Informacija

Povećavaju li antimuskarinski lijekovi cAMP ili cGMP

Povećavaju li antimuskarinski lijekovi cAMP ili cGMP



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aktivacija muskarinskih receptora M2 i M4 inhibira adenilat ciklazu koja smanjuje razinu cAMP. Za očekivati ​​je da će antimuskarinici poput ipratropija povećati razinu cAMP. Međutim, kaže se da je farmakološko djelovanje ipratropija posredovano povećanjem razine cGMP [1]. Zašto je to tako?

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/138578


Ciklični dinukleotidi vežu C-linker HCN4 za kontrolu odziva cAMP kanala

cAMP posreduje u autonomnoj regulaciji srčanog ritma pomoću hiperpolarizacijski aktiviranih cikličkih nukleotidnih (HCN) kanala, koji su u osnovi struje pejsmejkera If. Vezivanje cAMP na C-terminalnu cikličku nukleotidnu vezujuću domenu povećava vjerojatnost otvaranja HCN-a kroz konformacijsku promjenu koja dopire do pora putem C-linkera. Koristeći strukturnu i funkcionalnu analizu, identificirali smo vezni džep u C-linkeru HCN4. Ciklični dinukleotidi, nova klasa sekundarnih glasnika u sisavaca, vežu džep C-linkera (CLP) i antagoniziraju regulaciju cAMP kanala. Sukladno tome, ciklički dinukleotidi sprječavaju regulaciju cAMP-a If u miocitima sinoatrijalnog čvora, smanjujući broj otkucaja srca za 30%. Zauzetost CLP-a stoga predstavlja učinkovit mehanizam za ometanje β-adrenergičke stimulacije na If. Naši rezultati ističu regulativnu ulogu C-linkera i identificiraju potencijalnu metu lijeka u HCN4. Nadalje, ovi podaci proširuju opseg signalizacije cikličkih dinukleotida u sisavaca izvan njihove prve prijavljene uloge u urođenom imunološkom sustavu.


Uvod

Dušikov oksid (NO) prvi su opisali Stuehr i Marletta (1985) 1 kao produkt aktiviranih mišjih makrofaga. Također, tvar poznata kao opuštajući faktor izveden iz endotela (EDRF), koju su opisali Furchgott i Zawadzki (1980), 2, 3, identificirana je kao NO.

Topiva gvanilat ciklaza (sGC), odgovorna za enzimsku pretvorbu gvanozin-5-trifosfata (GTP) u ciklički gvanozin-3′,5′-monofosfat (cGMP), prvi put je identificirana kao sastavnica stanica sisavaca prije gotovo tri desetljeća. 4

NO i cGMP zajedno sadržavaju posebno širok sustav prijenosa signala kada se uzmu u obzir mnoge uloge cGMP u fiziološkoj regulaciji, uključujući opuštanje glatkih mišića, vizualnu transdukciju, intestinalni transport iona i funkciju trombocita. 5

Erektilna disfunkcija (ED) definira se kao dosljedna nemogućnost postizanja ili održavanja erekcije dovoljne za zadovoljavajući seksualni učinak i smatra se prirodnim procesom starenja. 6 Studije su pokazale da je ED uzrokovan neadekvatnim opuštanjem kavernoznog tijela s defektom u proizvodnji NO. 7

Jasno je da je NO prevladavajući neurotransmiter odgovoran za relaksaciju glatkih mišića kavernaze, a time i erekciju penisa. Njegovo djelovanje posredovano je stvaranjem drugog glasnika cGMP. Neuralno izvedeni NO utvrđen je kao posrednik relaksacije glatkih mišića u penisu, a smatra se da konstitutivni oblici sintaze dušikovog oksida (NOS) djeluju na posredovanje erekcije. 8 Oslobođeni NO aktivira sGC, koji katalizira pretvorbu GTP-a u intracelularni sekundarni glasnik cGMP u stanicama glatkih mišića. Povećanje cGMP modulira stanične događaje, kao što je opuštanje stanica glatkih mišića. 9

Ovaj pregled će opisati trenutno znanje o staničnim događajima uključenim u kavernoznu relaksaciju i niz navodnih čimbenika uključenih u opuštanje posredovano NO.


Sažetak

Ciklični GMP (cGMP) stvoren kao odgovor na atrijalni natriuretski peptid (ANP) ili dušikov oksid (NO) važan je regulator kratkoročnih promjena u tonusu glatkih mišića i dugoročnih odgovora na kronično liječenje lijekovima ili proliferativne signale. Sposobnost stanica glatkih mišića (SMC) da koriste različite kombinacije izoenzima fosfodiesteraze (PDE) omogućuje cGMP-u da posreduje u tim višestrukim procesima. Na primjer, PDE5 kao glavni PDE koji hidrolizira cGMP učinkovito kontrolira razvoj relaksacije glatkih mišića. Da bi došlo do kontrakcije, PDE5 se aktivira i cGMP pada. S druge strane, blokada aktivnosti PDE5 omogućuje produljenje i poboljšanje ciklusa opuštanja. Nedavno prikazana izravna aktivacija PDE5 cGMP vezanjem na GAF A domenu sugerira da bi ovo regulatorno mjesto moglo biti meta za razvoj novih lijekova. Nalet kalcija povezan s kontrakcijom pokrenutom vazokonstriktorom također aktivira PDE ovisan o kalciju/kalmodulinu (PDE1A). Zajedno, PDE5 i PDE1A snižavaju cGMP dovoljno da dopuste kontrakciju. Dugoročno, i PDE5 i PDE1A mRNA su inducirane kroničnom stimulacijom gvanilil ciklaze. Ova indukcija je glavni uzrok tolerancije koja se razvija na lijekove koji otpuštaju NO. Konačno, visoke razine cGMP ili cAMP također djeluju kao kočnica za slabljenje proliferativnog odgovora SMC-a na mnoge mitogene. Nakon oštećenja krvnih žila, kako bi došlo do proliferacije SMC, razine cGMP i cAMP moraju biti smanjene. Kod ljudi je ovo smanjenje velikim dijelom uzrokovano indukcijom drugog Ca 2+/kalmodulin-ovisnog PDE (PDE1C) koji omogućuje otpuštanje kočnice i početak proliferacije.

Pokazalo se da drugi glasnici cikličkih nukleotida, cAMP i cGMP, reguliraju širok raspon procesa u mnogim različitim tkivima tijela i sugerirano je da reguliraju mnoge druge. Zapravo, predloženo im je da moduliraju toliko različitih procesa da je donedavno bilo teško razumjeti kako bi te jednostavne, male molekule drugog glasnika mogle pružiti i specifičnost djelovanja i raznolikost funkcija potrebnih za takvu regulaciju. Posebno je problematično bilo razumijevanje kako se i vrlo brzi i vrlo spori procesi mogu modulirati istim mehanizmima.

Veliki konceptualni napredak u našem razumijevanju mehanizama pomoću kojih se takvi vremenski i prostorno različiti procesi mogu kontrolirati bila je spoznaja da su u organizmu prisutni mnogi različiti izozimi za sintezu (ciklaze) i razgradnju (fosfodiesteraze, PDE) cAMP i cGMP. 1 Na primjer, najmanje 10 različitih gena adenilil ciklaze i gotovo 20 različitih gena PDE identificirano je u vrstama sisavaca. Bilo koja određena vrsta stanica može eksprimirati dvije ili tri različite ciklaze i tri ili četiri različita PDE. Što je još važnije, broj mogućih kombinacija koje se mogu izraziti u bilo kojem odjeljku stanice je vrlo velik. Stoga diferencijalna ekspresija i lokalizacija jedinstvenih kombinacija sintetskih i degradativnih enzima pružaju svakoj stanici molekularna rješenja za ove probleme.

U glatkim mišićima arterija niz procesa kontrolira cAMP i cGMP. Oni uključuju metaboličke i mehaničke događaje koji su regulirani u relativno brzoj vremenskoj skali. Kontraktilni tonus mišića je možda najbolji primjer za to. 2 I cAMP i cGMP uzrokuju relaksaciju glatkih mišića velikim dijelom svojim učinkom na snižavanje intracelularnog kalcija ili aktiviranje miozin fosfataze. Sporije promjene koje su regulirane cikličkim nukleotidima uključuju promijenjenu proliferaciju kao odgovor na ozljedu ili čak dugotrajnu desenzibilizaciju na kroničnu stimulaciju lijekovima ili hormonima. Kao i kod svih regulatornih glasnika, amplituda i trajanje cikličkih nukleotidnih signala regulirani su njihovim stopama sinteze i stopama razgradnje. U ovom članku razmatramo neka od trenutnih razmišljanja o regulaciji funkcije glatkih mišića pomoću cikličkih nukleotida, a posebno uloge fosfodiesteraze koje hidroliziraju ili reagiraju na cGMP.

Regulacija funkcije glatkih mišića cikličkim nukleotidnim fosfodiesterazama

Sada je poznato da postoji 11 različitih familija gena PDE eksprimiranih u tkivima sisavaca (slika 1). Većina obitelji sadrži više od jednog gena i većina gena kodira više od jedne mRNA (alternativnim spajanjem ili alternativnim startnim mjestima transkripcije). Ovisno o vrsti, glavne fosfodiesteraze prisutne u glatkim mišićima arterija su PDEs1A, 1B i 1C, PDEs3A i 3B i PDE5. U nekoliko vrsta značajna količina aktivnosti PDE4 također je izražena u glatkim mišićima. Budući da je PDE4 specifičan za cAMP i nije reguliran cGMP-om, nećemo dalje raspravljati o njegovoj ulozi u ovom pregledu. U bazalnim uvjetima (tj. niske razine kalcija), smatra se da je najaktivniji PDE koji hidrolizira cGMP u glatkim mišićima cGMP-specifičan PDE koji veže cGMP, PDE5. U uvjetima s većim unosom kalcija (npr. tijekom mišićne kontrakcije i moguće u stanicama koje se stimuliraju na diobu), jedna ili više varijanti PDE1 može postati prevladavajući PDE. Iako PDE3 nema tako veliki ukupni katalitički kapacitet kao druga dva, on još uvijek može igrati ulogu u kontroli cAMP i možda cGMP u specifičnim odjeljcima stanice. Ovaj enzim snažno inhibira cGMP i u mnogim prethodnim studijama nazvan je cGMP-inhibirani PDE. U svim slučajevima, mora se imati na umu da ti različiti PDE ne dijele nužno istu substaničnu lokalizaciju i stoga često služe, barem djelomično, različite funkcionalne odjeljke u stanici.

Slika 1. Organizacija domena 11 obitelji gena PDE. Svi PDE dijele značajnu homologiju u svojoj katalitičkoj domeni, ali se uvelike razlikuju u svojim N-terminalnim dijelovima, koji sadrže različite vrste regulatornih domena. UCR domena je uzvodno konzervirana regija koja se nalazi samo u PDE4. GAF i PAS domene izvedene su iz prvih slova početnih članova njihovih odgovarajućih grupa. GAF domene (c G MP-regulirane fosfodiesteraze, nekoliko a denilil ciklaza i F hlA) izvorno su definirane u PDE2, PDE5 i PDE6, a kasnije prikazane u PDE10 i PDE11. PAS domena (Per, A RNT i Sim proteini) pronađena je samo u PDE8.

PDE5: cGMP-specifična, cGMP-vezujuća fosfodiesteraza

PDE5 i opuštanje glatkih mišića

Dobro je utvrđeno da dušikov oksid (NO), atrijalni natriuretski peptid (ANP) i nekoliko drugih endogenih vazodilatatora reguliraju tonus glatkih mišića kroz aktivaciju gvanilil ciklaze, povišenje cGMP i aktivaciju cGMP-ovisne protein kinaze (PKG) (slika 2). Čini se da su učinci NO/cGMP na kontrakciju u glatkim mišićima specifično posredovani PKG, ali ne i cAMP-ovisnom protein kinazom (PKA), jer je kod miševa s nedostatkom PKG-I relaksacija glatkih mišića aorte izazvana cGMP-om potpuno ukinuta, dok je cAMP -ovisna opuštenost ne utječe. 2 Postoji nekoliko specifičnih fizioloških supstrata za PKG u glatkim mišićima uključujući regulatornu podjedinicu miozin fosfataze koja veže miozin, 3 maxi K + (BK) aktiviran kalcijemca) kanala, 4 i IRAG (IP3 supstrat cGMP kinaze povezan s receptorom). 5 Fosforilacija svih ovih ciljeva doprinosi smanjenju unutarstanične koncentracije Ca 2+ ili smanjenju osjetljivosti na Ca 2+ i time smanjenom tonusu glatkih mišića. 6

Slika 2. cGMP je važan regulator funkcije glatkih mišića. Dušikov oksid (NO) i drugi endogeni vazodilatatori reguliraju tonus glatkih mišića putem cGMP/PKG signalnog puta. I, PDE5 učinkovito kontrolira razvoj opuštanja glatkih mišića. Blokiranje aktivnosti PDE5 omogućuje glatkim mišićima da poboljšaju i produže ciklus opuštanja. II, Dugotrajni odgovori na kronično liječenje nitroglicerinom (nitrotolerancija) uzrokuju promjene u PDE1A i PDE5 i, prema tome, manju osjetljivost na cGMP. III, PDE1C se inducira samo u ljudskim glatkim mišićnim stanicama proliferativnog fenotipa i njegova inhibicija rezultira supresijom proliferacije SMC.

PDE5, kao glavni PDE koji hidrolizira cGMP, izražen u stanicama glatkih mišića, u poziciji je da učinkovito kontrolira ovaj cGMP/PKG signalni put, posebno u uvjetima niske razine kalcija. Kao što je kasnije objašnjeno, u uvjetima višeg kalcija, PDE1 vjerojatno igraju sve važniju ulogu. PDE5 je pronađen u svim vrstama vaskularnih i visceralnih (maternica, tanko crijevo) SMC. Fiziološka važnost PDE5 u regulaciji tonusa glatkih mišića najučinkovitije je dokazana uspješnom kliničkom primjenom njegovog specifičnog inhibitora, sildenafila (Viagra, Pfizer Pharmaceuticals), u liječenju erektilne disfunkcije. 7 Opuštanje glatkih mišića corpus cavernosum izazvano je oslobađanjem NO iz endotelnih stanica i nekolinergičkih nenadrenergičkih (NANC) neurona koji okružuju arterije i sinusoide u kavernoznim tijelima. Inhibiranjem hidrolitičke aktivnosti PDE5 sildenafil uzrokuje višu stopu nakupljanja cGMP-a kao odgovor na NO, čime se pojačava erektilni odgovor. 8

PDE5 i plućna vaskulatura

Nedavno se liječenje plućne hipertenzije pojavilo kao novo potencijalno područje za kliničku primjenu inhibitora PDE5. Plućna hipertenzija je po život opasna bolest koju karakteriziraju visoki plućni arterijski tlak i vaskularni otpor. 9 U plućnoj vaskulaturi NO igra važnu ulogu kao vazorelaksant. Trenutno je inhalacijski dušikov oksid jedna od učinkovitijih terapija za liječenje plućne hipertenzije. 10 Jedna od prednosti egzogeno primijenjenog NO je da ima mali učinak na sustavni krvni tlak. Međutim, poluživot NO je relativno kratak, pa stoga učinkovito liječenje NO zahtijeva njegovu višestruku primjenu. Nažalost, tahifilaksa se obično vidi unutar nekoliko dana.

Primjena sildenafila za liječenje plućne hipertenzije pokazala je pozitivne rezultate kod ljudi. Klinička studija bolesnika s teškom primarnom plućnom hipertenzijom pokazala je dramatično poboljšanje plućnog sistoličkog tlaka nakon liječenja oralnim sildenafilom. 11 U drugom izvješću utvrđeno je da je sildenafil snažan plućni vazodilatator i bolji od inhaliranog NO u smanjenju tlaka u plućnoj arteriji i smanjenju plućnog vaskularnog otpora. 12 Kombinacija sildenafila i liječenja NO proizvela je još veći, sinergistički učinak.

PDE5 i sistemska vaskulatura

Izvorno je sildenafil testiran kao antianginalni lijek, ciljajući na PDE5 u sistemskoj vaskulaturi. 13 Međutim, u ranim kliničkim ispitivanjima ubrzo je postalo očito da sildenafil ima samo skroman učinak na smanjenje sistemskog krvnog tlaka. Ipak, ovaj mali učinak može se pretvoriti u tešku hipotenziju kod pacijenata koji uzimaju kombinaciju sildenafila i nitroglicerina ili drugih organskih nitrata. To je u skladu s raširenom pojavom PDE5 u svim slojevima glatkih mišića. Budući da sildenafil može uvelike pojačati učinke spojeva koji stvaraju NO, upotreba sildenafila je kontraindicirana za većinu pacijenata koji također koriste bilo koji organski nitrat. 14

Stoga je, kao i kod svih inhibitora PDE5, sildenafil najučinkovitiji kada je aktiviran signalni put NO/cGMP, što sugerira da bi se klinička upotreba ovih inhibitora mogla potencijalno proširiti na druge bolesti povezane s promjenama cGMP signalizacije.

Nedavno je prijavljen razvoj dva druga PDE5 specifična inhibitora, tadalafila (Cialis, Lilly ICOS LLC) i vardenafila (Levitra, Bayer i GlaxoSmithKline). 15,16 Svaki je u stanju inhibirati aktivnost PDE5 s IC50s u rasponu koncentracije nmol/L, a trenutno se oba koriste za liječenje erektilne disfunkcije. Svaki od njih ima vrlo slične afinitete za PDE5, ali se donekle razlikuju u svojoj farmakokinetici i selektivnosti prema drugim PDE-ovima. 17 Još ​​nije jasno hoće li te razlike donijeti bilo kakvu prednost u kliničkoj učinkovitosti ili pojavi nuspojava.

PDE5 varijante spajanja i organizacija domene

Prijavljene su tri različite izoforme PDE5A, PDE5A1, PDE5A2 i PDE5A3 (tablica). Sve varijante PDE5 razlikuju se samo na kraju N-terminala. Prvi PDE5 koji je pročišćen do homogenosti bio je topljivi enzim iz goveđih pluća. 18 Izvorno nazvan cGMP-vezujući, cGMP-specifičan PDE, ova izoforma je sada poznata kao PDE5A1. Čini se da je to prevladavajući oblik izražen u većini tkiva koja sadrže PDE5. Ljudski PDE5A1 je vrlo sličan goveđem PDE5A1, osim što sadrži dodatnih 10 aminokiselina na N-terminalnom kraju. 19-21 Druga varijanta, PDE5A2, sadrži značajno kraći aminokiselinski N-terminalni fragment i također je prikazana u nekoliko vrsta. 22 PDE5A3 je zabilježen samo u ljudskim tkivima na temelju RT-PCR podataka. 23

Stol 1. Izoforme PDE5 razlikuju se po svojim N-terminalnim krajevima

PDE5 je vrlo specifičan za hidrolizu cGMP i sadrži dvije homologne N-terminalne regulatorne domene, nedavno definirane kao GAF A i GAF B na temelju homologije njihove sekvence sa sličnim regulatornim motivima za sada poznato da su prisutni u velikoj skupini proteina. 24 Početni članovi ove skupine uključivali su c G MP-regulirane fosfodiesteraze (PDE2, PDE5 i PDE6), nekoliko a denilil ciklaza i bakterijski transkripcijski faktor nazvan F hlA. Akronim, GAF, izveden je iz prvih slova ovih grupa. Nedavno pretraživanje baze podataka pokazuje da gotovo tisuću drugih proteina sadrži GAF domene. Mnogi su, međutim, izraženi samo u prokariota.

GAF A domena PDE5 najhomolognija je GAF B domeni PDE2 koja također veže cGMP s visokom specifičnošću. Vrlo nedavno je riješena kristalna struktura GAF A/B domena PDE2 s vezan cGMP. 25 Smatra se da će struktura PDE5 GAF domena biti vrlo slična.

Mehanizmi za regulaciju aktivnosti PDE5

PKG inducirana fosforilacija PDE5

Prije nekoliko godina in vitro studije su pokazale da je PDE5 fosforiliran na svom N-terminalnom dijelu (serin 92) i da je vezanje cGMP-a na nekatalitičku GAF domenu PDE5 bilo potrebno za maksimalne stope fosforilacije PKA ili PKG. 26,27 Ovo mjesto fosforilacije je očuvano u svim izoformama PDE5 uključujući goveđi, ljudski, pasji, mišji i štakorski PDE5. Ipak, ostala su pitanja o tome ima li fosforilacija bilo kakvo fiziološko značenje in vivo. Ubrzo se pokazalo da se u stanicama glatkih mišića štakora 32 P može ugraditi u PDE5 nakon prethodnog označavanja s 32 P-ATP i tretmana s ANP. 28

U novije vrijeme, kvantitativniji pristup korištenjem antitijela specifičnih za mjesto fosforilacije PDE5 pokazao je dobru korelaciju aktivnosti s povećanom fosforilacijom od strane PKG, ali ne i PKA, kako in vitro tako i u intaktnim stanicama. 29 Dodavanje 8-Br-cGMP kultiviranim ljudskim glatkim mišićnim stanicama dovelo je do postupnog nakupljanja fosforiliranog oblika PDE5 (slika 3A). Kada je fosforilacija PDE5 uspoređena s fosforilacijom fosfoproteina stimuliranog vazodilatatorom (VASP), dobro okarakteriziranog supstrata za PKA i PKG, otkriveno je da je vremenski tijek fosforilacije PDE5 sličan onom kod VASP.Pokazalo se da je nakon aktivacije PKG fosforilirano 25% do 30% ukupnog PDE5, te da je imunoprecipitirani PDE5 imao 2 do 2,5 puta veću aktivnost u odnosu na nefosforilirani bazalni oblik kada je ispitan pri koncentraciji supstrata cGMP od 1 μmol/L.

Slika 3. U intaktnim stanicama, aktivacija PKG, ali ne i PKA, dovodi do fosforilacije PDE5. A, 1 mmol/L 8-Br-cGMP je dodan u kultivirane ljudske stanice glatkih mišića maternice, a stanice su sakupljene u različito vrijeme nakon dodavanja 8-Br-cGMP. Akumulacija fosfo-PDE5 otkrivena je Western blot analizom korištenjem fosfo-specifičnog PDE5 antitijela. Fosforilacija PKG-poželjnog mjesta na VASP, serin 239, otkrivena je korištenjem monoklonskog fosfo-serin 239-specifičnog VASP antitijela. B, Mišje stanice glatkih mišića aorte iz kontrolnih miševa (+/+) i miševa s nedostatkom PKG I (-/−) inkubirane su s 1 mmol/L 8-Br-cGMP (1), 1 mmol/L 8-Br- cAMP (2) ili oboje (3) 30 i 60 minuta. Akumulacija fosfo-PDE5 otkrivena je Western blot analizom korištenjem fosfo-specifičnog PDE5 antitijela. Adaptirano od Rybalkin SD, Rybalkina IG, Feil R, Hofmann F, Beavo JA. Regulacija cGMP-specifične fosfodiesteraze (PDE5) fosforilacije u stanicama glatkih mišića. J Biol Chem. 2002277:3310–3317.

Da bi se odgovorilo na pitanje specifičnosti protein kinaze za PDE5 u intaktnim SMC-ovima, korišteni su aortni SMC od miševa koji imaju poremećaj u PKG I genu. Inkubacija PKG I -/− stanica s 8-Br-cGMP nije proizvela nikakvu fosforilaciju PDE5, dok je u PKG I +/+ stanicama uočena značajna fosforilacija PDE5 (slika 3B). Dodavanje samo 8-Br-cAMP ili kombinacije 8-Br-cAMP i 8-Br-cGMP nije stimuliralo fosforilaciju PDE5 u PKG I −/− aortalnim SMC-ovima. Ovi eksperimenti daju nedvosmislen dokaz da je fosforilacija PDE5 in vivo pretežno posredovana putem cGMP/PKG I, a ne putem cAMP/PKA puta. 29

U srodnim studijama pokazalo se da je PDE5 važan regulator cGMP signalizacije u trombocitima. U tim stanicama NEMA donora poput GSNO (S-nitrosoglutation) proizvode iznimno brzo povećanje praćeno brzim padom intracelularnog cGMP-a. Vremenski ovisna promjena aktivnosti PDE5 i fosforilacije korelirala je s tim brzim padom iako nije uočena desenzibilizacija gvanilil ciklaze. 30

Vezivanje cGMP na GAF domenu izravno aktivira PDE5 katalitičku aktivnost

Budući da cGMP vezanje na PDE2 uzrokuje aktivaciju njegove katalitičke aktivnosti 31, postavilo se pitanje uzrokuje li ili ne vezanje cGMP na GAF domenu PDE5 sličnu aktivaciju. Iako se sumnjalo, dugi niz godina nisu pronađeni dokazi koji bi poduprli ovu ideju.

Jedan pristup ovom problemu koristio je fluorescentni analog cGMP (Ant-cGMP-2′-O-antraniloil cGMP), koji se slabo vezao za GAF domenu, ali je bio razuman supstrat za katalitičku domenu. 32 Međutim, aktivacija katalitičke aktivnosti vezanjem cGMP nije izravno dokazana.

U novije vrijeme, izravna aktivacija PDE5 nakon vezanja cGMP na regulatornu domenu GAF A zabilježena je u studiji koja je koristila rekombinantni PDE5. Kada je PDE5 bio preinkubiran s cGMP, uočena je velika (do 10 puta), vremenski ovisna aktivacija PDE5 (slika 4A). 33 PDE5 bi se također mogao reaktivirati nakon dodavanja drugog dijela cGMP-a u smjesu za predinkubiranje. cGMP-inducirana aktivacija PDE5 bila je najveća kada je aktivnost PDE5 ispitana na 0,1 μmol/L cGMP (9 do 11 puta). Pri 1,0 μmol/L cGMP, aktivacija PDE5 bila je samo 2 do 3 puta, a pri 10 μmol/L cGMP nije otkrivena aktivacija (slika 4B). Uočena aktivacija PDE5 nije bila rezultat fosforilacije PDE5 jer mutacija mjesta fosforilacije (serin 92) u alanin nije promijenila obrazac aktivacije PDE5 pomoću cGMP-a.

Slika 4. A, PDE5 se izravno aktivira vezivanjem cGMP na GAF A domenu PDE5. Mišji rekombinantni PDE5 eksprimiran u stanicama HEK 293 preinkubiran je s 50 μmol/L cGMP na ledu (ispunjeni trokuti), a nakon odgovarajućih razrjeđenja, aktivnost PDE5 je ispitana s 0,1 μmol/L cGMP tijekom 5 minuta na 30°C. Dodatni dio od 50 μmol/L cGMP je dodan u smjesu za predinkubaciju 60 minuta nakon početka predinkubacije kao što je označeno strelicom (otvoreni trokuti). Aktivnost PDE5 izražena je kao pmol · min -1 · μg -1 proteina. B, Predtretman PDE5 s mAb/P3B2 blokira cGMP-induciranu aktivaciju PDE5 i smanjuje bazalnu aktivnost PDE5. Aktivnost PDE5 izmjerena je na 0,1 μmol/L, 1,0 μmol/L ili 10 μmol/L cGMP. Uzorci su analizirani bez ikakvih tretmana (kontrola) ili nakon preinkubacije s 50 μmol/L cGMP na ledu (+cGMP), ili nakon preinkubacije s mAb/P3B2 tijekom 30 minuta na ledu (+mAb/P3B2), ili s mAb/P3B2 za 30 minuta, a zatim s 50 μmol/L cGMP (+mAb/P3B2+cGMP). Aktivnost PDE5 izražena je kao postotak kontrole, a kontrolna (nestimulirana) aktivnost PDE5 definirana je kao 100%. Adaptirano od Rybalkin SD, Rybalkina IG, Shimizu-Albergine M, Tang X-B, Beavo JA. PDE5 se pretvara u aktivirano stanje nakon što se cGMP veže na GAF A domenu. EMBO J. 200322:469–478.

Kako bi se potvrdilo da je učinak aktivacije PDE5 posljedica izravnog učinka zauzetosti cGMP mjesta vezanja cGMP, pronađeno je da mišje monoklonsko protutijelo (mAb/P3B2), generirano protiv GAF domene PDE5, može značajno blokirati cGMP vezanje za GAF A domenu PDE5. Kada je ovo monoklonsko protutijelo koje blokira cGMP primijenjeno prije preinkubacije cGMP, potpuno je spriječilo aktivaciju PDE5 i uvelike smanjilo hidrolitičku aktivnost PDE5 (slika 4B). Ovi podaci snažno ukazuju da cGMP vezan za svoju GAF domenu pokazuje veliki stimulativni učinak na katalitičku domenu PDE5, a bez takvog učinka PDE5 ima samo vrlo nisku intrinzičnu hidrolitičku aktivnost.

Čini se da je vezanje cGMP-a potrebno i dovoljno za postizanje pune aktivacije PDE5, jer in vitro fosforilacija aktiviranog PDE5 nije pokazala nikakvu dodatnu aktivaciju. Poznato je da je vezanje cGMP-a na GAF domenu neophodno za fosforilaciju PKG-om i da fosforilacija povećava prividni afinitet za vezanje cGMP-a. 27 Stoga se čini da ono što fosforilacija PDE5 stvarno čini in vivo je stabilizacija cGMP-vezanog, aktiviranog stanja enzima. To vjerojatno objašnjava zašto većina studija pokazuje 2-struku ili manju aktivaciju kada se analizira na 1 μmol/L supstrata. Štoviše, budući da je PDE5 selektivan supstrat za PKG, status fosforilacije PDE5, koji je u pozitivnoj korelaciji s promjenama aktivnosti PKG, može se koristiti kao in vivo specifičan marker za aktivaciju PKG u tkivima kao što su glatki mišići, trombociti i mali mozak koji sadrže i PKG i PDE5.

Zajedno, ovi podaci sugeriraju da PDE5 može postojati u najmanje dva različita konformacijska stanja in vivo: neaktivirana i aktivirana nakon vezanja cGMP (slika 5). Neaktivirani PDE5 je u stanju s niskom intrinzičnom katalitičkom aktivnošću koja se može reverzibilno pretvoriti u aktivirano stanje nakon vezanja cGMP. Ova reverzibilna konformacijska stanja PDE5 posjeduju različita kinetička i inhibitorna svojstva. Na primjer, cGMP-aktivirani PDE5 pokazao je veću osjetljivost prema PDE5 specifičnom inhibitoru sildenafilu u usporedbi s neaktiviranim PDE5. IC50 za inhibiciju sildenafila opao je s 2,1 na 0,63 nmol/L kada je aktivnost PDE5 ispitana pri koncentraciji supstrata od 0,1 μmol/L cGMP.

Slika 5. PDE5 se izravno aktivira nakon što se cGMP veže na njegovu GAF A domenu. Bez vezanog cGMP-a, PDE5 je u neaktiviranom stanju. PDE5 se pretvara u aktivirano stanje nakon vezanja cGMP na GAF A domenu. PKG fosforilira samo aktivirani PDE5. Adaptirano od Rybalkin SD, Rybalkina IG, Shimizu-Albergine M, Tang X-B, Beavo JA. PDE5 se pretvara u aktivirano stanje nakon što se cGMP veže na GAF A domenu. EMBO J. 200322:469–478.

Nedavno je pokazano da bi vezanje cGMP na mjesta za vezanje cGMP moglo povećati vezanje 3 H-sildenafila na katalitičko mjesto. 34 Metodom disocijacije razmjene 3 H-sildenafila pronađene su dvije vrijednosti KD (12 i 0,83 nmol/L), što implicira postojanje dva “konformera” katalitičkog mjesta PDE5.

Zanimljivo je da je također pronađeno da je sposobnost PDE5 da se izravno aktivira cGMP-om ograničena na relativno svježe pripravke. 33 PDE5 je postupno izgubio svoju osjetljivost na cGMP stimulaciju nakon tjedan dana skladištenja na ledu. Iako mehanizam ove promjene nije određen, ovaj učinak vjerojatno objašnjava zašto cGMP-inducirana aktivacija PDE5 nije ranije prijavljena jer su se dugotrajni protokoli pročišćavanja u više koraka tradicionalno koristili za njegovu izolaciju. Ostaje da se utvrdi da li PDE5 aktiviran skladištenjem predstavlja nepovratno "umjetno" ili neko drugo konformacijsko stanje.

CGMP-inducirana, PKG neovisna aktivacija PDE5 također je prijavljena u trombocitima osiromašenim PKG. 35 Nakon dodavanja 500 μmol/L cGMP ovim stanicama aktivnost PDE5, ispitana na 1,0 μmol/L cGMP, povećana je oko 2,5 puta. Slična razina aktivacije PDE5 (2,9 puta) uočena je u kontrolnim uzorcima, gdje je PDE5 fosforiliran PKG. Zanimljivo je da je kinetika akumulacije cGMP-a u trombocitima s nedostatkom PKG I tretiranih s 300 μmol/L GSNO bila ista kao u trombocita divljih miševa, tj. vrlo brz porast cGMP-a za 5 sekundi nakon čega slijedi potpuni nestanak cGMP-a. unutar 15 sekundi. Dok je PDE5 u kontrolnim trombocitima bio znatno fosforiliran, PDE5 u trombocitima PKG −/− miševa bio je samo malo fosforiliran, vjerojatno PKA.

Je li GAF domena PDE5 vjerojatna meta za razvoj novih lijekova?

Svi do sada opisani inhibitori PDE5 razvijeni su kao kompetitivni inhibitori na aktivnom mjestu. Činjenica da cGMP vezanje na GAF domenu PDE5 može uzrokovati aktivaciju sugerira da bi se i antagonisti i agonisti aktivnosti PDE5 mogli razviti na temelju vezanja na ovo mjesto. Budući da svi PDE dijele visok stupanj sličnosti sekvenci u svojoj katalitičkoj domeni, profili selektivnosti većine inhibitora barem se djelomično preklapaju. Na primjer, zaprinast, poznati antagonist katalitičkog mjesta PDE5, također je relativno dobar inhibitor PDE1. Što je veća homologija između PDE-a, veća je vjerojatnost da će se vezati za iste inhibitore. Iz tog razloga, mnogi inhibitori PDE5 također su PDE6 inhibitori. Čak i sildenafil, koji je jedan od najspecifičnijih inhibitora PDE5, još uvijek može inhibirati fotoreceptor PDE6 u rasponu koncentracija nmol/L. Vjerojatno je da ova inhibicija može objasniti vizualne nuspojave koje neki pacijenti prijavljuju nakon kliničke primjene sildenafila. 8 Tadalafil, noviji inhibitor PDE5, zabilježen je kao mnogo specifičniji za PDE5 nego za PDE6, ali je relativno dobar inhibitor PDE11, s IC50 od 37 nmol/L. Jedan od najnovijih selektivnih inhibitora PDE5, vardenafil, ima IC50 za inhibiciju PDE11 od 162 nmol/L. Sildenafil inhibira PDE11 IC50 od 2730 nmol/L. 17

Stoga, jedna moguća prednost ciljanja cGMP vezanja na GAF A domenu PDE5 (antagonisti cGMP) može biti drugačiji profil selektivnosti nego što je postignut s antagonistima katalitičkog mjesta. Suprotno tome, agonist mjesta vezanja cGMP-a također bi mogao biti moguć. Od takvog bi se sredstva očekivalo da održava unutarstanične razine cGMP vrlo niskim. To bi moglo biti korisno, na primjer, u liječenju neuronske ekscitotoksičnosti ili toksičnosti povezane s ishemijom i reperfuzijom.

PDE1: kalmodulinom stimulirane cikličke nukleotidne fosfodiesteraze

PDE1 varijante spajanja i organizacija domene

Ca 2+/kalmodulinom stimulirani PDE (CaM-PDE) čine veliku obitelj enzima, kodiranih s tri gena, PDE1A, PDE1B i PDE1C. 36 Višestruke amino-terminalne ili karboksi-terminalne varijante spajanja identificirane su unutar svakog gena. CaM-PDE sadrže dvije domene za vezanje Ca 2+/kalmodulina i vezanje i Ca 2+ i kalmodulina je potrebno za potpunu aktivaciju ovih PDE. Stupanj aktivacije Ca 2+ /CaM varira od 3 do 10 puta ili čak više ovisno o izvoru, tkivu i čistoći enzimskog pripravka. In vitro, bazalno nestimulirano stanje PDE1 dobiva se uklanjanjem Ca 2+ s Ca 2+ kelatorom (npr. EGTA).

CaM-PDE mogu hidrolizirati i cGMP i cAMP, ali specifičnost supstrata se razlikuje među različitim genima. PDE1A i PDE1B dijele isti visok afinitet za cGMP, ali imaju različite i niže afinitete za cAMP. Afinitet PDE1B za cAMP veći je od PDE1A. PDE1C se razlikuje od PDE1A i PDE1B po svojoj sposobnosti da podjednako dobro hidrolizira cGMP i cAMP. Varijante spajanja iz iste obitelji gena zadržavaju slične karakteristike supstrata. Međutim, nađeno je da varijacije na amino-terminalnom kraju imaju duboke učinke na sposobnost kalmodulina da inducira aktivaciju PDE1. Na primjer, goveđi PDE1A1 i PDE1A2 dijele identičan proteinski slijed osim 18 aminokiselina na samom N-terminalnom dijelu, ali polovina maksimalne aktivacije PDE1A1 kalmodulinom iznosi 0,1 nmol/L, dok je za PDE1A2 10 puta veća. 37

PDE1A i tolerancija na nitrate

Ranije se pokazalo da je aktivnost enzima PDE stimulirana Ca 2+/CaM važna za regulaciju razine i reaktivnosti vaskularnog cGMP (slika 2). 38 Većina vazokonstriktora, kao što su norepinefrin (NE), angiotenzin II (Ang II) i endotelin-1 (ET-1) povećavaju intracelularni Ca 2+, za koji se smatra da je glavni mehanizam kontrakcije glatkih mišića posredovanih vazokonstriktorima. Sukladno tome, utvrđeno je da je PDE stimuliran sa Ca 2+/CaM glavni enzim odgovoran za hidrolizu cGMP u aorti kunića stimuliranoj vazokonstriktorima kao što je NE. 39 Aktivacija PDE1A1 povećanjem koncentracije Ca 2+ dokazana je u uzgojenim SMC aorte štakora. Na primjer, otkriveno je da Ang II stimulira aktivnost PDE1A1 u SMC aorte štakora, vjerojatno preko Ang II posredovanog povećanja koncentracije Ca 2+. 40 Inhibicija PDE1A1 blokirala je Ang II posredovano slabljenje nakupljanja cGMP izazvanog ANP-om, što sugerira da PDE1A1 posreduje inhibicijski učinak Ang II na akumulaciju cGMP.

Uz brzu alosteričku regulaciju PDE1A1 i PDE5A1 pomoću Ca 2+ odnosno cGMP, dugoročne razine ekspresije PDE1A1 i 5A1 reguliraju se različitim farmakološkim reagensima ili patofiziološkim postavkama. Na primjer, aktivnost enzima PDE1A1, razina proteina i ekspresija mRNA selektivno se povećavaju u modelu štakora tolerantnog na nitrate induciranog kroničnim liječenjem nitroglicerinom (NTG). 40 NTG ostaje jedan od najistaknutijih lijekova u liječenju stabilne i nestabilne angine pektoris. 41 Kada se daje akutno, NTG ima jake vazodilatatorne kapacitete na arterijama, venama i koronarnim kolateralnim žilama. Međutim, kronična primjena NTG ograničena je zbog brzog razvoja tolerancije na nitrate. 42,43 Predloženo je nekoliko mehanizama za objašnjenje ovog fenomena kao što je neurohormonska proturegulacija (tzv. pseudotolerancija), 44 ili mehanizmi svojstveni samom vaskularnom tkivu, kao što je smanjenje unutarstanične SH-grupe, desenzibilizacija topive gvanilil ciklaze (sGC). ), 45 povećava vaskularnu proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta 46 ili povećava aktivnost PDE (tzv. istinska vaskularna tolerancija). 47 Također se pokazalo da je kronično liječenje NTG povezano s povećanjem osjetljivosti na vazokonstriktore kao što su kateholamini, Ang II, KCl i serotonin 48 od kojih svi mogu ugroziti vazodilatatorni kapacitet NTG, pridonoseći tako toleranciji.

NTG izaziva vazorelaksaciju oslobađanjem NO. NO može aktivirati sGC i povećati razinu cGMP u tkivu. 49 Kao što je ranije opisano, cGMP zauzvrat aktivira PKG, za koji se pokazalo da posreduje u vazorelaksaciji putem fosforilacije proteina koji reguliraju kontraktilnost. Bez obzira na mehanizme tolerancije, čini se da je povezan ne samo sa smanjenim povišenjem cGMP-a kao odgovorom na naknadno izlaganje nitratima, već i kao odgovor na vazokonstriktore kao što je NE. 45 Zanimljivo je da bi funkcionalne posljedice smanjene intracelularne razine cGMP-a lijepo objasnile oba fenomena uočene u postavci tolerancije, tj. smanjenu osjetljivost na NTG kao i povećanu osjetljivost na vazokonstriktore. Dakle, kao što je ranije spomenuto, aktivnost i ekspresija Ca 2+ /CaM stimuliranog PDE1A1, ali ne i PDE5A1, selektivno je inducirana u aorti štakora liječenoj tijekom 3 dana klinički relevantnom dozom (10 μg · kg -1 · min -1 ) NTG. 40 PDE inhibitor vinpocetin djelomično je vratio osjetljivost tolerantne vaskulature na naknadno izlaganje NTG. U vaskulaturi, PDE1A1 je primarno prisutan u SMC. 50 Stoga se promjene u ekspresiji PDE1A1 u intaktnim aortama nakon liječenja NTG najvjerojatnije javljaju u SMC-ima. U posudama tolerantnim na nitrate, utvrđeno je da je povećanje osjetljivosti na NE posljedica većeg učinka na snižavanje cGMP NE u posudama tolerantnim na nitrate. 45 Ova zapažanja zajedno snažno podupiru ideju da indukcija PDE1A1 u žilama tolerantnim na nitrate može biti jedan od mehanizama kojim se desenzibilizira vazodilatacija posredovana NO/cGMP i senzibilizira vazokonstrikcija posredovana Ca 2+. 40 Selektivna inhibicija ekspresije i/ili aktivnosti PDE1A1 stoga bi mogla biti novi terapijski pristup za ograničavanje tolerancije na nitrate.

Konačno, kod kultiviranih SMC štakora, tretman Ang II brzo i prolazno regulira ekspresiju mRNA PDE1A1 i PDE5A1, nakon čega slijedi povećana razina proteina i aktivnosti enzima. 51 Molekularni mehanizam za Ang II regulaciju ekspresije PDE1A1 i PDE5A1 izgleda vrlo sličan onom neposrednog ranog gena, c-fos. Ova opažanja sugeriraju da je promjena ekspresije mRNA PDE1A1 i PDE5A1 važan mehanizam za regulaciju cGMP-hidrolizirajuće aktivnosti u vaskularnim SMC u fiziološkim i patološkim uvjetima. Međutim, kao što je objašnjeno u sljedećem odjeljku, ljudski i neljudski (npr. štakori ili majmuni) SMC imaju različite profile ekspresije PDE. Stoga, budući da se modeli otporni na nitrate uglavnom temelje na eksperimentima s neljudskim tkivima, potrebno je provesti studije na ljudskim žilama.

PDE1C i proliferacija glatkih mišićnih stanica ljudske arterije
PDE1C se inducira u proliferirajućim ljudskim SMC

Kao što je ranije spomenuto, sve izoforme PDE1, PDE1A, PDE1B i PDE1C, mogu se eksprimirati u arterijskim SMC pod različitim uvjetima i u različitim vrstama. Međutim, čini se da ekspresija PDE1A i PDE1B nije regulirana proliferativnim stanjem SMC. 52 Ovaj dio će se usredotočiti na PDE1C, izoformu koju aktivira Ca 2+/kalmodulin kao i svi drugi PDE1, ali, za razliku od PDE1A i PDE1B, ima sposobnost hidroliziranja cGMP i cAMP s jednakom učinkovitošću. 53

Glatki mišići intaktne ljudske torakalne aorte odraslih ili novorođenčadi ne izražavaju PDE1C. 52 Nasuprot tome, PDE1C je visoko eksprimiran u glatkim mišićima netaknute ljudske fetalne aorte, koja sadrži obilje proliferirajućih stanica mjereno ekspresijom proliferirajućeg staničnog nuklearnog antigena (slika 2).54 Nadalje, postoji izrazita indukcija ekspresije i aktivnosti PDE1C u SMC aorte odraslih i novorođenčadi ljudi koji su stimulirani na proliferaciju u kulturi. 52 Dakle, u upečatljivoj suprotnosti s intaktnom ljudskom aortom odrasle osobe ili novorođenčeta, kada su SMC kultivirani i analizirani HPLC-om, uočena je visoka aktivnost PDE1C (Slika 6A). Kao što se očekivalo, PDE1C hidrolizira i cGMP i cAMP u prisutnosti Ca 2+/kalmodulina (označen čvrstim simbolima na slici 6A), a protein PDE1C prepoznaju antitijela stvorena protiv C-kraja rekombinantnog PDE1C (slika 6A), ali ne i antitijelima protiv PDE1A ili PDE1B. PDE1C induciran u proliferativnim ljudskim SMC u kulturi čini čak 85% ukupne cGMP-hidrolizirajuće aktivnosti i 80% ukupne cAMP-hidrolizirajuće aktivnosti (pri niskim koncentracijama supstrata) u prisutnosti Ca 2+/kalmodulina. Palmer i Maurice nedavno su potvrdili prisutnost visoke aktivnosti PDE1C u kultiviranim ljudskim aortalnim SMC. 55 Obilna aktivnost PDE1C također je pronađena u kultiviranim ljudskim SMC-ovima izoliranim iz karotidne arterije, te brojnim ljudskim proliferirajućim SMC-ima iz različitih organa koji sadrže glatke mišiće, što pokazuje da indukcija PDE1C nije ograničena na kultivirane SMC-ove aorte. 52

Slika 6. SMC ljudi i majmuna imaju različite obrasce ekspresije PDE: PDE1C se inducira u ljudskim SMC u primarnoj kulturi, ali ne i u SMC majmuna. Tekućinska kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC) – profil eluiranja aktivnosti PDE u odsutnosti ili prisutnosti Ca 2+/kalmodulina iz SMC aorte ljudi (A) i majmuna (B) u primarnoj kulturi. Aktivnost PDE u svakoj frakciji je ispitana ili s 1 μmol/L cAMP (trokuti) ili 1 μmol/L cGMP (kvadrati) bez Ca 2+ (u prisutnosti 1 mmol/L EDTA otvorenih simbola) ili s 1 mmol/L CaCl2 i 4 μg/mL kalmodulina (ispunjeni simboli). Imunoblotovi s vrpcama PDE1A, PDE1B, PDE1C i PDE5 prikazani su iznad njihovih kromatografskih frakcija. Adaptirano od Rybalkin SD, Bornfeldt KE, Sonnenburg WK, Rybalkina IG, Kwak KS, Hanson K, Krebs EG, Beavo JA. Kalmodulinom stimulirana ciklička nukleotidna fosfodiesteraza (PDE1C) inducira se u glatkim mišićnim stanicama ljudskih arterija sintetskog, proliferativnog fenotipa. J Clin Invest. 1997100:2611–2621.

Gore navedene studije pokazale su jasnu korelaciju između indukcije ekspresije i aktivnosti PDE1C, s jedne strane, i proliferativnog kapaciteta ljudskih SMC u fetalnoj aorti i kultiviranih humanih SMC. Kako bi se dodatno potvrdilo da je ekspresija PDE1C regulirana proliferativnim stanjem stanice, ljudski SMC su stavljeni na fibrilarni kolagen tipa I. Ovaj tip kolagena rezultira potpunim zaustavljanjem rasta SMC-a 56 i fenotipa sličnog SMC-ima pronađenim u intaktnoj aorti. 57 U skladu s hipotezom da je ekspresija PDE1C regulirana proliferativnim stanjem, kultivirani humani SMC-ovi naneseni na fibrilarni kolagen tipa I imaju izrazito smanjenu ekspresiju PDE1C. 54 S druge strane, kultivirani ljudski SMC-ovi izloženi niskim serumskim uvjetima ne smanjuju ekspresiju PDE1C u značajnoj mjeri. Zanimljivo je da je mirovanje izazvano fibrilarnim kolagenom tipa I izraženije od onog izazvanog povlačenjem seruma. Dakle, stanice koje su postavljene na fibrilarni kolagen zahtijevaju više vremena da uđu u S fazu nakon otpuštanja iz fibrilarnog kolagena u usporedbi sa stanicama koje nisu prethodno bile izložene fibrilarnom kolagenu. Vjerojatno je da fibrilarna struktura kolagena rezultira izlaskom stanica iz staničnog ciklusa (većina stanica bi bila u G0), dok povlačenje seruma rezultira G1 uhićenje. Dakle, ekspresija PDE1C je najprije smanjena kada SMC izađe iz staničnog ciklusa u G0.

Konačno, postoji jasna korelacija između vremena potrebnog za indukciju sinteze DNA i indukcije ekspresije PDE1C u SMC-ovima koji su oslobođeni iz fibrilarnog kolagena tipa I i zamijenjeni na plastiku kulture tkiva u prisutnosti seruma (slika 7A). Zajedno, ovi eksperimenti pokazuju da se ekspresija PDE1C ne samo pojačano regulira kada SMC-ovi uđu u stanični ciklus, već je također smanjena kada se inducira stanični mir, te sugeriraju da ili potpuni mir ili izlazak SMC-a iz staničnog ciklusa u G0 potrebna je za smanjenje ekspresije PDE1C.

Slika 7. A, indukcija PDE1C korelira s napredovanjem staničnog ciklusa. Imortalizirane ljudske aorte SMC (FLTR stanice) postavljene su na fibrilarni kolagen 2 dana. Stanice su zatim presvučene u neobložene posude s 24 jažice u prisutnosti 10% FBS. Sinteza DNA mjerena je kao ugradnja [3H]timidina i izražena kao srednja vrijednost ±SD trostrukih uzoraka. Ekspresija PDE1C mjerena je u duplikatu uzoraka Western blot analizom. B, PDE1C antisense oligonukleotidi inhibiraju SMC proliferaciju. FLTR stanice postavljene na fibrilarni kolagen tijekom 2 dana kako bi se smanjila bazalna ekspresija PDE1C tretirane su s PDE1C antisense ili kontrolnim (obrnutim) oligonukleotidima. Ekspresija PDE1C izmjerena je Western blot analizom u stanicama prije ponovnog postavljanja (kontrola) ili stanica ponovno postavljenih 3 dana na neobložene ploče. Stanice tretirane s PDE1C antisense oligonukleotidima ili kontrolnim oligonukleotidima (obrnuto) su također izbrojane. Kontrola (stanice na fibrilarnom kolagenu) je postavljena na 100%. Prilagođeno prema Rybalkin SD, Rybalkina I, Beavo JA, Bornfeldt KE. Ciklična nukleotidna fosfodiesteraza 1C potiče proliferaciju glatkih mišićnih stanica ljudskih arterija. Circ Res. 200290:151–157.

PDE1C regulira proliferaciju ljudskih SMC

Gore opisane studije pokazuju da je ekspresija PDE1C izrazito regulirana staničnim ciklusom u humanim SMC. Znači li to da je indukcija PDE1C potrebna za napredovanje staničnog ciklusa i staničnu proliferaciju? Trenutno su dostupna dva načina za rješavanje ovog pitanja: inhibicija aktivnosti PDE1C korištenjem farmakoloških inhibitora i smanjenje ekspresije PDE1C antisens ili tehnikama interferencije RNA PDE1C. Specifične izoforme PDE pokazuju različitu reakciju na farmakološke inhibitore. 53 Međutim, budući da specifični inhibitori PDE1C nisu bili dostupni, za inhibiciju aktivnosti PDE1C korišten je 8-metoksimetil 3-izobutil-1-metilksantin (8MM-IBMX) u koncentracijama od 10 do 30 μmol/L. Tretman uzgojenih ljudskih SMC s 8MM-IBMX rezultirao je značajnom redukcijom sinteze DNA. 54 Ovi učinci 8MM-IBMX vjerojatno su posljedica inhibicije PDE1C, jer iste koncentracije ne inhibiraju značajno druge cAMP PDE (PDE3 i PDE4). Nadalje, PDE5 inhibitori nisu oponašali učinke 8MM-IBMX. Za daljnju provjeru regulatorne uloge za PDE1C u proliferaciji humanih SMC, provedene su antisens studije PDE1C. Liječenje PDE1C antisense oligonukleotidima rezultiralo je smanjenom ekspresijom PDE1C bez utjecaja na ekspresiju PDE5, a također je značajno inhibirala proliferaciju SMC (Slika 7B). Zajedno, ovi rezultati snažno upućuju na to da indukcija PDE1C potiče proliferaciju ljudskih arterijskih SMC-a i može biti potrebna za njezino pojavljivanje.

Je li učinak PDE1C na proliferaciju SMC posredovan hidrolizom cAMP ili cGMP, ili oboje? Vjeruje se da su in vivo SMC-ovi izloženi i agensima koji podižu cAMP i cGMP koje oslobađa endotel. Prostaciklin (PGI2) je primjer agensa koji inducira cAMP koji se oslobađa iz endotela, dok NO djeluje, barem djelomično, podizanjem razine cGMP u ciljnim stanicama (slika 2). Poznato je da i cGMP i cAMP inhibiraju proliferaciju SMC in vitro i in vivo. 58 Sukladno tome, proliferaciju SMC kod ljudi mogu inhibirati farmakološki inhibitori selektivni za PDE koji hidrolizira cAMP ili za PDE koji hidrolizira cGMP. 54 Čini se da je učinak cGMP-a na proliferaciju SMC složeniji od cAMP-a. 59,60 Za razliku od potpune supresije prolaska staničnog ciklusa induciranog 8-Br-cAMP (analog cAMP djelomično otporan na hidrolizu posredovanu PDE), čini se da 8-Br-cGMP odgađa, ali ne blokira, G1-na-S prijelaz u SMC-ovima pupčane arterije novorođenčadi ljudi. 60 Ove stanice izražavaju i PKA i PKG, efektore cAMP i cGMP signalizacije. Dakle, molekularni putovi regulirani cAMP i cGMP mogu biti različiti. Ovaj koncept dodatno su poduprli nalazi da su i 8-Br-cAMP i 8-Br-cGMP potpuno potisnuli cdk4 aktivnost stimuliranu faktorom rasta (PDGF) stimuliranu trombocitima, ali da je samo 8-Br-cAMP rezultirao indukcijom cdk inhibitor p27 Kip1 i trajna supresija aktivacije cdk2. 60 Alternativno, 8-Br-cAMP i 8-Br-cGMP mogu se hidrolizirati različitim brzinama pomoću PDE eksprimiranih u SMC-ovima ljudske pupčane arterije, što rezultira prolaznijim učinkom 8-Br-cGMP u usporedbi s 8-Br-cAMP . U tom kontekstu, također može biti relevantno da analozi cAMP i naknadna aktivacija PKA mogu imati negativnu povratnu informaciju na aktivnost PDE1C. 61

U humanim SMC, inhibicija PDE1C rezultira povećanjem razine cAMP i cGMP, 54 kao što bi se očekivalo na temelju enzimskih karakteristika PDE1C. Zapravo, djelovanje cAMP-a i cGMP-a nije uvijek nepovezano. Na primjer, nedavna studija pokazuje da inhibitori PDE5 smanjuju proliferaciju SMC-ova koronarnih arterija goveda preko cGMP elevacije i naknadne inhibicije PDE3, cGMP-inhibibilnog PDE-a koji hidrolizira cAMP. 62 Kroz ovaj mehanizam, povećane unutarstanične razine cGMP mogu rezultirati povišenjem razine cAMP (vidjeti dio o PDE3). Učinci PDE1C na proliferaciju SMC mogu stoga biti posljedica hidrolize cGMP i cAMP.

Zašto se PDE1C inducira u proliferirajućim ljudskim SMC-ovima, ali ne i u SMC-ovima drugih vrsta?

Do danas je uočena aktivnost PDE1C uočena samo u proliferirajućim ljudskim SMC-ovima i, začudo, ne i u proliferirajućim SMC-ovima aorte od neljudskih primata (majmun s repom, Macaca nemestrina, i babuni), goveđi SMC, svinjski SMC, štakorski SMC ili ovčiji SMC. 52,63 S druge strane, sve ove vrste izražavaju PDE1A i/ili PDE1B. Kao što je prikazano na slici 6B, profil aktivnosti PDE u proliferirajućim aortalnim SMC-ovima izoliranim od majmuna s pramenom upadljivo se razlikuje od profila SMC-a izoliranih iz ljudske aorte (Slika 6A). I ljudski i majmunski SMC eksprimiraju PDE5 i PDE3/4, ali dok ljudski SMC eksprimiraju PDE1C, SMC majmuna eksprimiraju PDE1B (slika 6). Ovi nalazi pokazuju da postoje značajne razlike u ekspresiji i aktivnostima PDE1C u SMC-ima različitih vrsta. Možemo samo nagađati o razlogu indukcije PDE1C u proliferirajućem humanom SMC-u, za razliku od SMC-a dobivenih od drugih vrsta. Moguće je da ljudski SMC imaju potrebu za opsežnijom i kontroliranom hidrolizom cAMP i cGMP tijekom progresije staničnog ciklusa nego SMC mnogih drugih vrsta. Unutarstanične razine kalcija strogo su regulirane tijekom progresije staničnog ciklusa, 64 a indukcija PDE1C može poslužiti kao sredstvo za koordinaciju mitogene kalcijeve signalizacije s istodobnim smanjenjem razina inhibicije rasta cGMP i cAMP. Bez obzira na razlog indukcije PDE1C u proliferirajućim ljudskim SMC-ima, potrebno je obratiti posebnu pozornost pri ekstrapolaciji rezultata dobivenih selektivnim inhibitorima PDE u studijama na životinjama u klinička ispitivanja na ljudima.

S obzirom na ključnu ulogu koju očito igra PDE1C u regulaciji proliferacije glatkih mišića ljudi, ne bi bilo iznenađujuće da se mogu razviti terapeutska sredstva koja ciljaju aktivnost PDE1C. Očekuje se da će takvi agensi minimizirati višak proliferativnog odgovora glatkih mišića koji se javlja kao odgovor na ozljedu i upalu uzrokovanu balonskom angioplastikom ili stentiranjem, a možda čak i hipertenzijom. Vjerojatno bi također bili manje toksični od mnogih trenutno korištenih agenasa.

PDE3: cGMP-inhibirani PDE

I PDE3A i 3B su izraženi u većini vaskularnih glatkih mišićnih slojeva. Iako oni možda nisu dominantni sudionici hidrolize cGMP-a u ovim vaskularnim slojevima, ili u tom slučaju u kardiocitima, PDE3 vjerojatno regulira cGMP in vivo. PDE3 nemaju zasebne alosterične cGMP-vezujuće domene i nisu regulirane cGMP-om na isti način kao GAF domena koja sadrži PDE (PDE2 i PDE5). Međutim, katalitička mjesta PDE3 imaju sličan visok afinitet za cAMP i cGMP, ali Vmax za cAMP je mnogo veći (4 do 10 puta) nego za cGMP. Stoga je mehanizam kojim cGMP inhibira katalitičku aktivnost PDE3 kroz natjecanje s cAMP na katalitičkom mjestu. Dakle, cGMP djeluje kao prolazni prekidač koji uzrokuje inhibiciju hidrolitičke aktivnosti cAMP od strane PDE3 dok se sam ne hidrolizira.

Organizacija i funkcija PDE3 domene

Obitelj PDE3 sadrži dva gena, PDE3A i PDE3B. Organizacija domena oba je prilično slična i uključuje konzerviranu katalitičku domenu, divergentnu N-terminalnu regiju sa svojom membranskom asocijacijskom domenom i C-terminalni hidrofilni kraj (Slika 1). PDE3A i PDE3B dijele većinu homologije u katalitičkoj domeni, uključujući jedinstvenu inserciju od 44 aminokiseline, koja se ne nalazi u katalitičkim domenama PDE iz bilo koje druge obitelji. Međutim, ove se izoforme uvelike razlikuju i na N-terminalnom i na C-terminalnom kraju. 65 Studije različitih skraćenih oblika PDE3 otkrile su da N-terminalni kraj nije potreban za održavanje pune katalitičke aktivnosti i osjetljivosti na PDE3 specifične inhibitore, iako bi mogao biti važan za lokalizaciju. 65

Dvije izoforme PDE3 su različito izražene. PDE3A se izražava u glatkim mišićima krvnih žila, trombocitima, kardiocitima i oocitima. U glatkim mišićima krvnih žila štakora i ljudi izraženi su i PDE3A i PDE3B, ali imaju različite substanične lokalizacije. 55,66 PDE3A je pronađen uglavnom u topivoj frakciji, dok je PDE3B bio povezan s frakcijama čestica. PDE3B je također visoko izražen u masnim stanicama, hepatocitima i spermatocitima. 67

Obično se smatra da PDE3 uglavnom posreduje procese regulirane cAMP-om kao što su kontraktilnost srca, agregacija trombocita, opuštanje glatkih mišića i hormonska regulacija. 67 Mnogo se manje zna o uključenosti PDE3 u regulaciju cGMP signalizacije. Neka istraživanja su pokazala da agensi za podizanje cGMP mogu povećati razinu cAMP inhibirajući aktivnost PDE3. Na primjer, NO-inducirana inhibicija agregacije trombocita kunića djelomično je uzrokovana akumulacijom cAMP-a kao rezultatom inhibicije PDE3. 68 Također je sugerirano da su u ljudskim atrijalnim miocitima stimulacijski učinci NO-donora na srčanu kalcijevu struju posljedica cGMP inhibicije aktivnosti PDE3. 69 PDE3 je također predložen kao važna determinanta učinaka NO na bubrežnu vaskulaturu. 70

Međutim, nedavne studije na miševima s nedostatkom PKG I pokazale su da su visoke koncentracije donora NO mogle proizvesti dovoljno cGMP za postizanje izravne aktivacije PKA, dok niske koncentracije cGMP induciraju opuštanje glatkih mišića isključivo putem cGMP signalnog puta. 71 Stoga su potrebne daljnje studije kako bi se utvrdilo pod kojim uvjetima cGMP pojačava aktivnost PKA izravnom aktivacijom za razliku od neizravne inhibicijom PDE3.

PDE3 i razvoj kardiovaskularnih lijekova

Utvrđeno je da prva generacija inhibitora PDE3 (milrinon, vesnarinon, enoksimon) ima značajne vazodilatacijske i inotropne učinke in vitro i u studijama na životinjama. 53 U početnim kliničkim ispitivanjima vjerovalo se da ti inhibitori imaju pozitivan učinak u liječenju kroničnog kongestivnog zatajenja srca. 72 Međutim, dugoročni učinci oralne primjene milrinona otkrili su povećanje morbiditeta i smrtnosti bolesnika s teškim kroničnim zatajenjem srca. 73 Iako nije poznato jesu li korištene točne doze ili čak je li kardiotoksični učinak bio posljedica samo inhibicije PDE3, ovo neuspješno kliničko ispitivanje predstavljalo je dodatni izazov za razvoj inhibitora PDE3. Unatoč tim rezultatima, kratkoročna klinička primjena milrinona odobrena je za liječenje bolesnika s akutnim dekompenziranim zatajenjem srca. 74 Intravenska injekcija milrinon laktata (Primacor, Sanofi-Synthelabo Inc) može pružiti značajan, ali jako vremenski ograničen klinički učinak (ne dulje od 48 sati) i zahtijeva pomno praćenje elektrokardiografskih parametara ovih pacijenata.

Drugi inhibitor PDE3, cilostazol (Pletal, Otsuka America Pharmaceutical, Inc/Pharmacia Corporation), odobren je za liječenje intermitentne klaudikacije, vaskularne bolesti koju karakterizira bol u nogama. 75 Opet, ovaj lijek je kontraindiciran za bolesnike s kongestivnim zatajenjem srca. Novije generacije PDE3 specifičnih inhibitora vjerojatno će morati pokazati specifičnost tkiva ili izoforme koja bi trebala minimizirati učinke na srčano tkivo kako bi zadovoljila odobrenje.

Zaključci i perspektiva

Očekuje se da ćemo u sljedećih nekoliko godina naučiti mnogo više o tome koje specifične uloge pojedini PDE izozimi imaju u funkciji glatkih mišića. Također bismo trebali moći identificirati kako je transkripcija ovih PDE regulirana, koju ulogu(e) mogu igrati neki od novootkrivenih PDE-a (npr. PDE9), a posebno kako različite vrste koriste različite kombinacije PDE-a da reguliraju svoje ciklički procesi ovisni o nukleotidu. Čini se sasvim mogućim da će se identificirati nove uporabe za "tradicionalne" inhibitore PDE glatkih mišića poput Viagre i možda će se razviti novi lijekovi koji djeluju na druga mjesta PDE5 ili na aktivna mjesta drugih PDE eksprimiranih u glatkim mišićima krvnih žila.

Izvornik primljen 6. svibnja 2003. revizija primljena 7. srpnja 2003. prihvaćena 8. srpnja 2003.

Ovaj rad djelomično je podržao Grant-in-Aid od American Heart Association Washington Affiliate i NIH Grant HL62887 Karin E. Bornfeldt, NIH dodjeljuje DK21723 i HL44948 Josephu A. Beavu, a American Heart Association Grant 0030302T Chen .


Lijek koji je sada u kliničkim ispitivanjima za Parkinsonovu bolest jača srčane kontrakcije kod životinja

Prema rezultatima ranih studija na životinjama istraživača Johns Hopkins Medicine, lijek koji je trenutno u kliničkim ispitivanjima za liječenje simptoma Parkinsonove bolesti mogao bi jednog dana imati vrijednost za liječenje zatajenja srca.

Lijek, član klase spojeva poznatih kao inhibitori fosfodiesteraze (PDE) tipa I, pokazuje obećavajuće učinke na srca pasa i kunića, kao i na izolirane srčane stanice kunića, ponajviše povećanje snage kontrakcija srčanog mišića , kažu istraživači.

Ljudsko zatajenje srca je kronično stanje koje je često obilježeno slabljenjem srčanog mišića i njegovim naknadnim neuspjehom da pumpa dovoljno krvi. Trenutno su dostupni deseci lijekova za liječenje ili liječenje simptoma zatajenja srca, ali lijekovi koji poboljšavaju snagu kontrakcija srčanog mišića, kao što je dobutamin, nose rizik od opasnih komplikacija kao što je razvoj nepravilnih otkucaja srca.

Međutim, u njihovoj studiji, opisanoj u izvješću objavljenom u časopisu Cirkulacija 20. srpnja, istraživači Johns Hopkinsa pokazuju da novi spoj djeluje drugačije od postojećih lijekova, sugerirajući da bi njegova upotreba mogla biti sigurniji način za povećanje snage srčane kontrakcije.

Zatajenje srca pogađa oko 5,7 milijuna U.S.odrasle osobe, prema Centrima za kontrolu i prevenciju bolesti, te pridonosi procjeni jednom od devet smrtnih slučajeva. Standardno liječenje uključuje diuretike koji povećavaju proizvodnju mokraće kako bi spriječili da srce postane povećani inhibitori enzima koji pretvara angiotenzin (ACE) koji snižavaju krvni tlak i smanjuju opterećenje srca i beta blokatore koji štite od oštećenja srca zbog visokih razina hormona stresa adrenalina koji su uobičajeni kod zatajenja srca i koji pomažu u smanjenju opterećenja srca. Ne postoji lijek.

"Naši rezultati su intrigantni jer je do sada bio uglavnom neistražen teritorij za pronalaženje načina povećanja kontraktilnosti koji u konačnici ne šteti pacijentima", kaže David Kass, MD, profesor kardiologije Abraham i Virginia Weiss na Sveučilištu Johns Hopkins Medicinski fakultet i glavni istraživač studije.

Lijek istražen u novoj studiji, ITI-214, inhibira enzim PDE1, koji je dio veće obitelji fosfodiesteraze (PDE) od preko 100 takvih proteina. Svi PDE djeluju tako što razgrađuju jednu ili obje od dvije molekule: cAMP i cGMP, od kojih svaka služi kao molekularni glasnik unutar stanica. Svaki PDE ima vrlo specifične značajke, uključujući vrstu stanice u kojoj postoji i njihov položaj unutar te stanice, što im omogućuje da vrlo precizno prilagode cAMP i/ili cGMP.

PDE inhibitori djeluju tako što zaustavljaju razgradnju cAMP i cGMP, uzrokujući nakupljanje tih molekula kako bi mogli utjecati na proteine ​​da mijenjaju stanicu. Kod bolesti srca, aktivnost PDE može ograničiti korisne učinke cAMP ili cGMP, tako da inhibitori imaju potencijal djelovati kao terapija.

Kod miševa, napominje Kass, prijavljeno je da inhibitori PDE1 smanjuju abnormalno debeli srčani mišić uzrokovan visokim krvnim tlakom i šire krvne žile. Međutim, kod miševa srce uglavnom ima drugačiji oblik enzima PDE1 nego kod ljudi, tako da inhibitori PDE1 vjerojatno utječu na miševe drugačije od ljudi.

Psi i zečevi, na koje se ovo istraživanje fokusiralo, imaju sastav PDE1 sličniji ljudskom, kaže Kass.

Za svoje eksperimente, znanstvenici su koristili šest pasa kirurški opremljenih senzorima i srčanim stimulatorima, te su testirali učinke ITI-214 na njih prije i nakon izazivanja zatajenja srca brzim pokretanjem srčanog stimulatora tijekom otprilike tri tjedna. Lijek je testiran u različitim dozama, oralno i intravenozno. Psi su dobili najmanje jedan dan između testova.

Kada se daje u oralnoj dozi od 10 miligrama za svaki kilogram putem pilule prekrivene maslacem od kikirikija, ITI-214 je povećao količinu krvi koju srce ispumpava svake minute za 50 posto u zdravim srcima i za 32 posto u zatajenim srcima . To je učinio, kaže Kass, povećavši snagu srčanih kontrakcija za gotovo 30 posto i proširivši krvne žile. Intravenska primjena lijeka rezultirala je sličnim, ali bržim učincima.

"Bili smo prilično agnostični u pogledu onoga što ćemo pronaći i nismo nužno očekivali ništa od tog romana", kaže Kass. "Prema mojim saznanjima, nijedna studija ranije nije prijavila povećanu snagu srčane kontrakcije zbog inhibicije PDE1. Ali onda su sve prethodne studije u kojima je ovo moglo biti testirano koristile miševe i znali smo da je drugačiji oblik PDE1 pronađen u većih sisavaca i ljudi. Dakle, jednostavno smo morali isprobati, a rezultati su bili vrlo zanimljivi."

Kod zdravih pasa, upozorava Kass, lijek je također povisio njihov broj otkucaja srca za otprilike 40 otkucaja u minuti u prosjeku, što može biti opasno za pacijente sa zatajenjem srca. Međutim, psi s zatajenim srcem nisu imali značajnu razliku u otkucaju srca prije i nakon davanja lijeka.

Čak i uz ove obećavajuće rezultate, postojala je velika zabrinutost. Drugi lijekovi za zatajenje srca dizajnirani za jačanje srčanih kontrakcija imaju potencijalno smrtonosne komplikacije, kao što je razvoj neujednačenih otkucaja srca. Inhibitori drugačijeg PDE, PDE3, uključujući amrinon i milrinon, posebno su poznati po tome.

"Ovo je bio boogeyman u sobi", kaže Kass. "Novi lijek je izazvao mnoge iste promjene srca i arterija kao i inhibitori PDE3, pa smo se naravno brinuli hoće li djelovati na sličan način i može li imati komplikacije. Stoga smo ih testirali jedno pored drugog."

Kada su usporedili učinke ITI-214 s inhibitorom PDE3 u izoliranim mišićnim stanicama iz 13 zečjih srca, način na koji su dva lijeka djelovala izgledao je drugačije.

Smatra se da jedan od glavnih načina na koji inhibitori PDE3 djeluju jest povećanje količine kalcija unutar mišićne stanice, što pokreće ključne proteine ​​da djeluju više sile na stanicu i uzrokuje jače kontrakcije stanice.

Kao što se i očekivalo, kada su istraživači primijenili inhibitor PDE3 na srčane stanice, razina kalcija je porasla i stanice su se kontrahirale jače nego bez inhibitora.

Samo po sebi, inhibicija PDE1 nije imala utjecaja na mišićne stanice, ali istraživači su mislili da bi to moglo biti zato što je aktivnost PDE1 preniska u stanici u mirovanju. Stoga su upotrijebili lijek kako bi prvo malo povećali razinu cAMP-a, a to je povećalo aktivnost PDE1 dovoljno da promatraju učinke ITI-214.

Uz dodatak lijeka, ITI-214 je uzrokovao jače kontrakciju stanice. Međutim, razina kalcija u stanici nije porasla, što jasno ukazuje da ITI-214 povećava mišićne kontrakcije kroz drugačiji mehanizam od PDE3 inhibitora.

"Naši rezultati pokazuju da inhibiranje PDE1 proizvodi različite promjene od blokiranja PDE3, pa se nadamo da možemo zaobići aritmije posredovane kalcijem i potencijalno smrtonosne aritmije koje su mučile inhibitore PDE3", kaže Grace Kim, glavna koautorica i postdoktorska suradnica. u Kassovu laboratoriju. "Očekujemo slične pozitivne koristi na funkciju srca, ali s mnogo manje toksičnosti."

Kass kaže da ITI-214 također djeluje drugačije od dobutamina, koji jača srčane kontrakcije kod osoba sa zatajenjem srca, ali također može uzrokovati fatalne nepravilne srčane ritmove. Dobutamin djeluje stimulirajući beta adrenergički sustav, isti sustav koji se aktivira adrenalinom. Dobutamin djeluje na isti skup molekula glasnika koje povećavaju cAMP koji PDE3 razgrađuje, pa su njegovi srčani učinci slični onima kod inhibitora PDE3.

Kada su znanstvenici blokirali beta adrenergičke receptore u 11 zdravih, anesteziranih kunića i zatim primijenili ITI-214, svi učinci - osim njegovog utjecaja na otkucaje srca - ostali su. Ako je ITI-214 djelovao kroz beta adrenergički sustav, blokiranje receptora bi trebalo blokirati njegovo djelovanje.

Umjesto toga, čini se da bi lijek mogao djelovati na cAMP koji generira drugačiji signalni sustav u srcu koji koristi adenozin. Kada su znanstvenici upotrijebili lijek za blokiranje receptora u adenozinskom sustavu u zasebnom setu od sedam anesteziranih zečeva, svi učinci lijeka, uključujući povećan broj otkucaja srca, bili su eliminirani.

Druge studije su pokazale da adenozinski put može imati zaštitne učinke na srce, kaže Kass. U istom izdanju Circulation, drugi istraživači sa Sveučilišta Rochester također su otkrili da PDE1 kontrolira put adenozina i da bi inhibicija PDE1 mogla zaštititi srce od toksičnosti nekih lijekova protiv raka.

ITI-214 je sada u ranim kliničkim ispitivanjima i testira se na pacijentima sa zatajenjem srca na Johns Hopkins Medicine i Sveučilištu Duke. Već je prošao prvu fazu ispitivanja sigurnosti na zdravim osobama.

Ostali istraživači uključeni u studiju su Toru Hashimoto, Richard Tunin, Tolulope Adesiyun, Steven Hsu, Ryo Nakagawa, Guangshuo Zhu i Dong Lee iz Johns Hopkinsa, te Jennifer O'Brien, Joseph Hendrick, Robert Davis, Wei Yao, David Beard, Helen Hoxie i Lawrence Wennogle iz Intra-celularnih terapija.

Ovaj rad podržali su Nacionalni institut za srce, pluća i krv (HL135827-01, P01HL107153, HL119012), Japansko društvo za cirkulaciju prekomorskih istraživačkih stipendija i istraživačka stipendija Uehara Memorial Foundation, T32 Udruga za obuku u radu i American He grant -Celular Therapies, koje su osigurale lijek, kao i sredstva za istraživanje.

Financiranje i lijekove za studiju osigurala je Intra-Celular Therapies. Kass je plaćeni savjetnik za Intra-Celular Therapies. Ovaj dogovor pregledalo je i odobrilo Sveučilište Johns Hopkins u skladu sa svojim politikama sukoba interesa.


Uloga cAMP-PKA-CREB signalnog puta u tumorima

cAMP–PKA–CREB signalizacija ima paradoksalne učinke na tumore, djeluje kao tumor-supresor ili tumor-promotor u različitim tipovima tumora (Tablica 1). Uloga cAMP–PKA–CREB signalnog puta u karcinomu jetre i drugim tumorima opisana je u nastavku.

Rak jetre

Dok neke studije sugeriraju da povećanje razine cAMP može inhibirati rast HCC stanica [51,52,53], objavljeno je da PKA potiče invaziju HCC i metastaze fosforilacijom više supstrata kao što je CIP4 [29]. Fibrolamelarni hepatocelularni karcinom (FL-HCC) primarni je rak jetre koji se javlja uglavnom u djece i mladih odraslih osoba. 80% -100% pacijenata s FL-HCC ima fuziju gena DNAJB1-PRKACA, što rezultira brisanjem 400 kb genskog fragmenta na kromosomu 19 i proizvodnjom himernog proteina koji zadržava aktivnost PKA kinaze [54]. DNAJB1–PRKACA knock-in miševi mogu razviti karakteristike tumora FL-HCC [55]. Osim toga, PRKACA je prekomjerno izražena u oko 80% HCC mutiranog gena BAP1 (koji kodira BRCA1-povezan protein 1), koji pokazuju slične kliničke manifestacije i histološke karakteristike kao FL-HCC povezan s DNAJB1–PRKACA fuzijom [56]. Disfunkcija PKA puta igra važnu ulogu u razvoju i napredovanju ove dvije vrste HCC. Infekcija virusom hepatitisa B (HBV) glavni je čimbenik rizika za razvoj HCC. HBV X protein igra važnu ulogu u HBV povezanom HCC. Mehanički, HBVx može promicati karcinogenezu jetre putem signalnog puta CREB-miR-3188 i ZHX2-Notch [57], promicati rast HCC stanica aktiviranjem CREB-YAP osi [58] i promicati invaziju i metastazu HCC-a povezanog s HBV-om. -reguliranje ekspresije FOXM1 kroz Erk-CREB put [59]. Zajedno, ove studije pokazuju da PKA-CREB put može potaknuti napredovanje HCC-a. Doista, analiza tumora HCC štakora i sparenih normalnih uzoraka jetre pokazala je značajno povećanje razina CREB i CREB fosforilacije u HCC [60].

Međutim, čini se da je uloga cAMP u HCC pomalo paradoksalna. Kao što smo gore opisali, povećanje razine cAMP inhibitorima PDE može zaustaviti rast HCC stanica. Tretman HepG2 stanica analozima cAMP značajno smanjuje transkripciju i razinu proteina ciklina A i inducira zaustavljanje staničnog ciklusa [61]. Osim toga, inhibitori PDE4 rolipram i DC-TA-46 mogu povećati ekspresiju p21, p27 i p53 i smanjiti ekspresiju ciklina A, čime inhibiraju proliferaciju i promiču apoptozu HepG2 stanica [52]. Nasuprot tome, vazoaktivni crijevni peptid mogao bi smanjiti koncentraciju cAMP, ekspresiju CREB i fosforilaciju Ser 133, te inhibirati ekspresiju Bcl-xL, što dovodi do apoptoze Huh7 stanica [62]. Svestrane uloge cAMP-a u HCC-u mogu biti posljedica mnoštva njegovih ciljeva s različitim funkcijama. Stoga, promiče li cAMP ili inhibira HCC može ovisiti o kontekstu. Homeostaza u razinama cAMP može biti kritična za napredovanje HCC-a.

Rak mozga

Uloga CREB-aktivirajuće kinaze PKA u tumorima mozga također je paradoksalna. Nekoliko studija je pokazalo da PKA ima ulogu supresije tumora u staničnoj liniji glioblastoma A-172. Aktivacija PKA povećanjem razine cAMP ili opskrbom analoga cAMP (dcAMP i 8-Br-cAMP) može smanjiti brzinu proliferacije stanica A-172, potaknuti diferencijaciju i inducirati apoptozu [63]. Povećanje unutarstanične razine cAMP rolipramom, inhibitorom PDE, može povećati ekspresiju p21 i p27 i aktivirati PKA i Epac1-Rap1 signalizaciju, što dovodi do zaustavljanja rasta i apoptoze A-172 stanica [64, 65]. cAMP put također igra antikancerogenu ulogu u meduloblastomu. Adenilil ciklaza hipofize inhibira proliferaciju stanica meduloblastoma putem PKA-Gli1 puta [66], a neurocilijarni proteini inhibiraju rast meduloblastoma putem PDE4D-PKA-Hedgehog puta [67]. Protein ARHGAP36, član obitelji RhoGAP, može se vezati na PKA katalitičku podjedinicu i inhibirati njezinu aktivnost, aktivirajući na taj način Hedgehog put i promicati rast meduloblastoma [68]. Tumorski supresivni učinci cAMP i PKA mogu biti posredovani Epac1, Rap1 i Gli1, a ne CREB.

Fosforilaciju CREB-a može izravno inhibirati PTEN, proteinska fosfataza protiv raka koja je često mutirana ili inaktivirana u mnogim vrstama raka, uključujući najagresivnije vrste raka mozga, multiformni glioblastom i astrocitom [69, 70]. Nedostatak PTEN-a može povećati aktivnost CREB-a i inducirati ekspresiju PAX7, čime se potiče pretvorba ljudskih neuralnih matičnih stanica u matične stanice slične glioblastomu [71]. Osim toga, CREB može recipročno smanjiti PTEN. Tan i sur. izvijestili su da je CREB bio visoko eksprimiran u kliničkim uzorcima i staničnim linijama glioma, a CREB bi mogao inhibirati ekspresiju PTEN-a putem miR-23, čime se potiče razvoj glioma [72]. Štoviše, EGFR može aktivirati CREB putem MAPK-RSK2 puta, a zatim potaknuti rast i invaziju stanica glioma [73].

Receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR), mutant EGFRvIII i receptor faktora rasta izveden iz trombocita (PDGFR) mogu potaknuti razvoj i invaziju glioblastoma putem PKA-Dock180 signalnog puta [74, 75]. Također, miR-33a pojačava cAMP-PKA signalizaciju inhibiranjem ekspresije PDE8A, čime se potiče rast i samoobnavljanje početnih matičnih stanica glioma [76]. U staničnoj liniji humanog glioblastoma MGR3, aktivacija PKA dovodi do značajnog povećanja fosforilacije i aktivnosti GSTP1, što može dovesti do rezistencije na lijekove i neuspjeha liječenja [77].

Rak pluća

Kod raka pluća nemalih stanica (NSCLC) postoji značajna pojačana regulacija ekspresije CREB i fosforilacije u tumorskim tkivima u usporedbi sa susjednim normalnim tkivima. Povećana ekspresija CREB u korelaciji je s kratkim razdobljem preživljavanja bolesnika [78]. cAMP bi mogao smanjiti ekspresiju SIRT6 i tako smanjiti apoptozu NSCLC stanica izazvanu radioterapijom [79]. U visoko malignom karcinomu malih stanica pluća (SCLC), povećana aktivnost CREB-a pomaže u održavanju njegovih neuroendokrinih karakteristika i proliferaciji [80]. RGS17 je povećan u 80% tkiva raka pluća u usporedbi s odgovarajućim normalnim plućnim tkivom i potiče staničnu proliferaciju putem cAMP-PKA-CREB puta [81]. Osim toga, PKA-Smurf1-PIPKIγ signalna transdukcija potiče napredovanje raka pluća in vivo [82]. cAMP–PKA–CREB put mogao bi regulirati odgovor hipoksije u stanicama raka pluća [83]. PKA inhibitori H-89 i PKACA knockdown antagoniziraju hipoksiju izazvanu epitelno-mezenhimsku transformaciju, migraciju stanica i invaziju stanica raka pluća [84]. Štoviše, oksidativni stres igra važnu ulogu u patogenezi plućnih bolesti, uključujući plućnu fibrozu i rak pluća. Interakcije između PKA, Erk1/2 i CREB posreduju u preživljavanju stanica u oksidativnom stresu [85].

Kontradiktorno inhibiciji apoptoze NSCLC stanica izazvane radioterapijom putem cAMP-Sirt6 [79], čini se da cAMP-PKA-CREB put igra antikancerogenu ulogu u radioterapiji. Prethodno tretiranje miševa BALB/c forskolinom moglo bi inhibirati ATM i NF-κB fosforilacijom PP2A izazvanom PKA, što rezultira povećanjem apoptoze izazvane radioterapijom [86]. U staničnoj liniji raka pluća H1299, Gs protein potiče ekspresiju Bak putem PKA-CREB-AP1 puta i povećava apoptozu induciranu radioterapijom [87]. Ove studije sugeriraju da cAMP–PKA–CREB put također može imati suprotne učinke u različitim okolnostima istog tipa tumora.

Rak prostate

PKA podjedinica može biti biomarker za predviđanje odgovora raka prostate na radioterapiju i kemoterapiju. Analiza 456 kliničkih uzoraka raka prostate pokazala je da je PKA RIα visoko izražen u 80 slučajeva (17,5%), a prekomjerna ekspresija PKA RIα povezana je sa slabom učinkovitošću radioterapije i kratkotrajnom ili dugotrajnom terapijom deprivacije androgena, udaljenim metastazama i abnormalnim biokemijskim indeks [88]. U PC3M stanicama stanične linije raka prostate, prekomjerna ekspresija divljeg tipa PKA RIIβ ili mutantnog tipa PKA RIα-P (funkcionalno slično s PKA RIIβ) dovodi do inhibicije rasta i apoptoze in vitro, te inhibira rast tumora in vivo [89]. Signalizacija androgenih receptora (AR) ključna je za karcinogenezu prostate. Testosteron izravno stimulira GPR56, a zatim aktivira cAMP/PKA put, koji potiče AR signalizaciju [90]. PKA također fosforilira Thr 89 ostatak u HSP90, što dovodi do oslobađanja AR iz HSP90 i vezivanja AR na HSP27, koji prenosi AR u jezgru kako bi transaktivirao svoje mete [91]. Osim toga, PKA signalni put je uključen u neuroendokrinu diferencijaciju raka prostate, rani marker za razvoj neovisnosti o androgenu [92, 93]. Štoviše, visoka ekspresija osteokalcina i ostesialina u androgen neovisnoj staničnoj liniji raka prostate C4-2B ovisna je o cAMP-PKA signalnom putu [94]. PAK4 se može aktivirati pomoću cAMP-PKA kako bi se poboljšala aktivnost transkripcije CREB neovisno o fosforilaciji na ostatku Ser 133, a srušenje PAK4 u stanicama PC-3 i DU145 inhibira stvaranje tumora u golih miševa [95]. Štoviše, RGS17 je prekomjerno izražen u uzorcima raka prostate i potiče staničnu proliferaciju putem cAMP-PKA-CREB puta [81]. Osim toga, zabilježeno je da depresija i bihejvioralni stres mogu ubrzati napredovanje raka prostate putem PKA kinaze [30, 96].

Rak jajnika

Oko 54% humanih tumora jajnika dobivenih iz epitela u mikromrežu tkiva ima umjerenu ili visoku razinu ekspresije CREB, dok u normalnim uzorcima jajnika nije uočena ekspresija. Smanjenje ekspresije CREB značajno smanjuje proliferaciju stanica raka jajnika, ali nema utjecaja na apoptozu [97]. Epitelni karcinom jajnika jedan je od najsmrtonosnijih ginekoloških malignih tumora. PKA RIα je visoko izražen u epitelnom karcinomu jajnika [98]. Tijekom metastatskog širenja stanične linije epitelnog raka jajnika SKOV3, invazija izvanstaničnog matriksa zahtijeva aktivnost PKA i sidro AKAP, a inhibicija aktivnosti PKA ili PKA RI i RII sidra može blokirati invaziju matriksa [99]. Osim toga, PKA smanjuje intenzitet čvrstog spoja u staničnoj liniji epitelnog raka jajnika OVCA433 fosforilacijom klaudina-3 [100]. Također, gonadotropin potiče metastaze epitelnih stanica raka jajnika putem PKA i PI3K puteva [101].Dok gore spomenute studije sugeriraju da PKA-CREB ima ulogu promicanja tumora u epitelnom karcinomu jajnika, jedna studija sugerira da PKA može fosforilirati EZH2 na Thr 372 ostatku, što dovodi do mitohondrijske disfunkcije, vezivanja EZH2 na STAT3 i zatim inhibiranja STAT3 fosforilaciju i rast stanica raka jajnika epitela [102].

Rak dojke

Prekomjerna ekspresija R podjedinice, posebno RI PKA, povezana je s proliferacijom stanica u normalnim dojkama, malignom transformacijom epitelnih stanica dojke, lošom prognozom raka dojke i tolerancijom na terapiju antiestrogenima. Nedavna studija pokazuje da je nuklearna lokalizacija aktiviranog PKA u korelaciji s metastazama raka dojke [103]. Integrin α9 održava stabilnost β-katenina putem ILK/PKA/GSK3 signalizacije i na taj način potiče rast i metastaze trostruko negativnih stanica raka dojke [104]. Štoviše, uspješna antiestrogenska terapija povezana je sa smanjenom ekspresijom RI mRNA, a RI antisense oligonukleotidi mogu smanjiti stopu rasta stanica raka dojke [105]. Kod raka dojke pozitivnog na estrogenski receptor, fosforilacija ERα Ser 305 inducirana PKA i PAK1 povezani su s rezistencijom na tamoksifen i progresijom raka dojke [106, 107]. U Her-2 pozitivnim stanicama raka dojke, aktivacija PKA povezana je s rezistencijom na trastuzumab [108]. Osim toga, cAMP–PKA–CREB put također igra važnu ulogu u metaboličkoj regulaciji raka dojke. Serotonin potiče biosintezu mitohondrija putem AC-PKA puta u stanicama raka dojke [109]. Receptor estrogena povezan s citoplazmatskim G-proteinom potiče aerobnu glikolizu putem cAMP-PKA-CREB puta [110]. Suprotno gore navedenim studijama, objavljeno je da IL-24 inducira apoptozu stanica raka dojke aktiviranjem TP53 i stresa endoplazmatskog retikuluma putem PKA [111]. Stoga, PKA također može imati paradoksalnu ulogu u raku dojke ovisno o kontekstu.

Leukemija

Uloga cAMP-a je sasvim drugačija u različitim vrstama limfoma. PDE4 inhibitori blokiraju intracelularnu TLR signalizaciju i potiču apoptozu stanica kronične limfocitne leukemije (CLL) povećanjem koncentracije cAMP [112, 113]. Zanimljivo je da inhibitori PDE4 induciraju apoptozu u CLL-u B stanica, ali ne iu CLL-u T-stanica ili normalnim cirkulirajućim hematopoetskim stanicama, vjerojatno zbog toga što inhibitori PDE4 samo povećavaju razine glukokortikoidnih receptora i cAMP u CLL-u B stanica [114, 115]. cAMP-PKA može promicati apoptozu putem puteva ovisnih o mitohondrijima, smanjujući ekspresiju anti-apoptotičkih proteina Bcl-2 i survivina, te povećavajući ekspresiju pro-apoptotičkog proteina Bax u stanicama limfoma [116,117,118]. Kemokini CXCR4 i CXCL12 oslobođeni iz mikrookruženja mogu se vezati na Gαi-konjugirane GPCR na CLL stanicama, smanjujući sintezu cAMP i povećavajući stopu preživljavanja CLL stanica [119, 120]. PDE7B je prekomjerno izražen u CLL-u, a inhibitori PDE7 (BRL-50481 i IR-202) i dvostruki inhibitor PDE4/PDE7 IR-284 povećavaju apoptozu stanica CLL-a, koja je oslabljena inhibicijom PKA [121].

CREB je prekomjerno izražen u koštanoj srži većine staničnih linija leukemije i bolesnika s akutnom mijeloidnom leukemijom (AML) i akutnom limfoblastnom leukemijom (ALL) [122]. Prethodne studije također pokazuju da je CREB visoko izražen u većini stanica mijeloične leukemije u bolesnika s AML-om i povezan s lošom prognozom [123]. Inhibitor jmjd3/UTX GSKJ4 može potaknuti degradaciju CREB-a i inhibirati rast AML stanica [123]. Prekomjerna ekspresija CREB-a može potaknuti proliferaciju AML stanica povećanjem ekspresije ciklina A1. Osim toga, CREB transgeni miševi pokazuju mijeloproliferativne bolesti, ali ne i leukemiju, što sugerira da je CREB uključen u fenotip leukemije tijekom klijanja leukemije, ali nije dovoljan da se potpuno transformira u leukemiju [124]. Nasuprot tome, cAMP može zaštititi stanice akutne promijelocitne leukemije od apoptoze inducirane arsenikovim trioksidom i antraciklinima [124]. U AML staničnoj liniji IPC-81, cAMP može inducirati apoptozu kroz regulaciju Bim-a pomoću CREB-a i CDK-a [125].

Ostali tumori

Razine mRNA i proteina PKA RIα i AKAP10 značajno su povećane u tkivima raka debelog crijeva, u korelaciji s dubinom invazije, stupnjem diferencijacije i kratkim preživljenjem [126]. Tip-I receptor faktora rasta sličan inzulinu (IGF-IR) usko je uključen u tumorigenezu i rezistenciju na lijekove [127]. IGF-IR signalizacija inducira fosforilaciju ezrina na Thr 567 ostatku i time potiče cAMP-ovisnu aktivaciju PKA i preživljavanje stanica raka debelog crijeva [128]. Prekomjerna ekspresija PKA RIα i AKAP10 u nekoliko staničnih linija kolorektalnog karcinoma izravno je povezana s metastazama. Osim toga, rezistencija stanica raka debelog crijeva na selektivni inhibitor MEK1/2 selumetinib inducira se aktivacijom PKA [129], a otpornost stanica raka debelog crijeva na metotreksat može se inducirati cAMP signalizacijom [130]. Antagonisti PKA mogli bi inhibirati nuklearnu translokaciju β-katenina i ekspresiju c-myc i COX2 u APC mutantnom kolorektalnom karcinomu, čime bi inhibirali razvoj tumora [131].

Imunohistokemijski pokusi otkrili su da normalni melanociti ne eksprimiraju PKA RIα proteine, ali je jako izražen u uzorcima humanog melanoma i nekim staničnim linijama melanoma. Aktivacija RII ili tišina RIα može inhibirati proliferaciju i povećati apoptozu potaknutu kaspazom 3 [132]. PKA može potaknuti migraciju stanica melanoma. Studije su otkrile da hipoksija može inducirati ekspresiju proteina skele AKAP12 u melanomu, a fosforilacija regulirana PKA tijekom hipoksije ovisi o prisutnosti AKAP12. Inaktivacija AKAP12 dovodi do smanjenja rasta tumora, migracije i invazije kod mišjih modela melanoma [133]. PKA put također igra važnu ulogu u sintezi melanina. Dietilstilbestrol može potaknuti proizvodnju melanina putem cAMP-PKA posredovane up-regulacije tirozinaze i MITF-a u staničnoj liniji mišjeg melanoma B16 [134], a gingerol inhibira proizvodnju melanina smanjujući MAPK i PKA [135].


MATERIJALI I METODE

Drosophila

Drosophila melanogaster Meigen je uzgojen na standardnom mediju na 25°C, s fotoperiodom od 12 h:12 h svjetlo:tamno i 55% relativnom vlagom. Linije korištene u ovoj studiji bile su: divlji tip, Canton S bijelim mutanti: w 1118 (djelomično brisanje, gubitak funkcije: http://flybase.bio.indiana.edu/reports/FBal0018186.html) i w H (hipomorfni alel) (Zachar i Bingham, 1982.) glavni pokretač GAL4 specifičnih za tubule, c42 (Broderick et al., 2004.) transgenski w::eYFP linije D4, E5 i H8 (generirane za ovu studiju).

Mutantni w Drosophila (w 1118 i w H ) su "kantonizirane" križanjem bijelookih muha s izogeniziranim muhama divljeg tipa Canton S. Potomstvo je sakupljeno i križano kako bi se dobilo recesivno potomstvo bijelih očiju. Ovaj proces je ponovljen pet puta, čime je uklonjeno 97% svih kompenzacijskih mutacija koje su se mogle nakupiti otkako su mutantne zalihe prvi put izolirane.

Za disekciju, muhe su anestezirane hlađenjem na ledu i obezglavljene, prije nego što su uklonjene tubule u Schneiderovom mediju (Invitrogen Ltd, Paisley, Škotska). Sve kemikalije i lijekovi dobiveni su od Sigme (Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset, UK), osim ako nije drugačije navedeno.

Generacija transgenih Drosophila

Linije prekomjerne ekspresije koje sadrže White obilježen pojačanim žutim fluorescentnim proteinom (eYFP) na C kraju generirane su na sljedeći način:

Kodni slijed za eYFP (Clontech UK Ltd, Basingstoke, Hampshire, UK) je pojačan korištenjem početnica koji su inkorporirali Neja i KpnI mjesta na 5′ i 3′ krajevima, redom (GCGGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG/GGTACCCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC). Rezultirajući fragment je kloniran u Neja i KpnI web stranice strP korištenjem standardnih metoda za formiranje pP. The bijelim otvoreni okvir za čitanje, isključujući stop kodon, PCR je amplificiran iz cDNA predloška tubula korištenjem početnica: AGATCTATGGGCCAAGAGGATCAGGAG/GCGGCCGCCCTCCTTGCGTCGGGCCCGAAG, koji su ugrađeni EkoRI i NeI mjesta na 5′ i 3′ krajevima, respektivno. Ovaj fragment je kloniran strP koristiti EkoRI i NeI restrikcijska mjesta za formiranje plazmida strP<w – eYFP-UAST>. Insert je sekvencioniran kako bi se provjerile PCR greške, a plazmid je ubrizgan wDrosophila embriji(w 1118 ) standardnim tehnikama (Vanedis Drosophila usluga injekcija, www.vanedis.no). Transformanti su odabrani i održavani korištenjem standarda Drosophilagenetske tehnike.

Testovi transporta tekućine

Testovi transporta tekućine izvedeni su kako je prethodno opisano (Dow et al., 1994b) na intaktnim tubulima iz Kantona S, w 1118 i kantonizirano w 1118 Odrasle muhe stare 7 dana. Bazalne brzine transporta tekućine utvrđene su tijekom 30 minuta, nakon čega je u tubule dodano 100 μmol l –1 cGMP i mjerene su brzine transporta tekućine tijekom daljnjih 60 minuta. Podaci su prikazani kao srednje brzine transporta tekućine± s.e.m., N=7.

Testovi cikličkog transporta nukleotida

Transportni testovi za cGMP i cAMP temeljili su se na modificiranom testu transporta tekućine. Omjeri brzina prijenosa su izračunati kako je prethodno opisano (Day et al., 2006.). Brzina transporta daje linearnu mjeru jednosmjernog toka od bazalnog prema apikalnim, dok omjer izlučenog: kupanja od >1 ukazuje da se transportni supstrat koncentrira u tubulima (Maddrell et al., 1974.). Maksimalne brzine transporta cGMP i cAMP dogodile su se pri 100 μmol l –1 (Evans, 2007.) pa su svi transportni testovi provedeni s konačnom koncentracijom od 100 μmol l –1 cikličkog nukleotida. Maksimalne brzine transporta cAMP-a značajno su veće od one za cGMP: transportni omjer od ∼5 pri 100 μmol l –1 cAMP, vs ∼3 za cGMP pri 100 μmol l –1 cGMP.

Tubuli su secirani u fiziološku otopinu (Dow et al., 1994a) i ostavljeni da se oporave 30 minuta prije dodavanja cikličkih nukleotida: "hladni" cGMP ili cAMP na 100 μmol l -1, a tricijani cGMP ili cAMP dodan kao trag (Amersham Pharmacia, Biotech UK Ltd, Amersham, Bucks, UK). Gdje su bili uključeni konkurenti ili lijekovi, oni su dodani 30 minuta prije radioaktivno obilježenog supstrata. Gdje je istraženo uklanjanje aminokiselina i citrata, minimalno Drosophila korištena je fiziološka otopina (Linton i O'Donnell, 1999.) kojoj su nedostajali sastojci Drosophila fiziološka otopina (Dow et al., 1994a) ponovno su uvedene u uobičajenim koncentracijama.

U svim transportnim testovima, omjer i brzina transporta mjereni su 1 h nakon dodavanja radioaktivno obilježenog cikličkog nukleotida (Evans, 2007.). Tubule su ostavljene da se luče 1 h prije nego što je izlučena kapljica izmjerena i uklonjena u Eppendorf epruvete koje su sadržavale scintilacijsku tekućinu (Fisher Scientific, Loughborough, UK). Uzorak od 1 μl svake kapljice spremnika također je uklonjen i radioaktivnost je izmjerena u scintilacijskom brojaču (Beckman, High Wycombe, UK).

CGMP-ovisna kinaza biotest za izlučeni cGMP

Kako bi se utvrdilo prenosi li se nepromijenjeni cGMP kroz tubul iz kapljice za kupanje u lumen, izlučena tekućina testirana je na njezinu sposobnost da stimulira aktivnost protein kinaze ovisne o cGMP (cGK). in vitro. Proveden je test sekrecije s 80 tubula u standardnoj kapljici za kupanje Drosophila fiziološka otopina/Schneidersov medij (kontrola) ili fiziološka otopina/Schneidersov medij sa 100 μmol l –1 cGMP. Nakon puštanja tubula da se luče 1 h, izlučene kapljice su skupljene (∼2 ml ukupno), uklonjene iz posude za ispitivanje sekrecije i stavljene u Eppendorfovu epruvetu. Kako bi se uklonilo ostatke mineralnog ulja dobivenog iz testa sekrecije, uzorci su centrifugirani, a ulje (gornji sloj) je odbačeno. Zatim je proveden cGK test korištenjem Drosophila cGK, DG2 (MacPherson i sur., 2004.), koji je bio eksprimiran u S2 stanicama kao izvor DG2 i stoga cGK aktivnosti (MacPherson i sur., 2004.). Standardne kinazne reakcije postavljene su u ukupnom volumenu od 44 μl s 5 μl uzorka DG2 proteina, 39 μl pufera za ispitivanje kinaze (MacPherson et al., 2004.) i 1 μl izlučene tekućine iz kontrolnih uzoraka ili 1 μl izlučenog tekućina iz tubula inkubirana u 100 μmol l –1 cGMP. Pozitivne kontrole su postavljene dodavanjem 1 μl 100 μmol l –1 cGMP (konačna koncentracija 2,2 mmol l –1 ) u mješavinu testa kako je gore opisano. Provedena su tri odvojena eksperimenta za svako stanje, a rezultati su izraženi u pmol ATP min –1 mg –1 proteina (srednja vrijednost ±s.e.m.).

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu (Q-PCR)

Q-PCR je izveden kako je prethodno opisano (McGettigan et al., 2005.), korištenjem mRNA pripremljene iz tubula odrasle osobe stare 7 dana Drosophila. Gdje se istraživao učinak cGMP-a na ekspresiju gena, tubule su inkubirane sa ili bez 100 μmol l –1 cGMP u Schneiderovom mediju 3 h prije nego što je mRNA ekstrahirana. Reverzna transkripcija je provedena korištenjem Superscript II (Invitrogen) korištenjem oligo(dT) primera. Za svaki uzorak, 500 ng cDNA dodano je u 25 μl SYBR Green reakcijske mješavine (Finnzyme, Oy Espoo, Finska) s odgovarajućom koncentracijom početnica – WhiteF: GCCACCAAAAAATCTGGAGAAGC/WhiteR:CACCACTTGCGTGAGTTGTTG. Reakcije su provedene u termocikleru Opticon 2 (MJ Research Inc., Waltham, MA, SAD). Ribosomski rp49(rpl32) gen (primers rp49F: TGACCATCCGCCCCAGCATAC/rp49R:TTCTTGGAGGAGGACGCCGTG) korišten je kao referentni standard u svim eksperimentima (McGettigan i sur., 2005.).

Imunocitokemija

Imunocitokemija na intaktnim Malpighijevim tubulima provedena je kako je prethodno opisano (MacPherson i sur., 2001.). Mišje monoklonsko primarno anti-GFP protutijelo koje prepoznaje GFP varijante (Zymed, Invitrogen Ltd) razrijeđeno 1:1000 u PAT [0,05% (v/v) Triton X-100 i 0,5% (w/v) BSA u PBS s 14 mmol l – 1 NaCl, 0,2 mmol l –1 KCl, 1 mmol l –1 Na2HPO4 i 0,2 mmol l –1 KH2PO4, pH 7,4], korišteno je nakon čega je uslijedilo dodavanje sekundarnog protutijela, Alexa Fluor® 568-obilježenog anti-mišjeg IgG (Molecular Probes, Invitrogen Ltd), razrijeđenog 1:500 u PAT-u. Nuklearna boja 4′,6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorid (DAPI) nanesena je na tubule 1 min pri 500 ng ml –1 u PBS. Uzorci su pregledani pomoću konfokalnog sustava Zeiss 510 Meta, a slike su obrađene pomoću LMS softvera za slike. Sve slike su snimljene s istim pojačanjem i ekspozicijom.


Što je cAMP Boost?

Nutraville opisuje cAMP Boost kao sigurnu i snažnu formulu za sagorijevanje masti koja koristi najjače dostupne inhibitore PDE-4. Ovi inhibitori uklanjaju enzime koji blokiraju gubitak masnoće, a istovremeno pospješuju poruke o sagorijevanju masti koje šalju cAMP molekule. Kroz ove mehanizme, cAMP Boost može navodno reći vašim stanicama &ldquoto sagorijevati masnoću iz sata u sat, bez prestanka.&rdquo

cAMP Boost ima cijenu od 67 USD po boci i uz 365-dnevno jamstvo povrata novca. Svaka boca bi trebala trajati mjesec dana. Međutim, tvrtka preporučuje udvostručenje doze kako bi se povećala učinkovitost formule za sagorijevanje masti.

Kako djeluje cAMP Boost?

cAMP Boost koristi šest aktivnih sastojaka koji vam pomažu pri mršavljenju, uključujući ekstrakt grejpa, ekstrakt sjemenki guarane, ekstrakt zrna raja i ekstrakt crnog papra.

Proizvođač preporučuje uzimanje jedne kapsule dva puta dnevno (ujutro i sredinom dana) kako bi vam pomogao da izgubite značajnu količinu težine. Proizvođač također preporučuje udvostručenje doze kako bi se maksimizirali učinci formule za sagorijevanje masti.

Evo&rsquos kako Nutraville, proizvođač cAMP Boosta, opisuje učinke cAMP Boosta:

&ldquocAMP Boost je moćna formula za mršavljenje koja koristi sastojke prikazane u studijama za povećanje cikličkih pojačanih signala masnim stanicama. To cikličko pojačalo upozorava stanice da otpuštaju i sagorevaju masnoće tako da možete bez napora gubiti masnoću iz sata u sat.&rdquo

Svatko od nas u svom tijelu ima enzim koji se zove PDE-4. Ovaj enzim blokira vaše tijelo da šalje signale za sagorijevanje masti vašem cikličkom adenozin monofosfatu (cAMP). cAMP je najvažniji glasnik za slanje signala vašim stanicama za sagorijevanje masti. Kada je PDE-4 prisutan u vašem tijelu, sprječava vas da maksimalno povećate sagorijevanje masti.

Evo&rsquos kako web stranica c-AMP Boost objašnjava učinke cAMP-a i PDE-4 na vaš gubitak težine:

&ldquoPostoji&rsquo određena &ldquosignalizirajuća molekula&rdquo u tijelu koja se zove cAMP… I ova signalna molekula šalje poruke vašim stanicama za sagorijevanje masti. Međutim… postoji&rsquo i &ldquosignal-mutting enzim&rdquo u tijelu pod nazivom PDE-4… koji cilja i blokira signale za sagorijevanje masti koje šalju cAMP molekule.&rdquo

Kada PDE-4 blokira cAMP signale, otežava sagorijevanje masti – čak i ako jedete ispravno i vježbate.

Nažalost, kako starimo, tijelo stvara više PDE-4, što je jedan od uzroka neželjenog debljanja s godinama. Nutraville tvrdi da cAMP Boost zaustavlja PDE-4, inhibira enzim i otključava učinkovit gubitak težine.

Kako cAMP Boost zaustavlja PDE-4?

cAMP Boost djeluje kao inhibitor PDE-4, pomažući u otključavanju vaših sposobnosti sagorijevanja masti.

Za blokiranje PDE-4, cAMP Boost kombinira Sinetrol s prirodnim sastojcima. Sinetrol u cAMP Boostu deaktivira enzime PDE-4 i pojačava cAMP signale za sagorijevanje masti vašim masnim stanicama.

cAMP Boost također sadrži Bioperine, ekstrakt crnog papra koji poboljšava apsorpciju sastojaka.

  • Smršavite brzo i sigurno
  • Izravnajte trbuh
  • Sagorijevati kalorije
  • Pretvorite neuglednu bijelu tjelesnu masnoću u smeđu masnoću koja sagorijeva mast
  • Pomozite svojim stanicama sagorijevati masnoće iz sata u sat, bez prestanka

Nutraville tvrdi da sastojci u njihovoj formuli djeluju kao &ldquotenajjači dostupni PDE-4 inhibitori&rdquo uklanjajući enzime odgovorne za blokiranje gubitka masti. Ovi sastojci također pospješuju poruke o sagorijevanju masti koje šalju cAMP molekule, govoreći vašim stanicama da sagorevaju masnoće iz sata u sat, bez prestanka.

Važnost smeđe masti

cAMP Boost također cilja na smeđu masnoću u vašem tijelu, pretvarajući vašu bijelu tjelesnu masnoću u smeđu masnoću koja sagorijeva mast. Da, postoji&rsquos razlika između vrsta masti u vašem tijelu. Neke vrste masti su bolje od drugih.

Bijela mast, na primjer, sadrži samo jedan ili dva mitohondrija. Smeđa mast, u međuvremenu, sadrži desetak mitohondrija, što ga čini elektranom za sagorijevanje masti.

Povećanjem količine smeđe masnoće u vašem tijelu, možete olakšati mršavljenje. Što više smeđe masti imate, tijelo sagorijeva više kalorija.

cAMP Boost sadrži afrički začin koji navodno &ldquotoastira&rdquo bijelo masno tkivo u vašem tijelu. Evo&rsquos kako Nutraville objašnjava učinke tog sastojka:

&ldquoVolim to misliti kao pečenje bijelog sljeza na pucketavoj vatri jer postoji&rsquo određeni ljuti afrički začin koji &ldquotoasts&rdquo bijelo masno tkivo… A mi&rsquove smo to dodali našoj cAMP Boost formuli kako bismo doslovno pomogli pretvoriti tvrdoglavu tjelesnu masnoću u ovu masnoću za mršavljenje koji preoblikuje vašu figuru i daje vam tone energije.&rdquo

Ovaj sastojak i drugi sastojci unutar cAMP Boosta mogu navodno reaktivirati ovu smeđu masnoću koja sagorijeva mast, što olakšava mršavljenje.

Koliko kilograma možete izgubiti s cAMP Boostom?

Prema Nutravilleu, svako jutro se u ogledalu možete probuditi mršaviji, mlađi i seksi. Umjesto da svaki dan počnete frustrirani napretkom u mršavljenju, možete se probuditi s osjećajem motivacije.

Evo&rsquos koliko kilograma možete izgubiti, prema web stranici c-AMPBoost.com:

&ldquoVi&rsquoll odjednom izgubite 10, 20, čak 30 ili više kilograma teške, ružne tjelesne masti i zadivite svoju obitelj nevjerojatnom transformacijom koja je zapravo došla vraški lako…Povucite svoj omiljeni par traperica opet preko bedara… i pogledajte bootylicious (na seksi način).&rdquo

Ostale tvrdnje o gubitku težine na prodajnoj stranici cAMP Boost uključuju:

U jednoj studiji o sastojku unutar cAMP Boosta, sudionici su izgubili do 677% više tjelesne masnoće od placebo skupine – samo uzimajući dodatak PDE-4 inhibitoru

U drugoj studiji, sudionici su izgubili masnoće 6x brže od placebo skupine, a izgubili su 5,53% tjelesne masti nakon samo 4 tjedna, pa su nakon 12 tjedana izgubili ukupno 15,6% tjelesne masti, istraživači u ovoj skupini uzeli su spoj kiselog voća koji djeluje kao inhibitor PDE-4

U drugoj studiji, istraživači su otkrili da su sudionici sagorjeli dodatnih 180 kalorija &ldquodoslovno bez napora&rdquo nakon što su uzeli jedan od sastojaka cAMP Boosta, sudionici u toj studiji izgubili su 63% svoje masne mase u razdoblju od 4 mjeseca

Jedna žena predstavljena na web stranici c-AMPBoost.com tvrdi da je izgubila 22 lbs tjelesne masti nakon 8 tjedana dok je uzimala cAMP Boost, ili oko 2,5 do 3,5 lbs tjedno

Neke tablete za mršavljenje daju nerealne tvrdnje o mršavljenju, sugerirajući da možete izgubiti 50 funti u mjesec dana bez dijete ili vježbanja. Web stranica cAMP Boost je realističnija, poziva se na znanstvene studije, recenzirana istraživanja i stvarna iskustva kupaca. Kao i druge tablete za mršavljenje, cAMP Boost bi trebao nadopuniti zdravu prehranu i navike vježbanja, a ne zamijeniti ih.

CAMP Pojačani sastojci

cAMP Boost koristi Sinetrol i druge sastojke kako bi vam pomogao pri mršavljenju. Neki od ovih sastojaka inhibiraju PDE-4. Ostali sastojci povećavaju cAMP signalizaciju. Zajedno, ti učinci mogu vam pomoći da sagorite više masti 24 sata dnevno.

Evo sastojaka u cAMP Boostu i kako oni djeluju, prema Nutravilleu:

Sinetrol

Sinetrol je vlasnička formula koja cilja na korijenski uzrok tvrdokorne masnoće na trbuhu: enzim nazvan PDE-4. Ovaj enzim blokira aktivnost cAMP-a koji sagorijeva masnoće, što otežava gubitak težine. Sinetrol je proučavan zbog prednosti mršavljenja, a više studija je pokazalo da Sinetrol može imati moćne učinke na mršavljenje.

Rajska zrna

Rajsko zrno je biljka porijeklom iz južne Etiopije. Ovo je &lsquovrući afrički začin&rsquo spomenut u odjeljku o smeđoj masti iznad. Prema Nutravilleu, zrna raja mogu aktivirati smeđu masnoću u vašem tijelu. Smeđa mast sagorijeva više energije od bijele masti. Pretvarajući vašu bijelu masnoću u smeđu mast, rajska zrna mogu navodno imati moćne učinke na gubitak težine. Sudionici koji su uzimali rajska zrna sagorjeli su 100 kalorija dnevno više od placebo skupine u jednoj studiji.

Sjeme guarane

cAMP Boost također sadrži sjeme guarane, prirodni ekstrakt povezan s gubitkom težine u više studija. U jednoj studiji, sudionici koji su uzimali sjemenke guarane izgubili su 16,3 funti i 5,1% tjelesne masti u razdoblju od 8 tjedana. Čini se da guarana djeluje tako što vam pomaže da sagorite više kalorija, što dovodi do &ldquosagurnog i brzog gubitka masti,&rdquo prema Nutravilleu.

Ekstrakt grejpa

cAMP Boost sadrži ekstrakt grejpa, kiselo supervoće popularno za mršavljenje. Dr. Oz nedavno je pohvalio prednosti grejpa&rsquos za mršavljenje, tvrdeći da se &ldquotnjegov sastojak vratio za mršavljenje…i bolji nego ikad.&rdquo Prema Nutravilleu, ekstrakt grejpa pomaže u kontroli tjelesne težine povećavajući cAMP signale koji se šalju stanicama, stvarajući sigurnu i brzu masnoću gubitak. U jednoj studiji, sudionici koji su uzimali ekstrakt grejpa izgubili su 333% više težine od placebo skupine.

Bioperine

Konačni sastojak cAMP Boosta je Bioperine, posebna vrsta ekstrakta crnog papra. Nutraville je dodao ovaj sastojak kako bi poboljšao apsorpciju i bioraspoloživost ostalih sastojaka u cAMP Boostu. Prema Nutravilleu, Bioperine &ldquoradi poput štita oko svakog sastojka,&rdquo pomažući svakom sastojku da pruži maksimalnu korist vašem tijelu.

Priča iza cAMP Boosta

cAMP Boost kreirala je Carly Johnson, supruga i majka koja je bila frustrirana svojim debljanjem. Muž Carly&rsquos ostavio ju je zbog mršavije žene. Ta je žena kasnije ismijavala težinu Carly&rsquos, učeći svog sina da Carly zove debelom.

Ponižena i iznervirana, Carly je odlučila krenuti u akciju. Počela je istraživati ​​prirodne lijekove za mršavljenje. Osjećala se kao da je sve radila kako treba, uključujući dijetu i vježbanje, ali nije gubila na težini.

Na kraju je Carly naišla na inhibitore PDE-4 i gore navedene sastojke. Udružila se sa svojim prijateljem Johnom kako bi stvorila sastojke u obliku dodataka. Nakon što je uzela formulu, Carly je izgubila 22 funte u 8 tjedana.

Motivirana svojim uspjehom u mršavljenju, Carly je odlučila prodati dodatak online u obliku cAMP Boosta.

Carly pažljivo objašnjava da nije liječnica ili nutricionistica: ona je samo obična žena koja je odlučila stvoriti dodatak za mršavljenje. Danas svatko može kupiti cAMP Boost online putem službene web stranice, potencijalno uživajući u sličnim rezultatima mršavljenja kao i Carly.

Naljepnica sa sastojcima za pojačanje cAMP-a

Nutraville unaprijed objavljuje svoj puni popis sastojaka i doza, što olakšava usporedbu dodatka sa znanstvenim studijama i natjecanje za pomoć pri mršavljenju.

  • 450 mg ekstrakta grejpa, ekstrakta sjemenki guarane, ekstrakta citrusa Sinensis i koncentrata krvave naranče (u obliku Sinetrol Xpur)
  • 40mg zrna ekstrakta raja (u obliku CaloriBurn)
  • 5mg ekstrakta crnog papra (u obliku Bioperina)
  • Ostali sastojci, uključujući biljnu celulozu, titanov dioksid, rižin prah, magnezijev stearat i silicij dioksid

Znanstveni dokazi za povećanje cAMP-a

Nutraville tvrdi da je svaki sastojak unutar cAMP Boosta &ldquou studijama dokazan da je siguran i učinkovit.&rdquo Tvrtka citira desetke studija na c-AMPBoost.com koje podupiru njegove oglašene prednosti.

U ovoj studiji iz 2006., na primjer, istraživači su raspravljali o učincima inhibitora fosfodiesteraze (PDE). Fosfodiesteraze su raznolika obitelj enzima koji igraju ključnu ulogu u regulaciji unutarstaničnih razina drugih glasnika cAMP i cGMP, čineći PDE ključnim za staničnu funkciju. Postoje tri glavne vrste PDE inhibitora, uključujući PDE-3 inhibitore (za kongestivno zatajenje srca), PDE-4 inhibitore (za upalne bolesti dišnih putova) i PDE-5 inhibitore (za erektilnu disfunkciju).

Također je istina da aktivnost PDE-4 opada s godinama. U ovoj studiji iz 2016. znanstvenici su uočili dobne razlike u aktivnosti PDE, što je dovelo do zamjetnih promjena u staničnom signaliziranju. Istraživači su analizirali učinke ove aktivnosti PDE-4 na zdravlje srca i krvnih žila, a ne učinke gubitka težine. Međutim, istina je da se aktivnost PDE-4 mijenja s godinama.

Jedan od najvećih sastojaka cAMP Boosta je Sinetrol. Sinetrol je vlasnička mješavina ekstrakata citrusa potkrijepljena brojnim kliničkim ispitivanjima. Kako je objašnjeno na Sinetrol.com, dokazano je da spoj poboljšava sastav tijela i gubitak masnoće u tri klinička ispitivanja. U jednoj studiji koja je uključivala 77 ispitanika s prekomjernom tjelesnom težinom i pretilosti, ispitanici su u prosjeku smanjili 63% svoje tjelesne mase viška masnog tkiva i sagorjeli dodatnih 180 kalorija dnevno nakon uzimanja Sinetrola. Ispitanici su također značajno dobili čistu masu, što je dovelo do zdravijeg sastava tijela.

Također je istina da je smeđa mast metabolički aktivnija od bijele masti, što vam može pomoći da sagorite više kalorija u mirovanju. Kao što je objašnjeno u ovoj studiji iz 2009. objavljenoj u Dijabetes, metabolički aktivno smeđe masno tkivo (smeđa mast) doprinosi trošenju energije. Zapravo, smeđa mast je mehanizam preživljavanja. Rasipa energiju kao toplinu i utječe na dnevnu potrošnju energije, što ga čini vrijednom za gubitak težine.

cAMP Boost sadrži patentirani oblik zrnaca rajskog ekstrakta pod nazivom CaloriBurn. Kao što možete pogoditi iz imena, CaloriBurn je dizajniran posebno za poboljšanje učinaka sagorijevanja masti rajskih žitarica. U ovoj studiji iz 2014. istraživači su sudionicima dali zrnce raja u razdoblju od 4 tjedna. Iako istraživači nisu primijetili značajan gubitak težine u usporedbi s placebom, istraživači su otkrili da rajska zrna povećavaju potrošnju energije cijelog tijela. Na temelju ovih rezultata, istraživači su zaključili da zrna ekstrakta raja &ldquoma mogu biti učinkovito i sigurno sredstvo za smanjenje tjelesne masti.&rdquo Sudionici su uzimali 30mg zrna ekstrakta raja dnevno, što je nešto manje od 40mg zrna ekstrakta raja u svakom kapsula cAMP Boosta.

Općenito, cAMP Boost sadrži sastojke i doze za koje je dokazano da pomažu kod mršavljenja. Iako Nutraville nije završio klinička ispitivanja posebno na cAMP Boostu, tvrtka se povezala s mnogim studijama koje dokazuju da sastojci u cAMP Boostu mogu pomoći da izgubite težinu.

CAMP Boost Cijene

cAMP Boost ima cijenu od 67 USD po boci, iako cijena pada i na 41 USD po boci kada se naruči više jedinica.

  • 1 boca: 67 USD + 9,95 USD Dostava
  • 3 boce: 171 USD + besplatna dostava
  • 6 boca: 246 USD + besplatna dostava

Svaka bočica sadrži zalihu od 30 dana (60 kapsula). Uzimate jednu kapsulu dva puta dnevno kako biste inhibirali PDE-4, aktivirali cAMP i izgubili težinu.

CAMP Boost politika povrata

Možete zatražiti potpuni povrat novca za svoju kupnju (minus originalnih troškova dostave) u roku od 365 dana od datuma vaše izvorne kupnje.

Ako niste značajno izgubili na težini dok ste uzimali cAMP Boost, ili ako ste iz bilo kojeg razloga nezadovoljni rezultatima dodatka, tada možete zatražiti puni povrat novca bez pitanja i gnjavaže.

O Nutravilleu

cAMP Boost proizvodi tvrtka za dodatke prehrani pod nazivom Nutraville. Nutraville ima sjedište u Valenciji u Kaliforniji. Tvrtka proizvodi tri dodatka, uključujući Amyl Guard, Gluta Raise i cAMP Boost.


Materijali i metode

Ekspresija i pročišćavanje proteina

DNA sekvenca koja kodira ljudski PKG Iβ (92�) klonirana je u pQTEV [33]. Protein je proizveden u BL21 (DE3) E coli koje su uzgajane na 37ଌ do OD600 od 0,6 zatim induciran s 0,4 mM IPTG. Kulture su uzgajane dodatnih 18 sati na 18ଌ. Stanice su suspendirane u 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7,9) i lizirane korištenjem staničnog disruptora (Constant Systems). His-označeni PKG Iβ (92�) pročišćen je s BioRad IMAC smolom na Bio-Rad Profinia™ sustavu za pročišćavanje. Protein je eluiran puferom za suspenziju stanica koji je sadržavao 250 mM imidazola. Uzorak je inkubiran s 1,0 mg/ml TEV proteaze na 4ଌ tijekom 48 sati da se ukloni His-oznaka. Protein je dalje pročišćen s Q sepharose HP nakon čega je slijedila gel filtracija na Hi-load 16/60 Superdex-75 koloni (GE Healthcare) u 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM i 1 mM TCEP-HCl.

Kristalizacija

Za kristalizaciju djelomičnih apo kristala, uzorak proteina je koncentriran na 20 mg/ml korištenjem 10 kDa cutoff Amicon Ultra (Millipore). Djelomični apo kristali dobiveni su metodom parne difuzije u 1,4 M natrij/kalijev fosfat (pH 5,6) pri 22ଌ. Optimizacija kristala napravljena je pomoću robota Orxy6™ (Douglas Instruments LTD). Bipiramidalni kristali su se pojavili u 1,4 M natrij/kalijev fosfat (pH 8,1) na 22ଌ za 2 dana. Kokristalizacija s cGMP je postignuta dodavanjem cGMP (Aral Biosynthetics) do konačne koncentracije od 5 mM u pročišćeni proteinski uzorak, koji je zatim koncentriran na 33 mg/ml korištenjem 10 kDa cutoff Amicon Ultra (Millipore). Kristali kompleksa PKG Iβ:cGMP dobiveni su metodom parne difuzije u 0,1 M natrijevom malonatu (pH 5,0), 12% PEG 3350 na 4ଌ. Slično, kokristalizacija s cAMP je postignuta dodavanjem cAMP do konačne koncentracije od 5 mM u uzorak proteina, koji je koncentriran s 10 kDa graničnim Amicon Ultra (Millipore) do 17 mg/ml. Kristali kompleksa PKG Iβ:cAMP dobiveni su metodom parne difuzije u 1,4 M natrij/kalijev fosfat (pH 5,6) pri 4 °C.

Svi kristali su prebačeni u otopinu krioprotektanta (25% glicerol) i brzo ohlađeni u tekućem dušiku. Podaci o difrakciji rendgenskih zraka prikupljeni su na liniji snopa 8.2.1 (Advanced Light Source, Berkeley, CA, USA). Podaci o difrakciji obrađeni su i skalirani pomoću HKL2000, što je rezultiralo prihvatljivim skupom podataka sa zadovoljavajućim sažetkom statistike (Tablica 1).

Kristalna struktura PKG Iβ (92�):cAMP određena je molekularnom zamjenom korištenjem skraćenog modela PKA RIα (91�) (PDB: 1RGS) kao molekularne zamjenske sonde [8]. Naknadna faza, modifikacija gustoće i izgradnja modela provedeni su s phenix.autosolom [34]. Rezultirajući model ručno je dovršen u Cootu [35], a suzdržana struktura-pročišćavanje implementacijom TLS rafiniranja [36] rezultiralo je cAMP modelom s Rraditi i Rbesplatno od 20,6% odnosno 23,0%. Rafiniranje 2.9 Å PKG Iβ(92�):cGMP kompleksa provedeno je u PHENIX-u (dev-403) [10] korištenjem referentnih diedralnih ograničenja izvedenih iz cAMP kompleksa više rezolucije, kao što je opisano u sljedećem odjeljku . Upotreba referentnog modela više rezolucije u preciziranju poboljšala je vrijednosti R i R-free, kao i kriterije validacije MolProbity, što je rezultiralo konačnim modelom s Rraditi i Rbesplatno od 20,4% i 26,0%, respektivno [37]. Za sve od Fo-Fc izostavljajući karte prikazane na slikama, generirali smo simulirane karte izostavljanja žarenja, izostavljajući regiju s granicom od 2 Å oko svakog liganda kao što je opisano u Terwilliger et al.[38].

Pročišćavanje referentnog modela u phenix.refine

Kako bi se poboljšala stabilnost pročišćavanja i pridružena kvaliteta modela u preciziranju niske rezolucije, cGMP i djelomične apo strukture su pročišćene s feniks.pročistiti korištenjem diedralnih ograničenja dobivenih iz strukture PKG Iβ:cAMP više rezolucije. Diedralna ograničenja dobivena iz referentnog modela nametnuta su radnom modelu ako je apsolutno kutno odstupanje palo unutar korisnički definiranog praga. Za ovo preciziranje korištena je vrijednost praga od 15°. Ova ograničenja služila su usmjeravanju cjelokupne topologije modela uz izbjegavanje neopravdane pristranosti modelu visoke razlučivosti. Shema pročišćavanja slična je konceptu nekristalografskim ograničenjima simetrije usvojenim u SHELXL i pristupu deformabilne elastične mreže uvedenom u sljedećoj referenci [39].

Izotermna titracijska kalorimetrija

Za uklanjanje rezidualnog cAMP-a, svi uzorci su denaturirani inkubacijom u 6 M gvanidin HCl tijekom 24 h na 4ଌ, zatim renaturirani postupnom dijalizom protiv prvo 2 M, a zatim 0,5 M gvanidina HCl tijekom 48 h. Uzorci su zatim pročišćeni u 10 mM Tris (pH 8,0) i 150 mM NaCl na Hi-load 16/60 Superdex 75 koloni (GE Healthcare). Kalorimetrijska mjerenja za cAMP i cGMP vezanja na PKG Iβ (92�) provedena su korištenjem VP-ITC kalorimetra (MicroCal LLC, Northampton, MA). Protein je stavljen u ćeliju uzorka u koncentraciji od 15 µM u kolonskom puferu. Ciklični nukleotidi su stavljeni u injekcijsku štrcaljku u koncentraciji od 250 µM. Volumen ubrizgavanja bio je 5 μl. Podaci su obrađeni korištenjem Origin softvera s ITC podrutinom koju je isporučio proizvođač. Prijavljeni rezultati ponovljeni su u najmanje duplikatu.

Pristupni kodovi banke podataka proteina

Koordinate ovdje opisanih struktura pohranjene su u Protein Data Bank pod pristupnim kodovima 3OD0, 3OCP i 3OGJ za PKG Iβ:cGMP, PKG Iβ:cAMP i djelomične apo strukture, redom.


Uloga i funkcije drugih glasnika | Farmakodinamika

Nakon čitanja ovog članka naučit ćete o ulozi i funkcijama sekundarnih glasnika.

Mnogi hormoni, neurotransmiteri, autakoidi i lijekovi djeluju na specifične membranske receptore, čija je neposredna posljedica aktivacija citoplazmatske komponente receptora, što može biti enzim kao što je adenilat ciklaza, gvanilat ciklaza ili aktivacija transportnog sustava ili otvaranje ionski kanal.

Ove citoplazmatske komponente koje prenose podražaj s receptora poznate su kao drugi glasnici, a prvi glasnik je sam receptor. Primjeri sekundarnih glasnika su-cAMP, cGMP, ca 2+, G-proteini, IP3, DAG itd.

Uloga cAMP-a kao drugog glasnika prvi put je otkrivena u radu Sutherlanda kasnih 1950-ih i #8217. Ovo otkriće srušilo je barijere koje su postojale između biokemije i farmakologije. cAMP je nukleotid sintetiziran unutar stanice iz ATP-a djelovanjem adenilat ciklaze kao odgovor na aktivaciju mnogih receptora. Inaktivira se hidrolizom u 5′-AMP, djelovanjem enzima fosfodiesteraze.

cAMP ima različite regulatorne učinke na stanične funkcije, na primjer, energetski metabolizam, diobu i diferencijaciju stanica, transport iona, funkciju ionskih kanala, kontraktilnost glatkih mišića itd. Ovi različiti učinci su uzrokovani zajedničkim mehanizmom, naime aktivacijom razne proteinske kinaze pomoću cAMP.

Mnogi različiti lijekovi, hormoni neurotransmitera proizvode svoje učinke povećanjem ili smanjenjem katalitičke aktivnosti adenilat ciklaze i na taj način snižavajući ili podižući koncentraciju cAMP unutar stanice. Razine cAMP u stanici također se mogu povisiti inhibiranjem enzima koji metabolizira fosfodiesterazu.

Ciklični gvanozin monofosfat je još jedan međustanični glasnik koji sintetizira enzim gvanilat ciklaza iz GTP-a. Identificiran je u srčanim stanicama, stanicama glatkih mišića bronha i drugim tkivima. Čini se da je za većinu učinaka cAMP stimulirajući, dok se čini da je cGMP inhibitorne prirode.

Kada su cAMP i cGMP sustavi prisutni u jednoj stanici ili tkivu, oni su povezani s receptorima putem kojih lijekovi proizvode suprotne učinke. Na primjer, u stanicama srčanog tkiva, β-adrenoceptori povećavaju učestalost i snagu kontrakcije povećanjem razine cAMP, dok kolinergički receptori imaju suprotan učinak povećanjem razine cGMP.

IP3 i DAG sustav je još jedan važan intracelularni drugi sustav glasnika, a prvi ga je identificirao Michell 1975. Oba su produkti razgradnje membranskih fosfolipida enzimom fosfolipazom C. IP3 djeluje vrlo učinkovito na oslobađanje kalcija iz unutarstaničnih zaliha.Poznato je da ovaj Ca 2+ regulira funkciju raznih enzima, kontraktilnih proteina i ionskih kanala.

DAG izravno aktivira protein kinazu C i kontrolira fosforilaciju amo kiselina raznih intracelularnih proteina. To uzrokuje oslobađanje hormona iz endokrinih žlijezda ili modulira oslobađanje neuro i shytransmitera ili modulira kontraktibilnost glatkih mišića ili upalne odgovore ili ion-transport ili promociju tumora itd. Postoji najmanje šest različitih tipova PKC nejednako raspoređenih u različitim stanicama.

Aktivacija drugog enzima fosfolipaze A2 dovodi do proizvodnje arahidonske kiseline iz membranskih fosfolipida, koji se dalje razgrađuju na prostaglandine, leukotriene, tromboksane itd.

Oni su dobro poznati po svojoj ulozi lokalnih hormona, ali je zanimljivo da se nedavno pokazalo da sama arahidonska kiselina i njezini metaboliti djeluju kao intracelularni, glasnici, kontrolirajući funkciju kalijevih kanala u određenim neuronima.

Kalcijevi ioni su od velike važnosti među mnogim drugim intracelularnim sekundarnim glasnicima. Mnoga regulatorna djelovanja su posredovana Ca 2+ vezan za svoj intracelularni regulatorni protein, kalmodulin. Ca 2+ ioni su također uključeni u oslobađanje arahidonske kiseline iz membranskih fosfolipida aktiviranim fosfolipazama i tako pokreću sintezu prostaglandina i leukotriena. Pokazalo se da Ca 2+ u sinergizmu s PKC aktivira staničnu funkciju poput glikogenolize hepatocita, oslobađanja inzulina iz gušterače. Ca 2+ također igra važnu ulogu u kontrakciji i opuštanju skeletnih i glatkih mišića tijela.

G-proteini predstavljaju razinu srednjeg menadžmenta u staničnoj organizaciji i sposobni su komunicirati između receptora i efektorskih enzima ili ionskih kanala. Nazvani su G-proteini zbog njihove interakcije s nukleotidima gvanina, GTP i GDP.

G proteini su vezani za citoplazmatsku površinu plazma membrane. To su heterotrimerne molekule koje se sastoje od 3 podjedinice α, β i γ (slika 3.10). Njihova klasifikacija kao stimulirajuća ili inhibitorna temelji se na identitetu njihove različite α podjedinice.

β i γ podjedinice ostaju povezane kao β γ kompleks s citoplazmatskom površinom membrane kada je sustav neaktivan ili u stanju mirovanja, GDP je vezan za α podjedinicu.

Kad god agonist stupi u interakciju s receptorom, to olakšava vezanje GTP-a na α podjedinicu i potiče disocijaciju GDP-a s njegovog mjesta. Vezanje GTP-a aktivira α podjedinicu i tada se smatra da se α-GTP odvaja od β i stupa u interakciju s efektorom vezanim na membranu.

Proces se prekida kada se hidroliza GTP-a u GDP dogodi kroz aktivnost GTpaze α-podjedinice. Rezultirajući α-GDP zatim se odvaja od efektora i ponovno se sjedinjuje s β γ dovršavajući ciklus odgovora. Vezanje podjedinice na molekulu efektora zapravo povećava njezinu aktivnost GTpaze, veličina tog povećanja varira za različite vrste efektora.

Mehanizmi ovog tipa općenito rezultiraju amplifikacijom jer jedan kompleks receptora agonista može zauzvrat aktivirati nekoliko molekula G-proteina, a svaka od njih može ostati povezana s efektorskim enzimom dovoljno dugo da proizvede mnogo molekula proizvoda.

Proizvod je često drugi glasnik, a daljnje pojačavanje događa se prije nego što se proizvede konačni stanični odgovor. To je biološka prilagodba organizma za razumno korištenje njegovih prijenosnih tvari.

G-proteini nisu svi identični, a posebno α-podjedinica pokazuje varijabilnost. Vjeruje se da postoje tri glavne vrste G-proteina, tj. Gs, Gi i Gq. Gs i Gi proizvode stimulaciju i inhibiciju efektorskog sustava (slika 3.11). Nije neobično da nekoliko receptora u pojedinačnoj stanici aktiviraju jedan G protein i jedan receptor koji regulira više od jednog G-proteina.