Informacija

Vrijednosti E. coli za [enzime], [metabolite] i kinetičke brzine

Vrijednosti E. coli za [enzime], [metabolite] i kinetičke brzine


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

U svom pokušaju da stvorim metabolički model E coli, pronašao sam opsežan popis metaboličkih reakcija i njihovu stehiometriju. Ovaj koji trenutno koristim je E coli model iJO1366 (više ovdje). Ono što još nisam pronašao je opsežan popis konstanti kinetičke brzine povezanih s ovim reakcijama. Također mi je potreban izvor podataka o koncentracijama ovih enzima i metabolita u stabilnom stanju u E coli. Gdje mogu pronaći informacije o koncentracijama i konstantama brzine?


Savjetovao bih vam da koristite SMBL za iAF1260 E. Coli s COBRA alatnom kutijom na MATLAB-u. Ima sve konstante koje tražite optimizirane za stabilno stanje i opsežno je testiran za simulaciju brisanja/mutacije jednog i više gena. Čak i ako se želite držati svog modela, moći ćete kopirati konstante odatle.

Međutim, ovisno o tome što radite, možda nećete biti zadovoljni cijelim modelima, budući da su računski previše komplicirani za simulaciju i optimizaciju te dovode do računski nestabilnih rezultata, posebno kada pokušavate simulirati kolaborativne mehanizme kolonije.


Utjecaj kinetičkih izotopskih učinaka u izotopskim studijama metaboličkih sustava

Eksperimenti označavanja izotopa (ILE) sve se više koriste za istraživanje funkcioniranja metaboličkih sustava. Neki enzimi podliježu kinetičkim izotopskim učincima (KIE) koji moduliraju brzinu reakcije ovisno o izotopskom sastavu njihovog supstrata. KIE stoga mogu utjecati i na širenje izotopa kroz metaboličke mreže i na njihov rad, te u konačnici ugroziti biološku vrijednost ILE-a. Međutim, stvarni utjecaj KIE-a na metabolizam nikada nije istražen na razini sustava.

Rezultati

Prvo, razvili smo okvir koji integrira KIE u kinetičke i izotopske modele metabolizma, čime se uzima u obzir njihov učinak na koncentraciju metabolita, metaboličke tokove i izotopske obrasce. Zatim smo primijenili ovaj okvir za procjenu utjecaja KIE-a na središnji metabolizam ugljika Escherichia coli u kontekstu 13 C-ILE, u različitim situacijama koje se obično susreću u laboratorijima. Rezultati su pokazali da utjecaj KIE-a snažno ovisi o unosu oznake i razmatranoj varijabli, ali je značajno niži od očekivanog intuitivno iz mjerenja na izoliranim enzimima. Globalna robusnost i metaboličkog rada i izotopskih obrazaca uvelike proizlaze iz intrinzičnih svojstava metaboličkih mreža, kao što su distribucija kontrole kroz mrežu i dvosmjerna razmjena izotopa.

Zaključci

Ovi rezultati pokazuju nužnost istraživanja utjecaja KIE-a na razini cijelog sustava, u suprotnosti su s prethodnim hipotezama da bi KIE-i imali snažan učinak na raspodjelu izotopa i na određivanje toka, te jačaju biološku vrijednost 13 C-ILE-a. Predloženi okvir za modeliranje je generički i može se koristiti za istraživanje utjecaja svih izotopskih tragova (2 H, 13 C, 15 N, 18 O, itd.) na različite skupove izotopskih podataka i metaboličke sustave. Dopuštajući integraciju izotopskih i metabolomskih podataka prikupljenih u stacionarnim i/ili nestacionarnim uvjetima, također može pomoći u tumačenju ILE-a i olakšati razvoj točnijih kinetičkih modela s poboljšanim eksplikativnim i prediktivnim sposobnostima.


Uvod

Stanična heterogenost je sveprisutna u svim domenama života. Kod mikroba, klonske populacije pokazuju fenotipsku varijabilnost kao rezultat višestrukih čimbenika kao što su fluktuacije u mikrookruženju, stohastičnost u ekspresiji gena ili asimetrična podjela pri diobi stanica 1,2,3. Varijabilnost je dobro prepoznata na transkripcijskoj i translacijskoj razini. Ipak, različiti jednostanični fenomeni proizlaze iz pojave različitih metaboličkih stanja unutar klonske populacije. Na primjer, metabolička heterogenost igra ključnu ulogu u toleranciji na antibiotike 4,5,6, heterogenom unosu hranjivih tvari 7,8 i varijacijama u brzini rasta 9,10. Također se pokazalo da promjene hranjivih tvari mogu uzrokovati podjelu populacije u dvije 11,12 ili više 13 subpopulacija s različitim sposobnostima rasta. Pojava subpopulacija teoretizirana je kao strategija zaštite od opklada koja daje evolucijsku prednost za preživljavanje u nepovoljnim okruženjima 4,14.

Središnji izazov za kvantificiranje metaboličke varijabilnosti je nedostatak tehnika za mjerenje metabolita s rezolucijom jedne stanice 15 . Za razliku od mjerenja ekspresije proteina u jednoj stanici, za koja su razvijeni snažni reporterski sustavi 16,17, kvantifikacija metabolita u pojedinačnim stanicama ostaje glavni izazov. Neke od tehnika koje su do sada korištene uključuju Förster rezonantni prijenos energije (FRET) senzore 18 , faktore transkripcije koji reagiraju na metabolite 19,20, RNA senzore 21 i masenu spektrometriju 22 , no većina ovih tehnologija je u ranim fazama razvoja 15 . Kao rezultat toga, metabolička heterogenost se obično kvantificira neizravno putem mjerenja metaboličkih enzima ili brzine rasta u pojedinačnim stanicama 9,12,23.

Naš cilj u ovom radu je okarakterizirati heterogenost u metabolitima kao rezultat stohastičke ekspresije i katalize enzima. Metabolički modeli tradicionalno pretpostavljaju da se enzimske reakcije ponašaju deterministički na temelju toga da se i enzimi i metaboliti pojavljuju u velikom broju molekula 24 . Međutim, jednostanična proteomika u Escherichia coli pokazuju da su metabolički enzimi promjenjivi kao i bilo koji drugi član proteoma 17 , dok metabolomički podaci sugeriraju da prosječna količina metabolita obuhvaća nekoliko redova veličine 25 . Nekoliko skupova podataka o obilju jednostaničnog metabolita već sugerira značajnu varijabilnost u nekim metabolitima u E coli 19,26 . Takvi dokazi bacaju sumnju na tradicionalnu pretpostavku da je metabolizam čisto deterministički proces, sugerirajući vezu između fluktuacija u ekspresiji enzima i metabolita.

Uloga stohastičke ekspresije gena u varijabilnosti proteina dobro je proučavana 2,3,27,28,29, ali utjecaj takve nasumice na metaboličke reakcije ostaje mnogo manje shvaćen. Razne teorijske studije analizirale su utjecaj fluktuacija u opskrbi i potrošnji metabolita 30,31,32 ili širenje buke enzima na metabolit 33 . Međutim, unatoč rastućim eksperimentalnim dokazima o stohastičkim učincima na metabolizam, matematičkim modelima još uvijek nedostaje dovoljno detalja za integraciju procesa za koje je poznato da oblikuju heterogenost proteina, kao što su stohastičko prebacivanje promotora i transkripcijski prasak.

U ovom radu predlažemo model heterogenosti metabolita u pojedinačnim stanicama. Model integrira stohastičnost u enzimskoj katalizi 24 i ekspresiji 27, dva dobro uspostavljena procesa koja su do sada proučavana izolirano. Naš pristup uključuje stohastičku formulaciju različitih relevantnih mehanizama u enzimskim reakcijama, uključujući reverzibilnu katalizu, stohastičku promjenu aktivnosti promotora, fluktuacije u transkriptima mRNA i potrošnju enzimskog produkta nizvodnim procesima.

Ispitujemo model za različite izvore stohastičnosti koristeći simulacije i analitička rješenja za stacionarnu distribuciju metabolita. Analiza otkriva zamršene obrasce heterogenosti koji se prevode u bimodalne i multimodalne distribucije za broj molekula metabolita. Ovi fenomeni proizlaze iz međudjelovanja između enzima male količine i njegovih katalitičkih parametara. Pod odvajanjem vremenskih skala tipičnih za metaboličke reakcije, pokazujemo da se distribucije metabolita mogu točno aproksimirati pomoću modela Poissonove mješavine (PMM) u velikim područjima parametarskog prostora. Model mješavine može se lako prilagoditi širokoj klasi modela ekspresije gena i pruža kvantitativni alat za predviđanje varijabilnosti metabolita iz mjerenja enzima u pojedinačnim stanicama.


Strukturni i kinetički uvid u stimulaciju RppH-ovisne razgradnje RNA metaboličkim enzimom DapF

Od vitalne važnosti za kontrolu ekspresije gena u eukariota i prokariota, uklanjanje zaštite mRNA 5' završetaka regulirano je enzimima čija je aktivnost modulirana interakcijama s pomoćnim čimbenicima. U Escherichia coli degradacija mRNA ovisna o 5'-kraju počinje stvaranjem monofosforiliranih 5' završetaka pomoću RNA pirofosfohidrolaze RppH, koju može stimulirati DapF, diaminopimelat epimeraza uključena u biosintezu aminokiselina i stanične stijenke. Odredili smo kristalne strukture RppH-DapF kompleksa i izmjerili stope uklanjanja zaštite RNA. Ove studije pokazuju da DapF pojačava aktivnost RppH na dva načina, ovisno o prirodi supstrata. Njegov stimulativni učinak na reaktivnost difosforiliranih RNA, prevladavajućih prirodnih supstrata RppH, zahtijeva supstrat dovoljno dug da dosegne DapF u kompleksu, dok se čini da poboljšana reaktivnost trifosforiliranih RNA uključuje promjene u samom RppH izazvane DapF-om i isto tako raste s dužina podloge. Ova studija pruža osnovu za razumijevanje zamršenog odnosa između staničnog metabolizma i raspada mRNA i otkriva upečatljive paralele s stimulacijom dekapiranja aktivnosti u eukariota.

Figure

Paralele između degradacije mRNA ovisne o 5′-kraju…

Paralele između puteva degradacije mRNA o 5′-kraju u eukariotima i E coli . U…

Kristalna struktura E.…

Kristalna struktura E coli RppH–DapF kompleks u apo obliku sa…

Kristalna struktura RppH…

Kristalna struktura RppH t -DapF m heterodimer vezan za ppcpAGU RNA...

RppH–DapF sučelje. ( A…

RppH–DapF sučelje. ( A ) Sučelje između RppH t (zeleno) i DapF…

Heteromerni vezni afinitet RppH…

Heteromerni vezni afinitet RppH i DapF. ( A ) Kromatografija isključenja veličine…

Identifikacija potencijalnih alosteričnih interakcija…

Identifikacija potencijalnih alosteričnih interakcija DapF s RppH. ( A ) Utjecaj…

DapF stimulacija RppH reaktivnosti…

DapF stimulacija RppH reaktivnosti s difosforiliranim RNA supstratima. ( A ) Promjenjivo…

DapF stimulacija RppH reaktivnosti…

DapF stimulacija RppH reaktivnosti s trifosforiliranim RNA supstratima. ( A ) Promjenjivo…

Učinak DapF na reaktivnost RppH s yeiP mRNA. ( A…

Paralele između uklanjanja zaštite RNA na 5′-terminal...

Paralele između 5′-terminalnih RNA kompleksa za uklanjanje zaštite u bakterijama i eukariotima. ( A )…


Pripadnosti

Kemijski odjel i Lewis-Sigler institut za integrativnu genomiku, Sveučilište Princeton, Princeton, New Jersey, SAD

Bryson D Bennett, Elizabeth H Kimball, Melissa Gao i Joshua D Rabinowitz

Genomatica, Inc., San Diego, Kalifornija, SAD

Robin Osterhout i Stephen J Van Dien

Također možete tražiti ovog autora u PubMed Google Scholaru

Također možete tražiti ovog autora u PubMed Google Scholaru

Također možete tražiti ovog autora u PubMed Google Scholaru

Također možete tražiti ovog autora u PubMed Google Scholaru

Također možete tražiti ovog autora u PubMed Google Scholaru

Također možete tražiti ovog autora u PubMed Google Scholaru

Prilozi

B.D.B. izvršio eksperimente, analizirao podatke i napisao rad. E.H.K. i M.G. izvodili eksperimente. R.O. i S.J.V.D. proveo TMFA. J.D.R. analizirao podatke i napisao rad.

Odgovarajući autor


Metode

Opseg modela i početna konstrukcija ansambla

Metabolički model E coli konstruiran je metabolizam sastavljen od 457 reakcija i 337 metabolita (vidi sliku 1a i dodatne podatke 1). Ovaj model uzima u obzir sve reakcije na ljestvici genoma iAF1260 model 27 koji nose fluks u eksperimentalnim uvjetima mjerenja protoka osim biosinteze lipopolisaharida i mureina. To uključuje reakcije u glikolizi/glukoneogenezi, PP put, TCA ciklus, anaplerotične reakcije, sintezu/razgradnju aminokiselina, oksidaciju/sintezu masnih kiselina i niz reakcija u drugim dijelovima metabolizma, kao što su kofaktor i alternativni ugljik metabolizam, sinteza membranskih lipida i stanične ovojnice i putevi oksidativne fosforilacije (vidi sliku 1b). Osim toga, 295 regulatornih interakcija izdvojeno je iz BRENDA 24 i EcoCyc 25 i uključeno u model uvođenjem novih regulatornih reakcija (vidi sliku 1c) (vidi Dopunske podatke 1 za sveobuhvatan popis) 53 . Pojednostavljena verzija jednadžbe biomase za E coli opisano u (ref. 54) također je integrirano u model uključujući sve aminokiseline kao i druge prekursore sastavnih dijelova biomase u središnjem metabolizmu. Ova jednadžba biomase korištena je samo za 'odvođenje' prekursora biomase iz puteva koji su odsutni u k-ecoli457 (vidi sliku 1).

Slijedeći EM proceduru 19 , sve metaboličke reakcije i regulatorne interakcije u modelu najprije su razložene na njihove elementarne korake i razvijena je kinetika djelovanja mase za svaku elementarnu reakciju. Elementarni kinetički parametri su zatim izraženi u terminima elementarnih parametara reakcije, reverzibilnosti reakcija R i frakcije enzima, obje omeđene između nule i jedan. Reverzibilnost reakcije definira se kao elementarna brzina povratne reakcije podijeljena s prednjom reakcijom za svaki elementarni korak (gdje je Vneto je neto tok reakcije). Frakcija enzima definira se kao razina nevezanog enzima e normaliziran ukupnim skupom specifičnog enzima ( i ). Koncentracije metabolita također su normalizirane korištenjem referentnih vrijednosti (divljeg tipa) soja. Elementarni kinetički prikazi i skalirane koncentracije metabolita osiguravaju prikladno skaliranje između nule i jedan za uzorkovanje parametara za frakcije enzima i reverzibilnosti reakcije u skladu s termodinamičkim principima 19 . Koristili smo eksperimentalno izmjerene podatke o protoku za divlji tip E coli soj koji raste aerobno s glukozom 20 kao referentnim sojem za skaliranje i konstrukciju ansambla.

Referentna raspodjela toka dobivena je prvim maksimiziranjem prinosa biomase (po 100 mmol g DW −1 h −1 unosa glukoze i 200 mmol g DW −1 h −1 unosa kisika) u iModel AF1260 koji koristi FBA, a eksperimentalna mjerenja toka (za 43 reakcije) 20 nameće kao ograničenja. Zatim je korištena analiza varijabilnosti protoka 55 za identificiranje raspona protoka za reakcije bez eksperimentalnih mjerenja nakon fiksiranja toka biomase na vrijednosti dobivenoj u prvom koraku. Dobiveni rasponi protoka zatim su korišteni za ograničavanje reakcija bez dostupnih mjerenja. Izvediva raspodjela toka tada je dobivena nametanjem eksperimentalnih podataka zajedno s rasponima toka koji se pokreću analizom varijabilnosti toka u našem modelu maksimiziranjem prinosa biomase. Ta je raspodjela toka tada korištena za sidrenje stacionarnih tokova tijekom jednolikog uzorkovanja parametara modela i konstrukcije elementarne kinetičke ansambla. Koristili smo veličinu ansambla od 2 17 = 131 072 modela, budući da za veću veličinu ansambla nije postignuto poboljšanje u predviđanjima modela i konvergencija do optimalnog rješenja.

Višestruki skupovi podataka o protoku za parametrizaciju modela

Parametarizacija modela provedena je korištenjem podataka o protoku u stacionarnom stanju za 25 mutantnih sojeva E coli u aerobnim kao i anaerobnim uvjetima s višestrukim ugljičnim supstratima. Konkretno, skupovi podataka o protoku uključuju devetnaest pojedinačnih mutantnih sojeva koji rastu u aerobnim uvjetima (tj. Δpgi, ΔpykA, ΔpykF, ΔppsA, Δgnd, Δzwf, Δrpe, ΔpfkA, ΔpfkB, ΔfbaB, ΔgpmA, ΔgpmB, Δpgl, ΔrpiA, ΔrpiB, ΔtalA, ΔtalB, ΔtktA i ΔtktB) 20 i dva soja koja rastu u anaerobnim uvjetima (tj. divlji tip i Δldh) s glukozom kao ugljičnim supstratom 21 , tri soja rastu u aerobnim uvjetima s piruvatom kao ugljičnim supstratom (tj. divlji tip, Δzwf i Δgnd) 22 i jedan soj koji raste u aerobnim uvjetima s acetatom kao ugljičnim supstratom (tj. divlji tip) 23 . Ukupno smo ekstrahirali mjerenja protoka za ∼ 30 reakcija u svakom mutantnom soju uključujući glavne intracelularne reakcije u glikolizi, PP put i TCA ciklus (vidi sliku 1a) 20 . Osim toga, izvršili smo analizu spajanja s E coli reakcija biomase 56 za povećanje skupa podataka o protoku izvan onih u središnjem metabolizmu. Otkrili smo da je između 33 i 36 reakcija (ovisno o specifičnom mutantu) bilo u potpunosti povezano s proizvodnjom biomase i dodano na popis izmjerenih tokova. Te su reakcije, što nije iznenađujuće, locirane u putovima biosinteze sastojaka biomase, kao što su metabolizam stanične ovojnice i putevi sinteze aminokiselina (tj. treonin, lizin, metionin, valin, leucin, izoleucin, tirozin, triptolanin, metabolizam i phen) vidi dodatne podatke 1).

Intervali povjerenja procijenjenih i izmjerenih parametara

Intervali povjerenja dani su samo za izmjerene tokove soja divljeg tipa u skupovima podataka za obuku 20 . Posljedično, koristili smo iste intervale pouzdanosti prijavljeni za svaku reakciju u soju divljeg tipa kako bismo konstruirali raspon protoka (tj. 1 s.d. interval pouzdanosti) oko prijavljenih vrijednosti u mutantnim sojevima. Isto tako, za metabolite bez prijavljenog raspona pouzdanosti u mutantnim sojevima, koristili smo iste intervale pouzdanosti koji su prijavljeni za svaki metabolit u soju divljeg tipa kako bismo konstruirali raspon koncentracije (tj. interval pouzdanosti od 1 s.d.). Osim toga, za eksperimentalno izmjerene Michaelis-Menten konstante (tj. Km i kmačka) s višestrukim prijavljenim vrijednostima u BRENDA 24 i EcoCyc 25, intervali povjerenja izračunati su pomoću 1 s.d. iz srednje vrijednosti prijavljenih vrijednosti parametara. Za parametre sa samo jednom izmjerenom vrijednošću koristili smo raspon od 10% od prijavljenih vrijednosti parametara kao intervale pouzdanosti (vidi dodatne podatke 2). Osim toga, predviđene normalizirane koncentracije metabolita i Michaelis-Menten konstante su skalirane prema odgovarajućim rasponima pouzdanosti koncentracije metabolita u referentnom (divljeg) soja kako bi se pretvorile u stvarne raspone (pogledajte Dopunske metode, pretvorba procijenjenih elementarnih kinetičkih parametara) . Kako bismo smanjili nesigurnost baznih koncentracija, izdvojili smo sedam dodatnih skupova podataka izmjerene koncentracije za soj divljeg tipa uz podatke o referentnom soju i koristili njihova sjecišta raspona pouzdanosti kao rasponi baze 16,28,33,57,58, 59,60 (vidi dopunsku tablicu 2). Za metabolite bez podataka o koncentraciji u soju divljeg tipa (odnosno 12%) koristili smo prijavljene raspone u iAF1260 model E coli 27 . Zatim se kvaliteta sporazuma mjeri kao preklapanje između prijavljenih i predviđenih raspona pouzdanosti.

Procjena parametara k-ecoli457

Parametarizacija modela provedena je u dvije faze: (a) procjena elementarnih kinetičkih parametara i aktivnosti izozima korištenjem eksperimentalno izmjerenih podataka o protoku za pojedinačne mutante koji su rasli pod minimalnim aerobnim uvjetima glukoze (to jest, ukupno devetnaest skupova podataka o protoku) i (b) procjena razine enzima pod minimalnim fermentativnim (anaerobnim) uvjetima glukoze i alternativnim ugljičnim supstratima piruvat i acetat (to jest, ukupno šest skupova podataka o protoku).

Procjena elementarnih kinetičkih parametara i aktivnosti izoenzima

Korištena je GA implementacija koja je minimalizirala odstupanje predviđanja modela od dostupnih mjerenja protoka za devetnaest mutantnih sojeva uzgojenih aerobno s glukozom 15 . U biti, ovaj pristup temeljen na optimizaciji identificira optimalnu kombinaciju uzorkovanih parametara i posljedično ekvivalentnih Km i vmax vrijednosti u Michaelis–Mentenovom opisu permutiranjem parametrizacija za različite reakcije kroz modele u ansamblu. Posljedica nokauta enzima hvata se fiksiranjem ukupnog skupa normalizirane razine enzima na nulu (tj. ) za izbrisanu reakciju, dok se pretpostavlja da ostaje nepromijenjena za preostale reakcije. Za reakcije koje kataliziraju izozimi, brisanje jednog izoenzima smanjuje (ukupni enzim) na razinu između nule i referentne razine (to jest, ), jer nije jasno u kojoj mjeri preostali izozim može nadopuniti izgubljenu aktivnost. Stoga smo dopustili da se minimiziranje predviđanja modela s eksperimentalnim mjerenjima postigne najbolja vrijednost za uz zadržavanje zbroja za sve izozime na jedan. Ukupno smo dopustili da variraju normalizirane razine enzima za sedam reakcija koje katalizira 12 izozima (tj. ΔpfkA, ΔpfkB, ΔfbaB, ΔgpmA, ΔgpmB, Δpgl, ΔrpiA, ΔrpiB, ΔtalA, ΔtalB, ΔtktA i ΔtktB u aerobnim uvjetima s glukozom kao ugljičnim supstratom) tijekom prvog koraka (vidi Dopunske metode, implementacija GA).

Procjena razine enzima

Nakon fiksiranja procijenjenih elementarnih kinetičkih parametara (tj. Km), zatim smo procijenili odvojeno za mutantne sojeve koji rastu anaerobno i one s piruvatom ili acetatom kao ugljičnim supstratom. Napominjemo da je to ekvivalentno procjeni vmax () u opisu Michaelis–Mentena, dok se fiksira Km na procijenjene vrijednosti (vidi Dopunske metode, GA implementacija). To je zato što smo očekivali da će se samo razine enzima značajno promijeniti kada se rast prebaci s aerobnog na anaerobni ili na zamjenski ugljični supstrat 61,62,63. Stoga je za sve reakcije u modelu dopušteno da varira od nule (tj. brisanje) do 10-struke prekomjerne ekspresije (tj. ) za mutantne sojeve koji rastu (i) anaerobno s glukozom (odnosno, dva skupa podataka o protoku ), (ii) aerobno s piruvatom kao ugljičnim supstratom (tj. tri skupa podataka o protoku) i (iii) aerobno s acetatom (tj. jedan skup podataka o protoku). Ukupni broj enzima čiji je ukupni normalizirani skup dopušten da varira držan je na minimumu kako bi se izbjegla prekomjerna parametrizacija modela (vidi Dodatne metode, promjene razine enzima).

Procjena predviđenih prinosa za prekomjernu proizvodnju mutanata

Implementirali smo promjene razine enzima dopuštajući da ukupni skup normaliziranog enzima varira između 10-struke niže regulacije i razine divljeg tipa () za prijavljene snižene regulacije enzima. Za povećanje enzima, normalizirana razina enzima postavljena je između razine divljeg tipa i 10-struke regulacije (). Ova je aproksimacija korištena jer razina promjene enzima često nije dostupna u relevantnoj literaturi. Brisanje gena provedeno je postavljanjem kodiranog enzima na nulu.

Parameterizacija modela najmanjih kvadrata i analiza prinosa

Ciljna funkcija problema parametrizacije z je minimiziranje relativnog odstupanja k-ecoli457 predviđenog toka vj iz eksperimentalnih podataka za reakciju j s izmjerenim podacima N preko svih mutantnih sojeva M. Za svaku reakciju s izmjerenim podacima o protoku, prosječna relativna pogreška skalira se njezinim koeficijentom varijacije životopisj kako bi se uhvatila prijavljena nesigurnost u eksperimentalnim podacima (prosječno skalirano relativno odstupanje) 64 . Kao rezultat toga, reakcije s čvršćim intervalima povjerenja imaju veći doprinos u funkciji cilja.

Prinos proizvoda y definira se kao brzina reakcije koja proizvodi proizvod po stopi reakcije preuzimanja (mol proizvoda po molu glukoze).

Za usporedbu, većina eksperimentalnih studija izvijestila je samo o izmjerenom prinosu proizvoda bez raspona pouzdanosti. Posljedično, za svaki prinos proizvoda izračunata je pogreška na temelju relativnog odstupanja između izmjerenih y exp i predvidio y prije vrijednosti.

Svi problemi parametrizacije riješeni su primjenom GA implementacije. Svi proračuni, uključujući konstrukciju ansambla i GA probleme, implementirani su u MATLAB-u (MathWorks Inc.) i rješavani paralelno na tri čvora Intel Xeon E5-2670 v2 s 2,5 GHz (20 jezgri po čvoru i 256 GB RAM-a) na Penn State Lion-X grozdovi. Parametarizacija k-ecoli457 trajala je ∼ 58 800 CPU-sati. Integriranje k-ecoli457 (tj. rješavanje sustava običnih diferencijalnih jednadžbi) za dano metaboličko stanje također traje do nekoliko minuta. Procijenjeni osnovni kinetički parametri kao i stehiometrijska matrica modela dostupni su u Dodatnim podacima 1, a izvršni k-ecoli457 dostupan je za preuzimanje na i na http://www.maranasgroup.com kao MAT datoteka (MathWorks Inc. ).

Dostupnost koda

Autori izjavljuju da je kod koji podržava nalaze ove studije dostupan u datotekama s dodatnim informacijama članka () i na http://www.maranasgroup.com kao MAT datoteka (MathWorks Inc.).

Dostupnost podataka

Svi podaci generirani ili analizirani tijekom ove studije uključeni su u ovaj objavljeni članak i njegove datoteke s dodatnim informacijama.


Materijali i metode

Genomsko sekvenciranje soja.

Genomska DNA klonova krajnje točke ALE izolirana je miješanjem zrna u pločama s 96 jažica kao što je prethodno navedeno (31). Knjižnice sekvencioniranja DNA uparenog kraja cijelog genoma generirane su s kompletom za pripremu knjižnice Kapa HyperPlus (Kapa Biosystems) i pokrenute na Illumina HiSeq 4000 platformi s HiSeq SBS kitom, 150 čitanja baznih parova. Generirane fastq datoteke sekvenciranja DNK obrađene su računskim cjevovodom breseq (verzija 0.32.0) (32) i usklađene s E coli K12 MG1655 referentni genom (33) za identifikaciju mutacija. Kontrola kvalitete sekvenciranja DNA izvršena je pomoću softvera AfterQC (verzija 0.9.7) (34).

Klonovi su odabrani kako bi predstavljali visokofrekventne alele pronađene u populacijama krajnjih točaka odgovarajućih ALE eksperimenata. DNA sekvence korištene su za stvaranje referentnih proteoma za dolje opisane proteomske eksperimente.

Priprema uzorka.

Za svaki soj, 3 mL kulture uzgajano je preko noći na 37 °C uz mućkanje u mediju M9 (4 g glukoze L-1 ) (35) s elementima u tragovima (36), a zatim dvaput propušteno sljedećih dana u 15 mL medija na 37 °C od optičke gustoće (OD) 0,05 do 0,1 do OD 1,0 do 1,5. Za pokus, 100 mL kulture s početnim OD600 (OD na valnoj duljini od 600 nm) = 0,1 uzgaja se u tikvicama uz miješanje u vodenoj kupelji na 37 °C. Kad su kulture dosegle OD600 = 0,6, sakupljeno je 40 mL kulture i odmah stavljeno na led. Stanice su peletirane centrifugiranjem na 5000 o/min na 4 °C tijekom 20 minuta. Stanične pelete su zatim isprane s 20 mL hladne slane otopine puferirane fosfatom (PBS) tri puta i centrifugirane na 5000 rpm tijekom 20 minuta na 4 °C. Pelete su prebačene u epruvete za mikrocentrifugiranje od 1,5 mL i centrifugirane na 8000 rpm na 4 °C tijekom 10 minuta. Preostali PBS pufer je uklonjen, a pelete proteomskih uzoraka su zamrznute na -80 °C.

Liza uzorka za proteomiku.

Smrznuti uzorci uronjeni su u pufer za lizu koji je sadržavao 75 mM NaCl (Sigma Aldrich), 3% natrijevog dodecil sulfata (Fisher Scientific), 1 mM natrijevog fluorida (VWR International, LLC), 1 mM β-glicerofosfata Alm1 rich M, natrijev ortovanadat, 10 mM natrijev pirofosfat (VWR International, LLC), 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (Fisher Scientific), 50 mM Hepes (Fisher Scientific) pH 8,5 i 1x potpuni inhibitor proacetaze bez etilendiamintetraze Uzorci su podvrgnuti brzom miješanju i sonikaciji sondom pomoću sonikatora Q500 QSonica (Qsonica) opremljenog mikrovrhom od 1,6 mm s amplitudom od 20%. Uzorci su podvrgnuti tri ciklusa ultrazvučne obrade od 10 s, nakon čega je slijedilo 10 s mirovanja, s ukupnim vremenom obrade ultrazvukom od 50 s.

Kvantifikacija obilja proteina.

Ukupna količina proteina određena je korištenjem kompleta za ispitivanje proteina bicinhoninske kiseline (Pierce) prema preporuci proizvođača.

Izolacija peptida.

Šest miligrama proteina je alikvotno za svaki uzorak. Volumen uzorka je doveden do 20 mL u otopini 4 M uree + 50 mM Hepesa, pH = 8,5. Disulfidne veze su reducirane u 5 mM ditiotreitolu (DTT) tijekom 30 minuta na 56 °C. Reducirane disulfidne veze alkilirane su u 15 mM jodoacetamida u zamračenom okruženju na sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta. Reakcija alkilacije je ugašena dodatkom izvornog volumena DTT-a tijekom 15 minuta u zamračenom okruženju na sobnoj temperaturi. Proteini su zatim precipitirani iz otopine dodavanjem 5 μL 100% wt/vol trikloroctene kiseline. Uzorci su pomiješani i inkubirani na ledu 10 minuta. Uzorci su podvrgnuti centrifugiranju na 16 000 × g 5 minuta na 4 °C. Supernatant je uklonjen i pelete uzorka su nježno isprane u 50 μL ledeno hladnog acetona. Nakon koraka ispiranja, uzorci su podvrgnuti centrifugiranju na 16 000 × g na 4 °C. Ispiranje acetonom je ponovljeno, a konačni supernatant je uklonjen. Proteinske pelete su sušene na bloku za grijanje na 56 °C tijekom 15 minuta, a pelete su resuspendirane u otopini 1 M uree + 50 mM Hepesa, pH = 8,5. UPS2 standard (Sigma) je rekonstituiran na sljedeći način. U epruvetu je dodano 20 mililitara otopine 4 M uree + 50 mM Hepesa, pH = 8,5. Cijev za uzorke je podvrgnuta vrtložnom i sonifikaciji u vodenoj kupelji po 5 minuta. Standard je podvrgnut redukciji i alkilaciji korištenjem gore opisanih metoda. Uzorak je zatim razrijeđen u otopini 50 mM Hepesa, pH = 8,5 tako da je konačna koncentracija uree bila 1 M. Zatim je 0,88 mg proteinskog standarda dodano u svaki eksperimentalni uzorak, a uzorci su podvrgnuti dvostupanju. proces probave. Najprije su uzorci probavljeni korištenjem 6,6 μg LysC na sobnoj temperaturi preko noći, uz mućkanje. Zatim je protein razgrađen u 1,65 μg tripsina za sekvencioniranje (Promega) tijekom 6 sati na 37 °C. Reakcije probave prekinute su dodavanjem 3,3 μL 10% trifluoroctene kiseline (TFA) i dovedene su do volumena uzorka od 300 μL 0,1% TFA. Uzorci su podvrgnuti centrifugiranju na 16 000 × g tijekom 5 minuta i odslanjeno pomoću kolona za odsoljavanje u vlastitom pakiranju korištenjem metoda prilagođenih iz prethodno objavljenih studija (37, 38). Nakon odsoljevanja, uzorci su liofilizirani, a zatim pohranjeni na -80 °C do daljnje upotrebe.

LC-MS/MS.

Uzorci su resuspendirani u otopini 5% acetonitrila (ACN) i 5% mravlje kiseline (FA). Uzorci su podvrgnuti snažnom vorteksiranju i sonikaciji u vodenoj kupelji. Uzorci su analizirani na Orbitrap Fusion masenom spektrometru s in-line Easy NanoLC (Thermo) u tehničkom trostrukom primjerku. Uzorci su vođeni na rastućem gradijentu od 6 do 25% ACN + 0,125% FA tijekom 70 minuta, zatim 100% ACN + 0,125% FA tijekom 10 minuta. Jedan miligram svakog uzorka stavljen je na unutarnju izvučenu i napunjenu staklenu kapilarnu kolonu zagrijanu na 60 °C. Stup je bio dug 30 cm, vanjski promjer 360 mm i unutarnji promjer 100 mm. Vrh je pakiran C4 smolom promjera 5 mm do 0,5 cm, zatim smolom C18 promjera 3 mm dodatnih 0,5 cm. Ostatak kolone do 30 cm napunjen je smolom C18 promjera 1,8 mm. Ionizacija elektrosprejom postignuta je primjenom 2.000 V na T-spoj koji povezuje uzorak, otpad i kapilarne krajeve stupca. Maseni spektrometar je radio u načinu pozitivnog polariteta. MS1 skeniranja izvedena su u Orbitrapu, s rasponom skeniranja od 375 m/z do 1.500 m/z s rezolucijom od 120.000. Automatska kontrola pojačanja (AGC) postavljena je na 5 × 10 5 , s maksimalnim vremenom ubrizgavanja iona od 100 ms. Dinamičko isključenje provedeno je u trajanju od 30 s. Vrh n je korišten za izolaciju fragmenta iona, s n = 10. Opcija stabla odluka korištena je za analizu fragmenata iona. Ioni sa stanjem naboja 2 izolirani su između 375 m/z i 1.500 m/z, a ioni sa stanjima naboja 3 do 6 izolirani su između 600 m/z i 1.500 m/z. Prekursorski ioni su fragmentirani korištenjem fiksne disocijacije izazvane sudarom. Detekcija fragmenata iona dogodila se u linearnoj ionskoj zamci, a podaci su prikupljeni u profilnom modu. Ciljani AGC je postavljen na 1 × 10 4 .

Technical triplicate spectral data were searched against a customized reference proteome comprising the reference proteome of the respective strain (see above) appended to the UPS2 fasta sequences (Sigma) using Proteome Discoverer 2.1 (Thermo). Spectral matching and in silico decoy database construction was performed using the SEQUEST algorithm (39). Precursor ion mass tolerance was set to 50 parts per million. Fragment ion mass tolerance was set to 0.6 Da. Trypsin was specified as the digesting enzyme, and two missed cleavages were allowed. Peptide length tolerated was set to 6 to 144 amino acids. Dynamic modification included oxidation of methionine (+15.995 Da), and static modification included carbamidomethylation of cysteine residues (+57.021 Da). A false-discovery rate of 1% was applied during spectral searches.

Protein Abundance Estimation.

In order to estimate absolute protein abundance, the top3 metric was calculated for each protein as the average of the three highest peptide areas (11, 12). Robust linear regression (as implemented in the Modern Applied Statistics with S (MASS) package ref. 40) was used to calibrate top3 with the UPS2 standard according to the following model to obtain the amount of loaded protein A: l o g 10 A = a + b l o g 10 t o p 3 .

In order to obtain abundance relative to cell dry weight (C), we use a constant ratio γ = 13.94 µmol⋅gDW −1 (41), C i = γ A i ∑ j A j .

Calculation of kapp,max.

For each biological replicate, apparent catalytic rates kapp were calculated as the ratio of protein abundance and measured flux if 1) the protein abundance surpassed 50 pmol⋅gDW −1 and 2) the estimated flux was at least 4 times larger than the range of the 95% CI and larger than 100 fmol⋅gDW −1 h −1 , and the 95% CI did not include zero, as defined in McCloskey et al. (28).

For each of the two biological replicates per strain, kapp,max was calculated as the maximum kapp,max across the 21 strains. Finally, the average kapp,max over the two replicates was calculated and used in the presented analyses.

Parametric Bootstrap for kapp,max.

We used a parametric bootstrap approach to estimate how experimental variability in proteomics and fluxomics data affects kapp,max. For each enzyme, we assumed protein abundance to be normally distributed with mean and SD estimated from the biological replicates for the respective enzyme. In cases where only one biological replicate was available due to lack of detection in the MS/MS, we imputed the missing SD with a linear regression of SD (on log scale) against mean abundance (on log scale) for all available enzymes. Variability in flux data for the respective reaction was also assumed to take a normal distribution, where we used the SD estimated in the MFA procedure that resulted from multiple MFA model reruns on biological triplicates (as described in refs. 6 ⇓ ⇓ –9). For each reaction, 500 bootstrap samples were simulated based on the parameterized normal distributions of protein abundance and flux for that reaction, and these samples were used to calculate 95% CIs for kapp,max.

Machine Learning.

Turnover numbers were extrapolated to the genome scale using the machine learning approach published previously (15). In this supervised machine learning procedure, enzyme features on enzyme network context, enzyme structure, biochemical mechanism, and, in the case of kmačka in vitro, assay conditions were utilized (15). These enzyme features were labeled with the kapp,max values estimated in this study, and an ensemble model of elastic net, random forest, and neural network was trained using the caret package (42) and h2o (43). The ensemble used an average of the predictions of the three individual models. Model hyperparameters were chosen in five-times repeated cross-validation (one repetition in the case of neural networks) based on the RMSE metric, as reported in Heckmann et al. (15). For the neural networks, random discrete search was used for optimization of hyperparameters (15).

MOMENT Modeling.

Validation of different turnover number vectors in the MOMENT model was conducted as described in Heckmann et al. (15). In the MOMENT algorithm, a flux distribution is computed that maximizes strain growth rate subject to constraints on the total protein budget of the cell (16). In order to constrain fluxes based on enzyme usage, the algorithm requires kmačka parameters (16). Here, we use the respective vectors of kmačka from different sources to parameterize MOMENT and thus to predict protein abundances that were experimentally determined by Schmidt et al. (22). The genome-scale metabolic model iML1515 (44) was used in the R (45) packages sybil (46) and sybilccFBA (47) to construct linear programming problems that were solved in IBM CPLEX version 12.7.

ME Modeling.

To complement the MOMENT-based validation of the computed turnover numbers, a similar validation approach was employed with the iJL1678b-ME genome-scale model of E coli metabolism and gene expression (48). The ME model contains a detailed description of the cell’s gene expression machinery that is not contained in the MOMENT model. The kapps were mapped to iJL1678b-ME as previously described (15). However, the ME model kapps were adjusted due to a key difference that lies in the way that the MOMENT and ME model resource allocation models apply enzyme constraints. MOMENT accounts for each unique protein contained within a catalytic enzyme, whereas the ME model formulation accounts for the complete number of protein subunits in an enzyme. As a result, the macromolecular “cost” of catalyzing a reaction in the ME model is often notably higher than in MOMENT. To account for this, the kapps in the ME model were adjusted by scaling each kapp by the number of protein subunits divided by the number of unique proteins.

The ME model was solved in quad precision using the qMINOS solver (49) and a bisection algorithm (50) to determine the maximum feasible model growth rate, within a tolerance of of 10 −12 . All proteins in a solution with a computed synthesis greater than zero copies per cell were compared to experimentally measured protein abundances. Since the ME model accounts for the activity of many proteins outside of the scope of the kapp prediction method, only those that overlap with predicted kapps were considered.


Sinopsis

Adaptations to fluctuating carbon source availability are of particular importance for bacteria. To understand these adaptations, it needs to be understood how a system's behavior emerges from the interactions between the characterized molecules ( Kitano, 2002b ). To attain such a system understanding of bacterial metabolic adaptations to carbon source availability, the coupling between the recognition and adjustment aspects and between the enzymatic and genetic regulatory layers must be understood. For many carbon sources, neither transmembrane sensors nor regulatory proteins with sensing function have been identified. Also, it remains unclear how multiple local regulations work together to accomplish a coherent adjustment on the systems level. In this paper, we show that (1) the interplay of the known interactions in E coli's central metabolism is capable of recognizing carbon sources indirectly, and that (2) these molecular interactions can adjust E coli's metabolic operation between growth on glycolytic and gluconeogenic carbon sources, and that (3) this adaptation is governed by general principles.

We hypothesized that the system-level adaptations between growth on glycolytic and gluconeogenic carbon sources are accomplished by a system-wide regulation architecture that emerges when the known enzymatic and transcriptional regulations become coupled through five transcription factor (TF)–metabolite interactions. To (1) assess whether such coupled molecular interactions can indeed work together to adapt metabolic operation, and if yes, (2) to understand this system-level adaptation in molecular-level detail, we constructed a large-scale differential equation model. The model topology comprises the Embden–Meyerhoff pathway, the tricarboxylic acid (TCA) cycle, the glyoxylate (GLX) shunt, the anaplerotic reactions, the diversion of carbon flux to the GLX shunt, the uptake of glucose, the uptake and excretion of acetate, enzymatic regulation, transcriptional regulation by four TFs, and the regulation of these TFs’ activities through TF–metabolite interactions. We translated the topology into differential equations by assigning the most appropriate rate law to each interaction. The kinetic model comprises 47 ordinary differential equations and 193 parameters. Parameter values were estimated through application of the ‘divide-and-conquer approach’ ( Kotte and Heinemann, 2009 ) on published experimental steady state-omics data sets.

Model simulations reproduce E coli's known physiological behavior in an environment with fluctuating carbon source availability. But how does the u silikonu cell recognize acetate without a transmembrane sensor for extracellular acetate or a TF binding to intracellular acetate? Similarly, it is unclear whether the glucose sensing function of the phosphotransferase system is the exclusive mechanism to recognize glucose, or whether this sensing function is integrated into a larger sensing architecture. The model suggests that the recognition is performed indirectly through a mechanism we termed distributed sensing of intracellular metabolic fluxes. This mechanism uses two distinct motifs, which we termed pathway usage i flux direction, to establish defined correlations between metabolic fluxes and the levels of certain, here termed flux-signaling metabolites. The binding of these metabolites to TFs propagates the flux information to the transcriptional regulatory layer. A molecular sensor for intracellular metabolic flux is thus defined as a system of regulations and enzyme kinetics, comprising (1) either of the two motifs pathway usage ili flux direction and (2) the binding of the thus established flux-signaling metabolites to TF(s).

Kao što je u silikonu cell establishes and uses sensors for several intracellular metabolic fluxes, the overall sensing architecture infers the present carbon sources from a pattern of metabolic fluxes and is as such of a distributed nature. The core of this sensing architecture is formed not by transmembrane sensors but by four flux sensors, which establish flux-signaling metabolites according to the two proposed general motifs. These flux sensors use intracellular metabolic flux as a means to correlate the presence of extracellular carbon sources with the levels of intracellular metabolites. The recognition of glucose through the PTS transmembrane complex is embedded as one flux sensor in this distributed sensing architecture the other three flux sensors function without the help of transmembrane complexes.

The u silikonu cell achieves the coupling between recognition and adjustment through its TFs, whose activities respond to the available carbon sources and at the same time regulate the expression of target genes. This combined recognition and adjustment, centered on the four TFs, closes four global feedback loops that overarch the metabolic and genetic layers as illustrated in Figure 6. The adaptation of the u silikonu cell arises from the global feedback loop-embedded, flux sensor-adjusted transcriptional regulation of the four TFs, with each TF performing one part of the overall adaptation. This adaptation incorporates both the influence of the metabolic on the genetic layer, achieved through TF–metabolite interactions, and of the genetic on the metabolic layer, achieved through the impact of adjusted enzyme levels on metabolic fluxes.

The existence of the global feedback architectures challenges the conventional view that top-level regulatory proteins recognize environmental conditions and adjust downstream metabolic operation. It suggests that the capability for closed-loop self-regulation can emerge within metabolism itself and therefore, metabolic operation may adapt itself autonomously (not requiring upstream sensing and regulation) to changing carbon sources.

To conclude, the presented differential equation model of E coli's central metabolism offers a consistent explanation of how a multitude of known molecular interactions fit into a coherent systems picture the interactions work together like gear wheels that mesh with one another to adapt central metabolism between growth on the glycolytic substrate glucose and the gluconeogenic substrate acetate. The deduced general functional principles provide the missing link to understand system-level adaptations to carbon sources in molecular-level detail. The proposed principles fall under the umbrella of distributed flux sensing. The flux sensing mechanism entails the binding of TFs to flux-signaling metabolites, which are established through the motifs signaling of pathway usage i signaling of flux direction, and are embedded in global feedback loop architectures. These principles allow an autonomous adaptation of metabolic operation to growth in fluctuating environments.


Fusnote

Electronic supplementary material is available online at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5134778.

Izdaje Kraljevsko društvo pod uvjetima licence Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, koja dopušta neograničenu upotrebu, pod uvjetom da se navedu izvorni autor i izvor.

Reference

Cornish-Bowden A, Cárdenas ML, Division NATOSA

1990 Control of metabolic processes . NATO ASI series Series A, Life sciences . New York, NY : Plenum Press . Crossref, Google Scholar

et al. 2016 Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux . Znanost 354, aaf2786. (doi:10.1126/science.aaf2786) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

et al. 2017 Genome-scale architecture of small molecule regulatory networks and the fundamental trade-off between regulation and enzymatic activity . Izvješća o stanicama 20, 2666-2677. Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 New concepts in feedback regulation of glucose metabolism . Curr. Opin. Syst. Biol. 8, 32-38. (‘Regulatory and metabolic networks’ Special Section: Single cell and noise). Crossref, PubMed, Google Scholar

Tanner LB, Goglia AG, Wei MH, Sehgal T, Parsons LR, Park JO, White E, Toettcher JE, Rabinowitz JD

. 2018 Four key steps control glycolytic flux in mammalian cells . Cell Syst. 7, 49-62. (doi:10.1016/j.cels.2018.06.003) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1968 The energy charge of the adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction with feedback modifiers . Biokemija 7, 4030-4034. (doi:10.1021/bi00851a033) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1969 Limitation of metabolite concentrations and the conservation of solvent capacity in the living cell. U Current topics in cellular regulation (eds BL Horecker, ER Stadtman), vol. 1, pp. 29–43. New York, NY: Academic Press. Google Scholar

Jeske L, Placzek S, Schomburg I, Chang A, Schomburg D

. 2018 BRENDA in 2019: a European ELIXIR core data resource . Nukleinske kiseline Res. 47, D542-D549. (doi:10.1093/nar/gky1048) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1991 Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli . J. Mol. Biol. 222, 599-620. (doi:10.1016/0022-2836(91)90499-V) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zhou HX, Rivas GN, Minton AP

. 2008 Macromolecular crowding and confinement: biochemical, biophysical, and potential physiological consequences . Annu. vlč. Biophys. 37, 375-397. (doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125817) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Parry BR, Surovtsev IV, Cabeen MT, O’Hern CS, Dufresne ER, Jacobs-Wagner C

. 2014 The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity . stanica 156, 183-94. (doi:10.1016/j.cell.2013.11.028) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1995 The control of flux . Biochem. Soc. Trans. 23, 341-366. (doi:10.1042/bst0230341) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kreuzer-Martin HW, Lott MJ, Ehleringer JR, Hegg EL

. 2006 Metabolic processes account for the majority of the intracellular water in log-phase Escherichia coli cells as revealed by hydrogen isotopes . Biokemija 45, 13622-30. (doi:10.1021/bi0609164) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Systems biology: an introduction to metabolic control analysis . Seattle, WA : Ambrosius Publishing . Google Scholar

Hofmeyr J-HS, Cornish-Bowden A

. 2000 Regulating the cellular economy of supply and demand . FEBS Lett. 476, 47-51. (doi:10.1016/S0014-5793(00)01668-9) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1994 Economics and thermodynamics , 1st edn. Amsterdam, The Netherlands : Springer . Crossref, Google Scholar

et al. 2008 Lehninger principles of biochemistry , 5th edn. New York, NY : W.H. Freeman . Google Scholar

. 1973 Regulation in metabolism . London, UK : John Wiley & Sons . Google Scholar

. 2003 Information theory explanation of the fluctuation theorem, maximum entropy production and self-organized criticality in non-equilibrium stationary states . J. Phys. a-Math. Gen. 36, 631-641. (doi:10.1088/0305-4470/36/3/303) Crossref, Google Scholar

Presse S, Ghosh K, Lee J, Dill KA

. 2013 Principles of maximum entropy and maximum caliber in statistical physics . Rev. Mod. Phys. 85, 1115-1141. (doi:10.1103/RevModPhys.85.1115) Crossref, ISI, Google Scholar

Cannon WR, Zucker JD, Baxter DJ, Kumar N, Baker SE, Hurley JM, Dunlap JC

. 2018 Prediction of metabolite concentrations, rate constants and post-translational regulation using maximum entropy-based simulations with application to central metabolism of Neurospora crassa . Processes 6, 63. (doi:10.3390/pr6060063) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1910 The mechanics of irreversible phenomenon . C. R. Hebdomadaires Des Seances De L Acad. Des Sci. 151, 1052-1055. Google Scholar

. 1983 The development of transition-state theory . J. Phys. Chem. 87, 2657-2664. (doi:10.1021/j100238a002) Crossref, ISI, Google Scholar

Bennett BD, Kimball EH, Gao M, Osterhout R, Van Dien SJ, Rabinowitz JD

. 2009 Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli . Nat. Chem. Biol. 5, 593-9. (doi:10.1038/nchembio.186) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Park JO, Rubin SA, Xu YF, Amador-Noguez D, Fan J, Shlomi T, Rabinowitz JD

. 2016 Metabolite concentrations, fluxes and free energies imply efficient enzyme usage . Nat. Chem. Biol. 12, 482-9. (doi:10.1038/nchembio.2077) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1957 A Markovian decision process . J. Math. Meh. 6, 679-684. (doi:10.1512/iumj.1957.6.56038) Google Scholar

. 1998 Reinforcement learning: an introduction . Cambridge, MA : MIT Press . Google Scholar

. 1989 Learning from delayed rewards. PhD thesis. Sveučilište u Cambridgeu. Cambridge, UK. Google Scholar

. 1988 Learning to predict by the methods of temporal differences . Mach. Naučiti. 3, 9-44. (doi:10.1007/BF00115009) Crossref, Google Scholar

. 1996 Generalization in reinforcement learning: successful examples using sparse coarse coding. U Advances in neural information processing systems (eds DS Touretzky, MC Mozer, ME Hasselmo), vol. 8, pp. 1038–1044. Cambridge, MA: MIT Press. Google Scholar

. 1994 On-line Q-learning using connectionist systems, sv. 37. University of Cambridge, Department of Engineering Cambridge, UK. See http://mi.eng.cam.ac.uk/reports/svr-ftp/auto-pdf/rummery_tr166.pdf. Google Scholar

. 1992 Q-learning . Mach. Naučiti. 8, 279-292. (doi:10.1007/BF00992698) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2016 Nonequilibrium thermodynamic formalism of nonlinear chemical reaction systems with Waage–Guldberg's law of mass action . Chem. Phys. 472, 241-248. (doi:10.1016/j.chemphys.2016.03.026) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2010 Physical origins of entropy production, free energy dissipation, and their mathematical representations . Phys. Rev. E 81, 051133. (doi:10.1103/PhysRevE.81.051133) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2014 Simulating metabolism with statistical thermodynamics . PLOS JEDAN 9, e103582. (doi:10.1371/journal.pone.0103582) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1998 Solvation, reorganization energy, and biological catalysis . J. Biol. Chem. 273, 26 257-26 260. (doi:10.1074/jbc.273.41.26257) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1967 The labeling of pentose phosphate from glucose- 14 C and estimation of the rates of transaldolase, transketolase, the contribution of the pentose cycle, and ribose phosphate synthesis . Biokemija 6, 2227-2247. (doi:10.1021/bi00859a046) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

et al. 2018 Circadian proteomic analysis uncovers mechanisms of post-transcriptional regulation in metabolic pathways . Stanični sustavi 7, 613-626. (doi:10.1016/j.cels.2018.10.014) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Heimlicher MB, Bächler M, Liu M, Ibeneche-Nnewihe C, Florin EL, Hoenger A, Brunner D

. 2019 Reversible solidification of fission yeast cytoplasm after prolonged nutrient starvation . J. Cell Sci. 132, jcs231688. (doi:10.1242/jcs.231688) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Saha A, Connelly S, Jiang J, Zhuang S, Amador DT, Phan T, Pilz RB, Boss GR

. 2014 Akt phosphorylation and regulation of transketolase is a nodal point for amino acid control of purine synthesis . Mol. stanica 55, 264-76. (doi:10.1016/j.molcel.2014.05.028) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2008 Allosteric regulatory enzymes . Berlin, Germany : Springer Science & Business Media . Crossref, Google Scholar

. 1977 Cellular energy metabolism and its regulation . New York, NY: Academic Press. Google Scholar

Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM

. 2005 Lehninger principles of biochemistry , 4th edn. New York, NY : W.H. Freeman . Google Scholar

Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Stryer L

. 2007 Biokemija , 5th edn. New York, NY : W.H. Freeman . Google Scholar

Oakhill JS, Steel R, Chen ZP, Scott JW, Ling N, Tam S, Kemp BE

. 2011 AMPK is a direct adenylate charge-regulated protein kinase . Znanost 332, 1433-1435. (doi:10.1126/science.1200094) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chapman AG, Fall L, Atkinson DE

. 1971 Adenylate energy charge in Escherichia coli during growth and starvation . J. Bacteriol. 108, 1072-1086. (doi:10.1128/JB.108.3.1072-1086.1971) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1974 The survival of Peptococcus prevotii in relation to the adenylate energy charge . Mikrobiologija 80, 291-299. (doi:10.1099/00221287-80-1-291) ISI, Google Scholar

Aithal HN, Walsh-Reitz MM, Toback FG

. 1985 Regulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase by a cytosolic protein . Am. J. Physiol. 249, C111-C116. (doi:10.1152/ajpcell.1985.249.1.C111) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1967 Kinetic studies on the reaction catalyzed by phosphoglycerate kinase. II. The kinetic relationships between 3-phosphoglycerate, MgATP 2− activating metal ion . Biochim. Biophys. Acta 132, 33-40. (doi:10.1016/0005-2744(67)90189-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1974 The control of pyruvate kinases of Escherichia coli. I. Physicochemical and regulatory properties of the enzyme activated by fructose 1,6-diphosphate . J. Biol. Chem. 249, 265-274. PubMed, ISI, Google Scholar

Waygood EB, Rayman MK, Sanwal BD

. 1975 The control of pyruvate kinases of Escherichia coli. II. Effectors and regulatory properties of the enzyme activated by ribose 5-phosphate . Limenka. J. Biochem. 53, 444-54. (doi:10.1139/o75-061) Crossref, PubMed, Google Scholar

Waygood EB, Mort JS, Sanwal BD

. 1976 The control of pyruvate kinase of Escherichia coli. Binding of substrate and allosteric effectors to the enzyme activated by fructose 1,6-bisphosphate . Biokemija 15, 277-82. (doi:10.1021/bi00647a006) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2003 Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity by reversible phosphorylation . Biochem. Soc. Trans. 31, 1143-1151. (doi:10.1042/bst0311143) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

et al. 2014 Regulation of G6PD acetylation by SIRT2 and KAT9 modulates NADPH homeostasis and cell survival during oxidative stress . EMBO J. 33, 1304-1320. (doi:10.1002/embj.201387224) PubMed, ISI, Google Scholar

. 1999 Structure, function and regulation of pyruvate carboxylase . Biochem. J. 340 (Pt 1), 1-16. (doi:10.1042/bj3400001) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Regulation of glycolytic enzyme phosphoglycerate mutase-1 by Sirt1 protein-mediated deacetylation . J. Biol. Chem. 287, 3850-3858. (doi:10.1074/jbc.M111.317404) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 Environmental statistics and optimal regulation . PLoS računala. Biol. 10, e1003826. (doi:10.1371/journal.pcbi.1003826) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1922 Contribution to the energetics of evolution . Proc. Natl akad. Sci. SAD 8, 147-151. (doi:10.1073/pnas.8.6.147) Crossref, PubMed, Google Scholar

Niebel B, Leupold S, Heinemann M

. 2019 An upper limit on Gibbs energy dissipation governs cellular metabolism . Nat. Metab. 1, 125-132. (doi:10.1038/s42255-018-0006-7) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 1944 A method for the solution of certain non-linear problems in least squares . Quart. Prim. matematika. 2, 164-168. (doi:10.1090/qam/10666) Crossref, Google Scholar

. 1963 An algorithm for least-squares estimation of nonlinear parameters . J. Soc. Ind. Appl. matematika. 11, 431-441. (doi:10.1137/0111030) Crossref, ISI, Google Scholar

. 1985 Metabolic control and its analysis. additional relationships between elasticities and control coefficients . Eur. J. Biochem. 148, 555-561. (doi:10.1111/j.1432-1033.1985.tb08876.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

Sauro HM, Small JR, Fell DA

. 1987 Metabolic control and its analysis. Extensions to the theory and matrix method . Eur. J. Biochem. 165, 215-221. (doi:10.1111/j.1432-1033.1987.tb11214.x) Crossref, PubMed, Google Scholar

2008 Chemical biophysics: quantitative analysis of cellular systems . Cambridge texts in biomedical engineering . Cambridge, UK : Cambridge University Press . Crossref, Google Scholar

. 1955 Time’s speed regulator: the optimum efficiency for maximum power output in physical and biological systems . Am. Sci. 43, 331-343. ISI, Google Scholar

Paszke A, Gross S, Chintala S, Chanan G, Yang E, DeVito Z, Lin Z, Desmaison A, Antiga L, Lerer A

. 2017 Automatic differentiation in PyTorch . U 31st Conf. on Neural Information Processing Systems (NIPS 2017), Long Beach, CA, 9 December . See https://openreview.net/forum?id=BJJsrmfCZ. Google Scholar

Flamholz A, Noor E, Bar-Even A, Milo R

. 2012 eQuilibrator—the biochemical thermodynamics calculator . Nukleinske kiseline Res. 40, D770-D775. (doi:10.1093/nar/gkr874) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Goldberg RN, Tewari YB, Bhat TN

. 2004 Thermodynamics of enzyme-catalyzed reactions—a database for quantitative biochemistry . Bioinformatika 20, 2874-5877. (doi:10.1093/bioinformatics/bth314) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Noor E, Haraldsdottir HS, Milo R, Fleming RM

. 2013 Consistent estimation of gibbs energy using component contributions . PLoS računala. Biol. 9, e1003098. (doi:10.1371/journal.pcbi.1003098) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Jinich A, Rappoport D, Dunn I, Sanchez-Lengeling B, Olivares-Amaya R, Noor E, Even AB, Aspuru-Guzik A

. 2014 Quantum chemical approach to estimating the thermodynamics of metabolic reactions . Sci. Rep. 4, 7022. (doi:10.1038/srep07022) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar


Rasprava

Estimation of enzyme reaction rates

As shown in Table 1, the accuracy of the estimations of the enzyme reaction rates was confirmed by the reproduced metabolite concentrations, except for PGP in E coli. Since the concentration of PGP was very low (average concentration, 3.60 × 10 -3 mM), even a slight error in the enzyme reaction rate had a large influence. In fact, the average errors between the true enzyme reaction rate time series and the estimated enzyme reaction rate time series for both GAPDH (PGP-producing enzyme) and PGK (PGP-consuming enzyme) in E coli were adequately small, 2.44% and 1.46%, respectively. In the process for distinguishing dynamic/static enzymes, the average of the squared errors of all metabolite concentrations is used to calculate the fitness function (Eq. (5)) thus, an error in only one metabolite concentration has a limited effect. Actually, the results of distinguishing dynamic/static enzymes without the PGP time series (data not shown) were entirely the same as those shown in Table 2. However, if many metabolites with low concentrations are included in the modelled metabolic system, the processes for distinguishing dynamic/static enzymes may cause an erroneous conclusion to be drawn. This is a limitation of the current procedure. In comparison with the results for E coli, errors for all metabolites for S. cerevisiae were adequately small, because the dynamics of the metabolic system in S. cerevisiae is relatively slow compared with the sampling frequency.

Another difficulty in applying the proposed method is that we assume that the concentrations of all metabolites are measurable. It is expected that high-throughput measurement techniques for detecting a huge number of metabolites, such as capillary electrophoresis combined with mass spectrometry (CE-MS) [17–19], can be used for such comprehensive measurements. The 1-s sampling interval employed in this study is feasible, because some rapid-sampling instruments capable of drawing multiple samples within 1 s from a bioreactor have already been developed [26–28].

Distinction of dynamic and static enzymes

After a process for distinguishing dynamic/static enzymes is completed, the MRE in the corresponding hybrid model can be estimated using the linear relationship between the MRE in the process for distinguishing dynamic/static enzymes and the MRE in the hybrid model (Figure 3). This information helps to build a hybrid model that has the desired accuracy.

The staircase pattern of the relationships between the error and static enzyme ratio with decreasing w, observed in Figure 4, was probably caused by a property of metabolic systems. In a testing system, the number of enzymes that can potentially be allocated to the static module may be restricted. Ako w is greatly changed, the few potentially static enzymes would eventually start to be converted to static enzymes.

Weighting coefficient in the fitness function

The weighting coefficient in the fitness function (Eq. (5)) is a tuning parameter. Since a suitable value for the weighting coefficient (w) is not given apriorno, we need to consider how to define the value.

As shown in Figure 4, with a w of 1.000, about half of the enzymes were discriminated to the static module. Thus, a large amount of experimental work can be saved because no kinetic information is required by the static module. The MRE at w = 1.000 was 15.2% for the E coli hybrid model and 18.6% for the S. cerevisiae hybrid model (Figure 4). These errors are acceptable considering the accuracy of the experimentally measured metabolite concentrations. Tako, w = 1.000 may simply be chosen at the initial trial stage of model construction. When a more precise model is required, a smaller w can be used. Čak i ako w is set to between 0.025 and 0.100, the proportion of static enzymes remains at about 30% for both the metabolic systems tested. Our recommendation for w for general modelling is 0.050. At around this w value, the sensitivity of the error to a change of w is low thus, strict specification of w nije potrebno. Moreover, even if the actual error in the constructed hybrid model becomes considerably higher than the expected value as in the case of S. cerevisiae na w = 0.250 the actual error remains low.

Noise in metabolome data

As shown in Table 2, almost the same results in distinguishing dynamic/static enzymes were obtained between the procedures using noise-free data and those using noise-added data. This result could be predicted because most metabolite time series were successfully reproduced from the noisy data by the smoothing treatment, as shown in Figure S3. This result indicates that the proposed method for distinguishing dynamic/static enzymes can be applied to noisy measurements if a suitable noise reduction method is employed. To remove noise and obtain the slopes of metabolite concentration time series, a smoothing technique based on an artificial neural network, proposed by Voit et al. [29–31], is efficient. Many other noise cancellation techniques have been proposed for biochemical time series data [32–35]. For example, Rizzi et al. [36] obtained time-course functions of metabolites from noisy metabolite concentration measurements and used those functions to tune the parameters in their dynamic model.

Toward construction of accurate hybrid models

In the HDS method, accurate kinetics should be known not only for system boundary enzymes but also for all enzymes assigned to the dynamic modules. For this reason, high-throughput techniques for determining accurate and detailed enzyme kinetics are needed for the efficient development of models of metabolic systems. A promising power-law approach, generalized mass action (GMA) [37, 38], may be used to solve this problem. This method has a large representational space that enables enzyme kinetics to be sufficiently expressed in spite of its simple fixed form. Although modelling that uses this kind of power-law approach from time series data is often difficult owing to their nonlinear properties, Polisetty et al. [39] have proposed a method employing branch-and-bound principles to find optimized parameters in GMA models. Using this method, the global optimal parameter set can be efficiently searched.


Gledaj video: ELISA for E. coli O157 H7 Part 3 (Svibanj 2022).