ukupnu svjetlinu zelenog fluorescentnog proteina izraženog u stanicama sisavaca. Sveukupno, preko 190 tihih mutacija uvedeno je u kodirajuću sekvencu kako bi se poboljšala ekspresija u ljudskim tkivima. Kozak mjesto inicijacije translacije (sadrži nukleotidni slijed A/GCCAT) također je uveden umetanjem valina kao druge aminokiseline. Ovo, zajedno s nizom drugih poboljšanja (o kojima se raspravlja u nastavku), rezultiralo je vrlo korisnom sondom za snimanje živih stanica stanica sisavaca i zajedničko je svim trenutno korištenim fluorescentnim sondama dobivenim od izvornog proteina meduze.

Fluorescentna proteinska paleta boja

Razvijen je širok raspon genetskih varijanti fluorescentnih proteina koje sadrže spektralne profile fluorescentne emisije koji obuhvaćaju gotovo cijeli spektar vidljive svjetlosti (vidi stol 1). Napori mutageneze u originalu Aequorea victoria fluorescentni protein zelene meduze rezultirao je novim fluorescentnim sondama koje imaju raspon boja od plave do žute i neke su od najčešće korištenih in vivo reporterske molekule u biološkim istraživanjima. Fluorescentni proteini duže valne duljine, koji emitiraju u narančastom i crvenom spektralnom području, razvijeni su iz morske anemone, Discosoma striata, i grebenski koralji koji pripadaju klasi Anthozoa. Ostale vrste su iskopane za proizvodnju sličnih proteina koji imaju cijan, zelenu, žutu, narančastu i tamnocrvenu fluorescentnu emisiju. Razvojna istraživanja su u tijeku kako bi se poboljšala svjetlina i stabilnost fluorescentnih proteina, čime se poboljšava njihova ukupna korisnost.

Stol 1 - Fluorescentna svojstva proteina

Protein
(Akronim)
Uzbuđenje
Maksimum
(nm)
Emisija
Maksimum
(nm)
Kutnjak
Izumiranje
Koeficijent
Kvantni
Prinos
in vivo
Struktura
Relativno
Svjetlina
(% EGFP-a)
GFP (težina)395/47550921,0000.77monomer*48
Zeleni fluorescentni proteini
EGFP48450756,0000.60monomer*100
Smaragd48750957,5000.68monomer*116
Supermapa GFP48551083,3000.65monomer*160
Azami Green49250555,0000.74Monomer121
mWasabi49350970,0000.80Monomer167
TagGFP48250558,2000.59monomer*110
TurboGFP48250270,0000.53Dimer102
AcGFP48050550,0000.55monomer*82
ZsGreen49350543,0000.91Tetramer117
T-safir39951144,0000.60monomer*79
Plavi fluorescentni proteini
EBFP38344529,0000.31monomer*27
EBFP238344832,0000.56monomer*53
Azurit38445026,2000.55monomer*43
mTagBFP39945652,0000.63Monomer98
Cijan fluorescentni proteini
ECFP43947632,5000.40monomer*39
mECFP43347532,5000.40Monomer39
Tamnoplave boje43347543,0000.62monomer*79
mTirkizna43447430,0000.84monomer*75
CyPet43547735,0000.51monomer*53
AmCyan145848944,0000.24Tetramer31
Midori-Ishi Cyan47249527,3000.90Dimer73
TagCFP45848037,0000.57Monomer63
mTFP1 (teal)46249264,0000.85Monomer162
Žuti fluorescentni proteini
EYFP51452783,4000.61monomer*151
Topaz51452794,5000.60monomer*169
Venera51552892,2000.57monomer*156
mCitrin51652977,0000.76Monomer174
YPet517530104,0000.77monomer*238
TagYFP50852464,0000.60Monomer118
PhiYFP525537124,0000.39monomer*144
ZsŽuta152953920,2000.42Tetramer25
mBanana5405536,0000.7Monomer13
Narančasti fluorescentni proteini
Kusabira Orange54855951,6000.60Monomer92
Kusabira naranča255156563,8000.62Monomer118
mNarančasta54856271,0000.69Monomer146
mNarančasta254956558,0000.60Monomer104
drajčica55458169,0000.69Dimer142
dRajčica-Tandem554581138,0000.69Monomer283
TagRFP555584100,0000.48Monomer142
TagRFP-T55558481,0000.41Monomer99
DsRed55858375,0000.79Tetramer176
DsRed256358243,8000.55Tetramer72
DsRed-Express (T1)55558438,0000.51Tetramer58
DsRed-Monomer55658635,0000.10Monomer10
mTangerine56858538,0000.30Monomer34
Crveni fluorescentni proteini
mRuby558605112,0000.35Monomer117
mApple56859275,0000.49Monomer109
mJagoda57459690,0000.29Monomer78
AsRed257659256,2000.05Tetramer8
mRFP158460750,0000.25Monomer37
JRed58461044,0000.20Dimer26
mCherry58761072,0000.22Monomer47
HcRed158861820,0000.015Dimer1
mMalina59862586,0000.15Monomer38
dKeima-Tandem44062028,8000.24Monomer21
HcRed-Tandem590637160,0000.04Monomer19
mŠljiva59064941,0000.10Monomer12
AQ14359565590,0000.04Tetramer11
* Slab Dimer

Predstavljen u stol 1 je kompilacija svojstava koju pokazuje nekoliko najpopularnijih i najkorisnijih varijanti fluorescentnih proteina. Uz uobičajeni naziv i/ili akronim za svaki fluorescentni protein, vršne valne duljine apsorpcije i emisije (dane u nanometrima), molarni koeficijent ekstinkcije, kvantni prinos, relativnu svjetlinu i in vivonavedene su strukturne udruge. Izračunate vrijednosti svjetline izvedene su iz umnoška koeficijenta molarne ekstinkcije i kvantnog prinosa, podijeljenog s vrijednošću za EGFP. Ovaj popis je napravljen iz izvora znanstvene i komercijalne literature i nije namijenjen da bude sveobuhvatan, već umjesto toga predstavlja fluorescentne proteinske derivate koji su dobili značajnu pozornost u literaturi i mogu se pokazati vrijednima u istraživačkim naporima. Nadalje, spektri apsorpcije i emisije fluorescencije navedeni u tablicama i ilustrirani u nastavku snimljeni su u kontroliranim uvjetima i normalizirani su samo za potrebe usporedbe i prikaza. U stvarnim istraživanjima fluorescentne mikroskopije, spektralni profili i maksimumi valne duljine mogu varirati zbog utjecaja okoline, kao što su pH, koncentracija iona i polaritet otapala, kao i fluktuacije u koncentraciji lokalizirane sonde. Stoga se navedeni koeficijenti ekstinkcije i kvantni prinosi mogu razlikovati od stvarno opaženih u eksperimentalnim uvjetima.

Zeleni fluorescentni proteini

Iako prirodni zeleni fluorescentni protein proizvodi značajnu fluorescenciju i iznimno je stabilan, maksimum ekscitacije je blizu ultraljubičastog raspona. Budući da ultraljubičasto svjetlo zahtijeva posebna optička razmatranja i može oštetiti žive stanice, općenito nije prikladno za snimanje živih stanica optičkom mikroskopijom. Srećom, maksimum ekscitacije zelenog fluorescentnog proteina lako se pomiče na 488 nanometara (u cijan području) uvođenjem mutacije u jednoj točki koja mijenja serin na poziciji 65 u ostatak treonina (S65T). Ova mutacija je prikazana u najpopularnijoj varijanti zelenog fluorescentnog proteina, nazvanoj poboljšana GFP (EGFP), koji je komercijalno dostupan u širokom rasponu vektora koje nudi BD Biosciences Clontech, jedan od vodećih u tehnologiji fluorescentnih proteina. Nadalje, poboljšana verzija može se snimiti korištenjem uobičajeno dostupnih filtarskih setova dizajniranih za fluorescein i među najsvjetlijim je od trenutno dostupnih fluorescentnih proteina. Ove značajke učinile su poboljšani zeleni fluorescentni protein jednom od najpopularnijih sondi i najboljim izborom za većinu eksperimenata s fluorescentnim proteinima s jednom oznakom. Jedini nedostaci primjene EGFP-a su blaga osjetljivost na pH i slaba sklonost dimerizaciji.

Osim poboljšanog zelenog fluorescentnog proteina, nekoliko drugih varijanti trenutno se koristi u snimanju živih stanica. Jedan od najboljih u pogledu fotostabilnosti i svjetline može biti Smaragd varijantu, ali nedostatak komercijalnog izvora ograničio je njegovu upotrebu. Nekoliko izvora pruža humanizirane zelene fluorescentne varijante proteina koje nude jasne prednosti za prijenos energije fluorescentne rezonancije (FRET) eksperimenti. Zamjena ostatka fenilalanina na poziciji 64 za leucin (F64L GFP2) daje mutant koji zadržava ekscitacijski vrh od 400 nanometara i može se spojiti kao učinkovit partner za pojačani žuti fluorescentni protein. Varijanta od S65C mutacija (normalno zamjena cisteina za serin) koja ima vršnu ekscitaciju na 474 nanometra komercijalno je uvedena kao prikladniji FRET partner za poboljšani plavi fluorescentni protein od poboljšane zelene inačice s crvenim pomakom. Konačno, protein koralja grebena, tzv ZsGreen1 i koji ima vrhunac emisije na 505 nanometara, uveden je kao zamjena za pojačani zeleni fluorescentni protein. Kada se ekspresira u stanicama sisavaca, ZsGreen1 je vrlo svijetao u odnosu na EGFP, ali ima ograničenu korisnost u proizvodnji fuzijskih mutanata i, slično drugim proteinima koralja grebena, ima tendenciju stvaranja tetramera.

Žuti fluorescentni proteini

Obitelj žutih fluorescentnih proteina pokrenuta je nakon što je kristalna struktura zelenog fluorescentnog proteina otkrila da treoninski ostatak 203 (Thr203) nalazio se u blizini kromofora. Mutacija ovog ostatka u tirozin uvedena je kako bi se stabilizirao dipolni moment pobuđenog stanja kromofora i rezultirala je pomakom od 20 nanometara na duže valne duljine i za spektre ekscitacije i za emisiju. Daljnja usavršavanja dovela su do razvoja poboljšana žuti fluorescentni protein (EYFP), koji je jedan od najsvjetlijih i najčešće korištenih fluorescentnih proteina. Svjetlina i spektar emisije fluorescencije pojačanog žutog fluorescentnog proteina kombiniraju se kako bi ovu sondu učinili izvrsnim kandidatom za eksperimente s višebojnim slikama u fluorescentnoj mikroskopiji. Poboljšani žuti fluorescentni protein također je koristan za eksperimente prijenosa energije kada je uparen s poboljšanim cijan fluorescentnim proteinom (ECFP) ili GFP2. Međutim, žuti fluorescentni protein predstavlja neke probleme jer je vrlo osjetljiv na kiseli pH i gubi približno 50 posto svoje fluorescencije pri pH 6,5. Osim toga, pokazalo se da je EYFP osjetljiv na kloridne ione i fotoizbjeljivače mnogo lakše od zelenih fluorescentnih proteina.

Slika 3 - Spektralni profili uobičajenih fluorescentnih proteina

Nastavak razvoja fluorescentne proteinske arhitekture za žutu emisiju riješio je nekoliko problema sa žutim sondama. The Citrin varijanta žutog fluorescentnog proteina je vrlo svijetla u odnosu na EYFP i pokazalo se da je mnogo otpornija na fotoizbjeljivanje, kiseli pH i druge učinke okoliša. Još jedna izvedenica, nazvana Venera, najbrže sazrijeva i jedna je od najsjajnijih žutih varijanti razvijenih do danas. protein koraljnog grebena, ZsŽuta1, izvorno klonirano iz a Zoantus vrsta podrijetlom iz Indijskog i Tihog oceana, proizvodi pravu žutu emisiju i idealna je za višebojne aplikacije. Poput ZsGreen1, ovaj derivat nije toliko koristan za stvaranje fuzija kao EYFP i ima tendenciju stvaranja tetramera. Mnoge od robusnijih varijanti žutih fluorescentnih proteina bile su važne za kvantitativne rezultate u FRET studijama i potencijalno su korisne i za druga istraživanja.

Ilustrirano u Slika 3 su spektralni profili apsorpcije i emisije za mnoge uobičajeno korištene i komercijalno dostupne fluorescentne proteine, koji obuhvaćaju vidljivi spektar od cijan do daleko crvene. Varijante izvedene iz Aequorea victoria meduze, uključujući poboljšane cijan, zelene i žute fluorescentne proteine, pokazuju vršne valne duljine emisije u rasponu od 425 do 525 nanometara. Fluorescentni proteini dobiveni iz koraljnih grebena, DsRed2 i HcRed1 (o kojima se govori u nastavku), emitiraju duže valne duljine, ali pate od artefakata oligomerizacije u stanicama sisavaca.

Plavi i cijan fluorescentni proteini

Plava i cijan varijante zelenog fluorescentnog proteina rezultat su izravne modifikacije tirozinskog ostatka na poziciji 66 (Tyr66) u prirodnom fluoroforu (vidi Slika 2). Pretvorba ove aminokiseline u histidin rezultira plavom emisijom s maksimumom valne duljine od 450 nanometara, dok pretvorba u triptamin rezultira glavnim vrhom fluorescencije oko 480 nanometara zajedno s rameom koji doseže vrh oko 500 nanometara.Obje sonde su samo slabo fluorescentne i zahtijevaju sekundarne mutacije kako bi se povećala učinkovitost savijanja i ukupna svjetlina. Čak i uz modifikacije, poboljšane verzije u ovoj klasi fluorescentnih proteina (EBFP i ECFP) su samo oko 25 do 40 posto svijetle poput pojačanog zelenog fluorescentnog proteina. Osim toga, pobuđivanje plavih i cijan fluorescentnih proteina najučinkovitije je u spektralnim područjima koja se obično ne koriste, pa su potrebni specijalizirani setovi filtera i laserski izvori.

Unatoč nedostacima plavih i cijan fluorescentnih proteina, širok interes za višebojno označavanje i FRET popularizirao je njihovu primjenu u brojnim istraživanjima. To je osobito istinito za pojačani cijan fluorescentni protein, koji se može pobuditi izvan maksimuma argon-ionskim laserom (koristeći spektralnu liniju od 457 nanometara) i znatno je otporniji na fotoizbjeljivanje od plavog derivata. Za razliku od drugih fluorescentnih proteina, nije bilo velikog interesa za dizajniranje boljih sondi u plavom području spektra vidljive svjetlosti, a većina razvojnih istraživanja fluorofora u ovoj klasi bila je usmjerena na cijan varijante.

Slika 4 - Spektralni profili varijanti fluorescentnih proteina FRET kante

Među poboljšanim cijan fluorescentnim proteinima koji su uvedeni, AmCyan1 i poboljšana cijan varijanta nazvana Tamnoplave boje pokazati najviše obećanja. Potječe iz koralja grebena, Anemonia majano, varijanta fluorescentnog proteina AmCyan1 optimizirana je s ljudskim kodonima za stvaranje visoke razine relativne svjetline i otpornosti na fotoizbjeljivanje u usporedbi s poboljšanim cijan fluorescentnim proteinom tijekom ekspresije sisavaca. S druge strane, slično kao i većina drugih proteina koralja grebena, ova sonda ima tendenciju stvaranja tetramera. Cerulean fluorescentna sonda razvijena je mutagenezom usmjerenom na mjesto poboljšanog cijan fluorescentnog proteina kako bi se dobio veći koeficijent ekstinkcije i poboljšani kvantni prinos. Cerulean je najmanje 2 puta svjetliji od poboljšanog cijan fluorescentnog proteina i pokazalo se da značajno povećava omjer signala i šuma kada je spojen s fluorescentnim proteinima koji emitiraju žuto, kao što je Venera (vidi Slika 4), u FRET istragama.

Crveni fluorescentni proteini

Glavni cilj razvoja fluorescentnih proteina postao je izgradnja derivata koji emitira crveno i koji je jednak ili nadmašuje napredna svojstva poboljšanog zelenog fluorescentnog proteina. Među prednostima prikladnog crvenog fluorescentnog proteina je potencijalna kompatibilnost s postojećim konfokalnim i širokopoljnim mikroskopima (i njihovim setovima filtera), zajedno s povećanim kapacitetom snimanja cijelih životinja, koje su znatno transparentnije za crvenu svjetlost. Budući da je konstrukcija crveno-pomaknutih mutanata iz Aequorea victoria fluorescentni protein zelene meduze izvan žute spektralne regije pokazao se uglavnom neuspješnim, istraživači su svoju potragu usmjerili na koralje tropskog grebena.

Izveden je prvi fluorescentni protein dobiven iz koralja koji se intenzivno koristio Discosoma striata i obično se naziva DsRed. Nakon potpunog sazrijevanja, fluorescentni emisijski spektar DsRed-a ima vrh na 583 nanometara, dok ekscitacijski spektar ima glavni vrh na 558 nanometara i manji vrh oko 500 nanometara. Međutim, s korištenjem DsRed-a povezano je nekoliko problema. Sazrijevanje fluorescencije DsRed događa se sporo i prolazi kroz vremensko razdoblje kada je emisija fluorescencije u zelenom području. Naziva se zeleno stanje, ovaj artefakt se pokazao problematičnim za višestruke eksperimente označavanja s drugim zelenim fluorescentnim proteinima zbog spektralnog preklapanja. Nadalje, DsRed je obvezni tetramer i može formirati velike proteinske agregate u živim stanicama. Iako su ove značajke beznačajne za korištenje DsRed-a kao izvješća o ekspresiji gena, korisnost DsRed-a kao epitopske oznake je ozbiljno ograničena. Za razliku od fluorescentnih proteina meduza, koji su uspješno korišteni za označavanje stotina proteina, DsRed konjugati su se pokazali mnogo manje uspješnim i često su toksični.

Neki od problema s DsRed fluorescentnim proteinima prevladani su mutagenezom. Druga generacija DsRed, poznata kao DsRed2, sadrži nekoliko mutacija na peptidnom amino terminusu koje sprječavaju stvaranje proteinskih agregata i smanjuju toksičnost. Osim toga, ovim se modifikacijama smanjuje vrijeme sazrijevanja fluorofora. Protein DsRed2 još uvijek tvori tetramer, ali je kompatibilniji sa zelenim fluorescentnim proteinima u višestrukim eksperimentima označavanja zbog bržeg sazrijevanja. Daljnje smanjenje vremena sazrijevanja ostvareno je s trećom generacijom DsRed mutanata, koji također pokazuju povećanu razinu svjetline u smislu vršne stanične fluorescencije. Emisija crvene fluorescencije iz DsRed-Express može se primijetiti unutar sat vremena nakon ekspresije, u usporedbi s približno šest sati za DsRed2 i 11 sati za DsRed. Varijanta optimizirana za kvasac, tzv Crvena zvijezda, razvijen je koji također ima poboljšanu stopu sazrijevanja i povećanu svjetlinu. Prisutnost zelenog stanja u DsRed-Express i RedStaru nije očita, što ove fluorescentne proteine ​​čini najboljim izborom u narančasto-crvenoj spektralnoj regiji za višestruke eksperimente označavanja. Budući da ove sonde ostaju obvezni tetrameri, one nisu najbolji izbor za označavanje proteina.

Slika 5 - Spektralni profili narančastih i crvenih monometrijskih fluorescentnih proteina

Nekoliko dodatnih crvenih fluorescentnih proteina koji pokazuju značajnu količinu obećanja izolirano je iz organizama koralja grebena. Jedan od prvih koji je prilagođen za primjenu kod sisavaca je HcRed1, koji je izoliran iz Heteractis crispa i sada je komercijalno dostupan. HcRed1 je izvorno izveden iz nefluorescentnog kromoproteina koji apsorbira crvenu svjetlost kroz mutagenezu kako bi proizveo slabo fluorescentni obvezni dimer koji ima maksimum apsorpcije na 588 nanometara i maksimum emisije od 618 nanometara. Iako je spektar emisije fluorescencije ovog proteina prikladan za odvajanje od DsRed-a, on ima tendenciju koagregacije s DsRed-om i daleko je manje svijetao. Proizveden je zanimljiv HcRed konstrukt koji sadrži dvije molekule u tandemu kako bi se prevladala dimerizacija koja se, u principu, događa prvenstveno unutar tandemskog uparivanja kako bi se proizvela monomerna oznaka. Međutim, budući da ukupna svjetlina ovog proteina blizanaca još nije poboljšana, nije dobar izbor za rutinske primjene u mikroskopiji živih stanica.

Razvijanje monomernih fluorescentnih varijanti proteina

U svom prirodnom stanju, većina fluorescentnih proteina postoji kao dimeri, tetrameri ili oligomeri višeg reda. Također, Aequorea victoria Smatra se da zeleni fluorescentni protein sudjeluje u tetramernom kompleksu s equorinom, ali je ovaj fenomen uočen samo pri vrlo visokim koncentracijama proteina i sklonost fluorescentnim proteinima meduza dimeriziranju općenito je vrlo slaba (s konstantom disocijacije većom od 100 mikromola). Dimerizacija fluorescentnih proteina stoga općenito nije opažena kada su eksprimirani u sustavima sisavaca. Međutim, kada su fluorescentni proteini ciljani na specifične stanične odjeljke, kao što je plazma membrana, lokalizirana koncentracija proteina teoretski može postati dovoljno visoka da dopusti dimerizaciju. Ovo je posebno zabrinjavajuće kod provođenja FRET eksperimenata, koji mogu dati složene skupove podataka koji se lako kompromitiraju artefaktima dimerizacije.

Konstrukcija monomernih DsRed varijanti pokazala se kao težak zadatak. Više od 30 promjena strukture aminokiselina bilo je potrebno za stvaranje monomernog DsRed proteina prve generacije (nazvan RFP1). Međutim, ovaj derivat pokazuje značajno smanjenu emisiju fluorescencije u usporedbi s prirodnim proteinom i vrlo brzo izbjeljuje, što ga čini mnogo manje korisnim od monomernih zelenih i žutih fluorescentnih proteina. Napori istraživanja mutageneze, uključujući nove tehnike kao što je somatska hipermutacija, nastavljaju se u potrazi za žutim, narančastim, crvenim i tamnocrvenim fluorescentnim varijantama proteina koje dodatno smanjuju sklonost ovih potencijalno učinkovitih bioloških sondi da se samopodruže dok istovremeno potiskuju maksimume emisije. prema dužim valnim duljinama.

Razvijaju se poboljšani monomerni fluorescentni proteini koji imaju povećane koeficijente ekstinkcije, kvantne prinose i fotostabilnost, iako niti jedna varijanta još nije optimizirana po svim kriterijima. Osim toga, problemi ekspresije s obveznim tetramernim crvenim fluorescentnim proteinima prevladavaju se naporima za stvaranje monomernih varijanti, koje su dale derivate koji su kompatibilniji s biološkom funkcijom.

Možda je najspektakularniji razvoj na ovom planu uvođenje nove žetve fluorescentnih proteina izvedenih iz monomernog crvenog fluorescentnog proteina putem usmjerene mutageneze usmjerene na Q66 i Y67 ostaci. Ime je dobio po plodovima koji odražavaju boje slične spektralnom profilu emisije fluorescencije (vidi stol 1 i Slika 5), ovaj kadar monomernih fluorescentnih proteina pokazuje maksimume na valnim duljinama u rasponu od 560 do 610 nanometara. Daljnje proširenje ove klase iterativnom somatskom hipermutacijom dalo je fluorescentne proteine ​​s valnim duljinama emisije do 650 nanometara. Ovi novi proteini u biti popunjavaju prazninu između fluorescentnih proteina meduza s najviše crvenog pomaka (kao što je Venera) i crvenih fluorescentnih proteina koraljnog grebena. Iako nekolicini ovih novih fluorescentnih proteina nedostaje svjetlina i stabilnost nužna za mnoge slikovne eksperimente, njihovo postojanje je ohrabrujuće jer sugerira mogućnost svijetlih, stabilnih, monomernih fluorescentnih proteina u cijelom vidljivom spektru.

Optički markeri

Jedan od najzanimljivijih razvoja u istraživanju fluorescentnih proteina bila je primjena ovih sondi kao molekularni ili optički highlighteri (vidjeti Tablica 2), koji mijenjaju boju ili intenzitet emisije kao rezultat vanjske fotonske stimulacije ili protoka vremena. Kao primjer, mutacija jedne točke na nativni peptid meduze stvara fotoaktivirajuću verziju zelenog fluorescentnog proteina (poznatog kao PA-GFP) koji omogućuje fotokonverziju ekscitacijskog vrha iz ultraljubičastog u plavo osvjetljenjem svjetlom u rasponu od 400 nanometara. Nekonvertirani PA-GFP ima ekscitacijski vrh sličan u profilu onom kod proteina divljeg tipa (otprilike 395 do 400 nanometara). Nakon fotokonverzije, ekscitacijski vrh na 488 nanometara raste približno 100 puta. Ovaj događaj izaziva vrlo velike kontrastne razlike između nekonvertiranih i pretvorenih skupova PA-GFP i koristan je za praćenje dinamike molekularnih subpopulacija unutar stanice. Ilustrirano u Slika 6(a) je transficirana živa stanica sisavca koja sadrži PA-GFP u citoplazmi koja je snimljena uz 488-nanometarsku lasersku ekscitaciju argon-iona prije (Slika 6(a)) i poslije (Slika 6(d)) fotokonverzija s 405-nanometarskim plavim diodnim laserom.

Tablica 2 - Svojstva odabranih optičkih markera

Protein
(Akronim)
Uzbuđenje
Maksimum
(nm)
Emisija
Maksimum
(nm)
Kutnjak
Izumiranje
Koeficijent
Kvantni
Prinos
in vivo
Struktura
Relativno
Svjetlina
(% EGFP-a)
PA-GFP (G)50451717,4000.79Monomer41
PS-CFP (C)40246834,0000.16Monomer16
PS-CFP (G)49051127,0000.19Monomer15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08Monomer3
CoralHue Kaede (G)50851898,8000.88Tetramer259
CoralHue Kaede (R)57258060,4000.33Tetramer59
wtKikGR (G)50751753,7000.70Tetramer112
wtKikGR (R)58359335,1000.65Tetramer68
mKikGR (G)50551549,0000.69Monomer101
mKikGR (R)58059128,0000.63Monomer53
dEosFP-Tandem (G)50651684,0000.66Monomer165
dEosFP-Tandem (R)56958133,0000.60Monomer59
mEos2FP (G)50651956,0000.84Monomer140
mEos2FP (R)57358446,0000.66Monomer90
Dendra2 (G)49050745,0000.50Monomer67
Dendra2 (R)55357335,0000.55Monomer57
CoralHue Dronpa (G)50351895,0000.85Monomer240
Kindling (KFP1)58060059,0000.07Tetramer12

Drugi fluorescentni proteini također se mogu koristiti kao optički markeri. Trofotonska ekscitacija (na manje od 760 nanometara) DsRed fluorescentnog proteina sposobna je pretvoriti normalno crvenu fluorescenciju u zelenu. Ovaj učinak vjerojatno je posljedica selektivnog fotoizbjeljivanja crvenih kromofora u DsRed, što rezultira vidljivom fluorescencijom iz zelenog stanja. The Tajmer varijanta DsRed postupno prelazi iz svijetlozelene (emisija 500 nanometara) u svijetlocrvenu (emisija od 580 nanometara) tijekom nekoliko sati. Relativni omjer zelene i crvene fluorescencije tada se može koristiti za prikupljanje vremenskih podataka za istraživanja genske ekspresije.

Fotoizmjenjivi optički highlighter, tzv PS-CFP, dobiven mutagenezom zelene fluorescentne varijante proteina, uočen je prijelaz iz cijan u zelenu fluorescenciju nakon osvjetljenja na 405 nanometara (obratite pažnju na fotokonverziju središnje stanice u Slike 6(b) i 6(e)). Izražena kao monomer, ova je sonda potencijalno korisna u istraživanjima fotoizbjeljivanja, fotokonverzije i fotoaktivacije. Međutim, fluorescencija iz PS-CFP je približno 2,5 puta slabija od PA-GFP i inferiorna je u odnosu na druge markere u smislu učinkovitosti fotokonverzije (pomak od 40 nanometara u emisiji fluorescencije nakon fotokonverzije manji je nego što se opaža kod sličnih sonda). Dodatna mutageneza ovog ili srodnih fluorescentnih proteina ima potencijal da proizvede korisnije varijante u ovoj regiji valne duljine.

Slika 6 - Fluorescentni proteini optičkog markera

Optički highlighteri također su razvijeni u fluorescentnim proteinima kloniranim iz vrsta koralja i anemona. Kaede, fluorescentni protein izoliran iz kamenih koralja, fotokonvertira iz zelene u crvenu u prisutnosti ultraljubičastog svjetla. Za razliku od PA-GFP, pretvorba fluorescencije u Kaedeu događa se apsorpcijom svjetlosti koja je spektralno različita od njezina osvjetljenja. Nažalost, ovaj protein je obvezni tetramer, što ga čini manje prikladnim za upotrebu krzna kao epitopske oznake od PA-GFP. Još jedan tetramerni kameni koralj (Lobophyllia hemprichii) fluorescentna proteinska varijanta, nazvana EosFP (vidjeti Tablica 2), emitira svijetlo zelenu fluorescenciju koja se mijenja u narančasto-crvenu kada je osvijetljena ultraljubičastim svjetlom od približno 390 nanometara. U ovom slučaju, spektralni pomak nastaje foto-induciranom modifikacijom koja uključuje prekid peptidne okosnice koja se nalazi uz kromofor. Daljnja mutageneza EosFP proteina "divljeg tipa" dala je monomerne derivate, koji mogu biti korisni u konstruiranju fuzijskih proteina.

Treći ne-Aequorea optički marker, Kindling fluorescentni protein (KFP1) razvijen je iz nefluorescentnog kromoproteina izoliranog u Anemonia sulcata, i sada je komercijalno dostupan (Evrogen). Kindling fluorescentni protein ne pokazuje emisiju dok se ne osvijetli zelenim svjetlom. Svjetlost niskog intenziteta rezultira prolaznom crvenom fluorescencijom koja nestaje tijekom nekoliko minuta (vidi mitohondrije u Slika 6(c)). Osvjetljenje plavim svjetlom odmah gasi upaljenu fluorescenciju, omogućujući strogu kontrolu nad fluorescentnim označavanjem. Nasuprot tome, osvjetljenje visokog intenziteta rezultira nepovratnim raspaljivanjem i omogućuje stabilno isticanje slično kao PA-GFP (Slika 6(f)). Sposobnost precizne kontrole fluorescencije osobito je korisna kada se prati kretanje čestica u prepunom okruženju. Na primjer, ovaj pristup je uspješno korišten za praćenje sudbine stanica neuralne ploče u razvoju Xenopus embrija i kretanja pojedinih mitohondrija u PC12 stanicama.

Kako se razvoj optičkih markera nastavlja, fluorescentni proteini korisni za optičko označavanje trebali bi evoluirati prema svjetlijim, monomernim varijantama koje se mogu lako fotokonvertirati i prikazati širok spektar boja emisije. Zajedno s ovim napretkom, mikroskopi opremljeni za glatko usklađivanje između načina osvjetljenja za promatranje fluorescencije i regionalnog označavanja postat će uobičajeni u laboratorijima stanične biologije. U konačnici, ove inovacije imaju potencijal postići značajna postignuća u prostornoj i vremenskoj dinamici sustava za prijenos signala.

Fluorescentni proteinski vektori i prijenos gena

Fluorescentni proteini su prilično svestrani i uspješno se koriste u gotovo svim biološkim disciplinama od mikrobiologije do fiziologije sustava. Ove sveprisutne sonde bile su iznimno korisne kao izvjestitelji za studije ekspresije gena u kultiviranim stanicama i tkivima, kao i živim životinjama. U živim stanicama, fluorescentni proteini najčešće se koriste za praćenje lokalizacije i dinamike proteina, organela i drugih staničnih odjeljaka. Razvijene su različite tehnike za konstruiranje fluorescentnih proteinskih fuzijskih proizvoda i poboljšanje njihove ekspresije u sisavcima i drugim sustavima. Primarni prijenosnici za uvođenje fluorescentnih proteinskih himernih genskih sekvenci u stanice su genetski modificirani bakterijski plazmidi i virusni vektori.

Proizvodi fuzije fluorescentnih proteina mogu se uvesti u stanice sisavaca i drugih pomoću odgovarajućeg vektora (obično plazmida ili virusa) bilo prolazno ili stabilno. U prolaznim ili privremenim eksperimentima prijenosa gena (često se nazivaju prolazna transfekcija), plazmid ili virusna DNA unesena u organizam domaćina ne mora se nužno integrirati u kromosome, ali se može eksprimirati u citoplazmi u kratkom vremenskom razdoblju. Ekspresija proizvoda fuzije gena, koja se lako prati promatranjem emisije fluorescencije korištenjem filtarskog seta kompatibilnog s fluorescentnim proteinom, obično se odvija u razdoblju od nekoliko sati nakon transfekcije i nastavlja se 72 do 96 sati nakon uvođenja plazmidne DNA u stanice sisavaca . U mnogim slučajevima, plazmidna DNA može se ugraditi u genom u trajnom stanju kako bi se formirale stabilno transformirane stanične linije. Izbor prolazne ili stabilne transfekcije ovisi o ciljnim ciljevima istraživanja.

Slika 7 - Vektor lokalizacije endoplazmatskog retikuluma EYFP

Osnovna konfiguracija plazmidnog vektora korisna u eksperimentima prijenosa gena fluorescentnog proteina ima nekoliko potrebnih komponenti. Plazmid mora sadržavati prokariotske nukleotidne sekvence koje kodiraju porijeklo bakterijske replikacije za DNA i gen otpornosti na antibiotike. Ovi elementi, koji se često nazivaju čunak sekvencije, omogućuju razmnožavanje i odabir plazmida unutar bakterijskog domaćina kako bi se stvorile dovoljne količine vektora za transfekcije sisavaca. Osim toga, plazmid mora sadržavati jedan ili više eukariotskih genetskih elemenata koji kontroliraju inicijaciju transkripcije glasničke RNA, signal poliadenilacije sisavaca, intron (izborno) i gen za ko-selekciju u stanicama sisavaca. Elementi transkripcije neophodni su sisavcu domaćinu za ekspresiju proizvoda fuzije gena od interesa, a selekcijski gen je obično antibiotik koji daje otpor stanicama koje sadrže plazmid. Ove opće značajke variraju ovisno o dizajnu plazmida, a mnogi vektori imaju širok spektar dodatnih komponenti prikladnih za posebne primjene.

Ilustrirano u Slika 7 je restrikcijski enzim i genetska mapa komercijalno dostupnog (BD Biosciences Clontech) derivata bakterijskog plazmida koji sadrži kodirajuću sekvencu za pojačani žuti fluorescentni protein fuzioniran na ciljanu sekvencu endoplazmatskog retikuluma kalretikulina (rezidentni protein). Ekspresija ovog genskog produkta u osjetljivim stanicama sisavaca daje himerni peptid koji sadrži EYFP lokaliziran na membranskoj mreži endoplazmatskog retikuluma, dizajniran posebno za fluorescentno obilježavanje ove organele. Vektor domaćina je derivat od pUC plazmid s velikim brojem kopija (približno 500) koji sadrži podrijetlo bakterijske replikacije, što ga čini prikladnim za reprodukciju u specijaliziranim E coli naprezanja. Gen za antibiotik kanamicina lako se eksprimira u bakterijama i daje rezistenciju koja služi kao selektivni marker.

Dodatne značajke EYFP vektora predstavljenog gore su ljudski citomegalovirus (CMV) promotor za pokretanje ekspresije gena u transficiranim ljudskim i drugim staničnim linijama sisavaca, i f1 porijeklo replikacije bakteriofaga za proizvodnju jednolančane DNA. Vektorska okosnica također sadrži majmunski virus 40 (SV40) podrijetlo replikacije, koje je aktivno u stanicama sisavaca koje eksprimiraju SV40 T-antigen. Odabir stabilnih transfektanata s antibiotikom G418 je omogućen s kasetom otpornosti na neomicin koja se sastoji od ranog promotora SV40, gena za otpornost na neomicin (aminoglikozid 3’-fosfotransferaza) i poliadenilacijskih signala iz timidin kinaze virusa herpes simpleksa (HSV-TK) za stabilnost glasnika. Šest jedinstvenih mjesta restrikcijskih enzima (vidi Slika 7) prisutni su na okosnici plazmida, što povećava svestranost ovog plazmida.

Propagacija, izolacija i transfekcija fluorescentnih proteinskih plazmida

Uspješni eksperimenti transfekcije sisavaca oslanjaju se na korištenje visokokvalitetnih plazmidnih ili virusnih DNA vektora koji su relativno slobodni od bakterijskih endotoksina. U nativnom stanju, kružne plazmidne molekule DNA pokazuju tercijarnost superzamotan konformacija koja više puta okreće dvostruku spiralu oko sebe. Dugi niz godina, metoda izbora za pročišćavanje supersmotanog plazmida i virusne DNK bila je centrifugiranje gradijenta gustoće cezijevog klorida u prisutnosti interkalacijskog sredstva (kao što je etidijev bromid ili propidij jodid). Ova tehnika, koja je skupa u smislu opreme i materijala, odvaja supernamotanu (plazmidnu) DNK od linearne kromosomske i izrezane kružne DNK prema gustoći plutanja, omogućavajući prikupljanje plazmidne DNA visoke čistoće. Nedavno su uvedene pojednostavljene metode kolonske kromatografije s ionskom izmjenom (obično nazvane a mini-priprema) uvelike su istisnuli glomazan i dugotrajan protokol centrifugiranja kako bi se dobile velike količine plazmidne DNA bez endotoksina u relativno kratkom vremenskom razdoblju.

Specijalizirani bakterijski mutanti, tzv kompetentan stanice, razvijene su za prikladno i relativno jeftino pojačavanje plazmidnih vektora. Bakterije sadrže paletu mutacija koje ih čine posebno osjetljivima na replikaciju plazmida, a kemijski su permeabilizirane za prijenos DNK preko membrane i stanične stijenke u postupku poznatom kao transformacija. Nakon transformacije, bakterije se uzgajaju do logaritamske faze u prisutnosti selekcijskog antibiotika koji diktira plazmid. Bakterijska kultura se koncentrira centrifugiranjem i razbije lizom s lužnatom otopinom deterdženta koja sadrži enzime za razgradnju kontaminirajuće RNA. Lizat se zatim filtrira i stavlja na kolonu za ionsku izmjenu. Neželjeni materijali, uključujući RNA, DNA i proteine, temeljito se isperu iz kolone prije nego što se plazmidna DNA eluira korištenjem pufera s visokim udjelom soli. Precipitacija alkoholom (izopropanolom) koncentrira eluiranu plazmidnu DNA, koja se sakupi centrifugiranjem, ispere i ponovno otopi u puferu. Pročišćena plazmidna DNA spremna je za rad u pokusima transfekcije.

Slika 8 - Transfekcija posredovana lipidima u stanicama sisavaca

Stanice sisavaca koje se koriste za transfekciju moraju biti u izvrsnom fiziološkom stanju i rasti u logaritamskoj fazi tijekom postupka. Široki spektar transfekcijskih reagensa komercijalno je razvijen za optimizaciju preuzimanja plazmidne DNA od strane kultiviranih stanica. Te se tehnike kreću od jednostavne precipitacije kalcijevog fosfata do izdvajanja plazmidne DNA u lipidne vezikule koje se spajaju sa staničnom membranom i isporučuju sadržaj u citoplazmu (kao što je ilustrirano u Slika 8). Kolektivnim nazivom lipofekcija, tehnologija temeljena na lipidima naišla je na široko prihvaćanje zbog svoje učinkovitosti u velikom broju popularnih staničnih linija, a sada je metoda izbora za većinu eksperimenata transfekcije.

Iako prolazne transfekcije obično rezultiraju gubitkom produkta plazmidnog gena u relativno kratkom vremenskom razdoblju (nekoliko dana), stabilno transficirane stanične linije nastavljaju proizvoditi proteine ​​gostiju na kontinuiranoj dugotrajnoj osnovi (u rasponu od mjeseci do godina). Stabilne stanične linije mogu se odabrati korištenjem antibiotskih markera prisutnih u plazmidnoj okosnici (vidi Slika 7). Jedan od najpopularnijih antibiotika za odabir stabilnih transfektanata u staničnim linijama sisavaca je lijek G418 koji inhibira sintezu proteina, ali potrebna doza uvelike varira ovisno o svakoj staničnoj liniji. Ostali uobičajeni antibiotici, uključujući hidromicin-B i puromicin, također su razvijeni za stabilnu selekciju stanica, kao i genetski markeri. Najučinkovitija metoda dobivanja stabilnih staničnih linija je primjena tehnike visoke učinkovitosti za početnu transfekciju. u tom smislu, elektroporacija dokazano stvara stabilne transfektante s lineariziranim plazmidima i pročišćenim genima. Elektroporacija primjenjuje kratke, visokonaponske impulse na staničnu suspenziju kako bi se inducirala stvaranje pora u plazma membrani, nakon čega se dopušta transfekcijskoj DNA da uđe u stanicu. Za elektroporaciju potrebna je specijalizirana oprema, međutim, tehnika je usporediva po trošku s reagensima za lipofekciju kada se provodi veliki broj transfekcija.

Budućnost fluorescentnih proteina

Fokus trenutnog razvoja fluorescentnih proteina usredotočen je na dva osnovna cilja. Prvi je usavršiti i fino podesiti trenutnu paletu plavih do žutih fluorescentnih proteina dobivenih iz Aequorea victoria meduze, dok je drugi cilj razviti monomerne fluorescentne proteine ​​koji emitiraju u narančastim do daleko crvenim područjima spektra vidljive svjetlosti. Napredak prema ovim ciljevima bio je prilično impresivan i nije nezamislivo da se bliski infracrveni fluorescentni proteini naziru na horizontu.

Najnovija generacija varijanti meduza riješila je većinu nedostataka prve generacije fluorescentnih proteina, posebice žutih i zelenih derivata. Potraga za monomernim, svijetlim i brzo sazrijevajućim crvenim fluorescentnim proteinom rezultirala je nekoliko novih i zanimljivih klasa fluorescentnih proteina, posebice onih dobivenih od koraljnih vrsta. Razvoj postojećih fluorescentnih proteina, zajedno s novim tehnologijama, poput umetanja neprirodnih aminokiselina, dodatno će proširiti paletu boja. Kako tehnike optičkog spektralnog odvajanja budu sve bolje razvijene i sve raširenije, ove nove sorte će nadopuniti postojeću paletu, posebno u žutom i crvenom dijelu spektra.

Trenutni trend u tehnologiji fluorescentnih sondi je proširenje uloge boja koje fluoresciraju u daleko crvenu i blisku infracrvenu. U stanicama sisavaca, i autofluorescencija i apsorpcija svjetlosti uvelike su smanjeni na crvenom kraju spektra. Stoga bi razvoj dalekocrvenih fluorescentnih sondi bio izuzetno koristan za ispitivanje debelih uzoraka i cijelih životinja. S obzirom na uspjeh fluorescentnih proteina kao reportera u transgenim sustavima, upotreba daleko crvenih fluorescentnih proteina u cijelim organizmima postat će sve važnija u nadolazećim godinama.

Konačno, ogroman potencijal u primjeni fluorescentnih proteina za inženjering biosenzora upravo se ostvaruje. Broj biosenzorskih konstrukata brzo raste. Korištenjem strukturnih informacija, razvoj ovih sondi doveo je do poboljšane osjetljivosti i nastavit će to činiti. Uspjeh ovih nastojanja svakako sugerira da će gotovo svaki biološki parametar biti mjerljiv korištenjem odgovarajućeg biosenzora na bazi fluorescentnog proteina.

Autori doprinosi

David W. Klip - Odjel za molekularnu fiziologiju i biofiziku, Sveučilište Vanderbilt, Nashville, Tennessee, 37232.

George H. Patterson i Jennifer Lippincott-Schwartz - Ogranak stanične biologije i metabolizma, Nacionalni institut za zdravlje djece i ljudski razvoj, Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, Maryland, 20892.

Nathan S. Claxton i Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Povezani Nikonovi proizvodi

Fluorescentne filter kocke

Nikon nudi širok raspon fluorescentnih filtar kockica s visokom učinkovitošću akvizicije fluorescencije za podršku slikanju velikog broja fluorofora i fluorescentnih proteina.

Izvori svjetlosti

Nikon nudi izvore svjetlosti za širok raspon slikovnih potreba, od koaksijalnih sustava za stereomikroskopiju do iluminatora baziranih na LED-u za epifluorescentne aplikacije i moćne laserske jedinice za napredne aplikacije za snimanje. Mnoga od naših svjetlosnih rješenja uključuju jedinstvene implementacije i mogu se aktivirati za kontrolu velike brzine.


IZVORNI ISTRAŽIVAČKI RADOVI

Coons, A.H., Creech, H.J. & Jones, R.N. Imunološka svojstva antitijela koje sadrži fluorescentnu skupinu. Proc. Soc. Expt. Biol. Med. 47, 200–202 (1941)

Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. & Berliner, E. Demonstracija pneumokoknog antigena u tkivima korištenjem fluorescentnog antitijela. J. Immunol. 45, 159–170 (1942)

DALJNJE ČITANJE

Coons, A. H. & Kaplan, M. H. Lokalizacija antigena u stanicama tkiva: poboljšanja metode za detekciju antigena pomoću fluorescentnog antitijela. J. Exp. Med. 91, 1–13 (1950)

Coons, A. H. Počeci imunofluorescencije. J. Immunol. 87, 499–503 (1961)


Dizajn zasnovan na znanju fluorescentnih biosenzora bez reagensa iz rekombinantnih antitijela

Mogućnost dobivanja od bilo kojeg protutijela fluorescentnog konjugata koji reagira na vezanje antigena varijacijom njegove fluorescencije bila bi od velikog interesa za analitičke znanosti i za konstrukciju proteinskih čipova. Ta je mogućnost istražena s antitijelom mAbD1.3 usmjerenim protiv lizozima bjelanjka kokošjeg jajeta. Razvijena su pravila dizajna kako bi se identificirali ostaci antitijela na koje bi se fluorofor mogao kemijski spojiti, nakon što su se mutagenezom promijenili u cistein. Ta su se pravila temeljila na: ciljnom ostatku koji pripada topološkom susjedstvu antigena u strukturi kompleksa između antitijela i antigena, njegovoj odsutnosti funkcionalne važnosti za interakciju s antigenom i njegovoj dostupnosti otapalu u strukturi slobodnog antitijela. Konstruirano je sedamnaest konjugata između jednolančanog varijabilnog fragmenta scFv mAbD1.3 i fluorofora osjetljivog na okolinu. Za šest od deset ostataka koji su u potpunosti zadovoljili pravila dizajna, relativna varijacija intenziteta fluorescencije između slobodnog i vezanog stanja konjugata bila je između 12 i 75% (u neoptimalnom puferu), a afinitet konjugata jer je lizozim ostao nepromijenjen u odnosu na roditeljski scFv. Nasuprot tome, takvi su rezultati vrijedili samo za jedan od sedam ostataka koji nisu zadovoljili jedno od pravila i korišteni su kao kontrole. Jedan od konjugata je detaljnije proučavan. Njegova se fluorescencija povećala proporcionalno koncentraciji lizozima u nanomolarnom rasponu, do 90% u definiranom puferu i 40% u serumu. Ovo povećanje bilo je specifično za lizozim kokošjih jaja i nije uočeno kod blisko srodnog proteina, lizozima purećeg jajeta. Ostaci koji su dali operativne konjugate (šest u VL i jedan u VH), nalazile su se u neposrednoj blizini funkcionalno važnih ostataka, duž sekvence FvD1.3. Rezultati sugeriraju pravila dizajna za konstruiranje antigen osjetljivih fluorescentnih konjugata iz bilo kojeg protutijela, u nedostatku strukturnih podataka.



Komentari:

  1. Yasir

    Ova veličanstvena fraza je neophodna samo usput

  2. Gradon

    Da, sve je to fantazija

  3. Aldwyn

    Hvala na ovom postu. Dugo sam te čitao i sve mi se sviđa.

  4. Fakih

    It's a pity that I can't speak now - I'm forced to go away. I will be set free - I will definitely give my opinion on this matter.

  5. Shakagal

    Moram vam reći da ste na pogrešnom putu.

  6. Dary

    Što ste, ljudi! Nisu li naše recenzije najbolji šampanjac?



Napišite poruku