Informacija

Kako mogu očistiti RNA kontaminiranu fenolom bez gubitka uzorka?

Kako mogu očistiti RNA kontaminiranu fenolom bez gubitka uzorka?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nedavno sam prvi put ekstrahirao RNA iz listova biljaka u razvoju, kao dio vrlo dugog i intenzivnog eksperimenta. Uzorci su bili iznimno dragocjeni zbog količine truda koji je uložen u njihovo dobivanje (berba tisuća sitnih listova, po jedan sa svake biljke, kako bi se dobila potrebna masa).

RNK sam ekstrahirao TRIzolom i kloroformom. Nanodrop je pokazao izvrstan prinos kakav biste očekivali za aktivno rastuće mlado tkivo, ali neki od uzoraka imali su stvarno niske omjere 260/230. Znam da to ukazuje na kontaminaciju fenolom ili soli, ali što mogu učiniti da očistim uzorke bez gubitka dragocjene RNK? I kako mogu izbjeći kontaminaciju u budućnosti?


Fenol možete očistiti ispiranjem kloroformom, a zatim taloženjem izopropanolom nakon čega slijedi pranje sa 75% EtOH (javite mi ako želite točan protokol).

Kako biste izbjegli kontaminaciju (i gubitak uzorka), morate biti pažljivi u pipetiranju (što ćete s praksom poboljšati). Uvijek možete koristiti one epruvete s faznim zaključavanjem koje u osnovi zaglave čvrsti gel između vodene i organske faze tako da je puno lakše pipetirati.


Trebalo bi djelovati taloženje etanolom. Ali imao sam veliki uspjeh koristeći Qiagen RNA stupce za čišćenje, koji su po mom mišljenju lakši. Evo URL-a da vidite stupce za čišćenje RNA koje Qiagen nudi: http://www.qiagen.com/products/rnacleanupconcentration/default.aspx

Također u budućnosti trebali biste razmotriti korištenje PhaseLock cijevi:

http://www.5prime.com/products/nucleic-acid-purification/organic-nucleic-acid-extraction/phase-lock-gel-.aspx

To me je više puta spasilo od tvog problema.


Sažetak

Posljednjih desetljeća postupno su se usvajale molekularne tehnike za brzu potvrdu rezultata dobivenih metodama zlatnih standarda. Međutim, međunarodne organizacije obeshrabruju njihovu upotrebu u rutinskim laboratorijskim istraživanjima za postmortem dijagnozu bjesnoće, jer mogu dovesti do lažno pozitivnih rezultata zbog unakrsne kontaminacije. Čišćenje i dezinfekcija neophodni su za sprječavanje unakrsne kontaminacije uzoraka u laboratorijskom okruženju. Ova studija procijenila je učinkovitost odabranih dezinficijensa na opremi za obdukciju kontaminiranu bjesnoćom pod organskim izazovom pomoću testa na bazi nositelja. Pojava detektabilnog antigena virusa bjesnoće (RABV), održivog virusa i RNA procijenjena je pomoću zlatnih standarda fluorescentnog testa antitijela, testa infekcije kulture tkiva bjesnoće i molekularnih tehnika.

Niti jedno od testiranih dezinficijensa nije se pokazalo učinkovitim pod uvjetima na etiketi. Utvrđeno je da su protokoli za dezinfekciju izvan oznake učinkoviti samo za oksidirajuća sredstva i fenole. Bigvanid i kvaternarni amonijev spoj bili su neučinkoviti u svim ispitivanim uvjetima. Općenito, pri usporedbi različitih dijagnostičkih testova dobiveni su neskladni rezultati, što znači da u prisutnosti organske kontaminacije uobičajena dezinficijensa možda neće biti dovoljno učinkovita na održivi RABV ili RNA.

Naši rezultati pokazuju da bi učinkovit protokol dezinfekcije trebao biti pažljivo validiran kako bi se zajamčila sigurnost osoblja i pouzdanost rezultata.


Osoblje

Fokus forenzičara

Locardov princip razmjene nas uči da kada uđemo na mjesto zločina, uvodimo dokaze u tragovima, a kada napustimo mjesto zločina, uklanjamo tragove. Ako ne uzmemo u obzir Locardov princip razmjene prije, tijekom i nakon mjesta zločina, dokazi će biti ugroženi. Svi CSI su svjesni potencijalne kontaminacije i prošli smo dug put od dana kada je jedan od autora morao odvraćati detektiva da obuče ono što je nazvao "njegovim omiljenim parom rukavica" kada je pretraživao dom koji je nekada bio u vlasništvu Garyja Leona Ridgway, naknadno osuđeni ubojica iz Green Rivera.

Danas nam je potrebno samo nekoliko zalutalih stanica da bismo otkrili koristan DNK profil. Sa svakim napretkom DNK tehnologije, moramo naučiti novi vokabular za velike brojeve povezane sa statistikom podudaranja generiranom iz DNK profila. Kvadrilion, broj iza kojeg slijedi 15 nula (10 15 ), postao je uobičajen. Uskoro ćemo gledati na korištenje pojmova kao što je nemilijun (10 30 ) za opisivanje statistike podudaranja DNK. Druge kategorije dokaza kao što su vatreno oružje, ostaci vatre, eksplozivi, vlakna, itd., također mogu biti ugrožene, ali vrlo niske granice detekcije učinile su pitanja kontaminacije DNK dokaza toliko važnima. Najmanji pad naše budnosti može dovesti do kontaminacije.

Glavni izvori kontaminacije DNK su:

od osoblja do eksponata/DNK uzorka

od kontaminiranog potrošnog materijala [na primjer, brisevi, epruvete, osobna zaštitna oprema (PPE)/zaštitna odjeća] do eksponata/uzorka DNK

od eksponata do eksponata ili uzorka DNK do uzorka DNK i

od kontaminirane opreme koja nije propisno očišćena od prethodnih scena (na primjer, kamere, tronošci, stepenice).

Kontaminacija se može dogoditi na sljedeći način:

izravno (na primjer, slina ili perut od ispitivača koji završi na izložbi)

neizravno (na primjer, biološki materijal prisutan na ručki ladice prenosi se na rukavice ispitivača koji otvara ladicu, ne mijenja svoj vanjski par rukavica, a zatim rukuje značajnim predmetom, što rezultira neizravnim prijenosom biološkog materijala od ručke ladice do predmeta) ( Crown Copyright, 2016.).

Zapamtite da Locardov princip razmjene znači da ćete izgubiti dokaze s mjesta zločina i dodati ih na mjesto zločina, ali možete minimizirati stupanj prijenosa jednostavnim postupcima uključujući korištenje osobne zaštitne odjeće koja ograničava pristup čišćenje opreme za pregled mjesta i površina prije i nakon upotrebe osiguravajući da oprema koja se koristi na mjestima zločina temeljito se čisti između prizora koristeći samo briseve „bez DNK“ 1 i sterilni potrošni materijal i odvajajući eksponate tijekom transporta i skladištenja.

Koliko god hitno, ne zadovoljavajte svoje biološke potrebe na mjestu zločina. Kad god trebate jesti, piti ili otići u kupaonicu, 2 (čak i ako morate pušiti) koristite objekte izvan mjesta. Svatko, od najnovijeg novaka do starijeg CSI, ponekad treba podsjetiti da jednostavne ljudske radnje poput dodirivanja lica ili naočala ili znojenja u vrućim uvjetima mogu prenijeti DNK dokaze. Mora se njegovati kultura u kojoj se svi članovi tima osjećaju ugodno upozoravajući jedni druge kada promatraju takvo ponašanje.


Uvod

U okviru (preddiplomskog) medicinskog obrazovanja, anatomi koriste ljudska tijela za podučavanje studenata, bilo demonstriranjem proseciranih uzoraka ili seciranjem koje rade sami studenti. Tijela se stoga koriste kao obrazovni alat. Usporedba obrazovnih alata (Brenner etਊl. 2003.) otkrila je da ljudska tijela imaju različita svojstva i da ne postoje održive alternative. Ljudski leš se mora klasificirati kao poseban obrazovni alat jer nije niti studentov ‘prvi pacijent’ niti je puki biološki model. To je nevitalna, morbidna i smrtna, varijabilna i trodimenzionalna osoba s niskim zdravstvenim rizikom i visokom kvalitetom haptičkog iskustva, ograničenom dostupnošću i relativno umjerenim troškovima po učeniku. Učenik ga ne može naštetiti i njegova je upotreba etički ispravna.

Posljednjih godina pojavilo se nekoliko zabrinutosti u vezi s ovom upotrebom. Argumenti protiv seciranja uključuju etička i financijska pitanja, strah od opasnosti po zdravlje i svijest o osjetljivosti ljudi i vjerskim uvjerenjima (Aziz etਊl. 2002). Disekcija se smatra staromodnom i zastarjelom u svjetlu ‘virtualizacije’. S druge strane, također je sve veći broj kliničara, većinom kirurga, koji se zalažu za ponovno poboljšanje anatomske edukacije disekcijom (Bergman etਊl. 2011.).

Jedan od najvažnijih preduvjeta za korištenje ljudskih tijela u obrazovnim ustanovama je primjereno očuvanje leša. Očuvanje se smatra prikladnim kada se leš čuva od oštećenja, uništenja ili raspadanja. To se postiže tretiranjem leša posebnim kemikalijama, tj. balzamiranjem. Jedna od najvažnijih kemikalija koja se koristi u tu svrhu je formaldehid.

Danas se sve više protivi ovoj i drugim kemikalijama. Također postoji prijetnja da bi formaldehid mogao biti isključen za potrebe balzamiranja prema Direktivi o biocidnim proizvodima 98/8/EC (Europski parlament & Vijeće, 1998.).

Stoga je cilj ovog pregleda dati kratak pregled povijesti balzamiranja, sažeti anatomske postupke balzamiranja, identificirati i ukratko opisati najvažnije kemikalije te konačno razjasniti relevantne odlomke iz Direktive o biocidnim proizvodima.


Savjeti za laboratorijske štakore: produktivnost/zdravost/organizacija.

Nemojte neprestano gnjaviti studenta viših razreda o stvarima, on i PI imaju međusobno razumijevanje i mržnje i prezira koje vaše naivne oči tek trebaju iskusiti.

Postavite tjedni cilj za cilj koji želite postići. Na ovaj način, iako se ne čini puno, vidjet ćete koliko zaista postižete.

Izbjegavajte rad vikendom osim ako ne morate. Da, izuzetno ste posvećeni, ali ćete biti iskorišteni, u ovom ili onom obliku. Radi se o izmjeni načina na koji vas drugi vide. Sjajno je biti naporan, ali ako drugi očekuju da ćete raditi kasno navečer ili vikendom onda ste se prilično zapečatili u 80-satnom poslu s kojim se možda nećete uvijek moći pridržavati. Vaš PI može od vas tražiti da nešto učinite u petak i biti razočaran kada do ponedjeljka nemate rezultata. Možda će vam poslati podatke na analizu u petak navečer i prožvakati vas jer niste odgovorili na vrijeme. jer vikendom uvijek odgovarate na e-mailove. Da, trebali biste željeti biti što produktivniji, ali važno je imati i malo osobnog vremena kako ne biste izgorjeli. Sav posao i bez igre.

Za svaki test koji izvodite vodite Word dokument s vrlo detaljnim protokolom za analizu, čak i ako laboratorij već ima protokol iz kojeg ste učili. Većina ljudi na kraju modificira protokole kako bi odgovarali njihovom stilu, pa ćete htjeti zapisati sve male trikove do kojih dođete u slučaju da neko vrijeme počnete raditi drugi posao, a zatim se morate vratiti tom testu. Još bolje, spremite svaku verziju protokola kad god je modificirate i u svoju laboratorijsku bilježnicu zapišite koju verziju protokola ste koristili. Na ovaj način, ako se ikada trebate vratiti i saznati zašto je nešto funkcioniralo/nije funkcioniralo, moći ćete povući relevantni protokol i vidjeti što ste učinili drugačije.

Govoreći o bilježnicama, održavajte svoju bilježnicu ažurnom i pišite u nju previše, a ne premalo. Imajte ga pored sebe dok izvodite eksperiment i bilježite bilješke kako se stvari događaju. Npr. "Zabrljao sam i uzorak 4c je loš", ili "stanična kuglica izgleda malo manja nego inače", ili " trebam više pufera sljedeći put". Nećete se nužno sjećati ovih stvari kasnije, pa ako ih imate zapisane, ne morate brinuti o tome da ćete se sjećati bilo čega.

Nakon što ispunite bilježnicu, upišite sadržaj, isprintajte ga i zalijepite na unutarnju stranu prednje korice. Jamčim vam da će vas budući članovi laboratorija apsolutno voljeti zbog toga.

Trebali biste pisati svoju laboratorijsku bilježnicu kako bi netko mogao otprilike saznati što radite, a da vas ne mora pronaći i pitati o tome. To znači da ako ste odlučili upotrijebiti svoje antitijelo u omjeru 1:500 umjesto 1:1000, a eksperiment je konačno uspio, morate to zapisati točno tamo kako netko ne mora nužno prolaziti kroz cijeli proces optimizacije sve ispočetka.

Ne morate UVIJEK to činiti, ali kad god možete ili ima smisla, stavite svoje rezultate točno u laboratorijsku bilježnicu. Npr. ako čitate ploču i analizirate podatke u Excelu, samo ispišite svoje neobrađene podatke i grafikone i zalijepite ih u svoju bilježnicu. Očito, ako su vaši rezultati samo negativni ili eksperiment nije uspio, samo zapišite "rezultat: nije uspio" i ukratko razlog.

Nemojte se bojati učiniti svoju bilježnicu pomalo neurednom. Izgrebite stvari ako ste nešto promijenili. Doodle na njemu. Pišite stenografijom. Samo se pobrinite da na kraju dana bude razumno čitljiv i da netko može pratiti što ste učinili samo čitanjem. Ne mora biti savršeno.

Molimo vodite bilježnicu. Nekim ljudima to mora biti izričito rečeno. Nemate izbora. MORATE održavati laboratorijsku bilježnicu i barem jednom tjedno osigurati da je u potpunosti ažuriran.

Dobra je ideja napraviti Excel program koji će u osnovi izračunati vaše količine testa umjesto vas. Izbjegava glupe pogreške decimalnog zareza koje uništavaju gelove i analize. Na primjer, ako titrirate protein u EMSA ili nešto slično, napravite Excel proračunsku tablicu koja izračunava koliko mikrolitara proteina (imam kutiju za unos koncentracije) trebate za 25 nM, 50 nM, itd., i izračunava količinu pufera da se i on dovede do volumena. Ono što je prije trajalo 25 minuta zamornog računanja traje oko 20 sekundi. Samo sam unio sve parametre (koncentraciju DNK, koncentraciju proteina) u Excel proračunsku tablicu, ispisao je i gotovo. Štedi nestvarne količine vremena.

Pravilo broj 1 za produktivnost: imajte na umu STVARNI cilj. To dolazi u obzir kada počnete, recimo, pokušavati natjerati ligaciju da djeluje. Nakon 4 tjedna pokušaja, počinjete vjerovati da vam je cilj u životu da ligacija proradi. Nije. Vjerojatno pokušavate izraditi alat kako biste vidjeli je li gen izražen ili ubacili mutantni oblik proteina u bakteriju. Stoga se odmaknite i ponovno razmislite što radite. Uvijek postoji drugi način. Ako imate na umu svoje veće ciljeve, možete nemilosrdnije krenuti s točaka gušenja koje možda nisu potrebne za rad ili za koje postoje alternativni načini testiranja iste hipoteze.


Ekstrakcija DNA, RNA i proteina: prošlost i sadašnjost

Ekstrakcija DNA, RNA i proteina osnovna je metoda koja se koristi u molekularnoj biologiji. Te se biomolekule mogu izolirati iz bilo kojeg biološkog materijala za daljnje procese, analitičke ili preparativne svrhe. U prošlosti je proces ekstrakcije i pročišćavanja nukleinskih kiselina bio kompliciran, dugotrajan, radno intenzivan i ograničen u smislu ukupne propusnosti. Trenutno postoje mnoge specijalizirane metode koje se mogu koristiti za ekstrakciju čistih biomolekula, kao što su protokoli temeljeni na otopinama i stupcima. Ručna metoda je zasigurno napredovala tijekom vremena s raznim komercijalnim ponudama koje su uključivale kompletne komplete koji sadrže većinu komponenti potrebnih za izolaciju nukleinske kiseline, ali većina njih zahtijeva ponovljene korake centrifugiranja, nakon čega slijedi uklanjanje supernatanta ovisno o vrsti uzorka i dodatna mehanička obrada. Posljednjih godina potražnja za automatiziranim sustavima dizajniranim za srednje do velike laboratorije porasla je. To je alternativa radno intenzivnim ručnim metodama. Tehnologija bi trebala omogućiti visoku propusnost uzoraka, prinos, čistoća, reproducibilnost i skalabilnost biomolekula, kao i brzina, točnost i pouzdanost testa trebaju biti maksimalni, a minimizirati rizik od unakrsne kontaminacije.

1. Uvođenje ekstrakcije biomolekula

Ekstrakcija biomolekula, DNA, RNA i proteina, najvažnija je metoda koja se koristi u molekularnoj biologiji [1]. To je početna točka za daljnje procese i razvoj proizvoda uključujući dijagnostičke komplete. DNA, RNA i protein mogu se izolirati iz bilo kojeg biološkog materijala kao što su živa ili konzervirana tkiva, stanice, virusne čestice ili drugi uzorci za analitičke ili preparativne svrhe [1].

Dvije kategorije koje su uključene u pročišćavanje DNA uključuju izolaciju rekombinantnih DNA konstrukata kao što su plazmidi ili bakteriofagi i izolaciju kromosomske ili genomske DNA iz prokariotskih ili eukariotskih organizama [2]. Općenito, uspješno pročišćavanje nukleinske kiseline zahtijevalo je četiri važna koraka: učinkovito uništavanje stanica ili denaturaciju tkiva nukleoproteinskih kompleksa inaktivaciju nukleaza, na primjer, RNase za ekstrakciju RNA i DNase za ekstrakciju DNA dalje od kontaminacije [2]. Ciljana nukleinska kiselina ne bi trebala sadržavati onečišćenja uključujući proteine, ugljikohidrate, lipide ili druge nukleinske kiseline, na primjer, DNA bez RNA ili RNA bez DNA [3]. Kvaliteta i cjelovitost izolirane nukleinske kiseline izravno će utjecati na rezultate svih narednih znanstvenih istraživanja [4].

S druge strane, RNA je nestabilna molekula i ima vrlo kratko vrijeme poluraspada nakon što se ekstrahira iz stanice ili tkiva [5]. Postoji nekoliko vrsta RNK koje se prirodno pojavljuju, uključujući ribosomalnu RNA (rRNA) (80% –90%), glasničku RNA (mRNA) (2,5% –5%) i prijenosnu RNA (tRNA) [3]. Posebna pažnja i mjere opreza potrebni su za izolaciju RNA jer je osjetljiva na razgradnju [3, 6]. RNA je posebno nestabilna zbog sveprisutne prisutnosti RNaza koje su enzimi prisutni u krvi, svim tkivima, kao i većini bakterija i gljivica u okolišu [3, 5]. Jaki denaturanti oduvijek su korišteni u izolaciji intaktne RNA za inhibiciju endogenih RNaza [2]. Ekstrakcija RNA se oslanja na dobru laboratorijsku tehniku ​​i tehniku ​​bez RNAze. RNAza je toplinski stabilna i ponovno se savija nakon toplinske denaturacije. Teško ih je inaktivirati jer ne zahtijevaju kofaktore [2]. Najčešće metode izolacije mogu se podijeliti u dvije klase: korištenje 4 M gvanidinijevog tiocijanata i korištenje fenola i SDS-a [2].

Pročišćavanje proteina jedan je od najvažnijih dijelova u istraživanju proteina za razumijevanje njihove funkcije, budući da oni djelomično ili potpuno mogu biti uključeni u bilo koju aktivnost sinteze DNA. Pročišćavanje proteina je potrebno za određivanje njegovih jedinstvenih karakteristika, uključujući veličinu, naboj, oblik i funkciju [7]. Ekstrakcija na bazi stanica je početni korak za gotovo sva pročišćavanja proteina. Protein se može ekstrahirati na nekoliko metoda kao što su liza deterdženta, sila smicanja, tretman s niskom ionskom soli (saljenje) i brze promjene tlaka, koje su imale za cilj oslabiti i razbiti membrane koje okružuju stanicu kako bi proteini mogli pobjeći [7 ]. Neke čimbenike treba uzeti u obzir pri rukovanju proteinima. Obično se ekstrakcija proteina izvodi na vrlo niskoj temperaturi (

) jer se proteini lako denaturiraju nakon što se oslobode iz stanica.Stanje pufera jedan je od glavnih čimbenika koji treba uzeti u obzir. Preporuča se održavanje specifičnih puferskih uvjeta zbog osjetljivosti proteina na promjene pH okoliša [4]. Čistoća vode će utjecati na prinos krajnjih proizvoda jer nepročišćena voda sadrži puno mikroorganizama ili proteaza koje će rezultirati razgradnjom proteina [4]. Proteinski inhibitor, koji može postojati u otopini ili puferima, uzrokuje hidrolizaciju proteina. Deterdžent, još jedan značajan čimbenik koji se ne može zanemariti u pročišćavanju proteina, sastoji se od hidrofobnog dijela linearnog ili razgranatog ugljikovodičnog “repa” i hidrofilne “glave” [4]. Oni otapaju membranski protein i amfifatske su molekule koje tvore micele s hidrofilnom glavom proteina [4]. Reduktori će se dodati u otopinu ili pufer za ekstrakciju i pročišćavanje proteina kako bi se izbjegao gubitak aktivnosti proteina ili enzima koji je uzrokovan oksidacijom. Skladištenje proteina je važno jer poluživot proteina obično ovisi o temperaturi skladištenja [4].

Pročišćavanje proteina zahtijeva poseban test. Za pročišćavanje proteina mora biti poznata brza i jednostavna metoda analize kako bi se odgovarajućom metodom mogla otkriti poznata molekularna težina, specifični afinitet ili imunoafinitet neenzimskog proteina od interesa [7]. Postoji nekoliko metoda koje se obično koriste u pročišćavanju proteina. To su kromatografija ionske izmjene, gel filtracija, afinitetna kromatografija i gel elektroforeza [4].

2. Povijest

2.1. Ekstrakcija nukleinske kiseline

Prvu izolaciju DNK napravio je švicarski liječnik Friedrich Miescher 1869. [8]. Nadao se da će riješiti temeljna načela života, odrediti kemijski sastav stanica. Pokušao je izolirati stanice iz limfnih čvorova za svoj eksperiment, ali čistoću limfocita bilo je teško i nemoguće dobiti u dovoljnim količinama. Stoga je prešao na leukocite, gdje ih je dobivao iz gnoja na prikupljenim kirurškim zavojima.

U početku se Miescher usredotočio na različite vrste proteina koji čine leukocite i pokazao da su proteini glavne komponente stanične citoplazme. Tijekom svojih testova primijetio je da se tvar istaloži iz otopine kada je dodana kiselina i da se ponovno otopi kada se doda lužina. To je bio prvi put da je dobio sirovi precipitat DNK.

Kako bi odvojio DNK od proteina u svojim staničnim ekstraktima, Miescher je razvio novi protokol za odvajanje jezgri stanica od citoplazme, a zatim izolirao DNK. Međutim, njegov prvi protokol nije uspio dati dovoljno materijala za nastavak daljnje analize. Morao je razviti drugi protokol kako bi dobio veće količine pročišćenog nukleina, koji je kasnije njegov učenik Richard Altman nazvao 'nukleinskom kiselinom' [8].

2.2. Ekstrakcija proteina

U osamnaestom stoljeću, Antoine Fourcroy i drugi su bili poznati proteini kao posebna klasa bioloških molekula. Oni su ovu molekulu razlikovali po njenoj sposobnosti zgrušavanja pod tretmanom toplinom ili kiselinom. Međutim, prvi opis proteina izveo je Gerhardus Johannes Mulder, nizozemski kemičar, 1893. [9]. Njegova istraživanja o sastavu životinjskih tvari, uglavnom fibrina, albumina i želatine, pokazala su prisutnost ugljika, vodika, kisika i dušika [9]. Nadalje, prepoznao je da su sumpor i fosfor ponekad prisutni u životinjskim tvarima koje se sastoje od velikog broja atoma te je ustanovio da su te "tvari" makromolekule [9].

Većina ranih studija usredotočila se na proteine ​​koji se mogu pročistiti u velikim količinama. Na primjer, krv, bjelanjak i razni toksini. Većinu proteina teško je pročistiti u količinama većim od miligrama čak i današnjim vrlo naprednim metodama. Većina tehnika za pročišćavanje proteina razvijena je u projektu koji je vodio Edwin Joseph Cohn, znanstvenik za proteine, tijekom Drugog svjetskog rata. Bio je odgovoran za pročišćavanje krvi i razradio tehnike za izolaciju frakcije serumskog albumina iz krvne plazme, koja je važna u održavanju osmotskog tlaka u krvnim žilama, što pomaže vojniku da ostane na životu [10].

3. Trenutna tendencija

Nakon sudbonosnog događaja u kojem je Miescher uspio dobiti DNK iz stanice, mnogi drugi su ga slijedili što je dovelo do daljnjeg napretka u protokolu izolacije i pročišćavanja DNK. Početni rutinski laboratorijski postupci za ekstrakciju DNA razvijeni su iz strategija centrifugiranja s gradijentom gustoće. Meselson i Stahl koristili su ovu metodu 1958. kako bi demonstrirali polukonzervativnu replikaciju DNK [3]. Kasniji postupci koristili su razlike u topljivosti velike kromosomske DNA, plazmida i proteina u alkalnom puferu [3].

Trenutno postoje mnoge specijalizirane metode ekstrakcije čiste DNK, RNA ili proteina. Općenito se dijele na protokole koji se temelje na rješenju ili na stupcima. Većina ovih protokola razvijena je u komercijalne komplete koji olakšavaju procese ekstrakcije biomolekula.

3.1. Vrsta ekstrakcije nukleinske kiseline
3.1.1. Konvencionalna metoda

Ekstrakcija gvanidinijevog tiocijanata-fenol-kloroforma
Sol je uobičajena nečistoća u uzorcima nukleinske kiseline. Uvijek se zahtijevalo da se ukloni iz uzoraka nukleinske kiseline prije nego što se izvrši bilo koji nizvodni proces i analiza. Stoga su potrebni pojedinačni ili višestruki koraci odvajanja i/ili pročišćavanja kako bi se uzorak koji sadrži nukleinsku kiselinu odsolio [11]. Opći koraci pročišćavanja nukleinske kiseline uključuju lizu stanice, koja narušava staničnu strukturu kako bi se stvorio lizat, inaktivaciju staničnih nukleaza kao što su DNaza i RNaza, te odvajanje željene nukleinske kiseline od staničnih ostataka [2]. Organsko otapalo – ekstrakcija fenol-kloroformom je jedan od primjera, koji se široko koristi u izolaciji nukleinske kiseline.
Iako fenol, zapaljiva, korozivna i toksična karbolna kiselina može brzo denaturirati proteine, ne inhibira u potpunosti aktivnost RNAze [12]. Taj se problem može riješiti primjenom mješavine fenol: kloroform: izoamil alkohol (25:24:1). Proteini, lipidi, ugljikohidrati i stanični ostaci uklanjaju se ekstrakcijom vodene faze s organskom smjesom fenola i kloroforma [12, 13]. Dvofazna emulzija nastaje kada se dodaju fenol i kloroform. Hidrofobni sloj emulzije će se tada taložiti na dno, a hidrofilni sloj na vrhu centrifugiranjem [3]. Sakuplja se gornja faza koja je sadržavala DNA i DNA se može istaložiti iz supernatanta dodavanjem etanola ili izopropanola u omjeru 2:1 ili 1:1 i visoke koncentracije soli [3]. Precipitat DNA se skupi centrifugiranjem, a višak soli se ispere sa 70% etanola i centrifugira da se odbaci supernatant etanola. DNA peleta se zatim otopi u TE puferu ili sterilnoj destiliranoj vodi [3].
Korištenje gvanidinijevog izotiocijanata u ekstrakciji RNA prvi su spomenuli Ulrich i sur. (1977). Metoda je bila naporna. Stoga je Chomczynski i Sacchi (1987) [12] istisnut tehnikom u jednom koraku, poznatom kao ekstrakcija guanidinijevim tiocijanat-fenol-kloroformom, pri čemu se homogenat ekstrahira fenolom/kloroformom pri smanjenom pH. Gvanidinijev tiocijanat je kaotropno sredstvo koje se koristi u razgradnji proteina. Princip ove tehnike u jednom koraku je da se RNA odvaja od DNA nakon ekstrakcije kiselom otopinom koja se sastoji od gvanidinijevog tiocijanata, natrijevog acetata, fenola i kloroforma [13]. U kiselim uvjetima ukupna RNA ostaje u gornjoj vodenoj fazi cijele smjese, dok DNK i proteini ostaju u interfazi ili donjoj organskoj fazi. Obnavljanje ukupne RNA tada se vrši precipitacijom s izopropanolom [12].

Metoda alkalne ekstrakcije
Alkalna liza je korištena za izolaciju plazmidne DNA i E coli [12]. Dobro funkcionira sa svim vrstama E coli i s bakterijskim kulturama veličine od 1 mL do više od 500 mL u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS). Princip metode temelji se na selektivnoj alkalnoj denaturaciji kromosomske DNA visoke molekularne mase dok kovalentno zatvorena kružna DNA ostaje dvolančana [14]. Bakterijski proteini, slomljene stanične stijenke i denaturirana kromosomska DNA isprepleteni su u velike komplekse koji su obloženi dodecil sulfatom. Plazmidna DNA se može izdvojiti iz supernatanta nakon što je denaturirani materijal uklonjen centrifugiranjem.

Metoda ekstrakcije CTAB
Za ekstrakciju biljaka, početni korak koji je potrebno učiniti je samljeti uzorak nakon što ga zamrznete tekućim dušikom. Svrha ovog koraka je razbiti materijal stanične stijenke uzorka i omogućiti pristup nukleinskoj kiselini dok štetni stanični enzimi i kemikalije ostaju inaktivirani. Nakon mljevenja uzorka, može se resuspendirati u prikladnom puferu kao što je CTAB.
Cetiltrimetilamonijev bromid (CTAB) je neionski deterdžent koji može istaložiti nukleinske kiseline i kisele polisaharide iz otopina niske ionske snage [15]. U međuvremenu, proteini i neutralni polisaharidi ostaju u otopini pod tim uvjetima. U otopinama visoke ionske snage CTAB neće taložiti nukleinske kiseline i stvara komplekse s proteinima. CTAB je stoga koristan za pročišćavanje nukleinske kiseline iz organizama koji proizvode velike količine polisaharida kao što su biljke i određene gram-negativne bakterije [15].
Ova metoda također koristi organska otapala i precipitaciju alkohola u kasnijim koracima [12]. Netopljive čestice se uklanjaju centrifugiranjem kako bi se pročistila nukleinska kiselina. Topljivi proteini i drugi materijali se odvajaju miješanjem s kloroformom i centrifugiranjem. Nukleinska kiselina se nakon toga mora istaložiti iz supernatanta i temeljito isprati kako bi se uklonile kontaminirajuće soli. Pročišćena nukleinska kiselina se zatim resuspendira i pohranjuje u TE puferu ili sterilnoj destiliranoj vodi.

) Gradijentno centrifugiranje
Gradijentno centrifugiranje je komplicirana, skupa i dugotrajna metoda u usporedbi s drugim protokolima pročišćavanja. Zahtijeva veliku bakterijsku kulturu. Stoga nije prikladan za minipreparaciju plazmidne DNA [4]. Nukleinske kiseline se mogu koncentrirati centrifugiranjem u a

gradijent nakon precipitacije alkohola i resuspenzije. Interkalacija mijenja gustoću plivanja molekule u visokom molaru

Kovalentno zatvorene kružne molekule nakupljat će se pri nižim gustoćama u gradijentu jer sadrže manje po paru baza u usporedbi s linearnim molekulama. Hidrofob se zatim uklanja odgovarajućim hidrofobnim otapalima nakon ekstrakcije. Pročišćena nukleinska kiselina će se reprecipitirati alkoholom [1].

RNA pomoću Oligp(dT)-celulozne kromatografije
Poli RNA je predložak za translaciju proteina i većina eukariotskih mRNA nosi njezine dijelove na svojim 3’ krajevima [4, 15]. Čini 1 do 2% ukupne RNA i može se odvojiti afinitetnom kromatografijom na oligo (dT)-celulozi. Poli (A) repovi tvore stabilne RNA-DNA hibride s kratkim lancima oligo (dT) koji se vežu na različite matrice nosača [4, 15]. Puferu za kromatografiju mora se dodati velika sol kako bi se stabilizirali dupleksi nukleinske kiseline jer se formira samo nekoliko dT-A baznih parova. Pufer s malo soli koristi se nakon što se nepoliadenilirane RNA isperu iz matrice. Ovaj pufer pomaže destabilizirati dvolančane strukture i eluirati poli RNA iz smole [15].
Postoje dvije metode koje se obično koriste u odabiru Poly RNA - kolonska kromatografija na oligo (dT) kolonama i šaržna kromatografija. Kromatografija na stupcu koja se obično koristi za pročišćavanje velikih količina (>25

g) neradioaktivnog poli (A) + RNA izoliranog iz stanica sisavaca. Šaržna kromatografija je poželjna metoda kada se radi s malim količinama (<50 g) ukupne RNA sisavaca. Može se koristiti kada treba obraditi mnogo uzoraka RNA, bilo radioaktivno ili ne. Šaržna kromatografija provodi se s finom oligo (dT) celulozom na optimalnim temperaturama za vezanje i eluiranje [15].

3.1.2. Ekstrakcija nukleinske kiseline u čvrstoj fazi

Čvrsto-fazno pročišćavanje nukleinskih kiselina može se naći u većini komercijalnih kompleta za ekstrakciju dostupnih na tržištu. Omogućuje brzo i učinkovito pročišćavanje u usporedbi s konvencionalnim metodama [16]. Mnogi problemi koji su povezani s ekstrakcijom tekućina-tekućina, kao što je nepotpuno odvajanje faza, mogu se spriječiti. Sustav čvrste faze će apsorbirati nukleinsku kiselinu u procesu ekstrakcije ovisno o pH i sadržaju soli u puferu. Proces apsorpcije temelji se na sljedećim principima: interakcija vezanja vodika s hidrofilnim matriksom u kaotropnim uvjetima, ionska izmjena u vodenim uvjetima pomoću anionskog izmjenjivača, te mehanizmi isključivanja afiniteta i veličine.

Čvrstofazno pročišćavanje se obično izvodi pomoću okretne kolone koja radi pod centrifugalnom silom [17]. Ova metoda može brzo pročistiti nukleinsku kiselinu u usporedbi s konvencionalnim metodama. Silikatne matrice, staklene čestice, dijatomejska zemlja i anionski izmjenjivači su primjeri koji su korišteni u metodi ekstrakcije u čvrstoj fazi kao čvrsta potpora. Četiri ključna koraka uključena u ekstrakciju u čvrstoj fazi su stanična liza, adsorpcija nukleinskih kiselina, ispiranje i eluiranje [6].

Početni korak u procesu ekstrakcije krute faze je kondicioniranje stupca za adsorpciju uzorka. Kondicioniranje kolone može se provesti korištenjem pufera pri određenom pH za pretvaranje površine ili funkcionalnih skupina na krutini u određeni kemijski oblik. [17]. Zatim se uzorak koji je razgrađen korištenjem pufera za lizu nanese na kolonu. Željena nukleinska kiselina će se apsorbirati u kolonu uz pomoć visokog pH i koncentracije soli vezivne otopine [17]. Drugi spojevi, poput proteina, također mogu imati jaku specifičnu vezu s površinom stupca. Ti se kontaminanti mogu ukloniti u koraku pranja korištenjem pufera za ispiranje koji sadrži kompetitivno sredstvo [17]. Za korak eluiranja uvodi se TE pufer ili voda kako bi se željena nukleinska kiselina oslobodila iz stupca, tako da se može prikupiti u pročišćenom stanju [17]. Obično je potrebno brzo centrifugiranje, vakuumska filtracija ili odvajanje kolone tijekom koraka ispiranja i eluiranja procesa pročišćavanja.

Otkrivena je ekstrakcija nukleinske kiseline u čvrstoj fazi s mješovitim slojem i njezina uporaba u izolaciji nukleinske kiseline [18]. Čvrste faze s miješanim slojem ovog izuma su smjese najmanje dvije različite čvrste faze, mogu biti čvrste ili polukrute, porozne ili neporozne. Svaka čvrsta faza može se vezati na ciljanu nukleinsku kiselinu pod različitim uvjetima otopine i otpustiti nukleinsku kiselinu pod sličnim uvjetima eluiranja [18].

Silika matrice
Osnova za većinu proizvoda koji se odnose na pročišćavanje nukleinske kiseline su jedinstvena svojstva matrica silicija za selektivno vezanje DNA. Vrste silicijevih materijala uključujući staklene čestice, kao što su stakleni prah, čestice silicijevog dioksida i staklena mikrovlakna pripremljena mljevenjem filter papira od staklenih vlakana, uključujući dijatomejsku zemlju [19]. Hidrirani matriks silicijevog dioksida, koji je pripremljen refluksom silicijevog dioksida u natrijevom hidroksidu ili kalijevom hidroksidu u molarnom omjeru od oko 2:1 do 10:1 tijekom najmanje oko 48 sati, uveden je u pročišćavanje DNA. DNA se veže za anorganski matriks i oslobađa se u zagrijanoj vodi [20].
Princip pročišćavanja matrica silicijevog dioksida temelji se na visokom afinitetu negativno nabijene DNA okosnice prema pozitivno nabijenim česticama silicija [21]. Natrij ima ulogu kationskog mosta koji privlači negativno nabijeni kisik u fosfatnu okosnicu nukleinske kiseline [22]. Natrijevi kationi razbijaju vodikove veze između vodika u vodi i negativno nabijenih iona kisika u silicij dioksidu u uvjetima visoke soli (pH ≤7) [22]. DNK je čvrsto vezan, a opsežno pranje uklanja sve kontaminacije. Pročišćene molekule DNA mogu se kasnije eluirati pod niskom ionskom jakošću (pH ≥7) upotrebom TE pufera ili destilirane vode [21].
Osim matrica silicijevog dioksida, poznato je da se nitrocelulozne i poliamidne membrane poput najlonskih matrica također vežu na nukleinske kiseline, ali s manje specifičnosti. Ovi se materijali često koriste kao matrice za prijenos i hibridizaciju nukleinskih kiselina u čvrstoj fazi [23]. Poliamidne matrice su izdržljivije od nitroceluloze i poznato je da nepovratno vežu nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline mogu se imobilizirati na poliamidnim matricama u puferu niske ionske snage [23].

Staklena čestica
Staklene čestice, prah i kuglice korisni su za pročišćavanje nukleinske kiseline. Na primjer, izolacija DNA iz agaroznih gelova uključivala je upotrebu kaotropnih soli za olakšavanje vezanja DNA na obično silikatno staklo, kremeno staklo i borosilikatno staklo (filtar od staklenih vlakana). Do adsorpcije nukleinske kiseline na staklenu podlogu najvjerojatnije dolazi na temelju mehanizma i principa koji je sličan adsorpcijskoj kromatografiji [24]. Pročišćavanje nukleinske kiseline također se može obaviti na mješavini silika gela i stakla [19]. Ovaj izum je otkrio da se mješavina silikagela i staklenih čestica može koristiti za odvajanje nukleinske kiseline od drugih tvari u prisutnosti otopine kaotropnih soli.

Dijatomejska zemlja
Dijatomejska zemlja, koja je također poznata kao kieselgur ili dijatomit, ima sadržaj silicija čak 94% [25]. Koristi se za filtraciju i kromatografiju, a koristan je za pročišćavanje plazmida i druge DNA imobilizacijom DNA na njezine čestice u prisutnosti kaotropnog sredstva. Dobivena dijatomejska zemlja vezana DNA se zatim ispere puferom koji sadrži alkohol. Pufer koji sadrži alkohol se zatim odbacuje i DNA se eluira u puferu s malo soli ili u destiliranoj vodi [25].

Pročišćavanje nukleinskih kiselina na bazi magnetskih kuglica
Magnetsko odvajanje je jednostavan i učinkovit način koji se danas koristi u pročišćavanju nukleinske kiseline. Mnogi magnetni nosači sada su komercijalno dostupni. Čestice koje imaju magnetski naboj mogu se ukloniti upotrebom trajnog magneta u primjeni magnetskog polja. Često se za proces izolacije koriste magnetski nosači s imobiliziranim afinitetnim ligandima ili pripremljeni od biopolimera koji pokazuje afinitet prema ciljnoj nukleinskoj kiselini. Na primjer, magnetske čestice koje se proizvode od različitih sintetskih polimera, biopolimera, poroznog stakla ili magnetskih čestica na bazi anorganskih magnetskih materijala kao što je površinski modificirani željezni oksid. Za vezanje nukleinskih kiselina poželjno je koristiti materijale s velikom površinom. Materijali magnetskih čestica kao što su perle su poželjniji za potporu u procesu izolacije zbog njihovog većeg kapaciteta vezivanja.Proces vezivanja nukleinske kiseline može biti potpomognut nukleinskom kiselinom koja se "omata" oko nosača. Magnet se može staviti na bočnu stranu posude koja sadrži mješavinu uzorka za agregiranje čestica u blizini stijenke posude i odlijevanje ostatka uzorka [26].
Čestice koje imaju magnetska ili paramagnetska svojstva koriste se u izumu gdje su kapsulirane u polimeru kao što je celuloza koja se može magnetizirati [27]. U prisutnosti određenih koncentracija soli i polialkilen glikola, celuloza koja se može magnetizirati može se vezati na nukleinske kiseline. Mala nukleinska kiselina zahtijevala je veće koncentracije soli za snažno vezanje na čestice celuloze koje se mogu magnetizirati. Stoga se koncentracijom soli može selektivno manipulirati kako bi se oslobodila nukleinska kiselina vezana za celulozu koja se može magnetizirati na temelju veličine. Magnetizirana celuloza koja je vezana s nukleinskom kiselinom bit će isprana prikladnim puferom za ispiranje prije nego što se dovede u kontakt s prikladnim puferom za eluiranje kako bi se željena nukleinska kiselina odvojila od celuloze. Odvajanje celuloze koja se može magnetizirati od supernatanta tijekom svih koraka pročišćavanja može se obaviti primjenom magnetskog polja za njihovo povlačenje ili povlačenje na stranu posude [27]. Celuloza koja se može magnetizirati upotrijebljena u ovom izumu ima sadržaj željeznog oksida do oko 90% težine ukupne mase celuloze. Magnetska komponenta celuloze također se može zamijeniti drugim magnetskim spojevima kao što su željezni oksid ili nikal oksid [27].
Komplet za ekstrakciju koji se temelji na principu pročišćavanja nukleinske kiseline na bazi magnetskih kuglica komercijalno je dostupan na tržištu [28]. Poseban dio ovog kompleta je da su priloženi reagensi namijenjeni za korištenje s magnetskim alatima. Ovaj se magnetski alat preporučuje ako radite u formatu mikrotuba. To je praktičan uređaj za izvođenje odvajanja na temelju tehnologije magnetskih čestica. Komplet ne zahtijeva nikakva organska otapala i eliminira potrebu za ponovljenim centrifugiranjem, vakuumskom filtracijom ili odvajanjem na stupcu. Protokol se temelji na modificiranom postupku alkalne lize nakon čega slijedi vezanje nukleinske kiseline na magnetske čestice. Magnetski alat se koristi za hvatanje magnetskih čestica s vezanom nukleinskom kiselinom, a onečišćenja se uklanjaju ispiranjem priloženim puferom za ispiranje. Nukleinska kiselina se zatim eluira iz magnetskih čestica s puferom za eluiranje [28].
Drugi komplet za ekstrakciju ima isti princip kao i gore opisana ekstrakcija, koja je koristila tehnologiju magnetskih čestica za pročišćavanje nukleinske kiseline [29]. Kombinira brzinu i učinkovitost pročišćavanja DNK na bazi silicija s praktičnim rukovanjem magnetskim česticama. Za hvatanje magnetskih čestica koristi se magnetska šipka zaštićena poklopcem šipke. Ulazi u posudu koja sadrži uzorke i privlači magnetske čestice. Zatim se poklopac magnetske šipke postavlja iznad druge posude i magnetske čestice se oslobađaju [29].
Pročišćavanje nukleinske kiseline korištenjem cirkonijevog dioksida je još jedna vrsta pročišćavanja na temelju magnetskih kuglica. Ove mikrosferne paramagnetske kuglice imaju veliku dostupnu površinu za vezivanje i mogu se raspršiti u otopini. Ova karakteristika je omogućila temeljito vezanje nukleinske kiseline, ispiranje i eluiranje. Komplet za izolaciju ukupne nukleinske kiseline, koji koristi ovu tehnologiju za pročišćavanje nukleinske kiseline, koristi se mehaničkim razbijanjem uzoraka s zrncima cirkonija u otopini na bazi gvanidinijevog tiocijanata koja ne samo da oslobađa nukleinsku kiselinu već i inaktivira nukleazu u matrici uzorka [ 30]. Nakon koraka lize, razrjeđivanje uzoraka vrši se korištenjem izopropanola. Paramagenetska zrnca se dodaju uzorcima u svrhu vezanja nukleinske kiseline. Mješavina kuglica i nukleinske kiseline se imobilizira na magnetima i ispere kako bi se uklonili proteini i onečišćenja. Uklanjanje preostale vežuće otopine vrši se drugom otopinom za ispiranje i na kraju se nukleinska kiselina eluira u puferu s malo soli [30].
Čvrsta faza reverzibilne imobilizacije paramagenetske kuglice bazirana na tehnologiji je korištena za PCR sustav za pročišćavanje za isporuku kvalitetne DNK. Zahtijeva jednostavan protokol bez centrifugiranja i filtracije. PCR amplikoni se vežu na paramagenetske čestice koje ih izvlače iz otopine, omogućujući ispiranje kontaminanata kao što su dNTP, početnice i soli [31].
Magnetska oligo (dT) kuglica je alternativa drugim oligo (dT) matricama za pročišćavanje poli RNA iz uzorka ukupne RNA [4]. Poli RNA može se ekstrahirati uvođenjem magnetskih kuglica obloženih oligo (dT). RNA s poli-A repom veže se za oligo (dT). Zrnca će se zatim povući na dno epruvete uklanjajući mRNA izravno iz ukupne RNA. Magnetske kuglice koje su posebno obrađene minimiziraju nespecifično vezanje drugih nukleinskih kiselina i osiguravaju čistoću mRNA [32].

Materijal za anionsku izmjenu
Anionska izmjenjivačka smola jedan je od popularnih primjera koji koristi princip anionske izmjene [33]. Temelji se na interakciji između pozitivno nabijenih skupina dietilaminoetil celuloze (DEAE) na površini smole i negativno nabijenih fosfata DNA okosnice. Anionska izmjenjivačka smola sastoji se od definiranih kuglica silicijevog dioksida s velikom veličinom pora, hidrofilnog površinskog premaza i visoke gustoće naboja [34]. Velika površina smole omogućuje gusto spajanje DEAE skupina. Smola djeluje u širokom rasponu pH uvjeta (pH 6–9) i/ili koncentracije soli (0,1–1,6 M) što može optimizirati odvajanje DNA od RNA i drugih nečistoća [34]. Stoga su koncentracija soli i pH uvjeti pufera jedan od glavnih čimbenika koji određuju hoće li se nukleinska kiselina vezati ili eluirati iz kolone. DNA se može vezati na DEAE skupinu u širokom rasponu koncentracija soli. Nečistoće poput proteina i RNA ispiru se iz smole korištenjem pufera srednje količine soli, dok DNA ostaje vezana dok se ne eluira s puferom s visokim udjelom soli [34].
Metoda korištenja materijala za anionsku izmjenu za izolaciju nukleinske kiseline otkrivena je u izumu [35], gdje su korišteni komercijalno dostupni jaki ili slabi pozitivno nabijeni anionski izmjenjivači s odabranim otopinama poznate ionske snage za adsorpciju i eluciju. Većina komponenti topivih u vodi, kao što je protein, može se isprati kroz kolonu primjenom otopine poznate ionske snage za vezanje nukleinskih kiselina na materijale stupca za anionsku izmjenu. Ionska snaga za eluiranje dobiva se korištenjem poznate koncentracije soli, koja se pomiješa s puferom za kontrolu pH jačine, što idealno odgovara najnižoj ionskoj jakosti pri kojoj će nukleinske kiseline u potpunosti eluirati [35].

3.2. Vrsta metode ekstrakcije proteina

Prvi korak u pročišćavanju proteina je stanična liza. Kako bi se proteini učinkovito pročistili i analizirali, oni se prvo moraju osloboditi iz stanice domaćina u topivom obliku. Plazma membrana stanica sisavaca, sastavljena od fosfolipida i proteina, lako se poremeti [36]. Za usporedbu, ekstrakcija proteina iz gljivica i bakterija čini se zahtjevnijom zbog njihove stabilne stanične stijenke koja je jača od plazma membrane.

Biljna tkiva sadrže širok raspon proteina koji se razlikuju po svojim svojstvima. Neki specifični čimbenici moraju se uzeti u obzir pri razvoju protokola ekstrakcije proteina za biljku [37]. Na primjer, prisutnost krute celulozne stanične stijenke mora se skratiti kako bi se oslobodio sadržaj stanice. Specifični kontaminirajući spojevi kao što su fenoli i niz proteinaza mogu dovesti do razgradnje ili modifikacije proteina. Stoga su potrebni specifični uvjeti za ekstrakciju i pročišćavanje proteina iz biljke [38].

Tehnike mehaničkog prekida, kao što su French Press ili staklene kuglice, koriste se za uklanjanje stanične stijenke, nakon čega slijedi ekstrakcija ukupnog proteina temeljena na deterdžentu [39].

3.2.1. Ionska izmjenjivačka kromatografija

Ionska izmjenjivačka kromatografija razdvaja proteine ​​na temelju njihovog površinskog ionskog naboja pomoću smole koje su modificirane bilo pozitivno nabijenim ili negativno nabijenim kemijskim skupinama [4, 7]. Većina proteina ima ukupni negativan ili pozitivan naboj ovisno o njihovoj izoelektričnoj točki (pI) pri danom pH, što im omogućuje interakciju s suprotno nabijenom kromatografskom matricom [7]. Ako je neto naboj proteina pozitivan pri pH ispod vrijednosti pI, protein će se vezati na kationski izmjenjivač pri pH iznad vrijednosti pI, neto naboj proteina je negativan i protein će se vezati na anionski izmjenjivač [38 ].

Proteini koji slabo komuniciraju sa smolama, na primjer slab pozitivno nabijeni protein prebačen preko smole modificirane negativno nabijenom skupinom, eluiraju se u puferu s malo soli. S druge strane, proteini koji snažno djeluju zahtijevali su više soli za eluiranje. Proteini s vrlo sličnim karakteristikama naboja mogu se razdvojiti u različite frakcije jer se eluiraju iz kolone povećanjem koncentracije soli u puferu za eluiranje [7].

Kolona za ionsku izmjenu jedna je od tehnologija koja koristi princip kromatografije ionske izmjene [33]. Koristi tehnologiju koja upija membranu kao kromatografsku matricu za odvajanje proteina. Membranski apsorbenti u kolonama su stabilizirani na bazi celuloze s visoko poroznom strukturom koja omogućuje lak pristup proteinima nabijenoj površini. Interakcije između molekula i aktivnih mjesta na membrani dogodile su se u konvektivnim prolaznim porama. Stoga adsorpcijske membrane imaju potencijal za održavanje visoke učinkovitosti pri pročišćavanju velikih biomolekula s niskom difuzijom [33].

3.2.2. Gel filtracijska kromatografija

Gel filtracijska kromatografija, također nazvana kromatografija s isključenjem veličine ili kromatografijom gel permeacije, odvaja proteine ​​prema veličini i obliku molekula, a molekule se ne vežu na kromatografski medij [39]. To je proces u kojem velike molekule prolaze kroz stupac brže od malih molekula. Male molekule mogu ući u sve male rupice matrice i pristupiti većem dijelu stupca. Proteini male veličine proći će kroz te rupe i trebat će im više vremena da iscure iz stupca u usporedbi s proteinima velike veličine koji ne mogu ući u te rupe, ali izlaze izravno iz stupca kroz prazni prostor u stupcu [4, 7].

Komplet za gel filtracijsku kromatografiju primjenjuje princip gel filtracijske kromatografije [40]. Ciljani uzorak se nanosi na vrh stupca koji je sadržavao porozne kuglice, primjer matrice u koloni. Molekule se odvajaju kada molekule prođu kroz stupac poroznih kuglica. Razdvajanje molekula može se podijeliti u tri glavna tipa: totalno isključenje, selektivno prodiranje i granica ukupne permeacije. Potpuna isključenost je dio u kojem velike molekule ne mogu ući u pore i brzo eluirati. Za područje selektivne permeacije, međumolekule mogu ući u pore i mogu imati prosječno vrijeme zadržavanja u česticama ovisno o njihovoj veličini i obliku. Što se tiče granice ukupne permeacije, male molekule imaju najduže vrijeme zadržavanja nakon što uđu u pore na stupcu [40]. Prednost kromatografije temeljene na gel filtraciji je ta što je prikladna za biomolekule koje mogu biti osjetljive na promjene pH, koncentraciju metalnih iona i oštre uvjete okoline [39].

3.2.3. Afinitetna kromatografija

Afinitetna kromatografija ovisi o specifičnoj interakciji između proteina i čvrste faze koja utječe na odvajanje od onečišćenja. Sastoji se od istih koraka kao i kromatografija ionske izmjene [38]. Omogućuje pročišćavanje proteina na temelju njegove biološke funkcije ili pojedinačne kemijske strukture [41]. Proteini koji imaju visok afinitet prema specifičnim kemijskim skupinama kao što su ligandi kovalentno će se vezati i vezati na matriks stupca dok drugi proteini prolaze kroz kolonu [38]. Elektrostatske ili hidrofobne interakcije, van der Waalsove sile i vodikova veza biološke su interakcije između liganada i ciljnih proteina [41]. Vezani proteini će se eluirati iz kolone otopinom koja sadrži visoku koncentraciju topljivog oblika liganda [36].

Biospecifični ligand koji se može kovalentno vezati na matricu kromatografije jedan je od zahtjeva za uspješno afinitetno pročišćavanje. Vezivanje između molekula liganda i ciljnog proteina mora biti reverzibilno kako bi se omogućilo uklanjanje proteina u aktivnom obliku [41]. Nakon ispiranja kontaminanata, vezani ligand mora zadržati svoj specifični afinitet vezanja za ciljne proteine. Neki primjeri bioloških interakcija koji se obično koriste u afinitetnoj kromatografiji navedeni su u tablici 1 (vidi [41]).

Kromatografsko odvajanje diferencijalnim afinitetom na ligande imobilizirane na poroznoj smoli s zrncima temeljno je za istraživanje proteina [42]. Na tržište je uveden potpuni komplet koji sadrži kolone s afinitetnom smolom u pakiranju na bazi principa afinitetne kromatografije [42]. Afinitetna smola može se koristiti u šaržnom ili mikrocentrifugiranom spin stupcu ovisno o mjerilu i vrsti eksperimenta koji se treba provesti. Nadalje, može se pakirati i u neku vrstu većeg stupca gravitacijskog toka [42].

3.2.4. Gel elektroforeza

Gel elektroforeza je metoda odvajanja proteina prema njihovoj veličini i svojstvima naboja. Djelomično pročišćeni protein iz odvajanja kromatografijom može se dalje pročistiti elektroforezom u nedenaturirajućem poliakrilamidnom gelu (PAGE) ili nativnom gel elektroforezom [4]. U PAGE, proteini se pokreću primijenjenom strujom kroz gelirani matriks [43]. Kretanje proteina kroz ovaj gel ovisi o gustoći naboja (naboj po jedinici mase) molekula. Molekule s nabojem visoke gustoće brzo migriraju. Veličina i oblik proteina su još dva važna čimbenika koji utječu na frakcioniranje PAGE [43]. Veličina pora akrilamida igra ulogu molekularnog sita za odvajanje različitih veličina proteina [4]. Što je protein veći, sporije migrira jer se više zapliće u gel [43]. Oblik je također jedan od čimbenika jer se kompaktni globularni proteini kreću brže od duguljastih vlaknastih proteina usporedive molekularne mase [43].

PAGE se obično provodi u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata (SDS) [44]. Protein tretiran SDS-om obično će eliminirati sekundarnu, tercijarnu i kvartarnu strukturu proteina [4, 7]. Proteini se razvijaju u sličan štapićasti oblik zbog elektrostatičkog odbijanja između vezanih SDS molekula. Broj SDS molekula koje se vežu na protein približno je proporcionalan molekularnoj masi proteina (oko 1,4 g SDS/g proteina) [43]. Svaka vrsta proteina ima ekvivalentnu gustoću naboja i prolazi kroz gel s istom silom [43]. Osim toga, PAGE može minimizirati denaturaciju proteina. Mnogi proteini i dalje zadržavaju svoje biološke aktivnosti nakon pokretanja PAGE [7]. Međutim, veći se proteini zadržavaju u većem stupnju od manjih proteina jer je poliakrilamid visoko umrežen [43]. Posljedično, proteini se odvajaju pomoću SDS-PAGE na temelju njihove molekularne mase. SDS-PAGE se može koristiti za određivanje molekularne mase mješavine proteina uspoređivanjem položaja traka s onima koje proizvode proteini poznate veličine [43]. SDS koji se koristi u elektroforezi razrjeđuje mješavinu proteina prema duljini pojedinačnih polipeptidnih lanaca [7].

Tehniku ​​nazvanu dvodimenzionalna gel elektroforeza razvio je Patrick O’Farrell 1975. godine. Koristi se za frakcioniranje složenih smjesa proteina pomoću dvije različite tehnike – izoelektričnog fokusiranja i SDS-PAGE [43]. Prvo, proteini se odvajaju prema njihovoj izoelektričnoj točki u cjevastom gelu. Nakon ovog odvajanja, gel se uklanja i stavlja na vrh ploče od poliakrilamida zasićenog SDS-om. Proteini se kreću u pločasti gel i odvajaju se prema njihovoj molekularnoj masi [43]. Dvodimenzionalna gel elektroforeza prikladna je za otkrivanje promjena u proteinima prisutnim u stanici u različitim uvjetima, u različitim fazama razvoja ili staničnog ciklusa, ili u različitim organizmima [43].

3.2.5. Southwestern Blotting (imunoblotting)

Southwestern blotting je metoda koja se koristi za izolaciju, identifikaciju i karakterizaciju proteina koji vežu DNA prema njihovoj sposobnosti vezanja na specifične oligonukleotidne sonde [44, 45]. Mnogi proteini koji vežu DNA u stanici moraju biti izolirani pojedinačno i okarakterizirani kako bi se definirala funkcija gena [44]. Ova metoda uključuje tri koraka. Prvo, ekstrakti nuklearnog proteina se odvajaju SDS-PAGE elektroforezom. Zatim se odvojeni proteini prenose u nitrocelulozni filter, poliviniliden difluorid (PVDF) ili kationsku najlonsku membranu [12]. Filter će se zatim inkubirati s oligonukleotidnim sondama za analizu adsorbiranih proteina [44, 45]. Međutim, ova tehnika je opterećena problemima kao što su potrebne velike količine nuklearnih proteina (obično 50-100 mg), razgradnja proteina tijekom izolacije, suočavanje s poteškoćama u postizanju učinkovitog elektroforetskog odvajanja i prijenosa širokog raspona molekularne veličine proteina [45] .

3.3. Sve-u-jednom ekstrakcija biomolekula

Općenito, tehnike ekstrakcije ili pročišćavanja ili kompleti dostupni na tržištu mogu dopustiti samo ekstrakciju jedne vrste nukleinske kiseline, bilo DNA ili RNA, ili proteina iz ciljanog organizma. Kada je stanični materijal ograničavajući, poželjno je ekstrahirati DNK, RNA i protein iz istog izvora.

Varijacija metode izolacije u jednom koraku Chomczynskog i Sacchija (1987.), da se homogenat gvanidinijevog tiicianata ekstrahira s fenolom:kloroformom pri smanjenom pH, omogućuje pripremu DNA, RNA i proteina iz tkiva ili stanica. Ova metoda uključuje lizu stanica gvanidin izotiocijanatom i fenolom u jednofaznoj otopini. Druga faza nastaje nakon dodavanja kloroforma gdje se ekstrahiraju DNA i proteini, ostavljajući RNA u vodenom supernatantu. DNA i proteini se mogu izolirati iz organske faze precipitacijom s etanolom ili izopropanolom, a RNA precipitirana iz vodene faze s izopropanolom [15].

Danas je na tržištu predstavljeno nekoliko kompleta za ekstrakciju sve u jednom. Na primjer, komplet za ekstrakciju na stupcu koji je dizajniran za pročišćavanje genomske DNA, ukupne RNA i ukupnog proteina iz jednog biološkog uzorka istovremeno, bez upotrebe otrovnih tvari kao što su fenol ili kloroform i precipitacija alkohola [46].Kompatibilan je s malim količinama širokog spektra kultiviranih stanica i prikupljenih tkiva životinjskog i ljudskog podrijetla. Ciljani uzorak nije potrebno odvajati na 3 dijela prije pročišćavanja DNA, RNA i proteina [46].

Komplet za ekstrakciju 3-u-1 koji se temelji na otopini koji je dostupan na tržištu još je jedan primjer kompleta neorganskih otopina koji može ekstrahirati i pročistiti DNK, RNA i proteine ​​iz različitih organizama bilo koje vrste i veličine [47]. Njegov protokol u tri jednostavna koraka, koji traje oko 15 do 30 minuta, pruža brz i jednostavan način za ekstrakciju različitih biomolekula. Stoga se može očekivati ​​veći prinos jer manje koraka dovodi do manjeg gubitka [47].

3.4. Automatizirani sustav ekstrakcije

Automatizirani sustav ekstrakcije, velika, skupa i složena instrumentacija dizajnirana za obradu uzoraka visoke propusnosti, pomogla je pojednostaviti izolaciju nukleinskih kiselina [48]. Ovaj je sustav dizajniran za srednje do velike laboratorije čija je prisutnost tijekom posljednjih godina porasla [49]. Automatizacija procesa ekstrakcije nukleinske kiseline potencijalno je korisna iz niza razloga, uključujući smanjenje radnog vremena, smanjenje troškova rada, povećanje sigurnosti radnika i usred toga pruža priliku za povećanje ponovljivosti i kvalitete rezultata [50]. Osim toga, to je ključno rješenje za povećanje učinkovitosti laboratorija [48].

U kliničkim laboratorijima, pročišćavanje visokokvalitetnih biomolekula poput DNA, RNA i proteina iz raznih početnih materijala koristit će se u daljnjim aplikacijama ispitivanja. Ključno je dobiti pročišćene uzorke dovoljne kvalitete i čistoće [48]. Stoga bi automatizirane ekstrakcije trebale biti dosljednije i ponovljive. Brzina, točnost i pouzdanost cijelog procesa ekstrakcije trebaju biti maksimalne i istodobno minimizirati rizik od unakrsne kontaminacije [49]. Potrebno je uvesti rješenje za povećanje učinkovitosti pripreme uzoraka bez žrtvovanja kvalitete. Treba smanjiti mogućnost unakrsne kontaminacije i sustavi su podložni praćenju uzoraka s crtičnim kodom [51].

Sustav za ekstrakciju koji je dostupan na tržištu zadovoljio je gore navedene zahtjeve. Nudi forenzičkim laboratorijima brzu i pouzdanu obradu uzoraka zajedno s visokokvalitetnim automatiziranim pročišćavanjem DNK [52]. To je sustav za rukovanje paramagnetskim česticama za obradu uzorka i osiguravanje dosljednog prinosa i čistoće budući da nema uočljive unakrsne kontaminacije između uzoraka. Cijeli proces ekstrakcije traje oko 20 minuta od početka do kraja jer su potrebna samo tri jednostavna koraka: dodajte tekuće uzorke u uložak s reagensom stavite patrone s reagensom u stroj pritisnite gumb Start. DNA se eluira u pufer za eluiranje na kraju procesa [52].

Uveden je još jedan primjer automatiziranog sustava koji je fleksibilan i učinkovit za ekstrakciju nukleinskih kiselina i proteina [53]. Pomoću ovog sustava, koji je dizajniran za male i srednje količine uzoraka, mogu se obraditi različiti početni materijali. Koristio je površinski funkcionalizirane paramagnetske čestice za adsorpciju izolirane nukleinske kiseline [53]. Fleksibilnost ovog sustava omogućuje ekstrakciju nukleinske kiseline iz do dvanaest uzoraka istovremeno. Proces ekstrakcije traje oko 20 do 40 minuta, ovisno o primjeni. Kompleti koji su optimizirani za ovaj sustav mogu izdvojiti genomsku DNK, staničnu RNA, virusne ili bakterijske nukleinske kiseline [53].

4. Mogući budući smjer

Ekstrakcija biomolekula je prvi korak koji je potrebno izvesti za sljedeću analizu ili proces manipulacije. Zahtjev za rukovanje tekućinom je najizazovniji aspekt. Stoga svaki automatski sustav mora uključivati ​​ne samo automatsku opremu za svaki korak ekstrakcije, već i opremu za automatizaciju prijenosa tekućine između strojeva. Automatizacija je pomogla u povećanju propusnosti i poboljšanju pouzdanosti procesa, ali su ti sustavi još uvijek dizajnirani za korištenje samo u laboratorijskom okruženju. Neki od sustava za ekstrakciju nukleinske kiseline koji su dostupni na tržištu su veliki i zahtijevaju ručnu prethodnu obradu od strane laboratorijskog osoblja s tehničkom stručnošću [54]. Stoga bi robotske radne stanice za ekstrakciju nukleinske kiseline trebale ispuniti istinsku automatizaciju „odlaska“, što znači potpuno automatizirani proces [49]. Kombinacija sveobuhvatne otopine za ekstrakciju biomolekula i metode s potpuno automatiziranim sustavom ekstrakcije može biti potencijalni izum u budućnosti. Pročišćavanje DNA, RNA ili proteina iz različitih organizama može se izvesti istovremeno korištenjem ovog tipa ekstrakcijskog sustava samo jednom metodom ekstrakcije.

Često je nezgodno da se uzorak ciljanih biomolekula iz životinje, biljke ili čak klinički uzorak mora poslati u laboratorij kako bi se ekstrahirao i analizirao [54]. Uzorke, posebno kliničke uzorke kao što je krv, potrebno je ohladiti i prenijeti u najbliži laboratorij na ekstrakciju i analizu. Stoga prijenosni sustav za ekstrakciju biomolekula, koji donosi nekoliko prednosti kao što su smanjena radna snaga, smanjeni otpad i povećana brzina procesa ekstrakcije, može biti potencijalni razvoj u budućnosti [54]. Kombinacija prijenosnog sustava za ekstrakciju s DNA, RNA ili analizatorom proteina može se izgraditi u budućnosti kako bi se pomoglo istraživačima u smanjenju radnog vremena i povećanju radne učinkovitosti.

Kontinuirano poboljšanje minijaturizacije bit će budući trend robotske automatizacije u laboratoriju [28]. Mnogi klinički laboratoriji provode analizu tijeka rada i otkrivaju da su manji sustavi s nižom propusnošću u skladu s opterećenjem kliničkog laboratorija. Osim toga, ovaj se sustav automatizacije može implementirati uz relativno nisku cijenu, čime se poboljšava vrijeme obrade i također se smanjuju troškovi rada [55].

5. Zaključak

Budući da je prvu izolaciju DNK uspješno izvršio Friedrich Miescher 1869. godine, a početnu ekstrakciju DNK razvili su Meselson i Stahl iz strategija centrifugiranja s gradijentom gustoće 1958. godine, razvijene su mnoge tehnike za pročišćavanje biomolekula. Od ekstrakcije gvanidinijevim tiocijanat-fenol-kloroformom do tehnologije stupca koja se široko koristi u ekstrakciji DNA i RNA, i metode pročišćavanja kromatografijom do imunoblotinga koji se koristi za ekstrakciju proteina, ekstrakcija biomolekula pomogla je istraživačima i znanstvenicima u manipuliranju naknadnom analizom molekularne biologije kako bi kako bi bolje razumjeli biološke materijale zemlje.

Automatizirani sustav za ekstrakciju nukleinskih kiselina razvijen je pod utjecajem brzog razvoja tehnologije automatizacije današnjice. Automatizacija procesa ekstrakcije nukleinske kiseline potencijalno je korisna iz više razloga, uključujući smanjenje radnog vremena, smanjenje troškova rada, povećanje sigurnosti radnika i istovremeno pruža priliku za povećanje ponovljivosti i kvalitete rezultata. Međutim, potrebno je stalno raditi na poboljšanju slabosti nekih od instrumenata. U međuvremenu, sustav za ekstrakciju biomolekula "sve u jednom" ili izum minijaturnog i prijenosnog sustava za ekstrakciju mogu postati perspektivni razvoj u budućnosti.

Reference

  1. M. Wink, Uvod u molekularnu biotehnologiju: molekularne osnove, metode i primjena u modernoj biotehnologiji, Wiley-VCH, Weinheim, Njemačka, 2006.
  2. K. Doyle, Izvor otkrića: Vodič za protokole i aplikacije, PROMEGA, Madison, Wis, SAD, 1996.
  3. L. Buckingham i M. L. nedostaci, Molekularna dijagnostika: osnove, metode, & kliničke primjene, F.A. Davis, Philadelphia, Pa, SAD, 2007.
  4. L. J. Cseke, P. B. Kaufman, G. K. Podila i C.-J. Tsai, Priručnik za molekularne i stanične metode u biologiji i medicini, CRC Press, Boca Raton, Fla, SAD, 2. izdanje, 2004.
  5. G. Brooks, Biotehnologija u zdravstvu: Uvod u biofarmaceutike, Pharmaceutical Press, London, UK, 1998.
  6. K. Kojima i S. Ozawa, “Metoda za izolaciju i pročišćavanje nukleinskih kiselina”, patent Sjedinjenih Država US 2002/0192667 A1, prosinac 2002. Pogled na: Google Scholar
  7. J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Lecine i R. Losick, Molekularna biologija gena, Benjamin Cummings, San Francisco, Kalifornija, SAD, 5. izdanje, 2004.
  8. R. Dahm, Friedrich Miescher i otkriće DNK, Elsevier, Amsterdam, Nizozemska, 2004.
  9. D. Whitford, Proteini: struktura i funkcija, John Wiley & Sons, London, UK, 2005.
  10. J. T. Edsall, “Edwin Joseph Cohn (1892�)” u Biografski memoari, sv. 35, str. 47–83, Nacionalna akademija znanosti, Washington, DC, SAD, 1961. Pogled na: Google Scholar
  11. S. V. Smarason i A. V. Smith, “Metoda za odslađivanje nukleinskih kiselina”, patent Sjedinjenih Država US 2003/0186247 A1, deCODE genetics ehf., listopad 2003. Pogledajte na: Google Scholar
  12. J. Sambrook i D. Russel, Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik, sv. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, SAD, 3. izdanje, 2001.
  13. P. Chomczynski i N. Sacchi, “Metoda izolacije RNA u jednom koraku ekstrakcijom kiselog gvanidinij tiocijanat-fenol-kloroform: dvadeset i nešto godina kasnije,” Protokoli prirode, sv. 1, br. 2, str. 581–585, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  14. H. C. Birnboim i J. Doly, “Postupak brze alkalne ekstrakcije za probir rekombinantne plazmidne DNA,” Istraživanje nukleinskih kiselina, sv. 7, br. 6, str. 1513–1523, 1979. Pogled na: Google Scholar
  15. J. Sambrook i D. Russel, Molekularno kloniranje: laboratorijski priručnik, sv. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, SAD, 3. izdanje, 2001.
  16. K.-H. Esser, W. H. Marx i T. Lisowsky, “Matriks bez nukleinske kiseline: regeneracija stupaca koji se vezuju za DNK,” Biotehnike, sv. 39, br. 2, str. 270–271, 2005. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  17. D. T. Gjerse, L. Hoang i D. Hornby, Pročišćavanje i analiza RNA: priprema uzoraka, ekstrakcija, kromatografija, Wiley-VCH, Weinheim, Njemačka, 1. izdanje, 2009.
  18. CE Smith, DL Holmes, DJ Simpson, J. Kayzhendler, RH Bitner i JC Groseh, “Mješovita čvrsta faza i njena upotreba u izolaciji nukleinskih kiselina”, patent Sjedinjenih Država US 2002/0001812 A1, Promega Corporation, siječanj 2002. Pogled na: Google Scholar
  19. V. V. Padhye, C. York i A. Burkiewiez, “Pročišćavanje nukleinske kiseline na silikagelu i mješavini stakla”, patent Sjedinjenih Država US 5658548, Promega Corporation, kolovoz 1997. Pogledajte na: Google Scholar
  20. D. L. Woodard, A. J. Howard i J. A. Down, “Proces za pročišćavanje DNA na hidratiziranom silicij dioksidu”, patent Sjedinjenih Država US 5342931, Becton, Dickinson and Company, kolovoz 1994. Pogledaj na: Google Scholar
  21. K.-H. Esser, W. H. Marx i T. Lisowsky, “MaxXbond: prvi sustav regeneracije za matrice silicijevog dioksida koji vežu DNK,” Prirodne metode, sv. 3, br. 1, str. 1–2, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  22. Odjel za biologiju, Davidson College, “Geneclean ® ”, http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html. Pogledajte na: Google Scholar
  23. T. E. Arnold, M. T. Meyering i R. S. Chesterson, “Matriks za vezanje nukleinske kiseline”, patent Sjedinjenih Država US 6869532 B2, CUNO Incorporated, ožujak 2005. Pogledajte na: Google Scholar
  24. D. A. Dederich, G. Okwuonu, T. Garner i sur., “Pročišćavanje staklenih kuglica DNA predloška plazmida za visoko propusno sekvenciranje genoma sisavaca,” Istraživanje nukleinskih kiselina, sv. 30, br. 7, članak e32, 2002. Pogled na: Google Scholar
  25. M. C. Little, “Proces za pročišćavanje DNK na dijatomejskoj zemlji”, patent Sjedinjenih Država US 5075430, Bio-Rad Laboratories Inc., prosinac 1991. Pogledajte na: Google Scholar
  26. S. Berensmeier, “Magnetske čestice za odvajanje i pročišćavanje nukleinskih kiselina,” Primijenjena mikrobiologija i biotehnologija, sv. 73, br. 3, str. 495–504, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  27. R. D. Nargessi, “Magnetska izolacija i pročišćavanje nukleinskih kiselina”, patent Sjedinjenih Država US 6855499 B1, Cortex Biochem, Inc., veljača 2005. Pogledajte na: Google Scholar
  28. Bio-Nobile Oy, QuickPick TM plazmidna DNK, Bio-Nobile Oy, Turku, Findland, 2003.
  29. QIAGEN Inc., QAsymphony ® DNK priručnik, QIAGEN, Alameda, Kalifornija, SAD, 2008.
  30. Primijenjeni biosustavi, MagMAX TM komplet za izolaciju ukupne nukleinske kiseline, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD, 2008.
  31. Beckman Coulter, Inc., Agencourt ® AMPure ® Sustav: PCR sustav za pročišćavanje, Beckman Coulter, Chaska, Minn, SAD, 2009.
  32. BIOMOL GmbH, Korisnički priručnik za komplet za pročišćavanje mRNA ArrayGrade, BIOMOL GmbH, Hamburg, Njemačka, 2004.
  33. Thermo Scientific Inc., Pierce Strong ion Exchange Spin Columns, Thermo Scientific, New Hampshire, NH, SAD, 2007.
  34. QIAGEN Inc., QIAGEN Priručnik za genomsku DNK, QIAGEN, Valencia, Kalifornija, SAD, 2001.
  35. D. B. Selingson i E. J. Shrawder, “Metoda izolacije i pročišćavanja nukleinskih kiselina iz bioloških uzoraka”, patent Sjedinjenih Država US 4935342, Syngene Inc., lipanj 1990. Pogledajte na: Google Scholar
  36. QIAGEN Inc., Qproteome TM Priručnik za pripremu proteina sisavaca, QIAGEN, Valencia, Kalifornija, SAD, 2006.
  37. R. J. Fido, E. N. Mills, N. M. Rigby i P. R. Shewry, “Ekstrakcija proteina iz biljnih tkiva”, Metode u molekularnoj biologiji, sv. 244, str. 21–27, 2004. Pogled na: Google Scholar
  38. S. M. Wheelwright, Pročišćavanje proteina: dizajn i povećanje daljnje obrade, Carl Hanser, New York, NY, SAD, 1991.
  39. Laboratorij za istraživanje gena, Komplet pufera za filtriranje gela, Laboratorij za istraživanje gena, Taipei, Tajvan, 2007.
  40. Bangalore Genei, GeNei TM Priručnik za podučavanje kromatografije za gel filtraciju, Bangalore Genei, Bangalore, Indija, 2007.
  41. Amersham Biosciences, Načela i metode afinitetne kromatografije, Amersham Biosciences, Uppsala, Švedska, 2002.
  42. Thermo Scientific Inc., Spakirajte smolu Affinity Beaded u stupce, Thermo Scientific, New Hampshire, NH, SAD, 2008.
  43. G. Karp, Stanična i molekularna biologija: koncepti i oprema, John Wiley & Sons, London, UK, 5. izdanje, 2008.
  44. B. Bowen, J. Steinberg, U. K. Laemmli i H. Weintraub, “Detekcija DNA-vezujućih proteina blottingom proteina,” Istraživanje nukleinskih kiselina, sv. 8, br. 1, str. 1–20, 1980. Pogled na: Google Scholar
  45. J. S. Handen i H. F. Rosenberg, “Poboljšana metoda za jugozapadno blotiranje”, Granice u bioznanosti, sv. 2, str. 9–11, 1997. Pogled na: Google Scholar
  46. QIAGEN Inc., AllPrep ® DNA/RNA/Protein Mini priručnik, QIAGEN, Valencia, Kalifornija, SAD, 2007.
  47. “Tehnologija ekstrakcije DeRiPRO, DNA, RNA i proteina”, PCT/MY2008/000059, http://terra-ju.com/TLS.htm. Pogledajte na: Google Scholar
  48. Promega Corporation, Personal Automation TM za optimizaciju tijeka rada u kliničkom laboratoriju [pamflet], Promega, San Luis Obispo, Kalifornija, SAD, 2008.
  49. J. Loeffler, K. D. Schmidt, H. Hebart i H. Einsele, "Automatizirana ekstrakcija nukleinske kiseline", Enciklopedija genomike i proteomike, str. 93–96, 2004. Pogled na: Google Scholar
  50. J. Boyd, "Robotička laboratorijska automatizacija", Znanost, sv. 295, br. 5554, str. 517–518, 2002. Pogledaj na: Google Scholar
  51. G. Watkins, “Automatizirana ekstrakcija DNK”, http://www.ngrl.org.uk/Wessex/extraction.htm. Pogledajte na: Google Scholar
  52. Promega Corporation, Maxwell ® 16: Personal Automation TM iz Promege, Promega, San Luis Obispo, Kalifornija, SAD, 2006.
  53. Analytik Jena AG, Sustav za ekstrakciju InnuPure C12, Analytik Jena AG, Jena, Njemačka, 2007.
  54. D. Sadarangani, B. MacDonald, AG Rodrigo i D. Saul, “DNK analiza korištenjem prijenosnog robotskog instrumenta”, http://www.ele.auckland.ac.nz/~macdon/general/files/acra03- dsbmards.pdf. Pogledajte na: Google Scholar
  55. A. Thomsin, “Insights into lab automation's future”, IVD Technology, siječanj 2007. Pogledajte na: Google Scholar

Autorsko pravo

Autorska prava © 2009. Siun Chee Tan i Beow Chin Yiap. Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod licencom Creative Commons Attribution License, koja dopušta neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorno djelo ispravno citirano.


Priznanja

Ovaj rad je podržan od strane Sveučilišta Queensland i postdiplomske stipendije Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation. Autori bi željeli zahvaliti Davidu Leeju sa Sveučilišta Sunshine Coast i Odjelu za poljoprivredu, ribarstvo i šumarstvo Queenslanda (QDAFF) za pružanje Corymbia materijal lista za ekstrakciju koji daje korisne komentare za rukopis i Jason Lupoi iz Joint BioEnergy Institute za njegove komentare. Zahvaljujemo prof. Darrenu Craynu iz Australian Tropical Herbarium na opskrbi C. brassii listova, Myrna Constantin za digestiju endonukleaze, te Joint Genome Institute i Australian Genome Research Facility za pripremu knjižnice i sekvenciranje uzoraka.


Različite vrste kontaminacije, uzroci i prevencija za farmaceutsku industriju

Prisutnost neželjenih materijala kao što su prašina i čestice tijekom vremena proizvodnje i transporta naziva se kontaminacija. Pojam kontaminanti uključuje sve neželjene tvari koje se nalaze u proizvodu. Ti zagađivači utječu na kvalitetu proizvoda ili procesa.

Najčešći tipovi zagađivača uključuju:

  1. Fizička kontaminacija. Primjeri: vlaknasti materijal, čestice, strugotine iz alata za prešu za tablete.
  2. Kemijska kontaminacija. Primjeri: para, plinovi, vlaga, molekule.
  3. Biološka kontaminacija. Primjeri: gljivice, bakterije, virusi.

Unakrsna kontaminacija je moguća kada se neželjena tvar unese ili prenese iz jednog procesa u drugi tijekom proizvodnje.

Curenje u držaču kontaminiralo bi proizvod u njemu, što bi bio primjer fizičke kontaminacije.

Za kemijsku kontaminaciju, primjer bi bio kada je proizvod pohranjen u spremniku koji je prethodno držao drugi proizvod, ali nije bio pravilno očišćen. Kemijski sastav preostalog proizvoda može dodati nečistoće u novi proizvod, uzrokujući njegovu kontaminaciju.

U slučaju biološke kontaminacije, bakterije mogu napredovati ako spremnik nije pravilno očišćen i osušen.Kontaminirani spremnik će tada utjecati na proizvod i tako se mikrobi mogu unijeti u šaržu.

Uzroci biološke kontaminacije:

  • Nehigijenska i nehigijenska praksa
  • Neprikladna radna odjeća
  • Korištenje kontaminiranih materijala i opreme
  • Otvorene rane ili lezije kod operatera
  • Operateri koji boluju od zaraznih bolesti

Prevencija kontaminacije:

  • Utvrdite uzrok kontaminacije
  • Predvidite učinak
  • Spriječite svaki ulazak i izlazak
  • Smanjite posljedice i zatvorite područje
  • Kontrolirajte preostalu kontaminaciju
  • Uklonite izvorni materijal
  • Za uklanjanje nosača zagađivača:
    • Smanjite ljudsku uključenost
    • Regulirati korištenje opreme
    • Regulirajte korištenje zraka
    • Regulirati korištenje vode
    • Pobrinite se da nosite odgovarajuću odjeću kada dolazite i odlazite iz proizvodnog prostora
    • Kako je voda izvor broj jedan za unakrsnu kontaminaciju, važno je smanjiti i spriječiti kontaminaciju vode
    • Zagađivači koji se prenose vodom: čestice (kao što su minerali) i patogeni (npr. coli, salmonela, itd.
    • Korištenje preventivnih mjera kao što su uređaji za filtriranje, destilacija ili reverzna osmoza, UV tretmani
      • Kontrolirajte protok zraka kroz AHU
      • Korištenje zračnih brava
      • Ugradnja HEPA filtera
      • Ultra-niska količina čestica zraka

      Savjeti za sprječavanje kontaminacije

      • Testirajte jedan po jedan materijal kako biste spriječili unakrsnu kontaminaciju
      • Uzmite uzorak u prostoriji koja ima prikladan sustav kontrole zraka kako bi se spriječila kontaminacija kroz protok zraka
      • Koristite odgovarajuće alate dizajnirane za proizvod
      • Osigurajte pravilno čišćenje opreme kako biste spriječili bilo kakvo biološko onečišćenje
      • Redovito provjeravajte je li postupak čišćenja učinkovit
      • Redovito provjeravajte istrošenost opreme kako biste spriječili narušavanje njezina integriteta
      • Pravilno projektirajte sustav protoka zraka kako biste spriječili kontaminaciju protoka zraka
      • Postaje za točenje trebaju imati ispravan sustav za usisavanje prašine
      • Ne vraćajte korištene uzorke u originalne spremnike
      • Redovito kontrolirajte vodu kako biste provjerili prisutnost mikrobnog sustava
      • Izbjegavajte punjenje dva materijala istovremeno
      • Izbjegavajte istovar različitih materijala za različite serije
      • Prilikom zamjene proizvoda potrebno je paziti na razmak linije
      • Ukupna nečistoća ne smije biti veća od 0,5%, a pojedinačna nečistoća ne više od 0,1%

      Mi u LFA Tablet Presses ne prodajemo samo preše za tablete. Također podržavamo naše klijente u pokretanju njihovog poslovanja. Kontaminacija može biti stvarno veliki problem u prehrambenoj, farmaceutskoj i kemijskoj industriji. Ako trebate pomoć u smanjenju kontaminacije, kontaktirajte nas.


      Ukratko – Etanol ili izopropanol?

      Koristite etanol ako:

      1. Imate prostora da stavite dvije količine etanola za uzorkovanje u svoju epruvetu.
      2. Uzorak se mora čuvati dulje vrijeme i ohladit će se.
      3. Morate istaložiti vrlo male fragmente DNK.

      Koristite izopropanol ako:

      1. Volumen vašeg uzorka je velik i u epruvetu možete staviti samo 1 volumen otapala.
      2. Potrebne su vam vrste velike molekularne težine.
      3. Koncentracija DNK u vašem uzorku je niska.
      4. U žurbi ste i želite ubrzati taloženje nukleinskih kiselina na sobnoj temperaturi.

      Korak po korak vodič za alkalnu lizu

      Korak 1: Rast stanica i prikupljanje

      Počinjete s rastom bakterijske stanične kulture u kojoj se nalazi vaš plazmid. Kada se postigne dovoljan rast, stanice se peletiraju centrifugiranjem kako bi se uklonile iz medija za rast.

      Korak 2: Resuspenzija

      Pelet se zatim resuspendira u otopinu (obično se zove otopina 1 ili slično u kompletima) koja sadrži Tris, EDTA, glukozu i RNAzu A.

      Dvovalentni kationi (Mg 2+, Ca 2+) neophodni su za aktivnost DNaze i integritet bakterijske stanične stijenke.

      EDTA kelira dvovalentne katione u otopini sprječavajući DNaze da oštete plazmid i također pomaže destabiliziranjem stanične stijenke.

      Glukoza održava osmotski tlak tako da stanice ne pucaju, a RNaza A je uključena u razgradnju stanične RNA kada se stanice liziraju.

      Korak 3: Alkalna liza

      Pufer za lizu (aka otopina 2) sadrži natrijev hidroksid (NaOH) i deterdžent natrijev dodecil (lauril) sulfat (SDS).

      SDS otapa staničnu membranu.

      NaOH pomaže u razbijanju stanične stijenke, ali što je još važnije, remeti vodikovu vezu između baza DNA, pretvarajući dvolančanu DNK (dsDNA) u stanici, uključujući genomsku DNA (gDNA) i vaš plazmid, u jednostruku ulančana DNK (ssDNA).

      Taj se proces naziva denaturacija i središnji je dio postupka, zbog čega se naziva alkalna liza.

      SDS također denaturira većinu proteina u stanicama, što pomaže pri odvajanju proteina od plazmida kasnije u procesu.

      Važno je tijekom ovog koraka osigurati da su puferi za ponovnu suspenziju i lizu dobro izmiješani, iako ne previše snažno (vidi dolje). Pogledajte moj povezani članak o 5 savjeta o pripremi vektora za kloniranje gena za više informacija i savjeta. Također, zapamtite da su SDS i NaOH prilično gadni pa je preporučljivo nositi rukavice i zaštitu za oči kada provodite alkalnu lizu.

      Korak 4: Neutralizacija

      Dodatak kalijevog acetata (otopina 3) smanjuje lužnatost smjese. U tim uvjetima vodikova veza između baza jednolančane DNA može se ponovno uspostaviti, tako da se ssDNA može preobraziti u dsDNA. Ovo je selektivni dio.

      Iako je maloj kružnoj plazmidnoj DNK lako ponovno nastati, nemoguće je pravilno zapaliti te ogromne dijelove gDNA. To je razlog zašto je važno biti nježan tijekom koraka lize jer će snažno miješanje ili vorteksiranje posjeći gDNA stvarajući kraće dijelove koji limenka ponovno žarite i kontaminirajte svoj plazmid preparat.

      Dok se dvolančani plazmid može lako otopiti u otopini, jednolančana genomska DNA, SDS i denaturirani stanični proteini se lijepe zajedno kroz hidrofobne interakcije i tvore bijeli talog. Precipitat se može lako odvojiti od otopine plazmidne DNA centrifugiranjem.

      Korak 5: Čišćenje i koncentracija

      Sada je vaša plazmidna DNA odvojena od većine staničnih ostataka, ali se nalazi u otopini koja sadrži puno soli, EDTA, RNaze i zaostalih staničnih proteina i ostataka, tako da nema puno koristi za daljnje primjene. Sljedeći korak je čišćenje otopine i koncentriranje plazmidne DNA.

      Postoji nekoliko načina da se to učini, uključujući ekstrakciju fenolom/kloroformom nakon čega slijedi taloženje etanolom i metode temeljene na afinitetnoj kromatografiji uz korištenje nosača koji se prvenstveno veže na plazmidnu DNA pod određenim uvjetima soli ili pH, ali ga oslobađa pod drugim uvjetima. Najčešće metode detaljno su opisane u članku o 5 načina čišćenja uzorka DNK.

      Dakle, koliko često koristite alkalnu lizu za svoje preparate za plazmid? Javite nam u odjeljku za komentare sve cool savjete i trikove koje koristite za postizanje boljih i bržih rezultata!


      Gledaj video: Očistite rernu za tren oka bez puno truda! Jednostavan trik vrijedan zlata (Svibanj 2022).