Informacija

Što je antitijelo koje pokreće funkciju?

Što je antitijelo koje pokreće funkciju?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Čitam rad u časopisu o učinku adhezijske molekule neuralnih stanica na razvoj neurona i u sažetku ovog rada naišao sam na sljedeće:

Autofosforilacija i aktivnost Pak1 pojačani su kada su izolirani češeri rasta inkubirani s antitijelima koja pokreću NCAM funkciju, koja oponašaju interakciju između NCAM i njegovih izvanstaničnih liganada.

U ovom radu, NCAM protein se aktivira kada je izložen NCAM funkciji koja pokreće antitijela. Razumijem da su antitijela molekule koje proizvodi imunološki sustav i vežu se na antigene. Međutim, nisam siguran kako bi inkubacija čunjeva rasta s antitijelima koja pokreću NCAM zapravo pokrenula/aktivirala sam NCAM protein.

Nije li svrha antitijela da se veže na antigen kako bi se moglo ukloniti iz tijela? Nisam siguran kako bi izlaganje antigena njegovo odgovarajuće antitijelo pokrenulo njegovu funkciju. Pročitao sam nekoliko drugih radova o molekulama adhezije neuralnih stanica u kojima su se antitijela koristila za aktiviranje njihove funkcije. Tražio sam antitijela koja pokreću funkciju na Googleu, ali nisam pronašao nikakve korisne rezultate u vezi s tim. Svaki uvid se cijeni.


Izraz "antitijela koja pokreću funkciju" nije standardna, ona su šire poznata kao umrežena antitijela. Kao što možda znate, antitijelo ima više "rukova", s regijom koja veže antigen ili Fab (Fkrhotina antigen binding) na kraju. IgG antitijela imaju 2 kraka, IgM može imati 10. Fab dio je općenito identičan na svim krakovima, iako ih je moguće izraditi drugačije. To omogućuje da se antitijelo veže na više antigena u isto vrijeme, privlačeći ih zajedno.

NCAM je homofilni vezni protein, s izvanstaničnom domenom koja se veže na druge NCAM molekule, kako na susjednim stanicama tako i na istoj stanici. To vezanje inducira strukturne promjene u intracelularnoj domeni što potiče vezanje i aktivaciju kinaza, proteina koji fosforiliraju (i time aktiviraju ili inhibiraju) druge proteine. To pokreće signalnu kaskadu koja inducira promjene u stanici, obično kontroliranjem aktivnosti transkripcijskih čimbenika u jezgri.

Receptori općenito nisu ravnomjerno raspoređeni po površini stanice, često postoje grupirani u membranske strukture poznate kao lipidne splavi. Kada su dovoljno blizu jedna drugoj, NCAM molekule mogu samostalno započeti svoje signalne kaskade, jer se aktiviraju adapterski proteini vezani ili regrutirani za unutarstanične domene - kinaze i njihovi supstrati također su u neposrednoj blizini. Kako bi se inducirala ova vrsta signalizacije u laboratoriju, stanice se mogu tretirati s umreženim antitijelima koja spajaju receptore. To zapravo pokreće funkciju receptora, započinjući njihovu nizvodnu signalizaciju.

Izvor


Antitijela mogu funkcionirati kao enzimi (vidi https://en.wikipedia.org/wiki/Abzyme).

Ako koristite pravo monoklonsko antitijelo, varijabilni kraj može biti pravog oblika za vezanje na mjesto koje spominjete.


Fiziologija

3. kontroliranje protoka iona kroz sekretorne i epitelne stanice i reguliranje volumena stanica.

EX: ionski kanali pod utjecajem napona - kada Na depolarizira staničnu membranu

ligand-zatvoreni kanali
1. otvaraju ili zatvaraju hormoni
2. drugi glasnici
3. neurotransmiteri

Ugljični dioksid, nusprodukt staničnog disanja, dovoljno je mali da se lako difundira iz stanice.

Zasićuje se, posredovano nositeljima, stereospecifičnost, konkurencija.

brže od puke difuzije

2. P - parcijalna razlika tlaka plina i obrnuto je proporcionalna debljini membrane

3. A - površina membrane. Veće je bolje

tekućina, otopljene otopljene tvari su zarobljene unutar vezikule, uzete IZVANJA

manji od fagocitoze
javlja se u gotovo svim stanicama
konstitutivni proces b/c događa se kontinuirano
nisu potrebni specifični podražaji
Na rubu membrane mogu se formirati obložene jame

kako stanica može preuzeti transferin (nosač željeza).

otrov difterije i neki virusi ulaze ovako

nakupljaju se u vezikuli.
odredište migriraju u lizosome unutar stanica. organele probave.
unose proteine, endoktitske vezikule i proteaze u lizosome koji ih usitnjavaju
način da to bude selektivno:

završeci aksona koriste egzocitozu . esterkolin unutar vezikula čeka. meskalna membrana za spajanje s lipidnim dvoslojem i spajanje preko . izaziva kontrakcije mišića.

Endokrinologija poput inzulina iz stanica gušterače. pohranjene unutar vezikule.

2. konstitutivni putevi - proteini sluzi stvoreni u endoplazmatskom retikulumu. traje cijelo vrijeme. potrebna stalna ljepljiva sluz. tako da se jednostavno uvijek događa. epitelne stanice trepavica ga uvlače unutra. respiratorne stanice to luče.

3. regulirani put – inzulin se oslobađa iz stanica gušterače nakon jela. ili oslobađanje neurotransmitera u sinapsama. posebno ga kontrolira.

kolagen dolazi za izgradnju ekstracelularnog matriksa. djeluju kao sidro poput vezivnog tkiva . ali se mogu oštetiti. oxidzaited . treba reciklirati. dakle endocitoza.

apsorbirajući Fe u GI, mora transportirati Fe kroz krvotok do koštane srži. nosi transferin. i receptor za transferin.

Pošaljite ga u lizosome i oni imaju nisku pH okolinu. transferin s površine i stapa se s lizosomom i pri niskom pH te mijenja oblik molekule transferina i oslobađa transferin gdje ga stanica može koristiti.
Npr.: transport imunoglobina

Mliječna žlijezda - napraviti mlijeko. Lumen. proizvodeći mlijeko, jedna molekula koja može ući u mlijeko su imunoglobini. važno za imunološki sustav. važna antitijela.

2. regulacija intracelularnim ligandima. npr.: ciklički nukleotidni kanali. Važno u srcu. "smiješni" kanali koji vežu cAMP iznutra.

tijelo ima "set Točku" za količinu Ca
mmmol/L je 1,0 je (nešto više) do 1,45 (nešto manje)

bubrežni kamenci, kalcifikacija sluznice krvnih žila, otvrdnuće arterija ako je previše Ca

mora znati kako to ispraviti i dobiti prave parametre.

pomažući tijelu da obavlja svoje normalne kontrolne funkcije kao ND.

za većinu kontrolnih procesa - u prostoriji ili u tijelu - kontrolira Ca - mora biti senzorski sustav koji ga može nadzirati.

Termometar to radi u učionici.
U ljudskom tijelu postoji Ca receptor - sp protein - veliki aa - koji se nalazi na površini nekih naših stanica.

Endokrina žlijezda - paratireoidna žlijezda - kontrolira razinu Ca u našoj krvi. Trebam receptor koji može otkriti koliko Ca uopće ima. Sjedi na stanicama paratireoidne žlijezde i stalno prati.
Ako se Ca počne smanjivati ​​- oslobađa se više PTH. Imp funkcionira na bubrezima.
regulira koliko Ca napušta vaše tijelo i izlučuje se mokraćom svaki dan.

Nizak NIZAK KALCIJA u vašoj krvi (prenizak i umrijet ćete) - ca receptor prepoznaje ovaj b/c Ca se ne veže za stanicu - ima džep u koji Ca može stati - PTH prolazi kroz krv i dolazi do bubrega i stvara bubrege drži se Ca. Suprotno ako imate previše. PTH je nizak i bubrezi puštaju Ca da napusti tijelo u urinu.

kako tijelo apsorbira Ca iz prehrambenih izvora.
Kalcitonin - enzim.
Vit D je imp za apsorpciju Ca


Uvod

Molekula stanične adhezije L1 (također nazvana L1CAM ili CD171), član superfamilije imunoglobulina molekula stanične adhezije, igra važnu ulogu u interakcijama stanica-stanica. U živčanom sustavu [1], [2] L1 je prvenstveno lokaliziran u aksonima i konusima rasta diferencirajućih neurona, podržava migraciju i preživljavanje neuralnih stanica te potiče izrastanje neurita, fascikulaciju aksona [3]–[9], mijelinizaciju i sinaptička plastičnost [10], [11]. Mutacije u genu L1 lokaliziranog na X kromosomu ozbiljno utječu na funkcije živčanog sustava kod oboljelih muškaraca, uključujući mentalne teškoće, afaziju, miksanje hoda i aducirane palčeve (MASA sindrom) [12]–[14]. Nadalje, mutacije u genu L1 također su povezane sa shizofrenijom i Hirschsprungovom bolešću [15]. Osim svojih funkcija u živčanom sustavu, L1 igra važnu ulogu u progresiji tumora i metastazama. L1 je izražen u širokom skupu tumora koji ne uključuje samo gastrointestinalni stromalni tumor, melanom, neuroblastom, Schwannoma, paragangliom, feokromocitom neuroepitelnog i neuralnog podrijetla [16], već i tumore ne-neuralnog podrijetla, kao što je tumor granularnih stanica , hondrosarkom i Kaposi sarkom, kapilarni hemangiom, limfoblastom i karcinomi jednjaka, debelog crijeva i jajnika [17], [18]. Zbog njegove ključne važnosti u popravljanju živčanog sustava i metastatskom ponašanju tumora, nastojali smo pronaći antitijela koja bi, reagirajući s različitim domenama ljudske L1 molekule, s jedne strane, pokrenula njegove korisne funkcije i , s druge strane, inhibiraju štetne funkcije molekule.


1. UVOD

Molekula stanične adhezije L1 (L1) igra važnu funkcionalnu ulogu u živčanom sustavu u razvoju i odraslom živčanom sustavu, što pokazuje njezino sudjelovanje u migraciji i preživljavanju neurona, izrastanju i fascikulaciji aksona, mijelinizaciji, sinaptičkoj plastičnosti, učenju i pamćenju kao i u regeneraciji nakon ozljeda. 1-5 Kod ljudi, L1 je povezan s neuralnim poremećajima, kao što su L1 i fetalni alkoholni sindromi, Hirschsprungova bolest, shizofrenija i Alzheimerova bolest. 1, 6-12 (prikaz, stručni).

Korisne funkcije L1 ovise o njegovom proteolitičkom cijepanju različitim proteazama, kao što su tripsin, 13 plazmin, 14, 15 pro-protein konvertaza PC5A, 16 neuropsin, 17 katepsin E, 18 članova obitelji ADAM (ad isintegrin i am etaloproteaza) , 19-24 β-sekretaza, 25 γ-sekretaza kompleks, 23, 24 i neobične proteaze Reelin, 26 i bazični protein mijelina. 5, 27

L1 molekula pune duljine od 200 kDa sastoji se od domena sličnih izvanstaničnom imunoglobulinu i fibronektinu tipa III, transmembranske domene i citoplazmatskog repa. Cijepanje posredovano bazičnim proteinom mijelina u izvanstaničnoj L1 domeni na Arg687 dovodi do stvaranja i nuklearnog uvoza sumoiliranog fragmenta od 70 kDa. 5, 27, 28 Katepsin E-posredovano cijepanje u intracelularnoj domeni na Asp1167 stvara sumoilirani nuklearni fragment od 30 kDa. 18, 28 Cijepanje unutar transmembranske domene kompleksom γ-sekretaze daje nuklearni fragment od 28 kDa koji je uključen u regulaciju nuklearne signalizacije i ekspresije gena. 23, 24 Nuklearni L1 također može biti važan za popravak DNK, budući da nuklearna translokacija unutarstanične L1 domene regulira odgovore kontrolne točke oštećenja DNK i radioosjetljivost glioma stanica sličnih matičnim stanicama. 29

Koristeći rekombinantnu intracelularnu L1 domenu za afinitetnu kromatografiju, identificirali smo potencijalne L1 vezne partnere u nuklearnom ekstraktu ranog postnatalnog mišjeg mozga: faktor spajanja bogat prolinom/glutaminom (SFPQ također poznat kao faktor povezivanja polipirimidinskog trakta ili PSF), ne -POU domena koja sadrži protein koji veže oktamer (NonO) (također poznat kao 54 kDa nuklearni RNA- i DNA-vezujući protein ili p54nrb), komponentu paraspeckle 1 (PSPC1), DNA topoizomerazu I, importin-β, metil-CpG-vezujući protein 2 (MeCP2), WD-repeat protein 5 (WDR5), heterogeni nuklearni ribonukleoproteini A1 (hnRNP-A1), A2/B1 (hnRNP-A2/B1) i A3 (hnRNP-A3), histon H1.4, nukleoporin 93 kDa (Nup93), srodni protein toplinskog šoka 71 kDa (Hsc70) i ​​sinaptotagmin 1. Provjerili smo izravnu interakciju između nuklearnih L1 fragmenata i proteina koji vežu RNA i DNA NonO, SFPQ i PSPC1 u Drosophila ponašanje/ljudsko spajanje (DBHS) i sugeriraju da fragmenti nuklearnog L1 doprinose procesuiranju i transportu RNA, transkripciji, strukturi kromatina i popravku DNA, čime utječu na ključne nuklearne funkcije u živčanom sustavu.


Regulacija razine adenozina u zdravom i malignom tkivu

Izvanstanični adenozin, nukleozid i derivat ATP-a, uključen je u regulaciju različitih fizioloških procesa uključujući vazodilataciju (4), reapsorpciju vode uzrokovanu bubrezima (5), percepciju boli (6) i fino podešavanje ciklusa spavanja i buđenja (7). Iako su razine ekstracelularnog adenozina u zdravim tkivima zanemarive (8�), nakon ozljede ovaj nukleozid se oštro nakuplja u intersticiju gdje snažno ograničava imunološke odgovore (12) i izravno potiče zacjeljivanje rana (13). U homeostatskim uvjetima u zdravim tkivima, citosolna koncentracija ATP-a kreće se od 1 do 10 mM (14), dok su njegove izvanstanične razine zanemarive (15). Međutim, ovaj oštar gradijent može se brzo prekinuti nakon puknuća plazma membrane uzrokovanih nekrozom, apoptozom ili mehaničkim stresom, kao i reguliranim izljevom ATP-a. Pokazalo se da se potonji, potaknut raznim podražajima, uključujući hipoksiju, ishemiju i upalu, u velikoj mjeri javlja preko egzocitoza, transmembranski prijenos kroz ATP-binding cassette (ABC) transportere, kao i difuzijom kroz različite anionske kanale ili neselektivne pore plazma membrane formirane od strane koneksina, paneksina-1 ili ATP receptora P2X7R (16�). Na primjer, stimulirane T stanice oslobađaju ATP kroz panneksin-1 hemi-kanale i preko egzocitoza (19, 20).

Jednom u ekstracelularnom prostoru, ATP prolazi kroz brzu postupnu defosforilaciju ekto-nukleotidazama (21, 22) uključujući E-NTPDazu CD39, koja pretvara ATP ili ADP u ADP odnosno AMP, i 5′-nukleotidazu CD73, koja deformira AMP na adenozin (18, 23) (slika 1). Dodatni enzimi čija ektoaktivnost doprinosi stvaranju ekstracelularnog adenozina su druge E-NTPDaze, članovi obitelji ekto-fosfodiesteraze/pirofosfataze (E-NPP), nikotinamid adenin dinukleotid (NAD +) glikofastatična kiselina (APP) , i alkalnu fosfatazu (ALP) (21) (slika 1). Ukratko, koenzim NAD +, još jedna ključna stanična komponenta čija ekstracelularna koncentracija značajno raste u ozlijeđenom tkivu (24, 25), pretvara se u adenozin difosfat ribozu (ADPR) pomoću NAD + glikohidrolaze CD38 (26), dok se ADPR kao i ATP metaboliziraju u AMP pomoću E-NPP CD203a (27). Štoviše, PAP, koji je pretežno, ali ne isključivo, izražen u tkivu prostate (28), sposoban je pretvoriti izvanstanični AMP u adenozin (29), dok ALP katalizira hidrolizu ATP, ADP i AMP u adenozin (21). Konačno, adenozin se također može proizvesti intracelularno bilo hidrolizom S-adenozilhomocisteina (SAH), metabolita puta transmetilacije, bilo zbog katabolizma AMP-a koji sudjeluje u topljivom CD73 posredovanom s CD73 hidrolazom (SAHH). više staničnih procesa i čija koncentracija raste unutar stanica niskog energetskog naboja (30) (slika 1). Unutarstanično generirani adenozin može se lučiti na difuzijski ograničen način putem dvosmjernih ekvilibracijskih nukleozidnih transportera (ENT) (31). Međutim, iako postoje dokazi koji upućuju na to da hipoksija može potaknuti unutarstaničnu proizvodnju adenozina (32, 33), doprinos ovog puta nastajanju intersticijalnog adenozina uzrokovanom ozljedama smatra se manjim zbog istodobne hipoksije inducirane regulacije gore spomenutih transportera (34, 35 ). S obzirom na njegove različite učinke, prisutnost adenozina u izvanstaničnom prostoru podliježe strogoj prostorno-vremenskoj kontroli (12, 13, 36). Na primjer, izvanstanično nakupljanje adenozina sprječava se njegovim prijenosom prema unutra kroz ENT-ove ili koncentrirane, simportere ovisne o natrijevom gradijentu (31), kao i funkcijom intra/ekstracelularne adenozin deaminaze (ADA) i citosolne adenozin kinaze (ADK) , koji pretvaraju adenozin u inozin ili AMP (37) (Slika 1).

Slika 1. Regulacija razine intersticijalnog adenozina u ozlijeđenom tkivu. Ekstracelularno nakupljanje ATP-a ili NAD + izazvano stresom potiče kataboličke putove koji stvaraju adenozin, kao što je onaj posredovan CD39 i CD73. Aktivnost drugih ekto-nukleotidaza, uključujući CD38, CD203a, ALP i PAP, također doprinosi ekstracelularnoj akumulaciji adenozina. Adenozin se također može proizvesti intracelularno hidrolizom SAH-a izazvanom SAHH, kao i topljivim CD73 posredovanim katabolizmom AMP, a ENT-ovi ga mogu izvoziti na način ograničen difuzijom. S druge strane, kombinacija aktivnosti ADA-vezane na CD26 i staničnog unosa adenozina, bilo kroz ravnotežne ENT-ove ili preko koncentriranih CNT-ova, ograničava razine intersticijskog adenozina. Intracelularno, adenozin se može eliminirati putem njegove pretvorbe u SAH pomoću SAHH, u AMP pomoću ADK ili u inozin pomoću ADA. SAHH, S-adenozilhomocistein hidrolaza SAH, S-adenozilhomocistein ENTs, ekvilibracijski nukleozidni transporteri CNT, koncentrirani nukleozidni transporteri ADK, adenozin kinaza ADA, adenozin deaminaza.

Za razliku od homeostatskih stanja, razine ATP-a su visoko povišene u TME kao rezultat nekroze, apoptoze, hipoksije i trajne upale (17, 18), a intratumorske razine adenozina mogu doseći mikromolarne koncentracije (9, 10, 38) . Katabolizam ATP-a u tumorima primarno je posredovan CD39 i CD73 (39�), a visoka ekspresija ovih ekto-nukleotidaza snažno je povezana s lošim kliničkim ishodom za pacijente koji pate od raznih vrsta raka (3, 42, 43). Konkretno, otkrivena je (prekomerna) ekspresija CD39 i/ili CD73 na površini tumorskih stanica (39, 44�), fibroblasta povezanih s rakom (CAF) (52�), mezenhimalnih matičnih stanica i stromalnih stanica (55& #x0201357), endotelne stanice (EC) (45, 46, 51), mijeloidne supresorske stanice (MDSC) (58�), makrofagi povezani s tumorom (TAM) (53, 61), Tregs (46, 62Р) , Th17 stanica (65) i konvencionalnih CD4 + i CD8 + T stanica s iskustvom/iscrpljenim antigenom (64, 66�). Osim toga, egzosomi koji nose CD39/CD73 (69, 70), koje oslobađaju tumorske stanice (71), Tregs (72) i MDSC (57, 73) dodatno pridonose stvaranju adenozina. Trenutno se hipoksija, kao i neprestana upala, smatraju glavnim pokretačima intratumoralne prekomjerne ekspresije CD39 i CD73. Naime, hipoksijom inducirana (74, 75) aktivnost HIF1α (76�) i Sp1 (80) potiče ekspresiju ovih ekto-nukleotidaza. Na istoj liniji, signalni putevi pokrenuti molekulama povezanim s upalom, kao što su IL-2 (81), IL-6 (66, 82), IL-1β (83), TNFα (83�), IFN tipa I (86, 87), IL-27 (66, 88), TGFβ (82, 89, 90) kao i induktorima Wnt (91, 92) ili cAMP (83, 93�) signalni putovi također povećavaju razine CD39 (66, 81, 82, 88, 89, 95) i CD73 (81�, 89�).

Iako se smatra da katabolizam izvanstaničnog ATP-a posredovan CD39 i CD73 predstavlja najveći dio intratumoralnog stvaranja adenozina, razine ekspresije ekto-enzima koji sudjeluju u alternativnim putovima proizvodnje adenozina također rastu s pojavom raka. Na primjer, CD38 se često povećava unutar neoplastičnih tkiva (26, 96, 97), a sporadični dokazi sugeriraju da se razine CD203a također povećavaju na komponentama TME (98, 99). Na isti način, koncentracija PAP-a u serumu raste tijekom progresije raka prostate (100), dok drugi sugeriraju da se povećava i na kancerogenom tkivu (28). Konačno, nekoliko studija pokazalo je povišene razine ALP na stanicama raka (101, 102) kao i korelaciju razine ALP u serumu i stadija bolesti (103�). Od ključne važnosti, relativni doprinos ovih alternativnih puteva koji proizvode adenozin intratumoralnom nakupljanju ovog nukleozida tek treba utvrditi. Konačno, zajedno s aberantnom proizvodnjom, neispravan unos koji je rezultat smanjenja ravnotežnih (106, 107) kao i koncentriranih (108�) nukleozidnih transportera, također potaknut hipoksijom (34, 35, 111), dodatno pridonosi adenoziranju akumulacija u TME.


Rezultati i rasprava

ILC1 su odsutni u miševa s nedostatkom NKp46

NKp46 nokaut (KO) model miša—u kojem Ncr1, gen koji kodira NKp46, zamijenjen je zelenim fluorescentnim proteinom (gfp) (Ncr1 gfp/gfp ) [5,7] — korišteno je u ovoj studiji. Razvoj ILC populacija procijenjen je u različitim organima i tkivima u usporedbi s divljim tipom (WT) (Ncr1 +/+ ), heterozigot (Ncr1 gfp/+ ), i KO (Ncr1 gfp/gfp ) miševi. Strategija ulaza za ILC1 protočnu citometrijsku analizu prikazana je na slici 1A. Uočena je jasna populacija NK1.1 + NKp46 ─ (više od 50%) unutar populacije NK1.1 + u jetri (S1A slika), u skladu s prethodnim studijama [8,9]. Intenzitet površinske ekspresije CD49a bio je veći u populaciji NK1.1 + NKp46 + CD49b ─ CD49a + ILC1 nego u populaciji NK1.1 + NKp46 ─ CD49b ─ CD49a +, a potonja populacija pokazala je fenotip CD3 ─/dim (S1 i S2 slike). Dadi i suradnici nedavno su definirali populaciju sličnu ILC1, nazvanu urođene T stanice tipa 1 receptora T stanica (TCR) s fenotipom NK1.1 + NKp46 ─ CD49a + [10]. Štoviše, NKp46 se smatra pouzdanim markerom za ILC1 i NK stanice [9-11]. Dakle, u trenutnoj studiji, podskup ILC1 definiran je kao NK1.1 + NKp46 + (ili GFP + za KO miševe) CD49b ─ CD49a + (slika 1A), što ne uključuje NK1.1 + NKp46 ─ CD49b ─ CD49a + stanovništvo. Bilo je iznenađujuće da se u usporedbi s Ncr1 +/+ legla, proporcionalno ILC1 podskupina (CD49b ─ CD49a + ) bila je gotovo potpuno odsutna u jetri Ncr1 gfp/gfp miševa i značajno je smanjen u jetri Ncr1 gfp/+ miševi (slika 1A, donja ploča slika 1B, gornja ploča S2 slika, gornja ploča), dok se čini da postotak populacije NK1.1 + NKp46 ─ (ili GFP ─ za KO miševe) CD49b ─ CD49a + nema različiti među Ncr1 gfp/gfp , Ncr1 +/gfp i Ncr1 +/+ grupe (S2 sl, donja ploča). Nadalje, kvantifikacija podskupine ILC1 pokazala je da je apsolutna količina stanica također drastično smanjena u jetri Ncr1 gfp/gfp miševa i umjereno smanjen u jetri od Ncr1 gfp/+ miševi u usporedbi s njihovim Ncr1 +/+ legla (slika 1B, donja ploča). Također smo koristili markere uključujući CD62L, Eomesodermin (Eomes) i T-box izražene u T stanicama (T-bet) kako bismo potvrdili naše zapažanje o ovisnosti o NKp46 za razvoj ILC1 uspoređivanjem Ncr1 gfp/gfp miševi i/ili Ncr1 +/gfp miševi na Ncr1 +/+ miševi (S3 i S4 slike). Razvoj ILC populacija također je procijenjen u drugim organima i tkivima koristeći jetru kao referentnu točku i uspoređujući rezultate u WT (Ncr1 +/+ ) miševi na Ncr1 gfp/gfp miševi (slike 1C i 1D). Kvantifikacija stanica protočnom citometrijom pokazala je da su ILC1 (CD49b ─ CD49a + ) bili gotovo potpuno odsutni u koštanoj srži (BM), slezeni i tankom crijevu (SI) Ncr1 gfp/gfp miševi (slika 1E). Nasuprot tome, apsolutni broj NK stanica, koje su glavna populacija koja eksprimira NKp46 u testiranim organima ili tkivima, nije se značajno promijenio u Ncr1 gfp/gfp miševi u usporedbi s njihovim Ncr1 +/+ legla, u skladu s prethodnim izvješćem [7] (slika 1E, donja ploča).

(A) Strategija gatinga za ILC1. ILC1 su stavljeni na limfocite, a zatim su dalje definirani kao Lin − NK1.1 + NKp46 + CD49b ─ CD49a +, s iznimkom da je GFP + korišten za zamjenu NKp46 + kada Ncr1 gfp/+ ili Ncr1 korišteni su gfp/gfp miševi. (B) Postoci ili količine ILC1 određene su protočnom citometrijskom analizom u jetri Ncr1 gfp/gfp , Ncr1 gfp/+ i Ncr1 +/+ miševi. (C) NK stanice su zatvorene na Lin ─ NK1.1 + NKp46 + (ili GFP + za Ncr1 gfp/gfp miševi)CD49b + CD49a ─ među limfocitima. ILC1 su stavljeni na Lin ─ NK1.1 + NKp46 + (ili GFP + za Ncr1 gfp/gfp miševi)CD49b ─ CD49a + među limfocitima. (D) Kvantifikacija ILC1 u različitim organima ili tkivima u Ncr1 gfp/gfp miševi i Ncr1 +/+ legla, tj. sažeti podaci za (C). Svaki red prikazuje postotke ILC1 za par Ncr1 gfp/gfp i Ncr1 +/+ legla. (E) Količine NK stanica ili ILC1 u različitim organima Ncr1 gfp/gfp miševi i njihovi Ncr1 +/+ drugovi u leglu (n = 4). Trake grešaka, standardne devijacije ***, str < 0,001 **, str < 0,01 *, str < 0,05. Numerički podaci za ploče B, D i E mogu se naći u S1 podacima. Lin ─ , CD3 ─ CD19 ─ BM, koštana srž FSC-A, područje raspršenja prema naprijed FSC-H, FSC visina FSC-W, FSC širina GFP, zeleni fluorescentni protein ILC1, urođena limfoidna stanica 1 NK, prirodni ubojica Ncr1, prirodni receptor citotoksičnosti 1 SI, tanko crijevo SSC-A, bočno područje raspršenja SSC-H, visina SSC SSC-W, širina SSC.

Ncr1 gfp/gfp miševima nedostaje ligand koji inducira apoptozu (TRAIL) + ILC1s

Ligand koji inducira apoptozu (TRAIL) je funkcionalni protein, selektivno eksprimiran na podskupini ILC1, koji igra bitnu ulogu u posredovanju citotoksičnosti ove populacije na ciljne stanice kroz pokretanje signalnog puta transduciranog receptorom smrti [12]. Ekspresija TRAIL-a i nedostatak ekspresije CD49b također se može koristiti za razlikovanje ILC1 od NK stanica [13] jer NK stanice u mirovanju kod WT miševa ne eksprimiraju TRAIL, dok ILC1 to čine (slika 2A, lijevo). U skladu s podacima prikazanim na Slici 1 u vezi s gotovo potpunim nedostatkom CD49a + CD49b ─ ILC1, TRAIL + CD49b ─ populacija NKp46 + (ili GFP + )NK1.1 + tipa I ILC jedva se mogla otkriti u jetri (Sl. 2A i 2B) i drugi organi (slika 2C) od Ncr1 gfp/gfp miševi u usporedbi s njihovim Ncr1 +/+ kontrole legla.

(A) Postoci TRAIL + ILC1 analizirani su protočnom citometrijskom analizom u jetri Ncr1 gfp/gfp miševi i njihovi Ncr1 +/+ drugovi u leglu. ILC1 su stavljeni na Lin ─ NK1.1 + NKp46 + (ili GFP + za Ncr1 gfp/gfp miševi) TRAIL + CD49b ─ među limfocitima. (B) Kvantifikacija TRAIL + ILC1 u jetri Ncr1 gfp/gfp miševi i njihovi Ncr1 +/+ drugovi u leglu za (A) (n = 5). (C) Kvantifikacija TRAIL + ILC1 u drugim organima (slezena, n = 5 BM, n = 5 SI, n = 4) od Ncr1 gfp/gfp miševi i njihovi Ncr1 +/+ legla. **, str < 0,01 *, str < 0,05. Numerički podaci za ploče B i C mogu se naći u S1 podacima. Lin ─ , CD3 ─ CD19 ─ BM, GFP koštane srži, zeleni fluorescentni protein ILC1, urođena limfoidna stanica 1 Ncr1, prirodni receptor citotoksičnosti 1 NK, prirodni ubojica SI, TRAIL tankog crijeva, ligand koji izaziva apoptozu povezan s faktorom tumorske nekroze.

Nedostatak NKp46 nema značajan štetni učinak na podskupine ILC2 i ILC3

Zbog našeg zapažanja da nedostatak NKp46 ograničava razvoj ILC1, zatim smo krenuli testirati je li se ovaj učinak pojavio i u drugim podskupovima ILC-a. Međutim, koristeći strategiju zatvaranja kao što je opisano na slici 3A, nismo primijetili značajnu razliku u količinama ili frekvencijama Lin ─ CD127 + Gata3 + ILC2 i Lin ─ CD127 + RORγt + ILC3 kada Ncr1 gfp/gfp miševi su uspoređeni s njihovim Ncr1 +/+ kontrole legla (slike 3B i 3C). Postojala je nedovoljna količina ILC1 stanica iz Ncr1 gfp/gfp miševi kako bi proučili kako ovaj nedostatak NKp46 utječe na funkciju(e) ILC1, međutim, primijetili smo da proizvodnja interferona γ (IFN-γ) od strane NK stanica kao odgovor na kostimulaciju s IL-12 i IL-18 nije promijenjena između stanica izoliranih iz Ncr1 gfp/gfp miševi u odnosu na one iz Ncr1 +/+ kontrole legla (slika 3D). Isto tako, proizvodnja IL-22 od strane ILC3 stanica izoliranih iz Ncr1 gfp/gfp miševi u odnosu na one iz Ncr1 +/+ kontrole legla nisu se značajno razlikovale (slika 3E). U skladu s našim rezultatima, Satoh-Takayama i kolege su prethodno pokazali da NKp46 nije potreban za obranu crijevnih urođenih imunoloških stanica u crijevima posredovane IL-22 Citrobacter rodentium [14]. Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da NKp46 ne kontrolira homeostazu ili proizvodnju ILC citokina ILC2, NK stanica ili ILC3, ali selektivno sudjeluje u regulaciji razvoja ILC1.

(A) Strategija gatinga za ILC2 i ILC3. ILC2 su bili stavljeni na CD45 + Lin ─ CD127 + Gata3 + , a ILC3 su bili ograničeni na CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt + . (B) Postoci ILC2 ili ILC3 analizirani su protočnom citometrijom u SI u Ncr1 gfp/gfp miševi i Ncr1 +/+ legla. ILC2 su stavljeni na CD45 + Lin ─ CD127 + Gata3 + RORγt ─ limfocite. ILC3 su stavljeni na CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt + Gata3 ─ limfocite. (C) Količine ILC2 ili ILC3 određene su u SI od Ncr1 gfp/gfp miševi i njihovi Ncr1 +/+ drugovi u leglu (n = 4). (D) Lin ─ (ili CD3 ─ CD19 ─ )NK1.1 + NKp46 + (ili GFP + za Ncr1 gfp/gfp miševi) CD49b + NK stanice su razvrstane iz slezene Ncr1 gfp/gfp miševi ili Ncr1 +/+ legla i bili su kostimulirani s IL-12 (10 ng/ml) i IL-18 (10 ng/ml) tijekom 16 sati, nakon čega je uslijedilo mjerenje proizvodnje IFN-γ intracelularnom protočnom citometrijskom analizom (D, lijevi panel, n = 3) ili ELISA testovi (D, desna ploča, n = 3). Golgijev čep je dodan u razrijeđenju 1:1000 u kulturu 4 h prije prikupljanja stanica. (E) Homogenizirane SI stanice izolirane iz Ncr1 gfp/gfp miševi ili Ncr1 +/+ drugovi iz legla stimulirani su s IL-23 (10 ng/ml) tijekom 4 h, nakon čega je uslijedilo mjerenje proizvodnje IL-22 protočnom citometrijskom analizom nakon gatiranja ILC3s na CD45 + Lin ─ CD127 + RORγt + . Golgijev čep je dodan u razrijeđenju 1:1000 u kulturu 3 h prije prikupljanja stanica. Trake grešaka, standardne devijacije. Numerički podaci za panel C i D mogu se naći u S1 podacima. ELISA, enzimski imunosorbentni test FSC-A, područje raspršenja prema naprijed FSC-H, visina FSC IFN, interferon IL, interleukin ILC, urođena limfoidna stanica Ncr1, prirodni receptor citotoksičnosti 1 NK, prirodni ubojica NS, bez značaja RORγt, receptor siročeta povezan s receptorom retinoične kiseline (RAR) gama t SI, tanko crijevo SSC-A, bočno područje raspršenja SSC-H, visina SSC SSC-W, širina SSC.

NKp46 kontrolira razvoj ILC1 na način koji je svojstven stanicama

Iako su NK stanice i ILC1 usko povezani, ILC1 se ne razvijaju putem Lin ─ CD122 + NK1.1 ─ DX5 ─ prekursora NK stanica (NKP), ali se mogu razviti kroz Lin ─ c-kit low α4β7 + CD127 + CD25 ─ Flt3 ─ zajednički pomoćnik urođeni limfoidni prekursori (CHILP). I NKP i CHILP potječu od zajedničkog limfoidnog progenitora (CLP) [15]. Udio obje vrste prekursora sličan je u BM-u Ncr1 gfp/gfp i Ncr1 +/+ miševi (S5 slika). Kako bi se potvrdilo da nedostatak NKp46 rezultira gotovo potpunim izostankom ILC1, te kako bi se testiralo je li ovaj fenomen intrinzičan ili ekstrinzičan stanični, poduzeta je transplantacija BM. U tu svrhu, ozračeni WT CD45.1 primatelji su presađeni Ncr1 gfp/gfp (KO) ili Ncr1 +/+ (WT) CD45.2 donor BM stanica (slika 4A) ili 1:1 mješavina KO i WT (S6 slika) putem injekcije u repnu venu. Dva tjedna kasnije, kvantificiranje različitih ILC podskupova poduzeto je protočnom citometrijskom analizom. Donorske stanice i stanice domaćina razlikovale su se bojenjem stanica anti-CD45.2 antitijelom. Otkrili smo da postoji gotovo potpuni nedostatak ILC1 u jetri, slezeni i BM primatelja WT kada Ncr1 gfp/gfp BM stanice korištene su kao donorske stanice. Međutim, populacija ILC1 bila je prisutna u znatno većim količinama kada Ncr1 +/+ BM stanice korištene su kao donorske stanice (slika 4B i 4C i S6 slika). Nasuprot tome, količina ILC2 stanica i ILC3 stanica u SI nije bila pod utjecajem kod miševa primatelja koji su presađeni s Ncr1 gfp/gfp ili Ncr1 +/+ BM donorske stanice (slike 4D i 4E). Umjereno povećanje udjela NK stanica moglo bi se dogoditi zbog potpunog nedostatka ILC1 među NKp46 + NK1.1 + ILC-ovima tipa I (slika 4B gore desno, slika 4C dolje desno). Zajedno, ovi rezultati dodatno potvrđuju da razvoj ILC1 ovisi o NKp46, a ta je ovisnost intrinzična stanica (slika 1).

(A) Shema transplantacije BM pomoću BM stanica CD45.2 Ncr1 gfp/gfp miševi ili Ncr1 +/+ kontrole legla kao donorske stanice za ubrizgavanje u primatelje CD45.1 preko repne vene. Razvoj ILC podskupina analiziran je 2 tjedna nakon transplantacije. (B) Postoci CD45.2 + NK stanica ili CD45.2 + ILC1 analizirani su protočnom citometrijskom analizom u jetri CD45.1 primatelja, koji su usadjeni BM stanicama Ncr1 gfp/gfp miševi (n = 5) ili Ncr1 +/+ drugovi u leglu (n = 4). (C) Postoci CD45.2 + NK stanica ili CD45.2 + ILC1 analizirani su u slezeni ili BM miševa primatelja CD45.1, koji su ucijepljeni s BM stanicama Ncr1 gfp/gfp miševi (n = 5) ili njihov Ncr1 +/+ drugovi u leglu (n = 4). (D i E) Prikazani su podaci reprezentativni točkasti dijagrami protočne citometrijske analize (lijeva ploča) i sažeti podaci (desna ploča) CD45.2 + ILC2 (D) ili CD45.2 + ILC3 (E) u SI u CD45.1 primatelja, koji su usadjeni BM stanicama Ncr1 gfp/gfp miševi (n = 4) ili njihov Ncr1 +/+ drugovi u leglu (n = 4). Trake grešaka, standardne devijacije ***, str < 0,001 **, str < 0,01 *, str < 0,05. Numerički podaci za ploče B, C, D i E mogu se pronaći u S1 podacima. Lin ─ , CD3 ─ CD19 ─ BM, ILC koštane srži, urođene limfoidne stanice Ncr1, prirodni receptor citotoksičnosti 1 NK, prirodni ubojica RORγt, receptor siročeta srodni receptoru retinoične kiseline (RAR) gama t SI, tanko crijevo.

Zaključno, naši nalazi pružaju nove dokaze da NKp46 igra ključnu ulogu u razvoju ILC1. Prethodne studije u ovom području bile su usmjerene na transkripcijsku kontrolu razvoja ILC-a. Poznato je da T-bet i Eomes reguliraju razvoj NK stanica, Gata3 kontrolira razvoj ILC2, a RORγt definira lozu ILC3 [15]. Utvrđeno je da nekoliko transkripcijskih čimbenika – kao što je regulirani nuklearni faktor interleukin 3 (Nfil3), transkripcijski faktor 3 povezan s runt (Runx3) i T-bet – kontroliraju razvoj ILC1, međutim, ti čimbenici ne igraju selektivnu ulogu u određivanju razvoja ILC1 [15]. To jest, ovi faktori transkripcije imaju neke preklapajuće uloge u nekoliko tipova ILC-a i stoga pojedinačno ne mogu odrediti sudbinu razvoja ILC1. Na primjer, pokazalo se da T-bet igra ulogu ne samo u razvoju ILC1 nego iu razvoju NK stanica i ILC3 [15]. Ovdje smo identificirali receptor koji selektivno određuje razvojnu sudbinu ILC1. Naša studija također podržava ideju da ILC1 i NK stanice pripadaju različitim linijama, iako obje pripadaju skupini 1 ILC, i obje mogu proizvoditi IFN-γ kada se aktiviraju (npr. citokinima). To pokazuje i naša studija Ncr1 gfp/gfp miševi mogu poslužiti kao koristan životinjski model za istraživanje fizioloških ili patoloških funkcija ILC1, s obzirom na njihovu gotovo potpunu odsutnost u različitim organima, dok su razvoj i funkcija drugih ILC-a gotovo netaknutima, s izuzetkom funkcija povezanih na ulogu NKp46 u NK stanicama [7,16].


Imunološko ciljanje matičnih stanica raka

Sve veći dokazi sugeriraju da nedostatak eradikacije malignih matičnih stanica čini osnovu za recidiv i napredovanje raka. U tom smislu, klinička iskustva u liječenju kronične mijelogene leukemije (CML), prototipične bolesti matičnih stanica, bila su poučna i ilustrativna su za izazove s kojima se suočava liječenje raka kada se koriste moćni citoreduktivni agensi koji nepotpuno eliminiraju minimalnu rezidualnu bolest. S druge strane, nekoliko desetljeća kliničkog i laboratorijskog iskustva pokazalo je ljekoviti potencijal alogenske transplantacije matičnih stanica za CML i druge hematološke maligne bolesti. Kao što je prikazano u ovom poglavlju, ove studije su jasno pokazale ljekoviti potencijal imunološkog prepoznavanja tumorskih stanica, uključujući populaciju malignih progenitornih stanica. Ovi podaci postavljaju teren za novije pristupe koji se usredotočuju na imunološko ciljanje antigena prisutnih na matičnim stanicama raka.Racionalno imunološko ciljanje populacije koja inicira tumor kritično ovisi o (1) identificiranju jedinstvenih površinskih markera tih stanica kako bi se one mogle izolirati i (2) definiranju antigena koji su jedinstveno ili preferencijalno izraženi unutar malignih stanica s matičnim funkcije poput stanica u usporedbi s normalnim stanicama. Dok traje rasprava o točnoj prirodi i definiranju karakteristika stanične populacije koja je sposobna razmnožavati tumor, a time i kritične podpopulacije tumorskih stanica koja je potrebna za imunološko ciljanje, nekoliko obećavajućih pristupa za imunoterapiju raka se istražuje. U konačnici, kombinirana terapija koja uključuje oba farmakološka citoreduktivna sredstva zajedno s imunološkim ciljanjem na populaciju malignih matičnih stanica može pružiti učinkovit kurativni pristup s prihvatljivom toksičnošću za liječenje malignih bolesti.

1. Uvod

Do sada je postojanje stanica koje iniciraju rak dokazano u mnogim malignim bolestima (Al-Hajj i sur., 2003. Bonnet i Dick, 1997. Jamieson i sur., 2004. Singh i sur., 2003.) (Schatton i sur., 2008.) . To su rijetke populacije mirnih stanica koje se mogu serijski transplantirati, imaju sposobnost samoobnavljanja i često su otporne na citotoksične učinke standardne kemoterapije (Clarke i sur., 2006.). Ove karakteristike imaju jasne implikacije na napredovanje bolesti i pristupe terapijskoj intervenciji. Sve veći dokazi sugeriraju da nedostatak eradikacije malignih matičnih stanica čini osnovu za recidiv i napredovanje bolesti. U tom smislu, klinička iskustva u liječenju kronične mijelogene leukemije (CML), bolesti proizašle iz transformirane populacije matičnih stanica, bila su poučna (Odjeljak 2) i ilustrativna su za izazove s kojima se suočava i liječenje malignih tumora solidnog tumora. Ove studije su pokazale snažnu citoreduktivnu sposobnost nedavno razvijenih farmakoloških terapija, ali i njihovu opću nesposobnost da potpuno iskorijene rezidualne bolesti. S druge strane, veliko kliničko i laboratorijsko iskustvo tijekom posljednja tri desetljeća pokazalo je ljekoviti potencijal alogenske transplantacije matičnih stanica za CML i druge hematološke maligne bolesti. Kao što je recenzirano u 3. odjeljku, ove studije su jasno pokazale da usađivanje donora rezultira imunološkim prepoznavanjem tumorskih stanica, uključujući populaciju malignih progenitornih stanica. Ovi podaci postavljaju teren za novije pristupe koji se usredotočuju na imunološko ciljanje antigena prisutnih na matičnim stanicama raka. Dok se nastavlja rasprava o točnoj prirodi i definiranju karakteristika stanične populacije koja je sposobna razmnožavati tumor, a time i opsega ukupne populacije tumorskih stanica koja je potrebna za imunološko ciljanje, nekoliko obećavajućih pristupa za imunoterapiju raka se istražuje. Ovi pristupi mogu uključivati ​​imunizaciju i ciljanje antigena sa selektivnom ekspresijom na maligne matične stanice, zajedno s reagensima koji mogu regulirati snagu imunološkog sustava (Odjeljak 4). U konačnici, kombinirana terapija koja uključuje oba farmakološka citoreduktivna sredstva zajedno s imunološkim ciljanjem na populaciju malignih matičnih stanica može pružiti učinkovit kurativni pristup s prihvatljivom toksičnošću za liječenje malignih bolesti.

2. Pouke iz CML-a, poremećaja hematopoetskih matičnih stanica

Kronična mijelogena leukemija (CML) je mijeloproliferativna bolest povezana s t(9 22) kromosomska translokacija koja kodira onkogeno BCR-ABL fuzijski protein. Ovaj himerni protein ima aktivnost tirozin kinaze i neophodan je za malignu transformaciju i prekomjerno širenje mijeloidnih stanica koje karakterizira CML. Prirodna povijest CML-a je dobro okarakterizirana. Pacijenti obično ostaju u kroničnoj fazi (CP) nekoliko godina, ali se neizbježno transformiraju u agresivniji klinički sindrom (ubrzana faza) i na kraju u smrtonosnu blastnu krizu (BC) (Faderl i sur. , 1999.).

Genetske studije provedene prije više od 20 godina pokazale su da je maligni klon u CML-u pluripotentna hematopoetska matična stanica, sposobna da se diferencira u mijeloične stanice, monocite, eritrocite i trombocite (Bernstein i sur., 1992. Douer i sur., 1981. Fialkow i sur. ., 1977 Koeffler i sur., 1980 Martin i sur., 1980 Singer i sur., 1980 Singer i sur., 1979). Ove studije su utvrdile da su samo pojedinačni enzimski fenotipovi izoenzima G6PD vezanog na X bili prisutni u stanicama u cijelom spektru hematopoetskih linija kod žena s CML-om koje su bile heterozigotne za ovaj gen. Stoga je utvrđeno da maligni klon potječe iz najranije hematopoetske progenitorske stanice. Identificirane su fenotipske karakteristike ljudskih hematopoetskih matičnih stanica, prekursora i progenitorskih populacija (Kondo i sur., 2003.), a općenito se te subpopulacije mogu identificirati na temelju ekspresije CD34+ u kombinaciji s prisutnom ili odsutnom ekspresijom dodatnih imunofenotipskih biljega. U novije vrijeme, Jamieson i sur. dokazali su svojstvo samoobnavljanja unutar populacije matičnih stanica bolesnika s CML-om s kroničnom bolešću te unutar populacije matičnih stanica i mijeloidnih progenitora u bolesnika s blastnom krizom, koje su povezane s povećanom aktivnošću β-kateninskog puta (Jamieson i sur., 2004.).

Inhibicija na ABL kinaze, koja se konstitutivno aktivira u CML-u kao rezultat BCR-ABL translokacija, bila je uspješna nedavno razvijena strategija za liječenje CML-a. Specifični inhibitor tirozin kinaze, imatinib mezilat, kompetitivno inhibira vezanje ATP-a na ABL kinazna domena (Buchdunger et al., 1996.), te stoga ima specifično inhibitorno djelovanje za tirozin kinazu koju kodira BCR-ABL fuzijski transkript (Buchdunger i sur., 1996. Deininger i sur., 1997. Druker i sur., 1996.). Studije faze I i II pokazale su visoku učestalost hematoloških i citogenetskih odgovora u bolesnika s ubrzanom fazom ili BC CML-om, kao i s novodijagnosticiranim CP (Druker i sur., 2001a Druker i sur., 2001b Kantarjian i sur., 2002. ). (Kantarjian i sur., 2002. Sawyers i sur., 2002.). Štoviše, randomizirano kontrolirano ispitivanje faze III pokazalo je superiornost imatiniba u odnosu na kombinaciju IFNα i citarabina u novodijagnosticiranih bolesnika s CP-CML (ispitivanje IRIS) (O’Brien i sur., 2003.). Hematološki i glavni citogenetski odgovori opaženi su u 98% odnosno 84% bolesnika u skupini koja je primala imatinib, a ti su rezultati postignuti uz nisku toksičnost. Ovi impresivni rezultati doveli su do brzog odobrenja FDA-e 2001. godine, a imatinib se pojavio kao standardna prva terapija za CML. Tijekom posljednjih godina, ABL inhibitori kinaze povećane snage razvijeni su za liječenje bolesti otporne na imatinib, a uključuju dasatinib (odobren od FDA u lipnju 2006.) i nilotinib (odobren od FDA u listopadu 2007.) (Brave i sur., 2008. Cortes i sur. ., 2007. Guilhot i sur., 2007. Hochhaus i sur., 2008. Hochhaus i sur., 2007. Kantarjian i sur., 2007.a Kantarjian i sur., 2007.b le Coutre i sur., 2008.). Uzeto zajedno, liječenje CML-a sa ABL inhibitori kinaze služe kao model za uspjehe molekularnog ciljanja signalnih putova koji su vitalni za opstanak maligne stanice. Ovaj model je inspirirao razvoj strategija koje remete bitne signalne putove u drugim tumorima, uključujući tumore gastrointestinalnih stromalnih stanica (Blanke i sur., 2008.) i kod raka pluća (Giaccone, 2005. Sequist i sur., 2007.).

Unatoč ovim upečatljivim kliničkim rezultatima, nekoliko zapažanja su napomene za oprez. Prvo, u bolesnika s uznapredovalom bolešću, lijekom izazvane remisije u bolesnika s CML-om s uznapredovalom bolešću nisu trajne (Druker i sur., 2001.a) (Ottmann i sur., 2002. Sawyers i sur., 2002.). Istraživanja mehanizama rezistencije na imatinib podržala su ideje da: (a) BCR-ABL dovodi do ukupne genomske nestabilnosti koja može izazvati sekundarne genetske promjene (BCR-ABL amplifikacija gena, nove inaktivirajuće točkaste mutacije) doprinose BCR-ABL neovisni rast i/ili preživljavanje zloćudnog klona (Branford i sur., 2002. Gorre i sur., 2001. Hochhaus i sur., 2002. Roche-Lestienne i sur., 2002. Roumiantsev i sur., 2002. Schindler i sur., 2000. Shah i sur., 2002.) i (b) imatinib može odabrati za rezistentni klon bolesti u bolesnika s uznapredovalom bolešću, što je potkrijepljeno analizom mutacije pacijenata (Bumm i sur., 2003.). Drugo, čak i u bolesnika s manje uznapredovalom bolešću, <5% postaje potpuno PCR-negativno za BCR-ABL unatoč čestom postizanju potpunih citogenetskih odgovora (CCR) (Hughes i sur., 2003.). U ispitivanju IRIS, od 68% pacijenata koji su postigli CCR nakon 1 godine terapije, 30% je postiglo <2 log smanjenje medijana BCR-ABL razine prijepisa po BCR-ABL qPCR. Ova niska razina smanjenja u BCR-ABL transkript je bio povezan s 5-15% vjerojatnosti progresije bolesti nakon 24 mjeseca. Nasuprot tome, pacijenti sa >gt 3 log redukcije ostali su 100% bez progresije tijekom 24 mjeseca. Novije studije su pokazale da se s produljenom terapijom prve linije povećava vjerojatnost postizanja molekularne remisije, ali 50% pacijenata još uvijek ima detektivnu rezidualnu bolest (Branford i sur., 2007.).

U skladu s postojanošću molekularno detektivne minimalne rezidualne bolesti nakon terapije imatinibom, Bhatia i sur. identificirali maligne hematopoetske progenitore u 15 od 15 ispitanih bolesnika s CML-om, koji su bili u CCR-u nakon imatiniba (Bhatia i sur., 2003.). Graham i sur. izvijestili su da su primitivne mirne Ph+ progenitorne stanice pacijenata s CML-om neosjetljive na imatinib in vitro (Graham i sur., 2002.). Također je dokazano da dasatinib i nilotinib selektiraju za rast klonova koji nose mutacije otpornosti (Shah i sur., 2007.) i da neučinkovito iskorijenjuju rezidualne bolesti (Copland i sur., 2006. Jorgensen i sur., 2007.), usprkos povećanju potenciju u usporedbi s imatinibom. Jiang i sur. nedavno su pokazali da svježe izolirane matične stanice CML-a od neliječenih pacijenata već imaju visoku učestalost BCR-ABL mutacije. Štoviše, identificirali su više od 70 različitih BCR-ABL mutacije u potomstvu kultura matičnih stanica CML-a. Ove i druge studije pokazuju da primarne matične stanice CML pokazuju nestabilnost BCR-ABL fuzijski gen, te da rezervoar malignih progenitornih stanica perzistira u bolesnika liječenih s ABL inhibitori kinaze, koji imaju potencijal da se razviju u recidivnu bolest (Jiang i sur., 2007.). Mirne stanične subpopulacije otporne na lijekove s klonogenim ptoencijalom također su identificirane u drugim vrstama raka (Abbott, 2003. Challen i Little, 2006. Hadnagy i sur., 2006.).

3. Alogena transplantacija hematopoetskih matičnih stanica: ljekovita imunološka terapija koja rezultira eradikacijom malignih progenitornih stanica

Alogena transplantacija hematopoetskih matičnih stanica (HSCT) dobro je uhodan pristup liječenju mnogih hematoloških maligniteta. Dok su intenzitet i sastav režima kondicioniranja važni za uspješan HSCT, rekonstitucija imunoloških stanica donatora igra ključnu ulogu u eliminaciji tumorskih stanica primatelja, procesu koji se naziva transplant-versus-leukemia (GvL). Kao što će biti recenzirano u ovom odjeljku, više od 30 godina kliničkog i laboratorijskog iskustva pružilo je jasnu demonstraciju da imunološko ciljanje populacija malignih hematopoetskih stanica može učinkovito generirati trajne kurativne odgovore. Ovaj pristup je čak primijenjen i u liječenju solidnih tumora. Ove studije sada pružaju pozadinu za razvoj terapija koje povećavaju terapijsku korist alogene transplantacije, a minimiziraju rizike i toksičnosti povezane s liječenjem.

3.1. Dokazi koji podupiru postojanje efekta Graft protiv leukemije

Nekoliko linija kliničkih dokaza, ustanovljenih tijekom posljednjih 30 godina, uvjerljivo je pokazalo postojanje GvL-a i njegovu izvanrednu učinkovitost u osiguravanju trajnog imunološkog odbacivanja malignih stanica. Kao što je sažeto u tablici 1, ove su kliničke studije započele 1970-ih i 1980-ih, u kojima je utvrđeno da je rizik od relapsa bolesti nakon HSCT-a u velikoj korelaciji s imunološkim statusom primatelja. Na primjer, otkriveno je da je odgovor protiv leukemije (tj. GvL) snažno povezan s prisutnošću imunološke toksičnosti transplantacije, bolesti presatka protiv domaćina (GvHD). Relaps leukemije bio je 2,5 puta vjerojatniji u primatelja singenih matičnih stanica u usporedbi s alogenim primateljima koji odgovaraju HLA i koji su razvili GvHD (Weiden i sur., 1979.). Osim toga, utvrđeno je da pacijenti koji su doživjeli GvHD imaju smanjen rizik od recidiva bolesti, a to se činilo povezanim s opsegom podudarnosti HLA između primatelja i darivatelja (Fefer i sur., 1987. Sullivan i sur., 1989. Weiden i sur. ., 1981.) (Butturini i sur., 1987. Gale i sur., 1994. Jones i sur., 1991. Weisdorf i sur., 1987.). Primjeri remisije leukemije također su primijećeni u vezi s pogoršanjem GVHD-a (Odom i sur., 1978. Tricot i sur., 1996.) ili nakon prestanka uzimanja imunosupresivnih lijekova koji se koriste za prevenciju GvHD-a (Collins i sur., 1992. Libura i sur. ., 1999.). Nakon izvješća jedne ustanove koja opisuju pozitivnu korelaciju između smanjenog relapsa i akutnog i/ili kroničnog GvHD-a, naknadno je provedeno nekoliko velikih potvrdnih studija registra u Sjevernoj Americi (Horowitz i sur., 1990.) i u Europi (Ringden i sur., 1996.) . Neki pacijenti u ovim retrospektivnim studijama primili su transplantate matičnih stanica iz kojih su T stanice bile iscrpljene in vitro za sprječavanje GvHD-a. Osiromašenje T stanica učinkovito je spriječilo tešku GVHD, ali uočene su veće stope relapsa u ovih pacijenata u usporedbi s primateljima matičnih stanica bez T stanica. Ovaj učinak deplecije T stanica najčešće je zabilježen u bolesnika s CML-om. Uzeti zajedno, ove studije su pokazale da je GvHD povezan s vrlo značajnim GvL učinkom, koji je bio posredovan donorskim T stanicama u proizvodima matičnih stanica (Champlin i sur., 1990. Goldman i sur., 1988. Horowitz i sur., 1990. Martin et al. al., 1988).

Niža stopa recidiva nakon transplantacije alogenih matičnih stanica u usporedbi s autolognim ili singenim matičnim stanicama

Pozitivna korelacija između GVHD i GVL

Vremenska povezanost remisije leukemije s epizodama akutne ili kronične GVHD

Remisija bolesti nakon prestanka uzimanja imunosupresivnih lijekova

Smanjen relaps povezan s GVHD

Smanjenje T stanica transplantata matičnih stanica donora povezano je s većim stopama recidiva

Infuzija donorskih limfocita izaziva remisiju hematoloških maligniteta

Alogeni HSCT nakon nemijeloablativnog kondicioniranja izaziva remisiju hematoloških maligniteta i nekih nehematoloških maligniteta

Učinkovitost GvL odgovora u eliminaciji tumora definitivno je dokazana početkom 1990-ih kroz uspješno iskustvo korištenja infuzija donorskih limfocita (DLI) za liječenje relapsiranog CML-a nakon HSCT-a (Kolb i sur., 1990.). Opažanje da bi donorski limfociti sami, bez daljnje kemoterapije ili zračenja, mogli izazvati remisiju bolesti izravno je pokazalo snažno antitumorsko djelovanje imunoloških efektorskih stanica dobivenih od donatora. Od ovog početnog izvješća, iskustva s više centara u Europi i Sjevernoj Americi potvrdila su učinkovitost DLI za induciranje GvL (Collins i sur., 1997. Kolb i sur., 1995.). Iz ovih kliničkih studija jasno je da je DLI posebno učinkovit u liječenju stabilne faze CML-a, gdje se trajni odgovori javljaju u 75-80% bolesnika. Nasuprot tome, stope odgovora pacijenata s multiplim mijelomom i KLL-om kretale su se od 30-50% (Lokhorst i sur., 1997. Madigers et al., 2003. Rondon i sur., 1996. Tricot i sur., 1996.) i pacijenata s akutnim leukemija, samo 10-15%. U skladu s ovim zapažanjima, DLI je općenito učinkovitiji u bolesnika s manjim opterećenjem bolesti (van Rhee i sur., 1994.). Samo 5-10% bolesnika s uznapredovalom CML-om (blastna kriza/ubrzana faza) reagira na DLI. Zanimljivo je da su klinički odgovori nakon DLI često odgođeni do 2-4 mjeseca nakon jedne infuzije. Ovaj produljeni interval može odražavati vrijeme potrebno za uspostavljanje učinkovitog odgovora kada je učestalost naivnih T stanica sposobnih reagirati niska. Alternativno, odgođeni odgovori mogu odražavati vrijeme potrebno da se pokaže učinak lize onih stanica koje čine izvorni maligni klon. DLI odgovori za barem neke bolesti vrlo su trajni (Mattei i sur., 2001. Shimoni i sur., 2001.). Na primjer, Porter i sur. izvijestili su da je vjerojatnost preživljavanja 1, 2 i 3 godine nakon terapije DLI 83, 76 i 73 % (Porter i sur., 1999.).

Uz demonstraciju da GvL igra važnu ulogu u eliminaciji stanica leukemije nakon transplantacije, mnoge su studije počele ispitivati ​​izvedivost korištenja manje intenzivnih, ne-mijeloablativnih režima kondicioniranja za pripremu pacijenata za alogeni HSCT. Razvijeni su različiti nemijeloablativni režimi kondicioniranja i veliki broj kliničkih studija pokazao je učinkovitost ovog pristupa, posebno kod pacijenata koji nisu podobni za intenzivnije kondicioniranje (Khouri i sur., 1998. McSweeney i sur., 2001.) (Alyea i sur., 2005. Morris i sur., 2004.). Režimi kondicioniranja smanjenog intenziteta povezani su sa znatno manjom toksičnošću, ali unatoč tome osiguravaju dovoljnu imunosupresiju primatelja kako bi se spriječilo odbacivanje alogenih hematopoetskih matičnih stanica. Budući da su nemijeloablativni režimi kondicioniranja nedostatni za eliminaciju stanica leukemije u primatelja, dugotrajne remisije prvenstveno ovise o imunološkim mehanizmima posredovanim stanicama donora. Slično mijeloablativnoj postavci, GvL odgovori nakon nemijeloablativne transplantacije često su povezani s GvHD (Crawley i sur., 2005.). Koristeći ovaj pristup, nedavna klinička ispitivanja na pacijentima sa solidnim tumorima sugeriraju da se reakcije transplantata protiv tumora mogu primijetiti kod barem nekih od ovih pacijenata (Childs i sur., 2000. Demirer i sur., 2008. Tykodi i sur., 2004. Ueno i sur. ., 2003.)

3.2. Disekcija imunološke osnove GvL

Mnoge laboratorijske studije nastojale su definirati imunološke mehanizme koji doprinose GvL-u. Iako proizvodi matičnih stanica i DLI sadrže različite vrste mononuklearnih stanica, općenito se pretpostavlja da T stanice sadrže prevladavajuće efektorske stanice u tim proizvodima. Nedavne studije, međutim, također su implicirale ulogu B i NK odgovora u GvL odgovorima. U ovom odjeljku razmatramo dokaze o ulozi svake od ovih staničnih populacija u GvL-u.

3.2.1. Donatorske T stanice kao posrednici GvL i njihovi ciljni antigeni

U mišjim modelima pokazalo se da i CD4+ i CD8+ populacije T stanica doprinose aktivnosti GVL-a in vivo (Truitt i Atasoylu, 1991.). Uklanjanje bilo koje od ovih populacija T stanica dovodi do ugrožavanja GvL reaktivnosti, što ukazuje da su i CD4+ i CD8+ T stanice potrebne za stvaranje optimalnog GvL-a.U bolesnika koji su bili podvrgnuti alogenskom HSCT-u, identificirane su i CD4+ i CD8+ T stanice reaktivne na leukemiju. Posljednjih godina mnogo je aktivnosti usmjereno na preciznu identifikaciju ciljnih antigena donorskih T stanica nakon alogene HSCT, budući da bolje razumijevanje preciznih peptidnih epitopa koje prepoznaju T stanice može potencijalno dovesti do optimizacije strategija za razlikovanje GvL i GvHD efekti in vivo.

Većina strategija za identifikaciju epitopa T stanica oslanjala se na ispitivanje citolitičke aktivnosti T stanica dobivenih od donora protiv antigena domaćina, identificiranih biokemijskim pristupima ili testiranjem na ekspresijske biblioteke cDNA dobivene iz tkiva domaćina. Koristeći ove strategije, identificirani su mnogi manji antigeni histokompatibilnosti (mHA). mHA su antigeni koji nastaju kao rezultat genetskih polimorfizama koji postoje u cijelom ljudskom genomu (Mullally i Ritz, 2007.), te su stoga odraz onih polimorfnih autopeptida koji razlikuju bilo koje dvije individue. Transplantacija zrelih T stanica tijekom alogene HSCT rezultira prijenosom velikog broja stanica sposobnih prepoznati ove mHA.

Kao što je shematski prikazano na slici 1, čini se da kliničke posljedice mHA u potpunosti proizlaze iz njihove ekspresije u različitim tipovima stanica i prepoznavanja tih antigena od strane T-stanica donora (Akatsuka i sur., 2003. Dickinson i sur., 2002. Kloosterboer i sur. , 2005.). Većina do sada identificiranih humanih mHA ima široku tkivnu ekspresiju i ciljanje tih različitih tipova stanica od strane donatorskih T stanica predstavlja jedan od početnih događaja GvHD-a (Dickinson i sur., 2002.). Na primjer, jedna dobro okarakterizirana klasa široko izraženih mHA su geni na Y kromosomu. Mužjaci su tolerantni na ove proteine ​​kodirane Y kromosomom (H-Y antigeni), ali T stanice reaktivne s H-Y peptidima nisu izbrisane u normalnih ženki (Foote i sur., 1992. Wang i sur., 1995.). Ženke su tolerantne na izraženi homolog X kromosoma i kada su izložene H-Y antigenima kroz trudnoću ili transfuziju krvi mogu razviti dugovječne odgovore T stanica na ove mHA (James i sur., 2003. Verdijk i sur., 2004.). Slično usađivanje ženskih T-stanica u muških primatelja može dovesti do ekspanzije H-Y specifičnih donorskih T-stanica (Pierce i sur., 1999. Takami i sur., 2004. Vogt i sur., 2000.a). Dokazi da su to mete imuniteta dobivenog od donatora uključuju otkriće povećane incidencije GvHD-a kod muških primatelja transplantata matičnih stanica od ženskih donora (Atkinson i sur., 1986 Flowers i sur., 1990 Gratwohl i sur., 2001 Randolph et al. ., 2004.). Pretpostavlja se da je to posljedica široke tkivne i stanične ekspresije H-Y proteina i imunogenosti ovih antigena. Mnogi od HY mHA sadrže više različitih aminokiselina u usporedbi s njihovim X-homolozima, a ti peptidni epitopi predstavljeni su i molekulama MHC klase I i klase II (Spierings et al., 2003b Torikai et al., 2004 Vogt et al., 2002). Oba ova čimbenika vjerojatno pridonose visokoj razini imunogenosti ovih antigena. mHA kodirani ne-Y kromosomom uključuju autosomne ​​mHA koji se generiraju na temelju polimorfizama jednog nukleotida koji se razlikuju između davatelja i primatelja. Ove genetske razlike mogu dovesti do stvaranja alternativnih transkripata, razlika u proteasomskoj obradi (Brickner i sur., 2001 Spierings et al., 2003a) i izrazitih posttranslacijskih modifikacija (Meadows et al., 1997) kao i jednostavne zamjene pojedinačnih aminokiseline u antigenskom peptidu (den Haan i sur., 1998. Mommaas i sur., 2002. Pierce i sur., 2001. Vogt i sur., 2000b). Nedavno opisani polimorfizmi delecije gena također mogu igrati važnu ulogu u stvaranju mHA (Murata i sur., 2003.).


T i B stanice dobivene iz domaćina mogu se potaknuti da prepoznaju antigene povezane s tumorom, dok B i T stanice dobivene od donatora mogu prepoznati i antigene povezane s tumorom i aloantigene.

U mjeri u kojoj mHA eksprimiraju i maligne i normalne hematopoetske stanice u primatelju, ali ne i druga tkiva, ciljanje ovih antigena će pridonijeti GvL-u i pretvorbi u potpunu hematopoezu donora, ali neće pridonijeti GvHD-u (Bleakley i Riddell, 2004.). Iz tog razloga, ciljanje mHA s ograničenom hematopoetskom ekspresijom predloženo je kao važan mehanizam za razlikovanje GvL od GvHD nakon alogene HSCT i DLI (Hambach i Goulmy, 2005. Mutis i Goulmy, 2002. Riddell i sur., 2003.).

Druge kategorije GvL ciljeva uključuju tumor-specifične antigene, virusno kodirane tumorske antigene, pretjerano eksprimirane autoantigene, mutirane ili modificirane autoantigene i antigene raka testisa. Za hematopoetske maligne bolesti, postoje mnogi potencijalno važni antigeni u tim kategorijama, uključujući himerne BCR-ABL (Bocchia et al., 1995. Cathcart et al., 2004.) i PML/RARa (Bocchia et al., 1995.) proteini, latentni EBV antigeni, proteinaza-3 (Molldrem et al., 2000.), WT-1 (Azuma et al., 1995.) sur., 2002.), survivin (Reker i sur., 2004.), ML-IAP (Schmollinger et al., 2003.) i antigeni karcinoma testisa kao što je SLLP1 (Wang i sur., 2004.). U tim slučajevima, imunogenost ovih meta ne ovisi o genetskom nejednakosti između primatelja i darivatelja. Budući da to nisu mete aloreaktivnosti, one predstavljaju moguće mete imunoloških efektora domaćina (Symons i sur., 2008.). Međutim, primatelji s leukemijom možda su postali tolerantni na te antigene, dok normalni darivatelji možda neće biti tolerantni na antigene i ostati sposobni razviti učinkovite imunološke odgovore nakon transplantacije.

3.2.2. Donorske B stanice kao posrednici GvL i njihovi ciljni antigeni

Nekoliko nedavnih studija sugerira da će B stanice također vjerojatno igrati važnu ulogu u GvL. Kao dio adaptivnog imunološkog odgovora, B stanice mogu poboljšati imunogenost tumora izlučivanjem citokina i kemokina, a imunološki kompleksi antigen-antitijelo olakšavaju isporuku antigena stanicama koje predstavljaju antigen i na taj način mogu poboljšati antigen specifičnu aktivaciju T stanica. Kada su usmjerena protiv molekula stanične površine, antigen-specifična antitijela koja mogu izravno lizirati tumorske stanice putem stanične citotoksičnosti ovisne o antitijelima (ADCC) i komplementom posredovane lize.

Što se tiče T stanica, mHA i tumorski povezani antigeni su potencijalne mete B stanica donora koje mogu doprinijeti GvL (i GvHD) nakon alogenog HSCT (slika 1). Miklos i sur. izvijestili su da je Y kodiran mHA DBY često ciljan odgovorima antitijela nakon HSCT žena → muških (Miklos i sur., 2004.). Treba napomenuti da je 50% muških pacijenata koji su primili transplantate matičnih stanica od ženskih donora razvilo humoralni imunitet na rekombinantni DBY protein u usporedbi s 5% pacijenata s muškim donorima. Vrlo malo pacijenata razvilo je antitijela protiv X-kodiranog homologa, DBX, a odgovori antitijela bili su prvenstveno usmjereni na područja nesrazmjera aminokiselina između DBY i DBX. Kada je ova analiza proširena na panel od 5 rekombinantnih proteina kodiranih HY (DBY, UTY, ZFY, RPS4Y i EIF1AY) i njihovih homologa X kromosoma, 89% pacijenata s barem jednim HY antitijelom razvilo je kronični GVHD u usporedbi sa samo 31% pacijenata bez antitijela na ovu ploču (p < .0001). Štoviše, 48% pacijenata bez H-Y protutijela imalo je recidiv u usporedbi s 0% pacijenata s H-Y antitijelima (p < .0001) (Miklos i sur., 2005.). Kliničke studije u našem centru i druge nedavno su sugerirale da rituksimab, terapija usmjerena na B stanice, može poboljšati neke od kliničkih manifestacija kroničnog GvHD-a i pokrenuta su veća ispitivanja koja procjenjuju ovaj pristup (Ratanatharathorn i sur., 2003.) (Cutler i sur. ., 2006.). Međutim, inhibicija odgovora B stanica također može smanjiti aktivnost GvL i to treba pomno pratiti u ovih bolesnika.

Odgovori protutijela na antigene povezane s tumorom također su identificirani u vezi s aktivnošću GvL nakon alogene HSCT (Bellucci i sur., 2004 Hishizawa i sur., 2005 Wu i sur., 2000). U nizu prethodnih studija bili smo motivirani otkriti ciljne antigene imunosnog odgovora B stanica povezanih s DLI, na temelju neočekivanog nalaza jasne periferne limfocitoze B stanica i infiltracije srži plazma stanica koja se razvija u vrijeme kliničkog odgovora (koja nije bila komplicirano istodobnom GvHD) (Bellucci i sur., 2002.) u nizu pacijenata uključenih u ispitivanja DLI na DFCI (Alyea i sur., 1998. Bellucci i sur., 2002.). Ove studije dovele su do otkrivanja prisutnosti moćne humoralne imunosti – na razinama usporedivim s antivirusnim odgovorima – koja je bila vremenski povezana s kliničkom regresijom tumora u nizu pacijenata s CML-om (Wu i sur., 2000.). Prvo smo otkrili prisutnost antitumorske humoralne imunosti u vezi s DLI-om kada smo imunoblotirali lizate generirane iz stanične linije CML-a, stanice K562 protiv seruma dobivenih od bolesnika liječenog DLI-om, i vizualizirali smo nove trake otkrivene nakon DLI-a, ali ne i prije -DLI serumi, što označava detekciju novih odgovora antitijela na CML ciljne antigene nakon DLI. Nakon toga, ekspresijskim kloniranjem temeljenim na antitijelima, u kojem je plazma osoba koje su odgovorile na terapiju DLI korištena kao izvor antitijela za skrining biblioteke ekspresije CML cDNA koju smo generirali iz uzoraka pacijenata, niz ciljnih antigena kandidata protiv kojih je nakon DLI, ali ne i Pre-DLI niti pre-BMT serumi su bili reaktivni (Sahin i sur., 1997. Wu i sur., 2000.). Oni su kodirali niz poznatih i novih gena uključenih u različite stanične funkcije, uključujući transkripciju gena, stanični ciklus i staničnu signalizaciju. Utvrđeno je da je podskup antigena visoko izražen u širokom nizu tumora, ali samo u uskom rasponu normalnih tkiva. Dva nova antigena povezana s CML-om u ovoj skupini, CML66 i CML28, detaljno su okarakterizirana (Yang i sur., 2002. Yang i sur., 2001.). Odgovori protutijela na oba ova cilja nisu bili prisutni prije transplantacije ili prije DLI. Antitijela visokog titra razvila su se 2-3 mjeseca nakon DLI što se podudara s postizanjem citogenetske i molekularne remisije CML-a. Za razliku od H-Y gena, čini se da nijedan od ovih gena ne kodira polimorfizme koji razlikuju alele izražene u darivatelju i primatelju transplantata. Štoviše, antitijela na CML66 i CML28 nisu bila prisutna u bolesnika s kroničnim GvHD-om, bolesnika s CML-om koji su podvrgnuti alogenom HSCT s osiromašenim T stanicama ili normalnim darivateljima. Zanimljivo je da su antitijela na ova 2 antigena također bila prisutna u bolesnika s CML-om koji su odgovorili na liječenje interferonom-α, ali ne i u bolesnika liječenih hidroksiureom ili imatinibom. Ove studije sugeriraju da imunogenost oba ova proteina proizlazi iz njihove visoke ekspresije u stanicama leukemije, a ne zato što predstavljaju nove alo-antigene.

Utvrđeno je da su neki ciljevi humoralne imunosti izazvane imunološkim liječenjem površinski eksprimirani antigeni. Na primjer, Bellucci i sur. identificirao je BCMA, člana superfamilije TNF receptora koji se selektivno eksprimira na površini zrelih B stanica i stanica mijeloma, kao DLI-povezanu metu u bolesnika s mijelomom (Bellucci i sur., 2005.). Antitijela koja su se razvila in vivo nakon što je otkriveno da je DLI reaktivan s domenom površine stanice BCMA. Kada su testirana u funkcionalnim testovima, ova IgG antitijela u pacijentovom serumu bila su sposobna posredovati komplementom izazvanu lizu i ADCC stabilno transficiranih stanica koje eksprimiraju BCMA ili primarnih stanica mijeloma koje eksprimiraju BCMA. Ova su antitijela otkrivena u 2 od 9 DLI odgovornih i potrajala su dulje vrijeme nakon DLI. Druge nedavne studije pokazale su da antitijela protiv površinski eksprimiranih antigena mogu generirati specifične učinke receptor-ligand koji pojačavaju citotoksičnost tumora (Jinushi i sur., 2006.) (Jinushi i sur., 2008.). S druge strane, velika većina antigena identificiranih serološkim probirom su unutarstanični proteini. Iako oni mogu samo predstavljati razvoj imunološkog odgovora na ekstrudirani sadržaj liziranih tumorskih stanica, antitijela na unutarstanične antigene mogu olakšati unakrsnu prezentaciju ciljnih antigena putem FcγR posredovanog puta u dendritskim stanicama i mogu rezultirati stimulacijom CD8+ Odgovori T stanica na peptidne epitope unutar ciljnog proteina (Amigorena, 2002. Dhodapkar i sur., 2002. Kita i sur., 2002.) (Valmori i sur., 2007.) Uzeti zajedno, ova opažanja sugeriraju da odgovori B stanica na leukemiju vjerojatno doprinose GvL aktivnosti in vivo kroz razne mehanizme.

3.2.3. Donorske stanice prirodne ubojice (NK) kao posrednici GvL

Prirodne stanice ubojice (NK) prve su stanice limfoidne loze koje se rekonstituiraju nakon alogenske transplantacije, a adekvatan oporavak broja NK stanica u ranom razdoblju nakon transplantacije povezan je s poboljšanim ishodom bez relapsa (Jiang i sur., 1997.) . Angažiranje receptora NK stanica rezultira stimulacijom ili inhibicijom efektorske funkcije NK stanica, ovisno o intracelularnoj signalizaciji posredovanoj kroz citoplazmatski rep ili adapterske molekule povezane sa svakim receptorom (Chiesa i sur., 2005. Moretta i Moretta, 2004.). Iako odgovor NK stanica na metu ovisi o neto učinku aktivirajućih i inhibitornih receptora, on je pretežno negativno reguliran KIR-ima ili receptorima ili receptorima specifičnim ubojitim inhibitorima klase I (KIR). Adekvatna ekspresija odgovarajućih inhibicijskih liganada NK receptora štiti zdrave “samostalne” stanice od lize NK stanica. Međutim, u nedostatku ovog inhibitornog puta, mete postaju osjetljive na NK posredovanu lizu. U uvjetima alogene HSCT, rezultati aktivnosti NK ovise o usmjerenosti lize (Hsu i Dupont, 2005. Ruggeri i sur., 2005.a). Kada su NK stanice dobivene od donora, a stanicama primatelja nedostaje ekspresija srodnog KIR liganda, liza donorskih NK stanica ciljnih stanica primatelja može rezultirati GvL i/ili GvHD, ovisno o tkivnom podrijetlu NK mete. Međutim, ako je ciljna stanica donora podrijetla, a NK efektorska stanica primatelja, liza NK stanica može rezultirati odbacivanjem presatka. Nedavne studije su pokazale da na kapacitet efektora NK stanica utječe klasa i količina inhibitornih receptora za samo-HLA-B i HLA-C ligande. (Pfeiffer i sur., 2007. Yu i sur., 2007.) Procijenjeno je da se može očekivati ​​da će se aloreaktivnost NK stanica pojaviti u oko 50% nepovezanih donorskih transplantacija s jednim ili više nepodudarnosti razine alela HLA.

Studije provedene prije dva desetljeća pokazale su prisutnost litičke aktivnosti NK stanica protiv stanica leukemije iz domaćina nakon HSCT-a (Hauch i sur., 1990. Hercend i sur., 1986.). Uvjerljive studije koje su nedavno proveli Ruggeri i sur. ispitali su ulogu aktivnosti NK stanica u pacijenata koji su primili transplantaciju matičnih stanica s osiromašenim T stanicama od HLA-usklađenih donatora (Ruggeri i sur., 1999. Ruggeri i sur., 2002. Ruggeri i sur., 2005.b). U ovom okruženju, KIR na donorskim NK stanicama potencijalno je neusklađen sa svojim inhibirajućim HLA-ligandima i sposobni su prepoznati i ubiti stanice leukemije primatelja. Štoviše, aloreaktivnost NK predviđena je na temelju HLA-B i HLA-C tipizacije, a parovi donor-primatelj podijeljeni su u dvije skupine: one s nekompatibilnošću KIR liganda u smjeru davatelja u odnosu na domaćina, i one bez nje. U kliničkom ispitivanju koje je uključivalo 112 pacijenata s visokorizičnom akutnom leukemijom, predviđena aloreaktivnost NK bila je u visokoj korelaciji s ishodom transplantacije u bolesnika s AML. Značajno je da je preživljenje bez događaja za pacijente s AML-om u skupini nekompatibilnoj s KIR ligandom bilo 60%, u usporedbi sa samo 5% u kompatibilnoj skupini. Štoviše, probir NK klonova dobivenih od donora za lizu u odnosu na stanice primatelja potvrdio je da je nekompatibilnost KIR liganda usko povezana s detekcijom donorskih NK klonova koji ubijaju mete primatelja. Ove i druge studije pokazale su da se čini da nekompatibilnost KIR liganda u smjeru donatora u odnosu na domaćina štiti pacijente s AML od odbacivanja transplantata, GVHD-a i relapsa leukemije (Hsu i sur., 2005. Savani i sur., 2007.). Dokazana je izvedivost i sigurnost prilagodbenog prijenosa proširenih NK stanica u liječenju relapsirane leukemije, a u tijeku su napori za procjenu učinkovitosti ovog pristupa (Miller i sur., 2005.).

3.3. Dokaz da su maligne progenitorne stanice ciljane GvL

Kurativni potencijal transplantacije matičnih stanica i DLI implicira da su maligne progenitorne stanice uključene u opseg stanica primatelja na koje cilja GvL. U ovom odjeljku sažimamo dokaze iz studija molekularnog praćenja odgovora bolesti na terapiju i karakteriziranja ciljnih antigena odgovora T i B stanica nakon HSCT-a koji podržavaju ovaj koncept. Reprezentativni primjeri ovih studija prikazani su na slici 2.


(A) Učinkovita GvL povezana je s bolešću koja se ne može detektirati. Rezultati molekularnog praćenja BCR-ABL transkript (u odnosu na kontrolni GUS transkript) 50 pacijenata liječenih na BWH/DFCI s neliječenom bolešću, nakon terapije imatinibom, nakon alogenog HSCT-a i pacijenata bez CML-a. (B) Učinkovit GvL je povezan s odgovorima T stanica koje prepoznaju leukemijske progenitore (prilagođeno iz Smit et al. 1998.). pCILp test mjeri učestalost prekursora T stanica u perifernoj krvi koji su sposobni suzbiti rast CD34+ CML progenitorskih stanica. (C) Učinkovit GvL povezan je s odgovorima B stanica protiv antigena izraženih na leukemijskim progenitorima. Klinički odgovor na DLI u odgovorima bolesnika s CML-om povezan je s odgovorima antitijela visokog titra protiv CML66 i CML28. Isprekidana linija predstavlja 250D iznad srednje vrijednosti od 10 normala. (D) CML66 je visoko eksprimiran u mijeloidnim progenitornim stanicama na temelju imunohistokemijskog bojanja srži od pacijenata sa spojem AML do normalne koštane srži. (E) CML28 i CML66 su visoko eksprimirani u stanicama progenitorima mijeloda na temelju studija kvantifikacije RNA transkripata. Relativni broj kopija transkripata CML66 i CML28 mjeren je u ukupnoj RNA dobivenoj iz diferenciranih i nediferenciranih normalnih i malignih hematopoetskih stanica, mjereno gen-specifičnim RT-PCR. CML-SP = stabilna faza CML CML-BC = blastna kriza CML AML = akutna mijeloična leukemija.

3.3.1. Učinkovita GvL povezana je s bolešću koja se ne može detektirati

Prisutnost translokacije specifične za bolest BCR-ABL je olakšao razvoj osjetljivih molekularnih testova za otkrivanje ekspresije transkripta ovog produkta fuzijskog gena kao mjere opterećenja bolesti. Postizanje molekularno neotkrivenog statusa u skladu s kurativnim odgovorima i eliminacijom malignih samoobnavljajućih populacija dosljedno se pokazalo u bolesnika s CML-om nakon liječenja HSCT-om. Slika 2A prikazuje rezultate molekularnog praćenja skupine od 50 pacijenata liječenih u Dana-Farber Cancer Institute/Brigham and Women's Hospital, Boston (neobjavljeni podaci). Naš laboratorij koristi GUS (β-glukuronidaza) kao kontrolni transkript, koji je prethodno potvrđen (Muller i sur., 2008.). Kao što je prikazano na ovoj slici, neliječeni pacijenti s CML-om izražavaju %BCR-ABL/GUS omjer između 10-100% (naša standardna referentna baza), dok pacijenti bez BCR-ABL transkript (tj. bolesnici bez CML-a, kao što su bolesnici s kroničnom limfocitnom leukemijom (CLL)) imaju neotkrivene razine transkripta (%BCR-ABL/GUS = <0,001–0,0001%). U skladu s rezultatima koje su izvijestili drugi istraživači, uzorci primljeni od pacijenata liječenih imatinibom tijekom > 1 godine, BCR-ABL Razine transkripta promjenjivo su se smanjivale u rasponu od 5 log, pri čemu su mnogi postigli < 2 log redukcije transkripta u odnosu na standardnu ​​referentnu početnu vrijednost nakon monoterapije imatinibom. Nasuprot tome, naš test mjeri niske do neotkrivene količine bolesti u pacijenata koji su postigli remisiju izazvanu imunoterapijom (BMT- ili DLI-). Štoviše, ti pacijenti godinama ostaju molekularno neotkriveni.

Uspješna alotransplantacija za liječenje kronične limfocitne leukemije i multiplog mijeloma također je rezultirala molekularno neotkrivenim remisijama bolesti (Corradini i sur., 2003.) (Esteve i sur., 2001.). Čini se da je trajnost kliničkih odgovora nakon DLI povezana s postizanjem molekularne remisije, što sugerira da učinkovitost DLI na sličan način proizlazi iz imunološke eliminacije klona malignih matičnih stanica (Dazzi i sur., 2000.).

3.3.2. Odgovori T stanica povezani s GvL prepoznaju leukemične progenitore

Pichert i sur. ispitali relativne doprinose režima pripreme za transplantaciju i imunoloških mehanizama nakon transplantacije na eliminaciju stanica leukemije u primatelja (Pichert i sur., 1995.). Transplantacije su izvedene korištenjem proizvoda iz srži s osiromašenim T stanicama ili kojima nije manipulirano. Od 92 bolesnika liječenih TCD mijeloablativnim transplantatom za CML, koji su pokazali supresiju bolesti bez klinički očitog GvHD-a, laboratorijske studije su pokazale da BCR-ABL pozitivne stanice otkrivene kod ovih osoba predstavljale su rane progenitorne stanice izvedene iz CML klona (Pichert i sur., 1994.). Postojanost ovih CML stanica u velike većine pacijenata koji su primali mijeloablativnu terapiju stoga sugerira da režimi kondicioniranja s visokim dozama sami po sebi nisu učinkovito eliminirali stanice leukemije. Nasuprot tome, činilo se da su imunološki mehanizmi posredovani donorskim T stanicama važniji za suzbijanje stanica leukemije nakon transplantacije i sprječavanje relapsa leukemije.

Drugi istraživači su ispitali antigenske specifičnosti velikih T staničnih linija i T staničnih klonova proširenih od pacijenata s kliničkim GvL odgovorima, te su pokazali ciljanje na populaciju CD34+ stanica. Kao što je prikazano na slici 2B, Smit i sur. otkrivene povišene postotke CTL-a koji inhibiraju CML CD34+ stanice u pacijenata koji su pokazali klinički evidentan GvL nakon terapije DLI (Smit i sur., 1998.). Falkenburg i sur. izolirani CTL klonovi usmjereni protiv mHA koji su sposobni za antigen specifičnu lizu svježe dobivenih leukemijskih stanica i inhibiciju stanica prekursora leukemije in vitro (Falkenburg i sur., 1999.). Bonnet i sur. pokazali su da ljudski CTL klonovi specifični za mHA mogu prvenstveno ciljati matične stanice leukemije i da klonovi T stanica s ovom vrstom specifičnosti mogu učinkovito eliminirati transplantirane stanice leukemije kod NOD/SCID miševa (Bonnet i sur., 1999.). Rezvani i sur. su otkrili povezanost između učinaka GvL nakon transplantacije i detekcije citotoksičnih CD8+ T stanica protiv WT-1, koji je visoko izražen u malignim hematopoetskim progenitornim stanicama (Rezvani i sur., 2007.).

3.3.3. GvL-povezani odgovori B stanica ciljaju hematopoetske progenitorne stanice

Kao što je prikazano na slici 2C–E, CML66 i CML28, utvrđeno je da su mete B stanica povezane s GvL odgovorima nakon DLI-a visoko eksprimirane u mijeloidnim progenitornim stanicama, ali ne i u zrelijim mijeloidnim stanicama (Wu i sur., 2005.). Predlažemo da kombinacija serološkog imunoprobira sa studijama ekspresije gena može učinkovito identificirati obećavajuće antigene za imunološko ciljanje matičnih stanica. Nedavno smo, s proširenim otkrivanjem antigena na meti GvL-a, temeljenim na serologiji, otkrili da je velika većina antigena povezanih s DLI izražena na CD34+ stanicama. Ispitivali smo dvije komplementarne imunoproteomske platforme, ekspresijsku biblioteku bakteriofaga i proteinski mikromrež visoke gustoće, koristeći imunoglobulin plazme nakon terapije sedam pacijenata s CML-om od kojih je svaki pokazao klinički očigledan GvL bez bolesti presatka protiv domaćina (GvHD) nakon DLI. Ukupno, 62 antigena izazvala su povećanu reaktivnost nakon DLI u usporedbi s plazmom prije DLI. Analiza ekspresije gena u normalnim i malignim mijeloidnim stanicama korištenjem HG-FOCUS i HG-U133A Affymetrix mikromreža potvrdila je da >gt70% antigena ima detektabilnu ekspresiju gena u CML CD34+ stanicama. Četiri antigena (RAB38, TBCE, DUSP12 i VPS4B) bila su izražena na višim razinama u CML-u u usporedbi s normalnim CD34+ stanicama (p < 0,002). Kao zbirka, identificirani antigeni predstavljaju potencijalne imunogene ili reagense za praćenje imunoterapeutskih strategija dizajniranih za eliminaciju matičnih stanica mijeloične leukemije (Biernacki i sur., 2007.).

Na analogan način, Spisek i sur. nedavno je opisao otkrivanje odgovora protutijela u bolesnika s poremećajem prekursora mijeloma, monoklonskom gamopatijom nepoznatog značaja (MGUS), ali ne i s mijelomom protiv SOX2, gena potrebnog za samoobnavljanje u embrionalnim matičnim stanicama. Utvrđeno je da je Sox2 visoko eksprimiran u progenitornim stanicama koje obilježavaju klonogeni odjeljak MGUS-a i da izaziva čestu staničnu imunost u bolesnika s MGUS-om. Treba napomenuti da su CTL generirani protiv ovog antigena inhibirali klonogeni rast MGUS-a in vitro. Nadalje, otkrivanje antigen-specifičnih CTL-a u bolesnika s MGUS-om bilo je povezano sa smanjenom progresijom u malignu bolest i poboljšanim kliničkim ishodom (Spisek i sur., 2007.).

4. Strategije za imunološko ciljanje populacije matičnih stanica

Prethodni odjeljci ovog pregleda saželi su veliki broj podataka koji pokazuju moć imunološkog sustava donatora za eliminaciju i dugotrajnu kontrolu malignih stanica. Kao što je shematski prikazano na slikama 3A i 3B, dok preparativni režimi za mijeloablativnu transplantaciju sami po sebi mogu smanjiti opterećenje bolesti, studije opisane u prethodnim odjeljcima pokazuju da su imunološki odgovori generirani iz presađenih imunoloških stanica dobivenih od donora ključni za konačnu eliminaciju preostale bolesti, što dovodi do izlječenja. Iako su HSCT i DLI i dalje povezani sa značajnom toksičnošću i kontrola bolesti nije postignuta u svih bolesnika, alogena transplantacija predstavlja izvrstan primjer kliničkih rezultata koji se mogu postići kroz terapiju temeljenu na imunološkim mehanizmima.


Mnogi aspekti GvL nakon alogene HSCT nisu dobro shvaćeni. Međutim, stalni napredak u karakterizaciji GvL ciljeva odgovora T i B stanica otkrio je da se čini da su klinički učinkoviti imunološki odgovori poliklonalni, usmjereni na široku paletu antigena povezanih s alo i tumorom, uključujući one s ekspresijom na progenitorne stanice, a često uključuju koordinirani stanični, humoralni i urođeni imunitet. Štoviše, klinički se odgovori lakše generiraju u uvjetima niskog opterećenja bolesti i sporo proliferirajućih tumorskih stanica, osobito kada se manje intenzivna kemoterapija i terapija zračenjem koriste za pripremu pacijenata za alogeni HSCT. Kao što je prikazano na slici 3C, GvL učinci mogu se potencijalno pojačati uključivanjem aktivnog cijepljenja primatelja nakon usađivanja donorskih stanica kako bi se inducirali ili pojačali odgovori na mHA ili antigene povezane s tumorom. Modelski sustavi sugeriraju da je ovaj pristup izvediv i potencijalno učinkovit (Anderson i sur., 2000. Duraković i sur., 2007. Luznik i sur., 2003. Teshima i sur., 2002.), ali odabir metoda za cijepljenje, kao i vrijeme i doziranje cjepiva mora uzeti u obzir sposobnost rekonstituiranog imunološkog sustava donora da odgovori na antigenski izazov i niz čimbenika pacijenta.

Ili, kao što je sugerirano na slici 3D, mogu li se principi odgovora transplantat protiv leukemije primijeniti na razvoj učinkovite tumor-specifične imunoterapije u autolognom okruženju? Točnije, mogu li polivalentni stanični i humoralni imunološki odgovori biti usmjereni na populaciju malignih matičnih ili progenitornih stanica? Optimalno bi to zahtijevalo postizanje stanja minimalne rezidualne bolesti, te bi poštedjelo nemaligne stanice, a time i smanjilo rizik od autoimunosti. Kao što je objašnjeno u ovom odjeljku, racionalno imunološko ciljanje populacije koja pokreće tumor kritično ovisi o (1) identificiranju jedinstvenih površinskih markera ovih stanica kako bi se one mogle izolirati, i (2) definiranju antigena koji su jedinstveno ili preferencijalno izraženi unutar maligne stanice s funkcijama sličnim matičnim stanicama u usporedbi s normalnim stanicama. Postizanje ovog cilja je, međutim, komplicirano jer je činjenica da je točan imunofenotip inicijalnih stanica mnogih tipova tumora (osobito solidnih tumora) trenutno vrlo kontroverzna (LaBarge i Bissell, 2008.). Pojašnjenje identiteta stanice koja inicira tumor ima važne implikacije na opseg i izvedivost korištenja imunoloških odgovora na terapijski ciljani rak: na pr. je li potrebno ciljanje na cijelu populaciju tumorskih stanica, ili samo na jednu ili na skup različitih staničnih subpopulacija. Raspravlja se o strategijama imunološkog ciljanja.

4.1. Definiranje stanice koja inicira tumor

Postizanje cilja imunološkog ciljanja na “matičnu stanicu raka” zahtijeva poznavanje preciznog imunofenotipa ove stanične populacije, tako da se mogu identificirati antigeni jedinstveni za ovu populaciju stanica. Iako je ovaj pojam konceptualno jasan i dok postoji opća suglasnost da tumori neizbježno nastaju iz stanične populacije koja se može samostalno razmnožavati i obnavljati, točno podrijetlo ove stanice predmet je velike rasprave. Kao što je prikazano na slici 4, predložena su najmanje dva različita modela za razmnožavanje tumora, na temelju eksperimentalnih dokaza (Adams i Strasser, 2008. Shipitsin i Polyak, 2008.). S jedne strane, “hijerarhijski model” ili “hipoteza o matičnim stanicama raka” temelji se na konceptu da je samo rijetka stanična populacija odgovorna za samoobnavljajuća i samopropagirajuća svojstva raka (vidi sliku 4A). Ove specijalizirane populacije stanica izvorno su identificirane kod mijeloične leukemije kao stanice s primitivnim hematopoetskim progenitornim fenotipom (CD34+ CD38−) koje bi, kada se ubrizgavaju imunodeficijentnim miševima, mogle usaditi i regenerirati istu ljudsku leukemiju. Štoviše, ustanovljeno je da se nastala leukemija može serijski transplantirati u sekundarne primatelje, dok injekcija više diferenciranih leukemijskih stanica nije mogla (Bonnet i Dick, 1997. Lapidot i sur., 1994.). Koristeći isti metodološki pristup, populacije stanica s ovim karakteristikama definirane su za niz solidnih tumora. Na primjer, Al-Hajj i dr. izvijestili su da CD24 −/niske /CD44 + frakcije iz metastatskih pleuralnih izljeva i primarnog invazivnog tumora dojke imaju veći tumorogeni potencijal kada su ubrizgane u masni jastučić dojke ženki NOD/SCID miševa nego CD24 + /CD44 +/− stanične frakcije (Al- Hajj i dr., 2003.). U prilog modelu matičnih stanica raka kod raka dojke, Liu i sur. identificirali su različiti genski potpis povezan s tumorogenim CD24 −/niskim /CD44 + staničnim populacijama u usporedbi s normalnim epitelom dojke i uočili korelaciju između ovog “invazivnog” genskog potpisa s kraćim preživljenjem bez udaljenih metastaza i ukupnim preživljenjem. Ove studije sugeriraju da prisutnost i učestalost ove stanične populacije ima prognostički značaj (Liu i sur., 2007.). Drugi istraživači koristili su markere matičnih stanica CD133 ili CD44 za pročišćavanje navodnih matičnih stanica raka u nekoliko tipova tumora (Collins i sur., 2005. Li i sur., 2007. Zhang i sur., 2008.). Treba napomenuti da je liječenje miševa presađenih ljudskim AML stanicama s aktivirajućim anti-CD44 protutijelom značajno smanjilo repopulaciju leukemije, vjerojatno zbog interferencije s AML presađivanjem matičnih stanica i sposobnosti repopulacije (Jin i sur., 2006.).


(preuzeto iz Adams i Strasser 2008 uz dopuštenje).

Alternativno, zagovornici modela “stohastičke” ili “klonske evolucije” predlažu da nije rijetka populacija, već većina tumorskih stanica sposobna za samoobnavljanje i može značajno pridonijeti održavanju tumora. Kao što je prikazano na slici 4B, oni sugeriraju da stjecanje genetskih promjena, mutacija ili određenih odgovora na znakove okoline može rezultirati stanicama koje stječu programe i funkcije slične stabljici (Kelly i sur., 2007.). Prije svega, postavljaju pitanje odražava li uspješna ksenotransplantacija – kamen temeljac prijašnjeg modela – točno in vivo biologija ljudskih matičnih stanica, ili jednostavno definira populaciju ljudskih stanica raka koja je prilagodljiva mikrookolišu miša. Stoga, oni tvrde da korištenje ove metodologije za definiranje "materijala" podcjenjuje broj stanica koje iniciraju tumor. Nekoliko linija argumenata podupire ovu alternativnu hipotezu. Prvo, Kelly i sur. pokazao je da u odsutnosti barijera ksenotransplantacije, kao što su modeli mišjeg limfoma i PU.1 nokaut AML mišji model, obje stanice sa ili bez fenotipa nalik matičnim stanicama mogu uzrokovati tumore kod miševa primatelja (Kelly i sur., 2007). Drugo, neki istraživači su istaknuli da stanični markeri koji se koriste za definiranje navodnih matičnih stanica, kao što je CD133+, mogu činiti do 20% tumora. Slično, Shipitsin i sur. otkrili da je pretpostavljena populacija matičnih stanica raka dojke, na temelju fenotipa CD24 −/niski /CD44 +, prilično velika – 12–60% tumorskih stanica (Shipitsin i sur., 2007.). Stoga ove i druge studije sugeriraju da kod slabo diferenciranih tumora, stanice s funkcijama matičnih stanica mogu činiti većinu tumorskih stanica. Konačno, i dalje postoji zabuna u vezi s točnim markerima stanične površine koji definiraju populaciju matičnih stanica. Beier i sur. pokazalo da, ovisno o analiziranom tumoru, matične stanice raka glioblastoma mogu biti ili CD133+ ili CD133-, što sugerira da markeri za matične stanice raka nisu dobro utvrđeni, ili da su sve tumorske stanice tumorogene, ali u različitom stupnju (Beier et al. ., 2007.). Slična zbrka markera nedavno je prijavljena u području raka debelog crijeva (LaBarge i Bissell, 2008.).

U pokušaju da pomire ova dva modela, Adams i sur. sugeriraju da ponašanje pojedinih karcinoma može pobliže slijediti jedan ili drugi model (Adams i Strasser, 2008.). Dakle, rast hematopoetskih karcinoma, čiji su putovi stanične diferencijacije dobro okarakterizirani, može češće pokazivati ​​hijerarhijski obrazac, dok rast solidnih tumora – tipično heterogenih bolesti i više se oslanja na potpornu infrastrukturu endotelnih stanica i fibroblasta koji formiraju intratumoralne krvne žile, i koji osiguravaju parakrine čimbenike (koji bi bili odsutni u imunodeficijentnog miša) – mogu biti u skladu sa stohastičkim obrascem. Još jedan model, također prikazan na slici 4C, spaja dva modela i predlaže da možda postoji izvorna matična stanica raka, ali da bi je stjecanje genetskih promjena od strane sekundarne stanice raka moglo učiniti sličnom stabljici, što bi rezultiralo time da postane dominantna klon (Adams i Strasser, 2008).

4.2. Imunološko ciljanje stanica koje iniciraju tumor

Implikacije različitih modela matičnih stanica raka, o kojima se raspravljalo gore, su da dok hijerarhijski model sugerira da je ciljanje male populacije matičnih stanica dovoljno za terapijsku učinkovitost, drugi zahtijeva da sve tumorske stanice budu ciljane. To je zato što potonji model sugerira da svaka tumorska stanica može steći funkcije matične stanice. Stoga će usko fokusiranje na malu fenotipski definiranu podskupinu rezultirati bijegom tumora. Dakle, čak i kod CML-a, koji se može smatrati prototipom raka matičnih stanica, identificirani su višestruki putevi kojima maligne stanice mogu steći karakteristike matičnih stanica (Passegue i sur., 2003.). Kao što je shematski prikazano na slici 5, to uključuje genetske promjene koje se stječu u najranijoj stanici programa diferencijacije, što može dovesti do povećanog preživljavanja i proliferacije stanica. S druge strane, stečene genetske promjene nizvodno od matične stanice, kao što je progenitorna stanica, mogu dovesti do povećanog kapaciteta samoobnavljanja. Stoga će razvoj imuniteta protiv samo HSC-specifičnih ciljnih antigena propustiti eliminaciju progenitornih stanica koje se samoobnavljaju.


U primjeru CML-a, povećana sposobnost maligne samoobnavljanja može proizaći iz transformacije hematopoetskih matičnih stanica (HSC) da dovede do CML-a u kroničnoj fazi ili iz više diferenciranih progenitornih stanica, da izazove CML blastne krize. Aktivnost leukemijskih matičnih stanica može biti posljedica poremećene diferencijacije, povećanog preživljavanja stanica, povećane proliferacije, povećane genomske nestabilnosti i/ili povećanog kapaciteta samoobnavljanja. Navedeni su primjeri strategija cijepljenja.

S obzirom na nesigurnost na koje stanice ciljati i koji točni imunogeni rezultiraju eliminacijom tumora, pristup koji je usvojilo nekoliko skupina bio je korištenje cijelih tumorskih stanica za cijepljenje (vidi sliku 5). Ovaj pristup nije jedinstveno usmjeren na maligne matične stanice ili progenitorne stanice, ali te stanične populacije su uključene u raspon stanica ranjivih na učinke imunizacije. Ovaj „širi“ pristup ima prednost imunizacije s tumor-specifičnim antigenima pacijenta – uključujući i mutirane i različito izražene/prezentirane antigene. To je postignuto imunizacijom ozračenim autolognim tumorskim stanicama transduciranim citokinskim genom (Soiffer i sur., 1998. Zhou i sur., 2005.), tumorskim lizatima (Jocham et al., 2004.), proteinima toplinskog šoka vezanim na peptide dobivene iz autolognih tumori (Srivastava, 2006.), ili fuzijski hibridi između autolognog tumora i dendritskih stanica ili amplificirane RNA izvedene iz tumora (Su i sur., 2003.). Na primjer, na DFCI-u, cijepljenje ozračenim autolognim stanicama melanoma dizajniranim da luče moćni citokinski adjuvans GM-CSF, prijenosom gena posredovanim adenovirusom, vjerojatno cilja na neke stanice koje iniciraju melanom budući da 29% pacijenata s metastatskim melanomom preživi minimalno praćenje od 36 mjeseci (Soiffer i sur., 2003.).

Očito ograničenje autolognih cjepiva protiv cijelog tumora jest to što njihova upotreba osigurava personaliziranje imunogena, ali se ona – po definiciji – također sastoje od tisuća normalnih autoantigena koji su prisutni u mnogim tkivima. Stoga, kako se pojačava snaga cjepiva protiv tumora u stvaranju imuniteta, očekuje se da će jaka antitumorska imunost biti povezana s istodobnom i potencijalno fatalnom autoimunošću. Ovo se može smatrati analognim indukciji GvHD-a u okruženju transplantacije.Rani znakovi ove mogućnosti uočeni su u studijama novog agensa, CTLA4-Ig blokirajućeg antitijela, koje može izazvati značajnu autoimunost kada se isporučuje zajedno s tumorskim antigenima (Attia i sur., 2005. Beck i sur., 2006. Maker et al. 2006 Phan i sur., 2003 Ribas i sur., 2005 Sanderson i sur., 2005). S druge strane, nedavne izmjene rasporeda doziranja CTLA4-Ig dovele su do prihvatljivijih razina upale (Hodi i sur., 2008. Hodi i sur., 2003.). Konkretno, sekvencijalno doziranje tako da nakon cijepljenja slijedi blokada CTLA4 rezultiralo je kliničkom disocijacijom tumorskog imuniteta i autoimunosti, iako se kršenja tolerancije još uvijek vide, što je dokazano čestom pojavom prolaznih kožnih osipa, asimptomatske bilateralne hilarne limfoadenopatije i niske kolitis stupnja. Dakle, značajan rizik za autoimunost ostaje kod imuniziranja pacijenata s velikim količinama široko izraženih antigena, posebno kada metode za stimulaciju imuniteta postaju učinkovitije.

S obzirom na ove rizike, alternativni pristup je stvaranje cjepiva koja selektivnije ciljaju stanice koje iniciraju rak. Kao primjer ovog pristupa, Pellegatta i sur. koristili su dendritske stanice napunjene neurosferama, koje su obogaćene za matične stanice glioma, za cijepljenje miševa s tumorima koji se sastoje od GL261 glioma stanica. Cijepljenje s ovim napunjenim DC-ima rezultiralo je izlječenjem 80% miševa s tim tumorima, što sugerira da je ovo visoko zaštitna strategija (Pellegatta i sur., 2006.).

Drugi istraživači su nastojali razviti definirana antigenska cjepiva, koristeći imunogene koji su dosljedno prekomjerno eksprimirani u malignim progenitornim stanicama. Ovi imunogeni se mogu isporučiti kao cijeli protein ili kao peptidi. Općenito, često korišten metodološki pristup za identifikaciju kandidata imunoterapijskih ciljeva bio je identificiranje antigena koji pokazuju preferencijalnu ekspresiju ograničenu na tumor, a zatim bioinformatičko predviđanje peptida izvedenih iz kandidata za antigen koji se može vezati na uobičajene HLA alele. Zatim se procjenjuje reaktivnost citotoksičnih T stanica prema stanicama koje predstavljaju antigen i eksprimiraju predviđeni peptid. Na ovaj način, WT-1 je dobro okarakteriziran kao antigen s gotovo isključivom ekspresijom bilo na leukemijskim CD34+ matičnim ili progenitornim stanicama, te je testiran u kliničkim ispitivanjima (Rezvani i sur., 2008.). Osim visoke ekspresije u progenitornim stanicama, također je poznato da izaziva odgovore protutijela (Elisseeva i sur., 2002. Gaiger i sur., 2001. Ling i sur., 1998.). Nadalje, CTL-ovi specifični za WT1 mogu specifično ubiti BCR-ABL + leukemijom transformirane matične stanice bez oštećenja normalnih hematopoetskih matičnih stanica in vitro ili kod miševa in vivo (Gao i sur., 2000. Oka i sur., 2000.). Nedavno je provedena studija faze I u kojoj je 26 pacijenata s dojkama, plućima, MDS-om ili AML-om cijepljeno intradermalnim injekcijama HLA-A24 ograničenih prirodnih ili modificiranih 9-mernih WT1 peptida (Oka i sur., 2004.). Osamnaest od 26 dovršilo je 3 ili više injekcija, a 12 od 20 pokazalo je kliničke odgovore poput smanjenja blastnih stanica leukemije ili veličine tumora i markera, što je jasno povezano s povećanjem učestalosti WT1-specifičnih CTL-a nakon cijepljenja. Nije uočeno oštećenje normalnih tkiva. Ostali potencijalni antigeni povezani s leukemijom ove kategorije koji se procjenjuju u kliničkim ispitivanjima uključuju antigene povezane s leukemijom RHAMM, PRAME, survivin i proteinazu 3 (Greiner i Schmitt, 2008.). Ovaj opći pristup “obrnute imunologije” primijenjen je za identifikaciju obećavajućih kandidata povezanih s tumorom antigena za cijepljenje i kod solidnih tumora (Curigliano i sur., 2006. Gnjatic i sur., 2006. Purcell i sur., 2007.).

Potencijalna treća klasa tumorskih antigena rijetko se koristila u cjepivima zbog tehničkih poteškoća u njihovoj identifikaciji (Parmiani i sur., 2007. Sensi i Anichini, 2006.). Ova klasa se sastoji od proteina s tumor-specifičnim mutacijama koje rezultiraju promijenjenim aminokiselinskim slijedom. Takvi mutirani proteini imaju potencijal: (a) jedinstveno označiti tumor (u odnosu na ne-tumorske stanice) za prepoznavanje i uništenje od strane imunološkog sustava (Lennerz i sur., 2005.) (b) izbjegavanje središnje, a ponekad i periferne tolerancije T stanica , te ih tako prepoznaju učinkovitiji receptori T stanica visoke avidnosti (Gotter i sur., 2004.). Nedavno su veliki tradicionalni pokušaji sekvenciranja pokazali da tumori sadrže mali broj mutacija vozača i veliki broj putnika, te da prosječni tumor može imati desetke do stotine nesinonimnih mutacija u regijama koje kodiraju proteine ​​(Greenman i sur. , 2007. Sjoblom i sur., 2006. Thomas i sur., 2007.). Štoviše, u silikonu analiza sekvenci izvedenih iz tumorskih i normalnih stanica kod istog pacijenta sugerira da ove somatske mutacije osiguravaju nekoliko potencijalnih neoantigena za razvoj cjepiva protiv tumora, procijenjenih na ∼10 novih epitopa po tumoru koji mogu vezati HLA-A*0201 (Segal i sur., 2008. ). Alternativne varijante spajanja BCR-ABL u bolesnika s CML-om identificirani su imunogeni (Volpe i sur., 2007.) i sugeriraju da su to također potencijalne imunološke mete za ovu bolest. Nije poznato u kojoj se fazi hijerarhije CML-a te varijante stječu. Međutim, na temelju analize BCR-ABL mutacije nakon izlaganja ABL inhibitori kinaze (Odjeljak 2), te varijante imaju veliku vjerojatnost da će biti otkrivene u matičnim stanicama CML-a.

Za kraj, mnogi koncepti otkriveni u studijama CML-a općenito su primjenjivi na zamišljanje analognih terapijskih strategija u bolesnika s drugim malignim bolestima. Nedavna identifikacija malignih stanica koje posjeduju klonogeni potencijal sugerira mogućnost da ciljanje na specifične stanične subpopulacije može doprinijeti stvaranju kurativnih odgovora. Izuzetna specifičnost adaptivnog imunološkog odgovora predstavlja priliku za ciljanje ove stanične populacije bez kolateralnog oštećenja drugih nemalignih staničnih populacija. Nedavni napredak u otkrivanju učinkovitih pomoćnih sredstava i u seciranju mehanizama koji kontroliraju negativnu imunoregulaciju pobuđuju mogućnost razvoja učinkovitih cjepiva protiv raka. U budućnosti se možemo veseliti strategijama liječenja koje će koristiti ove informacije zajedno s odgovarajućom antigenskom stimulacijom za ciljanje stanica koje iniciraju rak kako bi se razvile kurativne terapije s minimalnom toksičnošću za rak.

1. Priznanja

CJW priznaje podršku programa Claudia Adams Barr u istraživanju raka, NCI-ja (5R21CA115043-2), nagrade za liječnike i znanstvenike u ranoj karijeri Medicinskog instituta Howard Hughes, Društva za leukemiju i limfom, te je Dalinical-Runyon koji podržava CJ. (djelomično) od strane Zaklade za istraživanje raka Damon-Runyon (CI-38–07).


DOPRINOSI AUTORA

M. Schachner osmislio je studiju R. Kleene, G. Loers, D. Lutz, M. Schachner i M.K.E. Schäfer je osmislio istraživanje D. Appel, L. Congiu, G. Loers i M.K.E. Schäfer je analizirao podatke D. Appel, L. Congiu, R. Kleene, G. Loers, D. Lutz i I. Hermans-Borgmeyer izvršili su istraživanje G. Loers, M. Schachner i M.K.E. Schäfer je napisao rad.

Napomena: Izdavač nije odgovoran za sadržaj ili funkcionalnost bilo koje prateće informacije koje su dali autori. Sve upite (osim sadržaja koji nedostaje) treba uputiti odgovarajućem autoru članka.


4. Vodozemci

7 mjeseci nakon čega IgX preuzima ulogu glavnog mukoznog Ig izotipa [101,102]. Iberijski triton izražava najmanje tri izotipa teških lanaca, IgM, IgY i IgP (za Pleurodele) [101,103] koji je kasnije identificiran kao IgD ortolog [95] poput IgM i IgY vodozemaca, teški lanci IgP imaju 4 konstantne domene i transkripte jer su pronađeni i membranski i sekretorni oblici. Čini se da je ekspresija IgP ograničena na slezenu ličinke i značajno se smanjuje nakon metamorfoze [103]. Do sada se pokazalo da kineski divovski daždevnjak izražava IgM, IgD i IgY, a za svaku je identificirano više izoforma analizom transkripta i western blotingom [95].

10 puta tijekom humoralnog odgovora kod Xenopusa, za razliku od >10 000-strukog povećanja uočenog s istim antigenom u sisavaca. Analiza sekvencije teških lanaca Ig pokazuje da, iako se stopa somatskih mutacija ne razlikuje mnogo između žaba i miševa, mutacije u Xenopusu imaju tendenciju da se javljaju prvenstveno na parovima baza gvanin-citozin (GC) [110] i omjeru R/S u CDR je bio vrlo nizak. Uzeto zajedno, to sugerira da je, poput koštanih riba, odabir mutanata neoptimalan kod Xenopusa, opet zbog jednostavnije organizacije njihovih limfoidnih organa i odsutnosti organiziranih zametnih centara [107,109,110]. Unatoč tome, uočen je odgovor antitijela kod Xenopusa kao odgovor na gljivicu chytrid Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), uzročnika smrtonosne kožne bolesti chytridiomycosis koja je povezana sa svjetskim smanjenjem sluzi kože iz X. laevis koja je prethodno bila izložena Bd-u u svijetu. značajne količine IgX specifičnog za patogen, te u manjoj mjeri IgM i IgY. Nadalje, imunizacija s patogenom ubijenim toplinom inducirala je specifična IgM i IgY antitijela u serumu [111]. Ostaje da se utvrdi jesu li ova antitijela zaštitna.


(ADCC). Mehanizam kojim su prirodne stanice ubojice (NK) ciljane na stanice obložene IgG, što rezultira lizom stanica obloženih protutijelima. Fc receptor niskog afiniteta za IgG (FcγRIII također poznat kao CD16), eksprimiran je na površini NK stanica i posreduje ADCC.

Talidomid i Lenalidomid

Talidomid (α-N-ftalimidoglutarimid) je derivat glutaminske kiseline. Farmakološki je klasificiran kao imunomodulatorni lijek zbog svoje sposobnosti da promijeni ekspresiju različitih citokina i da kostimulira imunološke efektorske stanice uključujući prirodne stanice ubojice. Lenalidomid je 4-aminoglutaramidni analog talidomida s pojačanim imunomodulatornim učincima i povoljnim profilom toksičnosti u usporedbi s njegovim matičnim spojem.

Imunostimulacijski DNK kompleksi

Sintetski DNA oligonukleotidi koji sadrže nemetilirane CpG motive (CpG-ODN) koji daju signal opasnosti za imunološki sustav oponašajući aktivnost bakterijske DNA. CpG-ODN izaziva brze odgovore urođenih imunoloških stanica uključujući plazmacitoidne dendritske stanice i prirodne stanice ubojice.

Funkcionalni proces sazrijevanja NK stanica koji uključuje prepoznavanje molekula MHC klase I domaćina od strane inhibitornih receptora NK stanica. Nedostatak takvog funkcionalnog sazrijevanja sugeriran je kao jedan od mehanizama koji stoji iza hiporesponzivnosti NK stanica koje ne izražavaju inhibitorne receptore za domaćine MHC klase I molekula.

Stanje zaustavljanja rasta koje na kraju postižu stanice koje su podvrgnute ponavljanoj proliferaciji in vitro ili in vivo, koju karakteriziraju funkcionalno aktivne stanice koje nemaju ili imaju smanjeni proliferacijski kapacitet. Stareće imunološke stanice češće su u starijih osoba i u bolesnika s kroničnim upalnim bolestima.

(TReg Stanice). Mala populacija CD4 + T stanica koja eksprimira transkripcijski faktor forkhead box P3 (FOXP3) i ima regulatornu (to jest, supresorsku) aktivnost prema aktivaciji T-stanica i prirodnih stanica ubojica. Nedostatak funkcionalnog TReg-stanice je povezana s teškom autoimunošću.

Sredstvo za alkiliranje DNA koje se široko koristi kao antitumorsko sredstvo ili imunosupresivno sredstvo. Pokazalo se da ciklofosfamid prvenstveno uništava određene podskupine limfocita, uključujući B stanice i regulatorne stanice.

Purinski analog koji djeluje kao inhibitorni supstrat za ribonukleotid reduktazu, DNA polimeraze, DNA ligazu I i DNA primazu. Utječe na sintezu i transkripciju DNK. Fludarabin inducira staničnu smrt, osobito u leukemijskim stanicama, i obično se koristi u liječenju indolentne leukemije i limfoma. Fludarabin je također uključen u pripremne režime smanjenog intenziteta za transplantaciju hematopoetskih matičnih stanica.

(siRNA). Kratke dvolančane RNA od 19-23 nukleotida koje induciraju interferenciju RNA, post-transkripcijski proces koji dovodi do utišavanja gena na način specifičan za sekvencu.

To su protutijela koja su dobivena rekombinacijom varijabilnih domena iz dva protutijela s različitim specifičnostima. Bispecifična antitijela su korištena za preusmjeravanje citotoksičnih imunoloških stanica na tumorske stanice.


Gledaj video: Relejno upravljanje - Osnovne logicke funkcije (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Burgtun

    Govorit ćemo za ovo pitanje.

  2. Mansfield

    Uostalom i kao što o tome ranije nisam razmišljao

  3. Geffrey

    the Response, a sign of the wit)

  4. Makale

    Now all became clear, many thanks for the information. You have very much helped me.



Napišite poruku