Informacija

Neutralizirajuća TCA sredstva za pranje

Neutralizirajuća TCA sredstva za pranje


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Trikloroctena kiselina (TCA) se obično koristi za taloženje proteina, ali otpad od pranja treba neutralizirati prije odlaganja. Što je točno potrebno za učinkovitu neutralizaciju TCA otpada? Da dodam samo kaustiku?


Između Brönstedovih kiselina i baza dolazi do reakcije neutralizacije kako bi se dobila sol.

U tom slučaju morate dodati Brönstedovu bazu da neutralizirate kiselinu. Ako je konačni pH važan, trebali biste odrediti točnu količinu baze za dodavanje. U suprotnom, samo upotrijebite lakmus papir da provjerite pH svoje otopine i dodajte bazu dok ne postane neutralna.

UREDI

S obzirom na drugi predloženi odgovor, želim naglasiti sljedeće:

NEMOJTE bacati svoju otopinu u sudoper/kanalizaciju. Ostavite ga u plastičnom spremniku dok ga laboratorijski tehničar ne odnese u peć.

Ako je baza koju koristite natrijev bikarbonat (NaHCO3), doći će do mjehurića uzrokovanog razgradnjom ugljične kiseline (H2CO3) u vodu (H2O) i ugljični dioksid (CO2). Uspješno ste neutralizirali TCA nakon što nema mjehurića nakon dodavanja NaHCO3.

Zaista je najbolje nastaviti polako dok dodajete svoju bazu.


Imao sam sreću pronaći protokol skriven u svojoj laboratorijskoj arhivi.

  • Kiseli otpad može se akumulirati 10 dana prije nego što ga treba neutralizirati. Otpad treba čuvati u spremniku u a dimna napa.
  • 50 mL 50% w/v kaše natrijevog bikarbonata treba dodati po litri otpada TCA. Tijekom neutralizacije stvarat će se dimovi koji mogu uključivati plinovitog klora.
  • Kada pH dosegne 6-8, otpad odložite u kanalizaciju.

Trikloroctena kiselina

Poput DCA, TCA postoji gotovo isključivo u obliku soli pri pH koji se nalazi u vodi za piće.

Toksikokinetika

TCA se lako apsorbira iz gastrointestinalnog trakta u pokusnih životinja i ljudi, a njegovo čišćenje iz krvi je relativno sporo u odnosu na druge HAA. Otprilike polovica primijenjene doze eliminirana je nepromijenjena. Postoje značajne razlike u ovom klirensu kod različitih vrsta. Klirens je mnogo brži kod miševa nego kod štakora, a kod ljudi je vrlo spor. TCA proizvodi iste metabolite kao DCA sa ili bez pretvaranja u DCA.

Toksičnost

Usmeni LD50 TCA (neutraliziran na pH 6-7) je 3,32 g kg -1 u štakora i 4,97 g kg -1 u miševa kada se primjenjuje u vodenoj otopini. Najočitiji ciljni organ za TCA je jetra. Ponovljena primjena TCA u vodi za piće proizvela je samo minimalne dokaze o toksičnosti za jetru. Primjena TCA rezultirala je smanjenjem tjelesne težine, malformacijama mekog tkiva i defektom interventrikularnog septuma. TCA (neutraliziran) inducira tumore jetre u mužjaka i ženki miševa, ali ne i u štakora kada se daje putem vode za piće. Nakon kratkotrajnog izlaganja, TCA inducira bazofilna žarišta jetre kod miševa, slična onima uzrokovanim nekoliko proliferatora peroksisoma.

TCA je jaka kiselina. Općenito je poznato da kontakt TCA s kožom može izazvati kiselinske opekline, a gutanje TCA može oštetiti tkiva gastrointestinalnog trakta ili izazvati sistemsku acidozu, iako se specifične studije ovih učinaka ne pojavljuju u literaturi. TCA se često koristi za kemijski piling od strane liječnika koji se bave dermatološkom kirurgijom. TCA je glavni metabolit često korištenih otapala kao što su TCE i PERC, a profesionalna izloženost tim otapalima bila je prilično visoka u prošlosti, ali malo, ako ih uopće ima, učinaka otapala na ljude pripisano je TCA. Stoga je razumno pretpostaviti da je TCA relativno netoksičan za ljude u okolnostima niske izloženosti poput onih koje se susreću u kloriranoj vodi za piće. Osim toga, način indukcije tumora – peroksisomalna proliferacija – kod životinja nije relevantan za ljude. IARC je klasificirao TCA kao spoj grupe 3 zbog njegove kancerogenosti.

Način djelovanja

TCA uzrokuje karcinogenost uglavnom mehanizmom peroksisomalne proliferacije. Dodatni su predloženi mehanizmi povećana ekspresija onkogena putem hipometilacije DNA i promicanje spontanih tumora jetre.


Koji od ovih pilinga mora biti neutraliziran: glikolni, salicilni, TCA, mliječna kiselina, Jessner?

Hvala na pitanju. Od navedenih pilinga koji se moraju neutralizirati je piling glikolne kiseline, ostali pilingi su samoneutralizirajući. Pilingi se lako nanose, ali mogu uzrokovati mnoge probleme/probleme ako se ne rade ispravno. Preporučila bih vam da pronađete iskusnog dermatologa ili estetskog kirurga koji će vam napraviti piling. - Dr. Dickerson

Odgovor: Ne pokušavajte ovo kod kuće.

Hvala na pitanju. Od navedenih pilinga koji se moraju neutralizirati je piling glikolne kiseline, ostali pilingi su samoneutralizirajući. Pilingi se lako nanose, ali mogu uzrokovati mnoge probleme/probleme ako se ne rade ispravno. Preporučila bih vam da pronađete iskusnog dermatologa ili estetskog kirurga koji će vam napraviti piling. - Dr. Dickerson

Odgovor: Užasna je pogreška raditi ove pilinge na sebi.

Sredstva za piling su dostupna online. To ne znači da ih trebate naručiti i primijeniti na sebe. Za sigurno izvođenje pilinga lica potrebna je velika prosudba. Učinite sebi uslugu i pronađite iskusnog dermatologa ili estetskog kirurga koji će vam napraviti piling.

Odgovor: Užasna je pogreška raditi ove pilinge na sebi.

Sredstva za piling su dostupna online. To ne znači da ih trebate naručiti i primijeniti na sebe. Za sigurno izvođenje pilinga lica potrebna je velika prosudba. Učinite sebi uslugu i pronađite iskusnog dermatologa ili estetskog kirurga koji će vam napraviti piling.


Kako neutralizirati kožu nakon kemijskog pilinga?

Nakon kemijskog pilinga, vaša koža može biti zategnuta, upaljena i osjetljiva, ovisno o jačini kiseline. Svrha a neutralizator je zaustaviti kiselinu i utješiti kožu. Vas svibanj imati čuo da soda bikarbona i voda limenka koristiti umjesto gotovih neutralizator nakon pilinga.

Dodatno, možete li neutralizirati kemijski piling vodom? &ldquoA kemijski piling je kiselina,&rdquo kaže dr. Jhin. &ldquoKiseline imaju vrlo nisku razinu pH, dakle vas želim neutralizirati to čineći ga alkalnim, a ne kiselim. preporučam to oni nanesite ovo na čisto lice, ostavite da djeluje pet minuta, a zatim poprskajte voda do neutralizirati to.

U skladu s tim, koliko je vremena potrebno za oporavak od kemijskog pilinga?

Obrađena područja uzeti otprilike jedan do sedam dana liječiti nakon svjetla kemijski piling.

Isperem li glikolnu kiselinu?

Jedna od glavnih prednosti glikolna kiselina serum je da dok većina proizvoda mora biti isprati, možete nanijeti serum i ostaviti da djeluje. Vaša koža ima koristi tijekom dužeg vremenskog razdoblja od seruma.


Uvod

Brzo međunarodno širenje teškog akutnog respiratornog sindroma coronavirus 2 (SARS-CoV-2), uzročnika COVID-19, povezano je s brojnim mutacijama koje mijenjaju sposobnost virusa. Dokumentirane su mutacije u sva 4 strukturna proteina kodirana virusnim genomom, uključujući glikoprotein male ovojnice (E), membranski glikoprotein (M), nukleokapsid (N) protein i šiljak (S) protein. Najistaknutije su mutacije u proteinu spike, koji posreduje u ulasku virusa u stanice interakcijom s receptorom enzima koji pretvara angiotenzin 2 (ACE2). Prijavljeno je nekoliko struktura varijanti šiljastog proteina SARS-CoV-2 u konformacijama prije i nakon fuzije, uključujući komplekse s ACE2 i raznim protutijelima [1–13]. Mutacije koje se pojavljuju u domeni za vezanje receptora (RBD) proteina šiljaka posebno su zanimljive s obzirom na njihov veliki potencijal za promjenu kinetike i snage interakcije virusa s ciljnim stanicama. Ove mutacije također mogu utjecati na vezanje antitijela sposobnih za vezanje i blokiranje interakcije virusa s ACE2.

U prosincu 2020. nove varijante SARS-CoV-2 koje nose nekoliko mutacija u proteinu šiljaka dokumentirane su u Velikoj Britaniji (SARS-CoV-2 VOC202012/01) i Južnoj Africi (501Y.V2) [14,15]. Rani epidemiološki i klinički nalazi pokazali su da ove varijante pokazuju povećanu prenosivost u populaciji [16]. Unatoč tome što je filogenetski različita, zajednička značajka varijanti u Velikoj Britaniji i Južnoj Africi je mutacija ostatka 501 u RBD od Asn do Tyr (N501Y). Strukturne studije rendgenske kristalografije i krio-elektronske mikroskopije (cryo-EM) identificirale su N501 kao ključni ostatak u proteinu šiljaka na sučelju između RBD i ACE2 koji je uključen u kritične kontakte s nekoliko ACE2 ostataka [5,6,10 ,13]. Studije provedene na modelu miša prije identifikacije nove varijante u Ujedinjenom Kraljevstvu sugerirale su da bi mutacije ostatka 501 mogle biti povezane s povećanim vezanjem receptora i infektivnošću [17,18]. Razumijevanje utjecaja N501Y na neutralizaciju antitijela, vezanje ACE2 i ulazak virusa stoga je od temeljnog interesa u nastojanjima da se spriječi širenje COVID-19.


KOMENTAR

Popratne informacije

Antitijela obavljaju nekoliko ključnih funkcija tijekom virusnih infekcija, uključujući regrutiranje komplementa, opsonizaciju i neutralizaciju. Antitijela specifična za patogene mogu tvoriti imunološke komplekse koji inaktiviraju virus i koji se uklanjaju fagocitnim stanicama (Corti i Lanzavecchia, 2013.). Međutim, ova sposobnost neutralizacije može imati širok raspon učinkovitosti na temelju patogena ili čak pacijenta. Test neutralizacije smanjenja plaka (PRNT) smatra se klasičnom metodom za mjerenje neutralizacije protiv betakorona virusa (Suthar i sur., 2010. Zhu i sur., 2007.). U PRNT, serumi koji sadrže protutijela od interesa serijski se razrjeđuju i inkubiraju s ciljanim virusom kako bi se formirali imunološki kompleksi. Ti se kompleksi zatim preklapaju na monosloj osjetljivih stanica, a difuzija virusa je ograničena preklapanjem agara. Tijekom razdoblja od nekoliko dana, monosloj se ispituje na citopatski učinak, što će rezultirati stvaranjem plaka. Sposobnost neutralizacije antitijela kvantificira se usporedbom broja plakova između stanica tretiranih serumima i netretirane kontrole. Ova metoda je pouzdana i dobro uspostavljena te zahtijeva malo specifičnih reagensa. Međutim, PRNT-ovima je potrebno nekoliko dana da se izvedu i osiguraju odgovarajuću rezoluciju plaka. PRNT se mora izvesti u formatu ploče sa 6 ili 12 jažica, što rezultira potrebom za velikim količinama stanica, ploča i reagensa za analizu velikog broja uzoraka. Stoga, iako su vrlo osjetljivi, PRNT nisu idealni za postavku visoke propusnosti.

Testovi neutralizacije fokusa (FRNT) razvijeni su za nekoliko virusa kao alternativa PRNT (Friedrich & Beasley, 2016. Quicke i sur., 2016. Vaidya i sur., 2010.). Ovaj test koristi sličan princip kao i PRNT, međutim, umjesto vizualizacije rasta virusa s plakovima, virus se otkriva korištenjem antitijela. U FRNT testu, imunološki kompleksi su prekriveni staničnim monoslojem, a difuzija virusa je imobilizirana pomoću metilceluloze. Stanice su fiksirane, a virus-specifična antitijela konjugirana na HRP koriste se za vizualizaciju žarišta inficiranih stanica. Ova metoda pruža nekoliko prednosti u odnosu na tradicionalni PRNT test: (1) FRNT se može izvesti u formatu ploče s 96 jažica, čineći obradu uzorka mnogo bržom i zahtijevajući manje reagensa i stanica (2) FRNT-u je potrebno 3 dana umjesto 5 -6 dana za koje PRNT zahtijeva (3) fiksacija stanica omogućuje veću fleksibilnost u obradi, jer se uzorci mogu pohraniti na 4°C nekoliko dana i vizualizirati u BSL-2 postavci. Glavni nedostatak FRNT testa u usporedbi s PRNT testom je zahtjev za virus specifičnim antitijelom za vizualizaciju žarišta.

U Osnovnom protokolu 2 opisujemo drugu metodu za otkrivanje neutralizacije virusa, nazvanu FRNT-mNG test, koji koristi virus SARS-CoV-2 koji izražava mNeonGreen (Xie i sur., 2020.). Ovdje se antitijela stvaraju u kompleksu sa SARS-CoV-2-mNG i zatim se prekrivaju na monosloj stanica na način sličan FRNT. Inficirana žarišta se izravno vizualiziraju pomoću fluorescentnog ELISPOT čitača. Ova metoda je povoljna za primjene visoke propusnosti, jer smanjuje vrijeme testiranja u usporedbi s FRNT testom izostavljanjem permeabilizacije, primarne i sekundarne inkubacije antitijela i koraka ispiranja. Međutim, nedostatak FRNT-mNG je taj što zahtijeva virus koji eksprimira protein mNeonGreen i metodu za vizualizaciju žarišta, kao što je ELISPOT čitač s sposobnošću fluorescencije.

Kritični parametri i rješavanje problema

I za osnovni i za alternativni protokol primjenjiva su sljedeća razmatranja. Važno je koristiti izolat SARS-CoV-2 provjerenog niza prolazne sekvence, jer prilagodbe stanične kulture mogu utjecati na neutralizacijske titre. Također je bitno posebno koristiti klon E6 Vero za dobivanje snažne infekcije. Mnoštvo infekcije (MOI) možda će biti potrebno pažljivo titrirati za optimalno razlučivanje žarišta. Ako je MOI prenizak, neće biti dovoljno žarišta za točno kvantificiranje aktivnosti neutralizacije ako je MOI previsok, bit će previše žarišta za izbrojavanje. Prilikom optimizacije veličine žarišta, vrijeme inkubacije nakon infekcije najvažniji je čimbenik. SARS-CoV-2 treba najmanje 18 sati da razviju vidljiva žarišta u Vero E6 stanicama. Primijetili smo da dulje vrijeme inkubacije dovodi do žarišta veće veličine, što otežava razlikovanje pojedinačnih žarišta (panel A na slikama 3 i 4). U ovoj metodi je utvrđeno da je optimalno vrijeme inkubacije 24-30 sati nakon infekcije, međutim, dulje ili kraće vrijeme inkubacije može raditi bolje u različitim okruženjima. Za osnovni protokol, kako bi se postiglo dobro bojenje žarišta, važno je ispiranje izvesti točno kako je opisano. Otkrili smo da smanjenje broja ispiranja ili volumena PBS-a po pranju može značajno povećati pozadinski signal. Dodatno, inkubacija preko noći s primarnim protutijelom općenito povećava robusnost bojenja. Za alternativni protokol, ako su stanice fiksirane, važno je fiksirati stanice paraformaldehidom, a ne metodom fiksacije na bazi metanola, koja će ugasiti fluorescenciju GFP-a.

Razumijevanje rezultata

Osnovni i Alternativni protokol opisuju metode za mjerenje sposobnosti neutralizacije SARS-CoV-2-specifičnih antitijela u danom biološkom uzorku. Za ispravno tumačenje rezultata svakog testa, važno je uključiti sljedeće kontrole: (1) neinficirane, neliječene lažne uzorke (2) SARS-CoV-2 zaražene, neliječene kontrole i (3) serum zdravih, SARS-CoV- 2-naivne osobe (slika 2). Reprezentativne slike žarišta za eksperimentalne i kontrolne uzorke za FRNT i FRNT-mNG prikazane su na slikama 3 i 4. Za kvantificiranje neutralizacije antitijela, broj žarišta se broji za svaki uzorak pomoću programa Viridot (Katzelnick et al., 2018.). Za izračunavanje postotka neutralizacije, brojevi žarišta se uspoređuju između netretirane, zaražene kontrole i serumom tretirane, inficirane jažice (slike 3 i 4). Titri neutralizacije izračunati su na sljedeći način: omjer srednjeg broja žarišta u prisutnosti seruma i žarišta pri najvećem razrjeđenju odgovarajućeg uzorka seruma. Svaki uzorak se ispituje u dva nezavisna ispitivanja koja se izvode u različito vrijeme. FRNT50 titar, razrjeđenje pri kojem uzorak seruma ili plazme dosegne 50% sposobnosti neutralizacije, interpolira se korištenjem 4-parametarske nelinearne regresije u GraphPad Prism 8.4.3. FRNT50 pruža kvantitativnu mjeru kapaciteta neutralizacije i može se koristiti za usporedbu učinkovitosti antitijela između skupina ili pacijenata. Općenito, i FRNT i FRNT-mNG testovi pružaju metode za brzo i precizno kvantificiranje neutralizirajućih protutijela u uzorku i usporedbu između skupina.

Vremenska razmatranja

Osnovni i Alternativni protokol zahtijevaju uspostavu kulture Vero E6, što se ne uzima u obzir za vremenska razmatranja. Trebat će nekoliko dana da se zaliha oživi iz tekućeg dušika i postigne konfluencija. I osnovni i alternativni protokol zahtijevaju 3 dana za dovršetak, s jednakim vremenom potrebnim za oba dana 1 i 2. Međutim, trećeg dana, za dovršetak Osnovnog protokola potrebno je oko 6 sati, dok je za Alternativni protokol potrebno samo 1-2 sata od posla.

Priznanja

Hvala Kathy Stephens i Laili Hussaini na njihovoj pomoći u regrutiranju pacijenata. Istraživanje objavljeno u ovoj publikaciji djelomično je podržano nagradom Emory EVPHA Synergy Fund (MSS i JW), fondovima COVID-Catalyst-I 3 iz Centra za zdravstvene znanosti Woodruff (MSS), Centra za dječje infekcije i cjepiva (MSS), Dječja zdravstvena zaštita Atlante (MSS), Woodruff Health Sciences Center 2020 COVID-19 CURE Award (MSS), od strane Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) preko Nacionalnog instituta za alergije i zarazne bolesti pod brojevima nagrada ORIP/OD P51OD011132 (MSS) , 3U19AI057266-17S1 (MSS), HIPC COVID-19 Dodatak U19AI090023 (MSS), R01AI127799 (MSS), R01AI148378 (MSS) i Konzorcij za klinička istraživanja zaraznih bolesti 44, MAG6V810 (R01AI127799 (MSS), R01AI148378 (MSS) i Konzorcij za klinička istraživanja zaraznih bolesti, 44, 2019, 2012, 2012, 2014, 2014, 2014, 2012, 2012, 2012, 2012, 2014, 2014, 2014, 19:00 i Svjetski referentni centar za nove viruse i arboviruse R24AI120942 (VDM). Sadržaj je isključivo odgovornost autora i ne predstavlja nužno službene stavove Nacionalnog instituta za zdravlje.

Izjava o sukobu interesa

Autori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa.

Prilozi autora

Abigail Vanderheiden: Konceptualizacija podataka Kuriranje formalne analize metodologija pisanje-izvorni nacrt pisanje-pregled i uređivanje. Venkata Viswanadh Edara: Konceptualizacija podataka Kuriranje formalne analize metodologija pisanje-izvorni nacrt pisanje-pregled i uređivanje. Katharine Floyd: Metodologija kuriranja podataka konceptualizacije pisanje-pregled i uređivanje. Robert C. Kauffman: Izvori konceptualizacije. Grace Mantus: Resursi za kuriranje podataka o konceptualizaciji. Evan Anderson: Pisanje-pregled i uređivanje resursa za kuriranje podataka o konceptualizaciji. Nadine Rouphael: Izvori konceptualizacije. Sri Edupuganti: Resursi. Pei-Yong Shi: Metodološki resursi. Vineet D. Menachery: Metodološki resursi. Mehul S. Suthar: Konceptualizacija podataka kustos formalna analiza financiranje nabava istraga nadzor vizualizacija pisanje-pregled i uređivanje.


KONZERVANSI | Tradicionalni konzervansi – organske kiseline

Limunska kiselina

Limunska kiselina je jedno od najsvestranijih, najjeftinijih i naširoko korištenih organskih sredstava za kiseljenje, a najčešće se primjenjuje u proizvodnji napitaka s voćnim okusom. Sadrži ga sve voće navedeno u Tablici 1 i predstavlja jedan od dva glavna kisela sastojka sadržana u većini ovih plodova. Osim toga, limunska kiselina se također koristi u džemovima, slasticama, slatkišima, sirevima, sokovima, vinu, konzerviranom povrću i umacima. Zbog svoje raširene upotrebe, limunska kiselina je postala zlatni standard prema kojemu se mjere druga sredstva za zakiseljavanje, uključujući parametre kao što su okus, titrabilna kiselost i zakiseljavanje. Konkretno, limunska kiselina je vrlo omiljena u prehrambenoj industriji zbog njenog laganog voćnog okusa, topljivosti, niske cijene i bogate ponude.


Ovaj rad je podržan od strane Fonda za inicijative i umrežavanje Helmholtzove udruge njemačkih istraživačkih centara (broj potpore SO-96), programa za istraživanje i inovacije Europske unije Horizon 2020 u okviru sporazuma o dodjeli bespovratnih sredstava br. 101003480—CORESMA. Ovaj je rad dodatno financiran od državnog ministarstva Baden-Württemberga za ekonomska pitanja, rad i stambenu izgradnju (FKZ 3-4332.62-NMI/68). Zahvaljujemo Florianu Krammeru na pružanju ekspresijskih konstrukcija za SARS-CoV-2 homotrimerni Spike i RBD. Financiranje otvorenog pristupa omogućeno i organizirano od strane Projekt DEAL.

Dizajn studije: NSM, TRW, MB, UR Nb selekcija i biokemijska karakterizacija: PDK, BT, TRW Imunizacija životinje: HS, SN, AS Multipleksni test vezivanja: JH, DJ, MB HDX-MS eksperimenti: MG, AZ Organizacija i pružanje uzoraka pacijenata: MoS, AN, JSW, KSL Dizajniranje i izvođenje studija kristalizacije: EO, GZ, TS Testovi neutralizacije virusa: NR, MiS Analiza podataka i statistička analiza: TRW, MB, JH, MG, AZ, NR, MiS, UR Izrada rukopisa: TRW, AD, UR Studijski nadzor: NSM, UR Čitanje rukopisa: Svi autori.


2. Materijali i metode

2.1. Virusi i stanice

Svi sojevi virusa SARS-CoV-2 korišteni u ovom radu izolirani su od hospitaliziranih pacijenata, uključujući domaće i strane pacijente s potvrđenim COVID-19 u bolnici za infektivne bolesti Yunnan od siječnja do svibnja 2020. godine. Soj s mutacijom D614G u proteinu S bio je izoliran od pedijatrijskog pacijenta koji se vratio iz SAD-a u svoj rodni grad i identificiran kao zaražen SARS-CoV-2 putem kliničke dijagnoze i q-RT-PCR-a u ožujku 2020. Virus je proliferirao u Vero stanicama (WHO) i je titriran mikrotitracijskim testom. Vero stanice uzgajane su u Dulbecco modificiranom mediju Eagle’ (DMEM Corning, NY, SAD) koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma (FCS HyClone, Logan, SAD).

2.2. Inaktivirano cjepivo

Inaktivirano cjepivo SARS-CoV-2 razvili su Institut za medicinsku biologiju (IMB), Kineska akademija medicinskih znanosti (CAMS) u svom pogonu u skladu sa zahtjevima GMP. Ukratko, soj virusa, nazvan KMS-1 (GenBank No: MT226610.1), inokuliran je u Vero stanice za proizvodnju u okruženju koje zadovoljava BSL zahtjeve. Sakupljeni virusi su inaktivirani formaldehidom (v:v =ਁ:4000) tijekom 48 h kako bi se lizirala virusna membrana, pročišćeni kromatografijom i koncentrirani. Provedena je druga inaktivacija beta-propiolaktonom (v:v =ਁ:2000) kako bi se uništila virusna genomska struktura, nakon čega je slijedilo drugo pročišćavanje i koncentracija korištenjem istog protokola. Zaliha cjepiva procijenjena je korištenjem različitih indeksa kvalitete, uključujući sadržaj antigena, imunogenost, sterilnost i testiranje rezidua. Sadržaj virusnog antigena mjeren je ELISA-om. Cjepivo je sadržavalo 50, 100 ili 150 EU inaktiviranog virusnog antigena adsorbiranog na 0,25 mg Al(OH)3 adjuvansa i suspendiran u 0,5  ml puferirane fiziološke otopine za svaku dozu. Prije nego što je ovo cjepivo pušteno u kliničku studiju od strane CFDA pod brojem 2020L00020, zaštitna učinkovitost cjepiva testirana je u testu izazivanja makaka [11] , [12] i raznim studijama toksičnosti, uključujući test akutne toksičnosti, dugotrajnim -termični test toksičnosti i alergijski test, pokazao je njegovu sigurnost kod neljudskih primata i glodavaca. Placebo je sadržavao samo istu količinu Al(OH)3 u tamponu.

2.3. Dizajn studija i sudionici

Ispitivanje je osmišljeno na temelju principa randomizacije, dvostrukog zasljepljivanja i placebo kontrole. Protokol studije pregledao je i odobrio Etički odbor Druge sveučilišne bolnice West China, Sveučilište Sichuan (broj odobrenja: Y2020008). Osnovan je neovisni odbor za praćenje sigurnosti podataka kako bi nadzirao sigurnosne podatke tijekom studije, točnije tijekom 7  dana nakon svake inokulacije (p.i.). Ispitivanje je provedeno u skladu s načelima Helsinške deklaracije i dobre kliničke prakse u West China Second University Hospital, Sveučilište Sichuan. Zdravi volonteri u dobi od 18�  godina imali su pravo na upis nakon davanja informiranog pristanka. Kriteriji za uključivanje i isključenje navedeni su u dodatnom dodatku. Upisani sudionici su nasumično raspoređeni u omjeru 1:1 kako bi primili dvije inokulacije u intervalu od 14ꃚna ili 28ꃚna, a subjekti u svakom rasporedu bili su raspoređeni u omjeru 1:1:1:1 za primanje jednu od tri doze cjepiva (50 EU, 100 EU i 150 EU) ili placebo. Svi upisani sudionici bili su zamoljeni da bilježe tražene i neželjene nuspojave, ako ih ima, u razdoblju od 28  dana. Osoblje studije posjetilo je sudionike na licu mjesta kako bi pratilo njihovo zdravstveno stanje i utvrdilo je li im potrebna medicinska njega. Uzorci krvi uzeti su od upisanih sudionika dan prije imunizacije (početna vrijednost) i 7., 14. i 28. dan (raspored 0, 14) ili 7. i 28. (plan 0, 28) nakon dopunske imunizacije kako bi se procijenila imunogenost cjepiva. cjepivo u različitim vremenskim točkama, odrediti razinu 48 citokina u serumu i analizirati ekspresiju gena mRNA u mononuklearnim stanicama periferne krvi (PBMC).

2.4. Randomizacija i maskiranje

Broj randomizacije za svaki raspored cijepljenja generiran je SAS softverom (verzija 9.4), a korištena je stratificirana blok randomizacija (veličina bloka 8) po podskupinama, generirana od strane neovisnog statističara. Unutar svakog bloka randomizacije, omjer cjepiva i placeba bio je 3:1. Svakom je sudioniku uzastopno dodijeljen randomizacijski broj, a zatim je sudioniku ubrizgano cjepivo ili placebo s istim brojem. Svi sudionici, istraživači i laboratorijsko osoblje bili su zaslijepljeni za raspodjelu liječenja.

2.5. Završne točke kliničkog ispitivanja

Primarna krajnja točka bila je ukupna stopa nuspojava od 0 do 28  dana nakon imunizacije. Sekundarne krajnje točke bile su serološki dokaz imunogenosti cjepiva.

2.6. Laboratorijsko otkrivanje

2.6.1. Test neutralizirajućih antitijela

Analiza neutralizirajućih antitijela provedena je mikrotitracijom, a neutralizacijski titar u serumu određen je promatranjem CPE. Ukratko, serum inaktiviran toplinom razrijeđen je i inkubiran sa živim virusom (100 lgCCID50/jažinac) 2 h na 37 ଌ nakon čega je slijedilo dodavanje Vero stanica (10 5 /mL), a smjesa je inkubirana na 37 ଌ u 5% CO2 za 7  dana. CPE su promatrani i procijenjeni kako bi se odredio titar neutralizirajućih antitijela u serumu. Izmjereni su geometrijski srednji titri (GMT) neutralizirajućih antitijela. Titri antitijela ≥਄ smatrani su pozitivnim. Serokonverzija je definirana kao seropozitivnost nakon imunizacije u prethodno seronegativnih ispitanika.

2.6.2. ELISA

ELISA je provedena s protutijelima protiv S proteina, N proteina i viriona koje je razvio ovaj institut. S/N protein (Sanyou Biopharmaceuticals Co., Ltd., Shanghai, Kina) i pročišćeni virusni antigen korišteni su za oblaganje ELISA ploča s 96 jažica (Corning, NY, SAD) u koncentraciji od 5 μg/jažici, i ploče su inkubirane na 4 ଌ preko noći. Ploče su zatim blokirane s 5% BSA i inkubirane s uzorcima seruma, a imunološki kompleksi su vizualizirani korištenjem HRP-konjugiranih antitijela (Abcam, MA, USA) i TMB supstrata (Solarbio, Peking, Kina) kao što je opisano u prethodnom izvješću [ 13] . Apsorbancija svake jažice na 450 nm izmjerena je pomoću ELISA čitača ploča (Gene Company, Peking, Kina). Uzorci seruma protutijela koji su dali vrijednosti OD-a najmanje 2,1 puta veće od one negativne kontrole pri razrjeđenju testnog uzorka od 1:400 definirani su kao pozitivni. Titar krajnje točke (ET) definiran je kao najveće razrjeđenje seruma koje je dalo pozitivnu vrijednost OD. GMT je izračunat kao geometrijska sredina ET pozitivnih uzoraka seruma u svakoj skupini. Za neutralizirajuća antitijela, serokonverzija je definirana kao seropozitivnost nakon imunizacije u prethodno seronegativnih ispitanika.

2.6.3. ELISpot test

ELISpot test je izveden s humanim IFN-γ ELISpot kompletom (Mabtech, Cincinnati, OH, SAD) prema protokolu proizvođača. PBMC su izolirani iz krvi dobivene od 50% ispitanika u imunizacijskim i placebo skupinama putem izolacije limfocita (Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare, Piscataway, NJ, SAD) i postavljeni u duple jažice. Pročišćeni virioni, rekombinantni S protein i rekombinantni N protein (Sanyou Biopharmaceuticals Co., Ltd.) dodani su u jažice kako bi se stimulirale stanice. Pozitivna kontrola bio je fitohemaglutinin (PHA), a negativne kontrole uključivale su kontrolu samo za stanice i kontrolu samo za medij. Ploče su inkubirane na 37 ଌ tijekom 24 h, stanice su uklonjene, a mrlje su razvijene. Obojene mrlje su izbrojane pomoću ELISPOT čitača (CTL, Shaker Heights, OH, SAD).

2.6.4. Populacije imunoloških stanica

Izolacija populacija imunoloških stanica provedena je prema standardnom protokolu. PBMC su izolirani putem izolacije limfocita (Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare). PBMC-ovima su dodana anti-CD3, anti-CD20 i anti-CD16 antitijela (BD558639 BD, SAD). Smjese su inkubirane na sobnoj temperaturi (RT) 30  min u mraku. Redom su dodavani reagensi za lizu crvenih krvnih stanica (BD, SAD) i permeabilizaciju membrane (BD, SAD). Nakon dva ispiranja s PBS, stanice su resuspendirane u PBS i podvrgnute protočnoj citometriji (BD, SAD). T stanice (CD3 + anti-humani CD3, BD555332), T pomoćne stanice (CD3 + /CD4 + anti-humani CD4, BD566319) i CD8 (+) T stanice (CD3 + /CD8 + anti-humani CD8, BD555368) bile su procijenjen. T stanice su dalje kategorizirane kao T pomoćne (Th)1 i Th2 stanice korištenjem anti-CD4 (BD550631), anti-IL-4 (BD500824) i anti-IFN-γ (BD506507) antitijela (BD, SAD). Protočnim citometrom (Beckman Coulter Cytoflex BD, SAD) određivan je postotak imunoloških stanica svake vrste. Procijenjene su Th1 stanice (CD4 + /IFN-γ + ) i Th2 stanice (CD4 + /IL-4 + ).

2.6.5. Citokinski test

Razine 48 citokina u serumu ispitanika mjerene su korištenjem Bio-Plex Pro Human Cytokine 48-Plex (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) prema protokolu proizvođača. Ukratko, 4-struka razrjeđenja uzoraka seruma dodana su u epruvete koje sadrže detekcijske kuglice. Zatim su dodana antitijela korištena za detekciju, a smjese su inkubirane na sobnoj temperaturi 0,5 h u mraku. Zrnca su zatim isprana, resuspendirana u puferu za ispiranje i izmjerena pomoću protočnog citometra (BD, SAD). Koncentracija svakog citokina određena je na temelju kalibracijske krivulje koja je konstruirana neovisno za svaki citokin. Uzorci su analizirani u duplikatu.

2.6.6. Transkriptomski test

Testove transkriptoma izvršio je Novogene Co., Ltd., Kina. Kako bi se isključile individualne razlike, svaka je skupina uključivala dva uzorka (A i B) u svakoj vremenskoj točki, a svaki uzorak je pomiješan s PBMC-ima od pet osoba. Ukupna RNA ekstrahirana je iz PBMC-a pomoću RNeasy Mini Kita (QIAGEN, GmBH, Njemačka). RNK je provjerena za kvalitetu i kvantificirana. Dvostruka i jednolančana DNA i ribosomska RNA (rRNA) su uklonjene. Magnetske kuglice su zatim korištene za pročišćavanje i obnavljanje produkta reakcije, a knjižnice sekvenciranja su generirane prema preporukama proizvođača. Ukratko, produkti reakcije su zagrijani, denaturirani i cirkularizirani korištenjem udlage oligo sekvence. Knjižnice RNA-seq sekvencionirane su na Illumina HiSeq X TEN platformi (2 ×򠅐-bp čitanja uparenog kraja).

Očitani parovi filtrirani su pomoću softvera kako bi se uklonili oni s bazama niske kvalitete (Phred kvaliteta <ਅ) ili s više od 10% nesigurnih baza. Očitavanja RNA-seq usklađena su s ljudskim genomom (http://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/homo_sapiens/dna/) korištenjem Bowtie V2.0.6. DESeq2 je koristio sirovi broj za kvantificiranje razine ekspresije gena. Cuffdiff je korišten za identifikaciju gena koji su različito eksprimirani u cjepivu i kontrolnim uzorcima. Kod P <਀.05 identificirani su značajno različito izraženi geni. The raw microarray data are available from the National Genomics Data Center of the China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (CNCB-NGDC), under accession number HRA000347.

2.6.7. qRT-PCR

RNA was extracted from samples using TRIzol reagent (Invitrogen Tiangen Biotech, China). Real-time RT-PCR assays were performed using the One-Step PrimeScript RT-PCR Kit (Takara, Shuzo, Japan) and a Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA). Primers and probes for SARS-CoV-2 were used to measure mRNA levels for N, these were forward: 5′-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3′, reverse: 5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3′, and probe: 5′-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3′, and for ORF 1ab, they were forward: 5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′, reverse: 5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′, and probe: 5′-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3′. Primers and probes targeting the 3′ untranslated region (UTR) of DENV serotypes 1𠄳 were used according to previously described methods [14] . An RT-PCR assay with a universal single probe for the diagnosis of dengue virus infections was performed [14] .

2.6.8. Statistička analiza

The sample size was determined based on the requirement of the National Medical Products Administration of China, which requires a minimum sample size of 20� participants for each vaccine dose in an immunization schedule in phase 1 clinical trials. Means and standard deviations are used to describe normally distributed continuous variables, and frequencies and proportions are used to describe categorical variables. The safety analysis was performed with the data from the participants who had received at least one dose of the vaccine and for whom safety data were available. The numbers and proportions of participants with adverse reactions or events were summarized. The immunogenicity analysis was conducted with the data from the full cohort, including all participants who received injections and had results for the antibody test. The antibodies against SARS-CoV-2 are summarized as geometric mean titers with 95% CIs, and the cellular responses are presented as the proportion of positive responders. The chi-square test or Fisher’s exact test was used to analyze the seroconversion rate of antibodies against SARS-CoV-2, and the rank-sum test was used to compare antibody titers. When the comparison among all four groups of each schedule showed a significant difference, pairwise comparisons were performed. A P value lower than 0.05 (two-sided) was considered to be significant. The statistical analysis was performed by an independent statistician using GraphPad Prism software (San Diego, CA, USA) and STATA software (Version 15.0 STATA Corp., College Station, TX, USA).


SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody

SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody detects SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD protein at cytoplasm by immunohistochemical analysis. Sample: Paraffin-embedded human SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike transfected 293T cell FFPE Cell Pellet Block (GTX435640). Green: SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD stained by SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) diluted at 1:1000. Blue: Fluoroshield with DAPI (GTX30920). Antigen Retrieval: Citrate buffer, pH 6.0, 15 min

GTX135709 ICC/IF Image

SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody detects SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD protein by immunofluorescent analysis. Sample: Mock and transfected 293T cells were fixed in 4% paraformaldehyde at RT for 15 min. Green: SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD stained by SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) diluted at 1:1000. Blue: Fluoroshield with DAPI (GTX30920).

GTX135709 ELISA Image

Sandwich ELISA detection of recombinant full-length SARS-CoV-2 spike (trimer) protein using SARS-CoV / SARS-CoV-2 (COVID-19) spike antibody [1A9] (GTX632604) as capture antibody at concentration of 5 μg/mL and SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) as detection antibody at concentration of 1 μg/mL. Rabbit IgG antibody (HRP) (GTX213110-01) was diluted at 1:10000 and used to detect the primary antibody.

GTX135709 WB Image

Non-transfected (–) and transfected (+) 293T whole cell extracts (30 μg) were separated by 5% SDS-PAGE, and the membrane was blotted with SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) diluted at 1:5000. The HRP-conjugated anti-rabbit IgG antibody (GTX213110-01) was used to detect the primary antibody.

GTX135709 FACS Image

SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) detects SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD protein by flow cytometry analysis.
Sample: 293T cells transfected SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike.
Blue: Unlabelled sample was used as a control.
Red: SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) dilution: 1:50.
Acquisition of 20,000 events were collected for FACS analysis.

GTX135709 Neutralizing/Inhibition Image

Inhibition analysis of immobilized recombinant SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD (N501Y Mutant) protein, His tag (active) (UK variant) (GTX136014-pro), SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD (K417N, E484K, N501Y Mutant) protein, His tag (active) (South Africa variant) (GTX136022-pro), SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD (K417T, E484K, N501Y Mutant) protein, His tag (active) (Brazil variant) (GTX136043-pro), SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD (E484K, N501Y Mutant) protein, His tag (active) (UK variant) (GTX136058-pro) and SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD protein, His tag (active) (GTX136090-pro) (coated at 2 μg/mL) binding to soluble recombinant Human ACE2 (ECD) protein, mouse IgG Fc tag (active) (GTX135683-pro) (1000 ng/mL). ACE2 binding was inhibited by increasing concentrations of SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) (13.72-10000 ng/mL). Bound ACE2 was detected by Goat Anti-Mouse IgG antibody (HRP) (GTX213111-01) (1:10000).

GTX135709 WB Image

Non-transfected (–) and transfected (+) Vero E6 whole cell extracts (30 μg) were separated by 5% SDS-PAGE, and the membrane was blotted with SARS-CoV-2 (COVID-19) Spike RBD antibody (GTX135709) diluted at 1:5000. The HRP-conjugated anti-rabbit IgG antibody (GTX213110-01) was used to detect the primary antibody.


Gledaj video: Nanosenje sredstva za pranje (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Percival

    Kakve potrebne riječi... Sjajno, izvrsna misao

  2. Haslet

    U ovome ima nečega. Sada mi je sve postalo jasno, hvala vam puno na informacijama.

  3. Arndt

    Da svakako. Sve gore navedeno je istina. Razgovarajmo o ovom pitanju. Ovdje ili u PM.

  4. Vutaxe

    Kakva lijepa ideja



Napišite poruku