Informacija

Toplotni šok naspram elektroporacije

Toplotni šok naspram elektroporacije



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Transformirao sam E. coli toplinskim šokom kako bih ubacio oligonukleotide (oko 50 nt); međutim, niti jedan moj eksperiment do sada nije dao pozitivne rezultate. Počinjem dovoditi u pitanje učinkovitost kemijske transformacije, posebno za kratke fragmente DNK. Postoji li tako značajna razlika između kemijske i elektro transformacije?

UREDI: Provjeravam proširenje CRISPR niza, tako da moji oligos imaju duljinu i strukturu protospacera. Koristim BL21(DE3) stanice koje imaju IPTG-inducibilni T7 koji prvo transformiram s Cas1-Cas2 plazmidom. Zatim induciram stanice da eksprimiraju te proteine, učinim ih kompetentnima i transformiram zatim još jednom, ali s oligos i eGFP plazmidom (za neku vrstu selekcije). Kako bih provjerio ima li pozitivnih rezultata, pojačavam spoj lider-ponavljanje CRISPR niza i uspoređujem njegovu duljinu (putem elektroforeze) s uobičajenim nizom koji nema integrande.


Kako otkriti potencijalno pozitivnu transfekciju? Kratki fragmenti mogu imati ispravne terijske strukture zbog kojih se mogu ponašati drugačije nego što biste očekivali. Također, nekružna DNK i RNA ciljaju se mnogo brže radi razgradnje u većini stanica ako nedostaju signali desne glave ili repa.

Na vaše pitanje: pulsna elektroporacija s dobro pripremljenim bakterijama (stanje, pufer,...) obično je 5-100 x učinkovitija od kemijski kompetentnih bakterija.


Razrijediti reakciju ligacije za elektroporaciju - (18. lipnja 2008.)

Toliko puta radim elektroporaciju za BL21 E.coli direktnom ligacijom od 1ul, ali u elektroporatoru uvijek dolazi flash pa je li važno razrijediti reakciju ligacije i koji je najbolji način da je razrijedite.

Da, razrijedite ga s ddH20 10 puta, a upotrijebite 1ul.

Elektroporacija je vrlo učinkovita metoda (u odnosu na toplinski šok), tako da uporaba razrijeđene reakcije ligacije neće biti problem. Zapravo, prema mom iskustvu, to povećava učinkovitost.

Da, razrijedite ga s ddH20 10 puta, a upotrijebite 1ul.

Elektroporacija je vrlo učinkovita metoda (u odnosu na toplinski šok), tako da uporaba razrijeđene reakcije ligacije neće biti problem. Zapravo, prema mom iskustvu, to povećava učinkovitost.

hvala ti na ideji danas sam napravio transformaciju s razrijeđenom smjesom i bez bljeskanja i sutra ću provjeriti br. kolonije hvala ti

Da, razrijedite ga s ddH20 10 puta, a upotrijebite 1ul.

Elektroporacija je vrlo učinkovita metoda (u odnosu na toplinski šok), tako da uporaba razrijeđene reakcije ligacije neće biti problem. Zapravo, prema mom iskustvu, to povećava učinkovitost.

hvala ti na ideji danas sam napravio transformaciju s razrijeđenom smjesom i bez bljeskanja i sutra ću provjeriti br. kolonije hvala ti

daer brojač ćelija
nisam sretan jer čak ni u kontrolnoj ploči nema kolonije što mogu učiniti

Prijedlog. Plutajte mali milipore filter papir na dd-vodi u petrijevoj zdjelici..i jednostavno stavite 5-10 uL svoje smjese za ligiranje na njih oko sat vremena. Nakon toga pomiješajte ligaciju pomoću pipete. i krenuti u transformaciju. Princip kao što ste do sada već pogodili je "mikro" dijaliza za odslađivanje..nadajmo se da djeluje. javi mi se..

1. Postoji nekoliko drugih stvari koje mogu krenuti po zlu, stoga morate riješiti i druge aspekte. Počevši od bakterijskog soja, medija, antibiotika, elektroporatora, kiveta, vremena inkubacije itd. Kako već radite elektroporaciju kontrolnog plazmida, možda ćete biti u redu bez rješavanja problema s dijelom kloniranja (ligacija itd.), ali provjerite pokrivaju li kontrole koje radite svaku eventualnost.

Vrlo je loša ideja pokušati transformirati BL21 sojeve izravno s proizvodom za ligiranje. Uštedjet ćete vrijeme i tugu tako što ćete se prvo transformirati u DH5a, DH10B ili neki drugi soj za kloniranje, napraviti miniprep i transformirati BL21 s plazmidnom DNK. BL21 ima vrlo slabu učinkovitost transformacije.


Biološki učinci električnog udara i toplinske denaturacije i oksidacije molekula, membrana i staničnih funkcija

Poznato je da izravno izlaganje stanica u suspenziji intenzivnim električnim impulsima uzrokuje oštećenja staničnih membrana i supramolekularne organizacije stanica, te denaturaciju makromolekula, slično kao ozljede i suze koje se mogu vidjeti kod pacijenata s električnim traumama. Stoga je sustav korišten kao laboratorijski model za istraživanje biokemijske osnove električnih ozljeda. Intenzivan električni impuls može proizvesti dva glavna učinka na stanice - jedan uzrokovan poljem ili električnim potencijalom, a drugi strujom ili električnom energijom. Transmembranski potencijal izazvan poljem može izazvati elektrokonformacijske promjene ionskih kanala i ionskih pumpi i, kada potencijal premašuje dielektričnu čvrstoću stanične membrane (približno 500 mV za širinu impulsa od nekoliko ms), elektrokonformacijska oštećenja i elektroporacije membranskih proteina i lipidnih dvoslojeva. Ti događaji dovode do prolaska električne struje kroz stanice koje su porirane membranom i do zagrijavanja staničnih membrana i citoplazmatskog sadržaja. Naknadna denaturacija staničnih membrana i citoplazmatskih makromolekula dovodi do mnogih složenih biokemijskih reakcija, uključujući oksidaciju proteina i lipida. Kombinirani učinci mogu osakatiti stanice koje se ne mogu popraviti. Ova komunikacija će se usredotočiti na toplinske učinke električnog udara. Nakon kratkog pregleda trenutnog stanja znanja o toplinskoj denaturaciji topivih enzima i mišićnih proteina, ovaj će rad opisati eksperimente s termičkom denaturacijom staničnih komponenti i funkcija, kao što su nukleosomi, te lanac prijenosa elektrona i ATP sintetski enzimi. unutarnje membrane mitohondrija. Podaci će pokazati da se peroksidacija lipida i naknadni gubitak sposobnosti stanica za prenošenje energije mogu pojaviti čak i pri umjerenim temperaturama između 40 i 45 stupnjeva C. Međutim, peroksidacija lipida može se spriječiti redukcijskim reagensima kao što su merkaptoetanol, ditiotreitol, i askorbinska kiselina. Reaktivacija denaturiranih staničnih proteina i funkcija također može biti moguća i raspravlja se o strategiji za to.


Transformacija plazmidne DNA u E. coli metodom toplinskog šoka

Transformacija plazmidne DNA u E. coli metodom toplinskog šoka osnovna je tehnika molekularne biologije. Sastoji se od umetanja stranog plazmida ili produkta ligacije u bakterije. Ovaj video protokol opisuje tradicionalnu metodu transformacije korištenjem komercijalno dostupnih kemijski kompetentnih bakterija Genlantis. Nakon kratke inkubacije u ledu, smjesa kemijski kompetentnih bakterija i DNK se stavlja na 42 stupnja C na 45 sekundi (toplotni šok), a zatim se vraća u led. Doda se SOC medij i transformirane stanice se inkubiraju na 37 stupnjeva C tijekom 30 minuta uz miješanje. Kako bi se osigurala izolacija kolonija bez obzira na učinkovitost transformacije, dvije količine transformiranih bakterija se stavljaju na pločice. Ovaj tradicionalni protokol može se uspješno koristiti za transformaciju većine komercijalno dostupnih kompetentnih bakterija. Turboćelije iz Genlantisa također se mogu koristiti u novom 3-minutnom protokolu transformacije, opisanom u priručniku s uputama.


Transformacija plazmidne DNA u E. coli metodom toplinskog šoka

Transformacija plazmidne DNA u E. coli metodom toplinskog šoka osnovna je tehnika molekularne biologije. Sastoji se od umetanja stranog plazmida ili produkta ligacije u bakterije. Ovaj video protokol opisuje tradicionalnu metodu transformacije korištenjem komercijalno dostupnih kemijski kompetentnih bakterija Genlantis. Nakon kratke inkubacije u ledu, smjesa kemijski kompetentnih bakterija i DNK se stavlja na 42ଌ na 45 sekundi (toplotni šok), a zatim se vraća u led. Doda se SOC medij i transformirane stanice se inkubiraju na 37°C 30 minuta uz miješanje. Kako bi se osigurala izolacija kolonija bez obzira na učinkovitost transformacije, dvije količine transformiranih bakterija se stavljaju na pločice. Ovaj tradicionalni protokol može se uspješno koristiti za transformaciju većine komercijalno dostupnih kompetentnih bakterija. Turboćelije iz Genlantisa također se mogu koristiti u novom 3-minutnom protokolu transformacije, opisanom u priručniku s uputama.


Metode prijenosa gena: 6 metoda

Ovaj članak baca svjetlo na šest metoda prijenosa gena. Šest metoda su: (1) Transformacija (2) konjugacija (3) Elektroporacija (4) Prijenos gena posredovan liposomima (5) transdukcija i (6) Izravan prijenos DNK.

Metoda # 1. Transformacija:

Transformacija je metoda uvođenja strane DNK u bakterijske stanice (npr. E.coli). E.coli preuzima plazmidnu DNA u ledeno hladnom CaCl2 (0-5°C), te naknadni toplinski šok (37-45°C oko 90 sekundi). Ovom tehnikom, učestalost transformacije, koja se odnosi na dio stanične populacije koji se može prenijeti, je razumno dobra, npr. otprilike jedna stanica za 1000 (10 -3 ) stanica.

Učinkovitost transformacije:

Odnosi se na broj transformanata po mikrogramu dodane DNK. Za E.coli, transformaciju pomoću plazmida, učinkovitost transformacije je oko 10 7 do 10 8 stanica po mikrogramu intaktne plazmidne DNA. Bakterijske stanice koje mogu preuzeti DNK smatraju se kompetentnima. Sposobnost se može poboljšati promjenom uvjeta rasta.

Mehanizam procesa transformacije nije u potpunosti shvaćen. Vjeruje se da je CaCI2 utječe na staničnu stijenku, lomi se na lokaliziranim područjima, a također je odgovoran za vezanje DNA na staničnu površinu. Kratki toplinski šok (tj. nagli porast temperature s 5°C na 40°C) potiče unos DNK. Općenito, DNK velike veličine manje su učinkovite u transformaciji.

Druge kemijske metode za transformaciju:

Kalcijev fosfat (umjesto CaCI2) je poželjan za prijenos DNA u kultivirane stanice. Ponekad kalcijev fosfat može uzrokovati talog i toksičnost za stanice. Neki radnici koriste dietil amino etil dekstran (DEAE -dekstran) za prijenos DNK.

Metoda br. 2. Konjugacija:

Konjugacija je prirodni proces mikrobne rekombinacije. Tijekom konjugacije, dvije žive bakterije (donor i primatelj) se spajaju, spajaju citoplazmatskim mostovima i prenose jednolančanu DNK (od donora do primatelja). Unutar stanice primatelja, nova DNK se može integrirati s kromosomom (prilično rijetko) ili može ostati slobodna (kao što je slučaj s plazmidima).

Konjugacija se može dogoditi među stanicama iz različitih rodova bakterija (npr. Salmonella i Shigella stanice). To je u suprotnosti s transformacijom koja se odvija među stanicama bakterijskog roda. Tako je konjugacijom moguć prijenos gena iz dvije različite i nepovezane bakterije.

Prirodni fenomen konjugacije se iskorištava za prijenos gena. To se postiže prijenosom DNA s umetnutim plazmidom iz jedne stanice u drugu. Općenito, plazmidima nedostaju konjugativne funkcije i stoga kao takvi nisu sposobni prenijeti DNA na stanice primatelja. Međutim, neki plazmidi s konjugativnim svojstvima mogu se pripremiti i koristiti.

Metoda br. 3. Elektroporacija:

Elektroporacija se temelji na principu da visokonaponski električni impulsi mogu potaknuti stanične plazma membrane na spajanje. Dakle, elektroporacija je tehnika koja uključuje permeabilizaciju membrane posredovanu električnim poljem. Električni udari također mogu potaknuti stanični unos egzogene DNK (za koju se vjeruje da je to preko pora formiranih električnim impulsima) iz suspenzijske otopine.

Elektroporacija je jednostavna i brza tehnika za unošenje gena u stanice različitih organizama (mikroorganizama, biljaka i životinja).

Osnovna tehnika elektroporacije za prijenos gena u stanice sisavaca prikazana je na slici 6.11. Stanice se stave u otopinu koja sadrži DNK i podvrgne se električnim udarima kako bi se izazvale rupe u membranama. Strani fragmenti DNA ulaze kroz rupe u citoplazmu, a zatim u jezgru.

Elektroporacija je učinkovit način transformacije stanica E.coli koje sadrže plazmide s umetnutim DNA duljim od 100 kb. Učinkovitost transformacije je oko 10 9 transformanata po mikrogramu DNA za male plazmide (oko 3 kb) i oko 10 6 za velike plazmide (oko 130 kb).

Metoda br. 4. Prijenos gena posredovan liposomima:

Liposomi su kružne molekule lipida, koje imaju vodenu unutrašnjost koja može nositi nukleinske kiseline. Razvijeno je nekoliko tehnika za kapsuliranje DNK u liposome. Prijenos gena posredovan liposomima, nazvan lipofekcija, prikazan je na slici 6.12.

Prilikom obrade fragmenta DNA liposomima, dijelovi DNK se inkapsuliraju unutar liposoma. Ti se liposomi mogu prianjati na stanične membrane i spajati se s njima kako bi prenijeli fragmente DNA. Tako DNK ulazi u stanicu, a zatim u jezgru. Pozitivno nabijeni liposomi vrlo učinkovito kompleksiraju s DNK, vežu se na stanice i brzo prenose DNK.

Lipofekcija je vrlo učinkovita tehnika i koristi se za prijenos gena u bakterijske, životinjske i biljne stanice. T

Metoda br. 5. Transdukcija:

Ponekad se strana DNK može upakirati u životinjske viruse. Ovi virusi mogu prirodno inficirati stanice i uvesti DNK u stanice domaćina. Prijenos DNK ovim pristupom naziva se transdukcija.

Metoda br. 6. Izravan prijenos DNK:

Moguće je izravno prenijeti DNK u staničnu jezgru. Mikroinjekcija i bombardiranje česticama su dvije tehnike koje se obično koriste u tu svrhu.

Prijenos DNK mikroinjekcijama općenito se koristi za kultivirane stanice. Ova tehnika je također korisna za uvođenje DNK u velike stanice kao što su oociti, jajašca i stanice ranih embrija. Pojam transfekcija se koristi za prijenos DNK u eukariotske stanice, na različite fizičke ili kemijske načine.


Toplotni šok protiv elektroporacije - Biologija

Zatražili ste strojni prijevod odabranog sadržaja iz naših baza podataka. Ova je funkcionalnost dostupna isključivo radi vaše udobnosti i ni na koji način nije namijenjena zamijeniti ljudski prijevod. Ni BioOne ni vlasnici i izdavači sadržaja ne daju, i izričito se odriču, bilo kakve izričite ili implicirane izjave ili jamstva bilo koje vrste, uključujući, bez ograničenja, izjave i jamstva u pogledu funkcionalnosti značajke prijevoda ili točnosti ili potpunosti prijevode.

Prijevodi se ne zadržavaju u našem sustavu. Vaše korištenje ove značajke i prijevoda podliježe svim ograničenjima korištenja sadržanim u Uvjetima korištenja web stranice BioOne.

ELEKTROPORACIJA EMBRIOGENIH PROTOPLASTA SLATKE NARANČE (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) I REGENERACIJA TRANSFORMOVANIH BILJAKA

RANDALL P. NIEDZ, 1,2 W. L. McKENDREE, 1 R. G. SHATTERS Jr. 1

1 Služba za poljoprivredna istraživanja, US Horticultural Research Laboratory, 2001 South Rock Road, Ft. Pierce, FL 34945-3030
2 Autor kome treba uputiti korespondenciju: [email protected]

Uključuje PDF i HTML, kada su dostupni

Ovaj članak je dostupan samo za pretplatnika.
Nije dostupan za pojedinačnu prodaju.

Uvjeti elektroporacije optimizirani su za transfekciju protoplasta izoliranih iz embriogene stanične linije slatke naranče [Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Hamlin]. Jačina električnog polja (375–450 V cm −1), koncentracija vektorske DNK (100 μg ml −1), koncentracija DNA nosača (100 μg ml −1), pufer za elektroporaciju (pH 8) i toplinski šok protoplasta prije elektroporacije (5 min na 45°C) su optimizirani. Korišten je plazmidni vektor pBI221 koji sadrži kodirajuću sekvencu β-glukuronidaze (GUS) pod kontrolom promotora CaMV 35S, a aktivnost GUS-a izmjerena je 24 h nakon elektroporacije. Sve varijable značajno su utjecale na učinkovitost transfekcije i kada su optimalni uvjeti za svaku kombinirani, aktivnost GUS-a bila je 7714 pmol 4-metilumbeliferona (MU) mg -1 (protein) min -1 . Protoplasti su zatim elektroporirani u prisutnosti ekspresijskih vektora zelenog fluorescentnog proteina (GFP) pARS101 ili pARS108. Odabrani su zeleni fluorescentni embriji, biljke su regenerirane, a integracija transgena je potvrđena Southern blot analizom. Oba plazmida su konstruirana korištenjem EGFP, GFP varijante 35 puta svjetlije od wtGFP, s jednim, crvenim pomaknutim ekscitacijskim vrhom i optimiziranom za korištenje kodona kod ljudi. pARS101 je konstruiran stavljanjem EGFP pod kontrolu 35S-35S promotora koji sadrži 33 bp neprevedene vodeće sekvence iz virusa mozaika lucerne. pARS108 je konstruiran slično osim što su dodane sekvence za transport i zadržavanje EGFP-a u lumenu endoplazmatskog retikuluma.

RANDALL P. NIEDZ , WL McKENDREE i RG SHATTERS Jr. "ELEKTROPORACIJA EMBRIOGENIH PROTOPLASTA SLATE NARANČE (CITRUS SINENSIS (L.) OSBECK) I REGENERACIJA TRANSFORMOVANIH BILJAKA - (Razvoj TRANSFORMIRANI BILJAKA - Plan 6 in Vitro), Plan 6 in Vitro 586-594, (1. studenog 2003.). https://doi.org/10.1079/IVP2003463

Primljeno: 4. veljače 2003. Prihvaćeno: 1. svibnja 2003. Objavljeno: 1. studenog 2003.

Ovaj članak je dostupan samo za pretplatnika.
Nije dostupan za pojedinačnu prodaju.


Esej: Tehnike prijenosa gena – za i protiv

Prijenos gena je tehnika za stabilno i učinkovito uvođenje funkcionalnih gena (koji su obično klonirani) u ciljne stanice. Genetski prijenos je mehanizam kojim se DNK prenosi s donora na primatelja. Nakon što je donor DNK unutar primatelja, može doći do križanja. Rezultat je rekombinantna stanica koja ima genom koji se razlikuje od donora ili primatelja. Događaj rekombinacije mora se dogoditi nakon prijenosa kako bi promjena u genomu bila nasljedna (prenesena na sljedeću generaciju). Geni su nacrti neophodni za stvaranje svih proteina u našim tijelima koji na kraju obavljaju sve biološke funkcije. Stoga, kada se gen učinkovito uvede u ciljnu stanicu domaćina, proizvodi se protein koji je kodiran tim genom.
Tehnologije prijenosa gena u početku su se razvile kao istraživački alat za proučavanje ekspresije gena i njegove funkcije. Za prijenos gena koristi se niz tehnika i prirodnih procesa.
Dostupne su tehnike za uvođenje DNA u mnoge različite tipove stanica u kulturi, bilo za proučavanje funkcije i regulacije gena ili za proizvodnju velikih količina rekombinantnog proteina.
Stanične kulture su stoga korištene u komercijalnim razmjerima za sintezu proizvoda kao što su antitijela, hormoni, faktori rasta, citokini i virusni proteini omotača za imunizaciju. Najvažnija primjena ove tehnologije je in vivo genska terapija, tj. uvođenje DNA u stanice živih životinja u svrhu liječenja bolesti. Izvanredan potencijal promijenjene molekule DNK je stvaranje novih oblika života koji su bolje prihvaćeni za preživljavanje. Promjena baznog slijeda DNA dovodi do promjene u proteinu koji uzrokuje bolest, što se može ispraviti manipulacijom gena. Velik naglasak dat je manipulaciji genima kod kardiovaskularnih bolesti, Parkinsonove bolesti, lizosomskih poremećaja, očne genske terapije i osteoartritisa.
Pregled strategija prijenosa gena:
Prijenos gena može se u osnovi postići na tri puta. Najjednostavniji je izravan prijenos DNK, fizičko unošenje strane DNK izravno u stanicu. Na primjer, u kultiviranim stanicama to se može učiniti mikroinjekcijama, dok se za stanice in vivo izravni prijenos često postiže bombardiranjem sitnim metalnim česticama obloženim DNK. Drugi put se naziva transfekcija, a on obuhvaća niz tehnika, neke kemijske i neke fizičke, koje se mogu koristiti za uvjeravanje stanica da preuzmu DNK iz svoje okoline. Treći je pakiranje DNK unutar
životinjski virus, budući da su virusi razvili mehanizme za prirodnu infekciju stanica i uvođenje vlastite nukleinske kiseline. Prijenos strane DNK u stanicu ovim putem naziva se transdukcija.
Izbor metoda prijenosa DNA ovisi o ciljnim stanicama u kojima će se transformacija provesti. Također ovisi o ciljevima manipulacije genima. Transfekcija može biti stabilna ili prolazna. Iako je izbor metode prijenosa DNA vrlo važan, drugi važni koraci su odabir gena, izolacija gena, priprema rekombinantne DNA i selekcija transformiranih stanica. Jednako je važna i regeneracija organizma s novim karakteristikama. Isporuka gena in vitro može se obaviti tretiranjem stanica virusima kao što su retrovirus ili adenovirus, kalcijevim fosfatom, liposomima, bombardiranjem česticama, injekcijom gole DNK tankom iglom, elektroporacijom ili bilo kojom kombinacijom ovih metoda. Ovo su moćni alati za istraživanje i moguća primjena u genskoj terapiji.
ČIMBENICI KOJE JE KOJI SE RAZMATRATI PRI ODBORU METODA ISPORUKE GENA
Napredak novih tehnologija učinio je isporuku gena učinkovitijom, ali i zbunjujućom s obzirom na ogroman niz reagensa i metoda koji su sada dostupni. Određivanje najboljeg pristupa isporuke gena za bilo koji određeni eksperiment zahtijeva pažljivo razmatranje niza različitih čimbenika kako je navedeno u nastavku.
1. Stanični kontekst ili okruženje – Kontekst ili okruženje stanica (tj. in vivo naspram in
vitro vs. ex vivo) na koje će nukleinske kiseline biti isporučene prvi je čimbenik koji treba uzeti u obzir kada
odlučivanje o metodi prijenosa gena. Prepreke i izazovi koje predstavlja dostava u
vitro stanične kulture su vrlo različite od onih koje postavljaju in vivo ili ex vivo stanice, i zahtijevaju
različite alate i tehnike za njihovo prevladavanje. Na primjer, ciljanje nukleinskih kiselina na
određene stanice dok izbjegavanje drugih stanica obično je glavna briga za prijenos gena in vivo
primjene, ponekad je zabrinutost za ex vivo aplikacije, ali obično nije briga za in vitro
aplikacije.
Još jedno važno pitanje koje se mora riješiti pri planiranju in vivo (ali ne in vitro) gena
studije isporuke je imunogenost sustava prijenosa gena. Ovo je osobito važno kada se razmatra korištenje određenih virusnih vektora o kojima se prethodno govorilo, a koji mogu biti visoko imunogeni. Također je povezano s imunogenošću pitanje opće sigurnosti, kako za eksperimentatora tako i za subjekta bilo koje studije koja koristi transfekciju. Gotovo uvijek, uporaba virusnih vektora zahtijeva vrlo opsežne sigurnosne mjere nego korištenje metoda sintetske transfekcije.
2. Tip stanice ili tkiva – Podrijetlo stanica ili tkiva u koje će biti nukleinske kiseline
prijenos je obično drugi parametar koji se uzima u obzir pri odabiru isporuke gena
metoda. Iz niza različitih razloga, teškoća isporuke stanične nukleinske kiseline varira
od tipa ćelije do tipa ćelije. Zbog toga je uvijek važno pregledati literaturu
utvrditi je li tip stanice od interesa prethodno korišten za eksperimente prijenosa gena,
koje su točne metode korištene i koja je učinkovitost isporuke postignuta, tj. što
postotak stanica koje su stvarno transficirane ili transducirane, svakom metodom.
Određene vrste stanica često se opisuju kao ‘notorno teške za transfekciju’.
To uključuje primarne stanične kulture mnogih varijanti. Uspješan prijenos gena u takve stanice
obično zahtijeva dosta istraživanja prije odabira bilo koje metode isporuke gena.
3. Učinkovitost isporuke – Za većinu primjena, transfekcija ili transdukcija onoliko stanica koliko
moguće je poželjno, osobito kada je potrebno otkriti prisutnost rijetkog transgena
proizvodi. Stoga je važno odrediti razinu učinkovitosti isporuke potrebnu za danu
primjena prije odluke o određenoj metodi prijenosa gena. U većini slučajeva se utvrdi da
virusni vektori pružaju najveću učinkovitost isporuke. Za neke uobičajeno korištene i lako transficirane stanične linije, kationski lipidi gotovo se podudaraju s virusnim vektorima u njihovoj učinkovitosti prijenosa gena, dok pružaju sigurnije i mnogo brže postupke.
4. Stabilna naspram prolazne isporuke gena – Postupci prijenosa gena često su kategorizirani
time da li dostavljeni gen ostaje odvojen od kromosoma stanice domaćina ili je integriran u kromosom stanice domaćina. U prvom slučaju, poznatom kao prolazna isporuka gena, ekspresija transgena obično nestaje nakon određenog vremenskog razdoblja – obično unutar
nekoliko dana – jer je ekspresijski vektor ili degradiran ili izbačen iz stanice domaćina.
U drugom slučaju, poznatom kao stabilna isporuka gena, ekspresija prenesenog gena je
produženo ili stabilno, jer je vektor integriran u kromosom stanice domaćina. Očito,
različite primjene zahtijevaju različita vremenska razdoblja ekspresije transgena. Dakle, oprezan
usporedba između različitih metodologija isporuke gena omogućit će prikladan izbor za
generiranje željenog prolaznog ili stabilnog izraza.
U slučaju virusnih vektora, utvrđivanje je li određeni virus prikladan za stabilan ili prolazan
transdukcija je jednostavno stvar učenja općih karakteristika vektora. U slučaju
kemijskog ili fizikalnog/mehaničkog prijenosa gena, određujući je li određena metoda
pogodno za prolaznu u odnosu na stabilnu isporuku može biti jednostavno kao čitanje prodajne literature iz
proizvođača ili provjera primarne istraživačke literature.
5. Vrsta isporučene molekule – Još jedan čimbenik koji treba uzeti u obzir pri odabiru isporuke gena
metoda je vrsta nukleinske kiseline ili druge molekule koja se transficira ili transducira. Za
na primjer, reagens koji učinkovito isporučuje plazmide možda neće učinkovito dostaviti DNA
oligonukleotidi. Često je najlakše jednostavno pregledati literaturu kako biste saznali koje su metode uspješno korištene i kontaktirati druge istraživače koji imaju iskustva s isporukom molekule od interesa.
6. Citotoksičnost – Još jedan problem koji se često pojavljuje pri odabiru između različitih gena
metode isporuke je citotoksičnost različitih metoda i reagensa. Neke metode, npr
kao što su elektroporacija i gensko oružje, mogu biti izuzetno oštri za stanice i često rezultirati smrću
većine stanica. Također, DEAE-dekstran može biti prilično oštar prema nekim tipovima stanica, posebno
kada se kao dio postupka koristi korak DMSO ili glicerol šok. U nekim aplikacijama,
kao što je kada je potreban mali broj transfektanata od neposlušnog tipa stanica, to je
nije problem. Međutim, u većini primjena visok je postotak stanične smrti jednostavno
neprihvatljivo. Mnoštvo dostupnih kationskih lipida i polimernih reagensa varira
stupnjevi toksičnosti s različitim tipovima stanica, a njihove koncentracije tijekom transfekcije mogu biti
optimiziran prema potrebi kako bi se smanjila smrt stanica.
7. Suspenzija naspram adherentnih stanica – Najčešće transficirane stanice rastu – i
transficirano – dok je pričvršćeno na neku vrstu potpore, bez obzira je li ta potpora tkivo iz
koje su izvedene, neka inertna membrana ili skela, ili površina kulture tkiva
tanjur. Manje su uobičajene stanice koje rastu dok su suspendirane u mediju, poput onih dobivenih iz
krvi i drugih tjelesnih tekućina. Stanice suspenzije općenito je teže transfektirati
stoga će se možda biti potrebno osloniti na oštrije metode isporuke gena, kao npr
elektroporacije, genskih topova, mikroinjekcija ili virusnih vektora za prihvatljive razine transfekcije.
Također, neki kationski lipidi mogu učinkovito transficirati stanice suspenzije, i treba ih isprobati kada
moguće zbog svoje jednostavnosti i isplativosti.
8. Stručnost – Stupanj težine u izvođenju različitih tehnika transfekcije može
značajno variraju, pa je stoga stručnost i iskustvo istraživača obično jedan
važan čimbenik koji treba uzeti u obzir. Na primjer, metode kao što su mikroinjekcija i metode virusne transfekcije su uvijek složenije od kationskih lipida i polimernih reagensa. Također, od kemijskih metoda, koprecipitacija kalcijevog fosfata može biti prilično nezgodna zbog svoje osjetljivosti na male promjene u eksperimentalnim uvjetima.
9. Vrijeme – Drugi važan čimbenik koji treba uzeti u obzir je vrijeme potrebno za isporuku gena. Virusni
metode, iako su vrlo učinkovite, mogu oduzeti dosta vremena, obično od dva tjedna do jednog mjeseca da se dovrše. Nasuprot tome, kemijske i fizikalne/mehaničke metode obično se mogu dovršiti unutar nekoliko dana, ali često daju nižu učinkovitost transfekcije. Stoga, nije neuobičajeno da se prednosti bržih rezultata i manje rada moraju odvagati s prednostima veće učinkovitosti.
10 Trošak – Konačno, cijena može biti glavni čimbenik pri odlučivanju o najboljoj isporuci gena
metoda za određenu primjenu. Najskuplje metode su obično
fizikalne/mehaničke metode, kao što su elektroporacija i gensko oružje, zbog specijaliziranih
opremu koja im je potrebna. Dostava virusnih gena je možda druga najskuplja metoda, budući da zahtijeva vektorske reagense, puno vremena i rada za dovršenje dugotrajnih postupaka pripreme vektora, kao i pravilno odlaganje virusnog otpadnog materijala.
Treće najskuplje metode isporuke gena koriste polimere i kationske lipide, koji ne zahtijevaju nikakvu specijaliziranu opremu ili dugotrajne korake pripreme virusnog vektora. Takvi reagensi obično koštaju stotine dolara, ovisno o broju transfekcija koje treba izvršiti. Konačno, najjeftinije metode koriste kalcijev fosfat, koji je jeftin i bogat mineral, i golu DNK, koja očito ne zahtijeva troškove reagensa za transfekciju, ali može biti vrlo neučinkovita.
TEHNIKE PRIJENOSA GENA
TRANSFORMACIJA
Transformacija je prirodni proces prijenosa gena koji uključuje apsorpciju genetskog materijala od strane stanice kroz staničnu membranu uzrokujući fuziju strane DNK s nativnom DNA što rezultira genetskom ekspresijom primljene DNK. Transformacija uključuje preuzimanje “gole” DNA (DNA koja nije ugrađena u strukture kao što su kromosomi) od strane kompetentnih bakterijskih stanica. Stanice su kompetentne (sposobne preuzeti DNK) samo u određenoj fazi svog životnog ciklusa, očito prije završetka sinteze stanične stijenke.
Transformacija je obično prirodna metoda prijenosa gena, ali kao rezultat tehnološkog napretka nastala je umjetna ili inducirana transformacija. Dakle, postoje dvije vrste koje se nazivaju prirodna transformacija i umjetna ili inducirana transformacija. U prirodnoj transformaciji strana DNK se veže za DNA receptor stanice domaćina i uz pomoć proteinske DNA translokaze ulazi u stanicu domaćina. Prisutnost nukleaza ograničava ulazak dviju lanaca DNK, uništava jedan lanac dopuštajući samo jednom lancu da uđe u stanicu domaćina. Svaka DNK koja nije integrirana u kromosom bit će degradirana. Ova jednolančana DNK uspješno se miješa s genetskim materijalom domaćina.
Umjetna ili inducirana metoda transformacije radi se u laboratorijskim uvjetima, što je ili kemijski posredovan prijenos gena ili elektroporacija. Genetski inženjeri mogu inducirati sposobnost stavljanjem stanica u određene otopine, koje obično sadrže kalcijeve soli. Na ulaznom mjestu, endonukleaze sijeku DNK na fragmente od 7.000-10.000 nukleotida, a dvolančana DNA se odvaja u jednostruke niti. Jednolančana DNK može se rekombinirati s kromosomom domaćina jednom unutar stanice. Ova rekombinacija zamjenjuje gen u domaćinu s varijantom – iako homolognim – genom.
Nedostaci:
DNK iz blisko srodnog roda može se steći, ali se DNK općenito ne izmjenjuje između udaljenih mikroba.
Ne mogu sve bakterije postati kompetentne.
KONJUGACIJA
Konjugacija je način prijenosa gena kod mnogih vrsta bakterija. Kontakt od stanice do stanice putem specijaliziranog dodatka, poznatog kao F-pilus (ili sex pilus), omogućuje prijenos kopije F-plazmida (plazmida plodnosti) u stanicu koja ne sadrži plazmid. U rijetkim slučajevima F-plazmid se može integrirati u kromosom svog bakterijskog domaćina, stvarajući ono što je poznato kao Hfr (visoka frekvencija rekombinacije) stanica. Takva stanica također može usmjeravati sintezu spolnog pilusa. Kako se kromosom Hfr stanice replicira, on može početi prelaziti preko pilusa tako da se plazmid i kromosomska DNA prenose u stanicu primatelja. Takva se DNK može rekombinirati s onom svog novog domaćina, uvodeći nove varijante gena. Plazmidi koji kodiraju gene za faktore virulencije i otpornost na antibiotike prenose se kroz populacije bakterija i između više vrsta bakterija konjugacijom.
U laboratoriju, konjugacija se može koristiti za prijenos poremećenih gena na samotransmisivi plazmid, za razvoj mutiranog soja. Gen od interesa iz soja E. coli primatelja klonira se u samoprenosivi vektor i održava u soju donora za genetsku manipulaciju. Izbrisani genski konstrukt se zatim konjugacijom prenosi iz soja donora natrag u soj primatelja.
TRANSDUCTION
Transduction is another method for transferring genes from one bacterium to another the transfer is mediated by bacteriophages. A bacteriophage infection starts when the virus injects its DNA into a bacterial cell. The bacteriophage DNA may then direct the synthesis of new viral components assembled in the bacterium. Bacteriophage DNA is replicated and then packaged within the phage particles. Early in the infective cycle the phage encodes an enzyme that degrades the DNA of the host cell. Some of these fragments of bacterial DNA are packaged within the bacteriophage particles, taking the place of phage DNA. As the number of phages increases it breaks open (lyse) the cell. When released from the infected cell, a phage that contains bacterial genes can continue to infect a new bacterial cell, transferring the bacterial genes.
Sometimes genes transferred in this manner become integrated into the genome of their new bacterial host by homologous recombination. Such transduced bacteria are not lysed because they do not contain adequate phage DNA for viral synthesis and these phages can enter an alternate life cycle called lysogeny. In this cycle, all the virus’s DNA becomes integrated into the genome of the host bacterium. The integrated phage, called a prophage, can confer new properties to the bacterium.
Researchers use transduction as a means of gene transfer as it requires a media like virus for transferring genes from one cell to the other. Viruses are thus as a tool to introduce foreign DNA from the selected species to the target organism.
There are two types of transduction called as generalized transduction in which any of the bacterial gene is transferred via the bacteriophage to the other bacteria and specialized transduction involves transfer of limited or selected set of genes.
Viral vectors for gene transfer:
The use of viruses as vectors for transduction, i.e. the introduction of genes into animal cells by exploiting the natural ability of the virus particle, within which the transgene is packaged, to adsorb to the surface of the cell and gain entry is being employed . Due to the efficiency with which viruses can deliver their nucleic acid into cells and the high levels of replication
and gene expression it is possible to achieve, viruses have been used as vectors not only for gene expression in cultured cells but also for gene transfer to living animals. Four classes of viral vector have been developed for use in human gene therapy and have reached phase 1 clinical trials. These are the retrovirus, adenovirus, herpesvirus and adenoassociated virus (AAV) vectors . Before introducing the individual vector systems,we discuss some general properties of viral transduction vectors. Transgenes may be incorporated into
viral vectors either by addition to the whole genome or by replacing one or more viral genes. This is generally achieved either by ligation (many viruses have been modified to incorporate unique restriction sites) or homologous recombination.
For many applications, it is favourable to use vectors from which all viral coding sequences have been deleted.These amplicons (also described as ‘gutless vectors’) contain just the cis-acting elements required for packaging and genome replication. The advantage of such vectors is their high capacity for foreign DNA and the fact that, since no viral gene products are made, the vector has no intrinsic cytotoxic effects. The choice of vector depends on the particular properties of the virus and the intended host, whether transient or stable expression is required and how much DNA needs to be packaged. For example, icosahedral viruses such as adenoviruses and retroviruses package their genomes into preformed capsids, whose volume defines the maximum amount of foreign DNA that can be accommodated. Conversely, rod-shaped viruses such as the baculoviruses form the capsid around the genome, so there are no such size constraints. There is no ideal virus for gene transfer ‘ each has its own advantages and disadvantages. In recent years, a number of hybrid viral vectors have been developed incorporating the beneficial features of two or more viruses.
prednosti:
1) viral vectors that especially efficient at transducing the intended cell type but not other cell types.
2) retroviruses are particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
Limitations:
1) cannot deliver genes to terminally differentiated cells
2) viral vectors may be highly immunogenic
TRANSFECTION BY CHEMICAL METHODS
One of the methods of gene transfer where the genetic material is deliberately introduced into the animal cell in view of studying various functions of proteins and the gene is transfection. This mode of gene transfer involves creation of pores on the cell membrane enabling the cell to receive the foreign genetic material. When transformation is carried out in eukaryotic cells it is termed as transfection.
1) Calcium phosphate mediated DNA transfer
The process involves a mixture of isolated DNA (10-100ug) with solution of
calcium chloride and potassium phosphate. . When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface .Cells are then incubated with precipitated DNA either in solution or in tissue culture dish. A fraction of cells will take up the calcium phosphate DNA precipitate by a process not entirely understood but thought to be endocytosis.
Transfection efficiencies using calcium phosphate can be quite low, in the range of 1-2 % . Može
be increased if very high purity DNA is used and the precipitate allowed to form slowly.
Ograničenja
1. Frequency is very low.
2. Integrated genes undergo substantial modification.
3. Many cells do not like having the solid precipitate adhering to them
and the surface of their culture vessel.
4. Integration with host cell chromosome is random.
5, Due to above limitations transfection applied to somatic gene therapy
je ograničen.
Prijave:
This technique is used for introducing DNA into mammalian cells. This process has been a preferred method of identifying many oncogenes.
2)DNA transfer by DAE-Dextran method:
DNA can be transferred with the help of DAE Dextran also. DAE-Dextran may be used in the
transfection medium in which DNA is present. This is a polycationic, high molecular weight substance and is convenient for transient assays. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis.
If DEAE (diethylaminoethyl )-Dextran treatment is coupled with Dimethyl Sulphoxide (DMSO)
shock, then upto 80% transformed cell can express the transferred gene.
prednosti:
The advantage of this method is that, it is cheap, simple and can be used for transient cells
which cannot survive even short exposure of calcium phosphate.
The major advantages of the technique are its relative simplicity and speed, limited expense, and remarkably reproducible interexperimental and intraexperimental transfection efficiency.
Limitations:
Disadvantages include inhibition of cell growth and induction of heterogeneous morphological changes in cells.
Furthermore, the concentration of serum in the culture medium must be transiently reduced during the transfection.
It does not appear to be efficient for the production of stable transfectants.
For cells that grow in suspension, electroporation or lipofection is usually preferred, although DEAE-dextran-mediated transfection can be used.
Transfer of DNA by polycation-DMSO:
As calcium phosphate method of DNA transfer is reproducible and efficient but there is narrow range of optimum conditions. DNA transfer by
Another polycationic chemical,the detergent Polybrene is carried out to increase the adsorption of DNA to the cell surface followed by a brief treatment with 25-30% DMSO to increase membrane permeability and enhance uptake of DNA. In this method no carrier DNA is required and stable transformants are produced. This method works with mouse fibroblast and chick embryo.
LIPOSOME MEDIATED GENE TRANSFER
Liposomes are spheres of lipids which can be used to transport molecules into the cells. These are artificial vesicles that can act as delivery agents for exogenous materials including transgenes. They are considered as spheres of lipid bilayers surrounding the molecule to be transported and promote transport after fusing with the cell membrane.
Liposomes for use as gene transfer vehicles are prepared by adding an appropriate mix of bilayer constituents to an aqueous solution of DNA molecules. In this aqueous environment, phospholipid hydrophilic heads associate with water while hydrophobic tails self-associate to exclude water from within the lipid bilayer. This self-organizing process creates discrete spheres of continuous lipid bilayer membrane enveloping a small quantity of DNA solution. The liposomes are then ready to be added to target cells. Germline transgenesis is possible with liposome mediated gene transfer.Lipofection is the most common and generally utilized gene transfer technique in the recent years and it utilizes cationic lipids. The combined DNA and cationic lipids act instantaneously to form structures called as lipoplexes that are more complex in structure than the simple liposomes. Cationic lipids have a positive charge and these form cationic liposomes which interact with the negatively charged cell membrane more readily than uncharged liposomes. This leads to a fusion between cationic liposome and the cell surface resulting in quick entry by endocytosis and the delivery of the DNA directly across the plasma membrane. Cationic liposomes can be produced from a number of cationic lipids that are commercially available and sold as an in vitro-transfecting agent, termed lipofectin.
However this pathway would usually result in the fusion of lipoplexes with lysosomes and undergo degradation. This problem is overcome by utilizing the neutral helper lipids, which are generally included along with the cationic lipid. This allows entrapped DNA to escape the endosomes, reach the nucleus and get access to the cell’s transcriptional machinery.The endosomal structure is destroyed by increasing the osmotic pressure created by the lipids’ buffering action within the endosomes and by the fusion of the lipid with the endosomal membrane. The ability of a lipid to destroy endosomes is one of the main characteristics of a transfection reagent.
Prednosti
1. Simplicity.
2. Long term stability.
3. Low toxicity.
4. Protection of nucleic acid from degradation.
5. particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
6. cationic lipids effectively transfect suspension cells.
Limitations:
1) Cannot deliver genes to terminally differentiated cells
ELECTROPORATION
A rapid and simple technique for introducing genes into a wide variety of microbial, plant and animal cells, including E. coli, is electroporation. Electroporation uses electrical pulse to produce transient pores in the plasma membrane thereby allowing macromolecules into the cells. These pores are known as electropores which allow the molecules, ions and water to pass from one side of the membrane to another. The electropores reseal spontaneously and the cell can recover. The pores can be recovered only if a suitable electric pulse is applied .The formation of electropores depends upon the cells that are used and the amplitude and duration of the electric pulse that is applied to them. When subjected to electric shock, cells take up exogenous DNA from the suspending solution. Once inside the cell, the DNA is integrated and the foreign gene will express. A proportion of these cells become stably transformed and can be selected if a suitable marker gene is carried on the transforming DNA. The most critical parameters are the intensity and duration of the electric pulse, and these must be determined empirically for different cell types. Electric currents can lead to dramatic heating of the cells that can results in cell death. Heating effects are minimized by using relatively high amplitude, a short duration pulse or by using two very short duration pulses. However, once optimal electroporation parameters have been established, the method is simple to carry out and highly reproducible.
Many different factors affect the efficiency of electroporation, including temperature,
various electric-field parameters (voltage, resistance and capacitance), topological form of the DNA,
and various host-cell factors (genetic background, growth conditions) and post-pulse treatment.
General applications of electroporation.
1. Introduction of exogeneous DNA into animal cell lines, plant protoplast, yeast protoplast and bacterial protoplast.
2. Electroporation can be used to increase efficiency of transformation or transfection of bacterial cells.
3. Wheat, rice, maize, tobacco have been stably transformed with frequency upto 1% by this method.
4. Genes encoding selectable marker may be used to introduce genes using electroporation.
5. To study the transient expression of molecular constructs.
6. Electroporation of early embryo may result in the production of transgenic animals.
7. Hepatocytes, epidermal cells, haematopoietic stem cells, fibroblast, mouse T and B lymphocytes can be transformed by this technique.
8. Naked DNA may be used for gene therapy by applying electroporation device on animal cells.
Advantages of electroporation.
1. Method is fast.
2. Less costly.
3. Applied for a number of cell types.
4. Simultaneously a large number of cell can be treated.
5. High percentage of stable transformants can be produced.
DRAWBACKs
1)Limited effective range of

1 cm between the electrodes.
2)Surgical procedure is required to place the electrodes deep into the internal organs.
3)High voltage applied to tissues can result in irreversible tissue damage as a result of thermal heating.
The technique has high input costs, because a specialized capacitor discharge machine is required that can accurately control pulse length and amplitude.
4) Larger numbers of cells may be required than for other methods because, in many cases, the most efficient electroporation occurs when there is up to 50% cell death.
ULTRASONICATION
Sonication is the act of applying sound energy to agitate particles in a sample. Ultrasonic frequencies (>20 kHz) are usually used, leading to the process also being known as ultrasonication . Sonoporation, or cellular sonication, is the use of these ultrasonic frequencies for modifying the permeability of the cell plasma membrane. This technique is usually used in molecular biology and non-viral gene therapy in order to allow uptake of large molecules such as DNA into the cell, in a cell disruption process called transfection or transformation. Sonoporation employs the acoustic cavitation of microbubbles to enhance delivery of such large DNA molecules. Although the early results could achieve only 10- to 30-fold increases in transfection efficiency in vitro, technical refinements have lead to enhancements of up to several thousand fold in vitro ,sufficient to encourage ultrasonication mediated gene transfer in vivo.
prednosti:
1) It is non-invasive and well tolerated,
2)extraordinary safety record over a wide range of frequency and intensity
3)high levels of public acceptability and understanding.
there are highly sophisticated, flexible, cost-effective and readily available diagnostic and therapeutic systems that can achieve site-specific transfer of ultrasound energy almost anywhere in the body, except perhaps the lung.
4) The bioactivity of this technique is similar to, and in some cases found superior to, electroporation.
5) in vivo is relatively nontoxic.
Limitations:
1)Extended exposure to low-frequency (<MHz) ultrasound has been demonstrated to result in complete cellular death (rupturing) as well as microvascular hemorrhage and disruption of tissue structure, thus cellular viability must also be accounted for when employing this technique.
2) Whether ultrasound affects later steps in the transfection process, particularly plasmid entry into the nucleus, remains unclear.
Prijave:
Sonoporation is under active study for the introduction of foreign genes in tissue culture cells, especially mammalian cells. Sonoporation is also being studied for use in targetedGene therapy in vivo, in a medical treatment scenario whereby a patient is given modified DNA, and an ultrasonic transducer might target this modified DNA into specific regions of the patient’s body.
MICROINJECTION
In microinjection DNA can be introduced into cells or protoplast with the help of very fine needles or
glass micropipettes having the diameter of 0.5 to 10 micrometer. The DNA may be directly delivered into the nucleus or in the cytoplasm. Some of the DNA injected may be taken up by the nucleus. The desired gene in the form of plasmid or alone is injected directly into the plant protoplast.
Injection into the nucleus is more efficient than that into the cytoplasm. Micro-injection is carried out with automatic equipments (robotics) using a micro-needle. Computerized control of holding pipette, needle, microscope stage and video technology has improved the efficiency of this technique.
Advantages of microinjection.
1. Frequency of stable integration of DNA is far better as compare to other methods.
2. Method is effective in transforming primary cells as well as cells in established cultures.
3. The DNA injected in this process is subjected to less extensive modifications.
4. Mere precise integration of recombinant gene in limited copy number can be obtained.
Ograničenja
1. Costly.
2. Skilled personal required.
3.Has not been successful for many plant cells .
4. Embryonic cells preferred for manipulation.
5. Knowledge of mating timing, oocyte recovery is essential.
6. Method is useful for protoplasts and not for the walled cells.
7. Process causes random integration.
8. Rearrangement or deletion of host DNA adjacent to site of integration are common.
9. The technique is laborious, technically difficult, and limited to the number of cells actually injected.
Applications of microinjection.
1. Process is applicable for plant cell as well as animal cell but more common for animal cells.
2. Technique is ideally useful for producing transgenic animal quickly.
3. Procedure is important for gene transfer to embryonic cells.
4. Applied to inject DNA into plant nuclei.
5. Method has been successfully used with cells and protoplast of
tobacco, alfalfa etc.
Fig: microinjection in mouse egg.
BIOLISTICS
(MICROPROJECTILE/GENE GUN)
Biolistics or particle bombardment is a physical method that uses accelerated microprojectiles to
deliver DNA or other molecules into intact tissues and cells. Biolistics transformation is relatively new and novel method amongst the physical methods for artificial transfer of exogenous DNA. The nucleic acid is delivered through membrane penetration at a high velocity, usually connected to microprojectiles like microscopic particles of tungsten or gold coated into cells using an electrostatic pulse, air pressure, or gunpowder percussion. As the particles pass through the cell, the DNA becomes free to integrate into the plant-cell genome.
The gene gun is a device that literally fires DNA into target cells . The DNA to be transformed
into the cells is coated onto microscopic beads made of either gold or tungsten. Beads are carefully
coated with DNA. The coated beads are then attached to the end of the plastic bullet and loaded into
the firing chamber of the gene gun. An explosive force fires the bullet down the barrel of the gun
towards the target cells that lie just beyond the end of the barrel. When the bullet reaches the end of
the barrel it is caught and stopped, but the DNA coated beads continue on toward the target cells.
Some of the beads pass through the cell wall into the cytoplasm of the target cells. Here the bead and
the DNA dissociate and the cells become transformed. Once inside the target cells, the DNA is
solubilised and may be expressed.
Applications
1. Biolistics technique has been used successfully to transform soyabean,
cotton, spruce, sugarcane, papaya, corn, sunflower, rice, maize, wheat,
tobacco etc.
2. Genomes of subcellular organelles have been accessible to genetic
manipulation by biolistic method.
3. Mitochondria of plants and chloroplast of chlamydomonas have been
transformed.
4. Method can be applied to filamentous fungi and yeast (mitochondria).
5. The particle gun has also been used with pollen, early stage
embryoids, meristems somatic embryos, plant cells, root section, seeds and pollen.
6. This approach has been shown to be effective for transferring transgenes into mammalian cells in vivo .
Prednosti
1. Requirement of protoplast can be avoided. Unlike electroporation and microinjection, this technique does not require protoplasts or even single-cell isolations and is applicable to even intact plant tissue
2. Walled intact cells can be penetrated.
3. Manipulation of genome of subcellular organelles can be achieved.
4. This is also a highly mechanized or robotic mediated technique in which the
speed of the micro-projectile particles is controlled by foolproof mechanisms
5) It is also gaining in use as a method for transferring DNA construct into whole animals.
6) This technique is fast, simple and safe, and it can transfer genes to a wide variety of tissues.
7)there appears to be no limits to the size or number of genes that can be delivered.
Ograničenja
1. Integration is random.
2. Requirement of equipments.
3.It can be a challenge to obtain a sufficient number of cells modified by this method to see a biologically significant effect.
MICROLASER
A new technique is presented to incorporate exogeneous gene materials (DNA) into cells with a microbeam irradiation from an uv pulsed laser. A frequency-multiplied Laser, 355 m wavelength, 5 ns pulse duration, punches a self-healing hole of submicrometer aperture in cell membrane under selected irradiation conditions. At the site of the beam impact, due probably to local temperature changes, the cell membrane modifies its permeability. As a consequence of the hit, circular areas, whose radius may be apparently regulated by changing the irradiation time and/or the radiation intensity (energy), appear on the wall, last for a short time and fade spontaneously . It takes a fraction of a second for the aperture to close, long enough to allow the foreign DNA, contained in the medium, to slip into the cell.
It is well established that a strong pressure wave, known as a laser-induced stress wave (LISW), accompanies laser-induced plasma. We have extended their method to deliver macromolecules, such as genes. Plasmid DNA (circular DNA residing in bacterial cytoplasm) is used as a vector of the gene of interest. We inject the plasmid into target tissue, on which a laser target is placed, and subject the target to irradiation with a high-intensity, nanosecond laser pulse to induce plasma and hence an LISW. By placing optically transparent material on the target, the plasma is confined, resulting in an increase in the LISW’s impulse. Interaction of tissue cells with the LISW allows plasmid to enter the cytoplasm
Prednosti
1) it only takes advantage of the presence of phenol-red, a normal cell medium component, with no need of addition of extraneous substances
(2) it is a very mild treatment virtually suitable for any cell type and
(3) it allows transfection of selected cells even in the presence of cells of different type (providing that they are morphologically distinguishable).
4) . it is rapidly replacing virus mediated techniques as they have serious side effects caused by immune response and limited targeting characteristics rendering them inappropriate for clinical application
5) The method offers a clear advantage over existing methods: increases the success rate of DNA transfection as well as the efficiency of cell modification by orders of magnitude.
6) . It enables minimally invasive tissue interaction.
ZAKLJUČAK
Thus there are a number of ways by which the genes can be introduced into the cells. With the advent of molecular tools and technologies it is now comparatively easy to introduce gene into cells without losing its integrity and biological activity. Moreover the recent development in molecular biology has made the transfer of gene with great accuracy to the target cell. The transfer of gene through different gene transfer technologies has cured a number of diseases. Research is on progress to cure those diseases which cannot be cured by using drugs. Moreover the treatment of diseases by gene transfer provides better result for a prolong period of time. It is the need of hour to discover new and cheap method of gene transfer technologies so to make the treatment of the diseases a little easier and affordable. Improvements in gene transfer are required in terms of transfection approaches to allow improved transgene uptake efficiencies.
REFERENCES
1)Society of Applied Sciences.
Gene Transfer Technologies and their Applications: K.H.KHAN
Medical Biotechnology Division, School of Biosciences and Technology,
VIT University, Vellore-632014, Tamil Nadu, India.
2)Principles of gene manipulation: R.W.Old ,S.B. Primrose and R.M.Twymann ‘ sixth edition,chapter 10 and 11.
3) BIOTECHNOLOGY 2020-From the Transparent Cell to
the Custom-Designed Process–Prof. Gerhard Kreysa Dr.-Ing. E.h. Dr.h.c. & Dr. R??diger Marquardt
4) INTRODUCTION TOBIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING
-A.J. NAIR, PH.D.
5)From genes to genomes- concepts and applications of DNA technology–Jeremy W Dale, Malcom von Schantz
6) http://www.nature.com
7)www.learner.org

Essay Sauce is the free student essay website for college and university students. We've got thousands of real essay examples for you to use as inspiration for your own work, all free to access and download.

. (download the rest of the essay above)

About this essay:

If you use part of this page in your own work, you need to provide a citation, as follows:


Heat shock vs electroporation - Biology

Article Summary:

Definicija:-
Elektroporacija je biotehnološki proces kojim se električna struja propušta kroz živu površinu, primjerice, stanice ili molekule. Na taj način na površini žive strukture nastaju pore i kroz nju lako prolazi biološki materijal. Ova metoda se obično koristi za unos virusa ili plazmida u obliku vektora ili plazmida u stanicu kroz pore u staničnoj membrani.

Što je elektroporacija: -
Tehnika elektroporacije najviše se koristi u području molekularne biologije. Kada se ova tehnika primjenjuje na bilo koju stanicu korištenjem električne struje iz vanjskog izvora, stanična membrana postaje propusnija dopuštajući stranim objektima da uđu u nju. Kada znanstvenici moraju umetnuti molekularnu sondu, mali komadić DNK ili bilo koji lijek koji može promijeniti funkciju stanice, koriste ovu tehniku.

Nije lako napraviti pore u staničnoj membrani dok se ne izloži odgovarajućem električnom polju koje može omogućiti plazma membrani da prijeđe svoju dielektričnu čvrstoću. Ako je cijeli eksperiment dobro kontroliran, onda se nakon nekog vremena pore plazma membrane mogu ponovno zatvoriti, ali za to vrijeme molekule ili strani objekti mogu ući u citoplazmu stanice. Štetno je za stanicu ako je duže vrijeme izložena električnoj struji. To rezultira smrću stanice ili apoptozom.

Proces elektroporacije se uglavnom koristi za transformaciju bakterija, biljnih protoplasta i kvasca. Stanična stijenka bakterije sastoji se od peptidoglikana i njegovih derivata. Prirodno ima pore u staničnoj stijenci, tako da kada plazmidi moraju ući u bakterijsku stanicu, mala količina električne struje se koristi u tu svrhu samo kako bi plazmid ušao u bakterijsku stanicu. Cijeli proces treba dobro kontrolirati kako bi se moglo uočiti da se bakterijske stanice mogu podijeliti u nove stanice kćeri koje sadrže plazmide. Ovaj proces je učinkovitiji od kemijske elektroporacije. Ovaj se proces također može koristiti za stanice kulture tkiva da unesu strane gene uglavnom u stanice sisavaca.

Kako funkcionira proces elektroporacije?
Za izvođenje procesa elektroporacije koriste se posebne vrste uređaja koji se nazivaju elektroporatori. Ovaj uređaj prolazi kroz otopinu stanice koja obično sadrži bakterije, ali se u tu svrhu mogu koristiti i druge vrste poziva. Otopina stanica se stavlja u staklenu ili plastičnu kivetu. Staklena ili plastična kiveta je mala kružna cijev koja je posebno dizajnirana za čuvanje uzoraka za spektroskopske eksperimente. Sadrži dvije aluminijske elektrode po jednu sa svake strane. Ako se bakterijska stanica koristi u procesu elektroporacije, tada korištena suspenzija mora biti od 50 mikrolitara. Plazmidi se stavljaju u suspenziju prije početka procesa i cijela suspenzija se ubacuje u staklenu kivetu. Napon se postavlja na 240 volti u elektroporatorima, a kiveta se postavlja unutar elektroporatora. Prije inkubacije u kivetu se ubacuje 1 mililitar tekućeg medija i zatim se započinje inkubacija. Nakon sat vremena inkubacije, cijela otopina se stavi na agarozni gel. Ako je otopina plazmida čista, postoje šanse za dobivanje boljih rezultata eksperimenta, inače bi bakterijske stanice mogle umrijeti zbog prevelike eksplozije i proces bi se mogao ponovno pokrenuti.

Prijave: -
Elektroporacija Proces elektroporacije primjenjiv je u području medicine za liječenje raka i srčanih bolesti umetanjem novih gena u kancerogenu stanicu. Uz pomoć elektroporacije mogu se izliječiti i neke druge bolesti kod kojih je potrebno odstranjivanje tkiva.

About Author / Additional Info:

Important Disclaimer: All articles on this website are for general information only and is not a professional or experts advice. We do not own any responsibility for correctness or authenticity of the information presented in this article, or any loss or injury resulting from it. We do not endorse these articles, we are neither affiliated with the authors of these articles nor responsible for their content. Please see our disclaimer section for complete terms.


Načelo

Transformation process allows a bacterium to take up genes from its surrounding environment that is transformation involves the direct uptakes of fragments of DNA by a recipient cell and the acquisition of new genetic characteristics. There are two major parameters involved in efficiently transforming a bacterial organism. The first is the method used to induce competence for transformation. The second major parameter is the genetic constitution of the host strain of the organism being transformed. Competent cells are capable of uptaking DNA from their environment and expressing DNA as functional proteins. If a bacterium is said to be competent, it has to maintain a physiological state in which it can take up the donor DNA. Calcium chloride treatment is one of the best methods for the preparation of competent cells. Competence results from alterations in the cell wall that makes it permeable to large DNA molecules. This is a naturally occurring process and through this bacteria can transfer advantageous characteristics, such as antibiotic resistance. Bacteria can take DNA from the environment in the form of plasmid. Most of them are double stranded circular DNA molecules and many can exist at very high copy numbers within a single bacterial cell. Many naturally occurring plasmids carry an antibiotic resistant gene referred to as a marker.

In the process of transformation, the competent cells are incubated with DNA in ice. Then it is placed in a water bath at 42ºC and further plunging them in ice. This process will take up the DNA into the bacterial cell. Then it is plated in an agar plate containing appropriate antibiotic. The presence of an antibiotic marker on the plasmid allows for rapid screening of successful transformants. Blue &ndashwhite selection (Alpha complementation) can be used to determine which plasmids carry an inserted fragment of DNA and which do not. These plasmids contain an additional gene (lac Z) that encodes for a portion of the enzyme &beta &ndash galactosidase. When it transformed into an appropriate host, one containing the gene for the remaining portion of &beta &ndashgalactosidase, the intact enzyme can be produced and these bacteria form blue colonies in the presence of X &ndash gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) and a gratuitous inducer called IPTG (Isopropyl &beta-D- Thiogalactopyronoside). These plasmids contains a number of cloning sites within the lac Z gene, and any insertion of foreign DNA into this region results in the loss of the ability to form active &beta &ndashgalactosidase. Therefore colonies that carry the plasmid with the insert, ie, Transformants will remain white and the colonies without the foreign DNA (Non-Transformants) will remain Blue. We can also calculate the efficiency of transformation by using the concentration of DNA and number of transformed colonies.