Informacija

U istraživanju genoma, koji je problem u mapiranju koji može biti uzrokovan prekratkim očitavanjem?

U istraživanju genoma, koji je problem u mapiranju koji može biti uzrokovan prekratkim očitavanjem?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

U sljedećem scenariju: Dobili ste kratke sekvencije biljne RNA dobivene iz stroja za sekvenciranje sljedeće generacije (fragmenti duljine 20-30 nukleotida). Pokušavate ih mapirati natrag u genom, ali značajan dio njih se ne podudara.

Pitanje je: dajte neka očita objašnjenja zašto poravnanje kratkih sekvenci može propasti, osim moguće kontaminacije ili tehničkih poteškoća tijekom pripreme RNA.

Odgovorio bih kao zato što su čitanja kratka i zbog introna (pošto je RNA)

Drugi scenarij: Postoje neke naznake da problematične sekvence potječu od nekarakterističnog biljnog RNA virusa. Što bi sljedeće učinio? Koja su posebna upozorenja s kratkim nizom čitanja?

Dobio sam gornja pitanja, student sam informatike koji radim bioinformatiku, bilo koji biolog koji bi mogao odgovoriti bit će cijenjen


Budući da sam i bioinformatičar, nisam baš ono što ste tražili, ali radim s biljnom genetikom pa ću ipak pokušati odgovoriti.

Ono što mapirate je RNA. Dakle, kao što ste već shvatili, događaji spajanja bit će problem za mapiranje čitanja od kraja do kraja. Međutim, postoje alati koji to upravljaju, pa pretpostavimo da ste koristili jedan od njih, a još uvijek se velik dio vaših čitanja ne mapira. Da ukažem na WYSIWIG-ovu dobru poantu: Još jedan događaj koji može pokvariti vaše poravnanje je Uređivanje RNA, iako to nije previše vjerojatno da će uzrokovati da se veliki udio čitanja uopće ne uskladi.

Neki aligneri bi mogli filtar izbacite "prekratke" upite, pa se pobrinite da ne koristite jedan od njih.

Onda, imaš li ti prethodno obrađene vaša čitanja? Ako niste, možda će ostati nizovi adaptera. Ili čitanja mogu imati vrlo lošu kvalitetu, pa su također usklađena s lošom kvalitetom, pa se mogu računati kao neusklađeni.

A onda provjerite s čime se usklađujete. Mnogi objavljeni biljni genomi su također od minorne kvalitete, uključujući puno nedodijeljenih baza. Dakle, mogao bi postojati veliki udio vašeg referentnog genoma koji se računa u duljinu genoma, ali je samo Ns i ništa se tu neće uskladiti.

Na kraju, ali ne i najmanje važno, vaša bi misao o virusu također mogla biti točna. Ovisno o eksperimentu, moglo bi biti patogena RNA u svom uzorku, pa provjerite u odgovarajućoj bazi podataka.

Ako je problem samo u tome što su očitanja "prekratka" iz bilo kojeg razloga, pokušajte to učiniti sklop transkriptoma prije usporedbe s vašom referencom.


Mislim da nije moguće odgovoriti na 1. dio bez više informacija. Konkretno, koristite li maper svjesnog spajanja, kao što je Tophat? Koristite li unaprijed određeni gtf s navodnim egzonskim koordinatama? Ako je tako, je li to za izuzetno dobro proučenu biljku, kao što je Arabidopsis, ili nešto sasvim novo? Vaš odgovor nije točan, introni bi se dobro uskladili s genomom. Aligner ne zna ili ne brine da te sekvence ne bi trebale biti u uzorku, što neće utjecati na mapiranje. Osobno mislim da nema baš dobrog odgovora na to pitanje. Nije vjerojatnije da će kratka čitanja propasti nego dulja. Vjerojatnije je da će mapirati na krivo mjesto, ali to nije neuspjeh u mapiranju.


Gledajući moje gene: što mi oni mogu reći o mom mentalnom zdravlju?

Mentalni poremećaji su zdravstvena stanja koja utječu na to kako osoba misli, osjeća i djeluje. Ovi poremećaji mogu utjecati na život osobe na značajan način, uključujući način na koji se nose sa životnim događajima, zarađuju za život i odnose s drugima.

"Zašto se ovo dogodilo?" To je često pitanje koje pacijenti i njihove obitelji imaju nakon psihotične epizode, pokušaja samoubojstva ili dijagnoze mentalnog poremećaja.

Istraživanje koje je proveo i financirao Nacionalni institut za mentalno zdravlje (NIMH) pokazalo je da su mnogi mentalni poremećaji uzrokovani kombinacijom bioloških, okolišnih, psiholoških i genetskih čimbenika. Zapravo, sve veći broj istraživanja je otkrio da su određeni geni i varijacije gena povezani s mentalnim poremećajima. Dakle, koji je najbolji način da “pogledate svoje gene” i odredite svoj osobni rizik?


Koji su simptomi ahondroplazije?

Osobe koje boluju od ahondroplazije imaju abnormalan rast kosti koji uzrokuje sljedeće kliničke simptome: nizak rast s nerazmjerno kratkim rukama i nogama, kratki prsti, velika glava (makrocefalija) i specifične crte lica s istaknutim čelom (prednji dio) i hipoplazija sredine lica .

Inteligencija i životni vijek osoba s ahondroplazijom obično su normalni.

Dojenčad rođena s ahondroplazijom obično imaju slab mišićni tonus (hipotoniju). Zbog hipotonije može doći do kašnjenja u hodu i drugih motoričkih vještina. Kompresija leđne moždine i/ili opstrukcija gornjih dišnih puteva povećava rizik od smrti u dojenačkoj dobi.

Osobe s ahondroplazijom obično imaju probleme s disanjem u kojima se disanje zaustavlja ili usporava na kratka razdoblja (apneja). Ostali zdravstveni problemi uključuju pretilost i ponavljajuće infekcije uha. Odrasli s ahondroplazijom mogu razviti izraženo i trajno njihanje donjeg dijela leđa (lordoza) i povijenih nogu. Problemi s donjim dijelom leđa mogu uzrokovati bolove u leđima što dovodi do poteškoća s hodanjem.

Osobe koje boluju od ahondroplazije imaju abnormalan rast kostiju koji uzrokuje sljedeće kliničke simptome: nizak rast s neproporcionalno kratkim rukama i nogama, kratki prsti, velika glava (makrocefalija) i specifične crte lica s istaknutim čelom (prednji dio) i hipoplazija sredine lica .

Inteligencija i životni vijek osoba s ahondroplazijom obično su normalni.

Dojenčad rođena s ahondroplazijom obično imaju slab tonus mišića (hipotonija). Zbog hipotonije može doći do kašnjenja u hodu i drugih motoričkih vještina. Kompresija leđne moždine i/ili opstrukcija gornjih dišnih puteva povećava rizik od smrti u dojenačkoj dobi.

Osobe s ahondroplazijom obično imaju probleme s disanjem u kojima se disanje zaustavlja ili usporava na kratka razdoblja (apneja). Ostali zdravstveni problemi uključuju pretilost i ponavljajuće infekcije uha. Odrasli s ahondroplazijom mogu razviti izraženo i trajno ljuljanje donjeg dijela leđa (lordoza) i povijenih nogu. Problemi s donjim dijelom leđa mogu uzrokovati bolove u leđima što dovodi do poteškoća s hodanjem.


Opcije pristupa

Dobijte puni pristup časopisu na 1 godinu

Sve cijene su NETO cijene.
PDV će biti dodan kasnije na naplati.
Obračun poreza bit će dovršen tijekom naplate.

Dobijte vremenski ograničen ili potpun pristup članku na ReadCubeu.

Sve cijene su NETO cijene.


Što je sekvenciranje DNK?

Sekvenciranje znači određivanje točnog reda parova baza u segmentu DNK. Ljudski kromosomi imaju raspon od oko 50.000.000 do 300.000.000 parova baza. Budući da baze postoje kao parovi, a identitet jedne od baza u paru određuje drugog člana para, znanstvenici ne moraju prijaviti obje baze para.

Primarna metoda koju je HGP koristio za proizvodnju gotove verzije ljudskog genetskog koda bila je sekvenciranje temeljeno na karti ili BAC-u. BAC je akronim za "bakterijski umjetni kromosom". Ljudska DNK je fragmentirana na komade koji su relativno veliki, ali još uvijek upravljivi u veličini (između 150 000 i 200 000 parova baza). Fragmenti se kloniraju u bakterijama koje pohranjuju i repliciraju ljudsku DNK tako da se može pripremiti u količinama dovoljno velikim za sekvenciranje. Ako se pažljivo odabere kako bi se preklapanje minimiziralo, potrebno je oko 20.000 različitih BAC klonova da bi sadržavali 3 milijarde parova baza ljudskog genoma. Zbirka BAC klonova koja sadrži cijeli ljudski genom naziva se "BAC biblioteka".

U metodi koja se temelji na BAC-u, svaki BAC klon se "mapira" kako bi se odredilo odakle dolazi DNK u BAC klonovima u ljudskom genomu. Korištenje ovog pristupa osigurava da znanstvenici znaju i točan položaj DNK slova koja su sekvencionirana iz svakog klona i njihov prostorni odnos prema sekvenciranoj ljudskoj DNK u drugim BAC klonovima.

Za sekvenciranje, svaki BAC klon je izrezan na još manje fragmente duljine oko 2000 baza. Ti se dijelovi nazivaju "podklonovi". Na tim se subklonovima provodi "reakcija sekvenciranja". Produkti reakcije sekvenciranja zatim se učitavaju u stroj za sekvenciranje (sekvencer). Sekvenser stvara oko 500 do 800 parova baza A, T, C i G iz svake reakcije sekvenciranja, tako da se svaka baza sekvencira oko 10 puta. Računalo zatim sastavlja te kratke sekvence u neprekidne dijelove sekvence koje predstavljaju ljudsku DNK u BAC klonu.

Sekvenciranje znači određivanje točnog reda parova baza u segmentu DNK. Ljudski kromosomi imaju raspon od oko 50.000.000 do 300.000.000 parova baza. Budući da baze postoje kao parovi, a identitet jedne od baza u paru određuje drugog člana para, znanstvenici ne moraju prijaviti obje baze para.

Primarna metoda koju je HGP koristio za proizvodnju gotove verzije ljudskog genetskog koda bila je sekvenciranje temeljeno na karti ili BAC-u. BAC je akronim za "bakterijski umjetni kromosom". Ljudska DNK je fragmentirana na komade koji su relativno veliki, ali još uvijek upravljivi u veličini (između 150 000 i 200 000 parova baza). Fragmenti se kloniraju u bakterijama koje pohranjuju i repliciraju ljudsku DNK tako da se može pripremiti u količinama dovoljno velikim za sekvenciranje. Ako se pažljivo odabere kako bi se preklapanje minimiziralo, potrebno je oko 20.000 različitih BAC klonova da bi sadržavali 3 milijarde parova baza ljudskog genoma. Zbirka BAC klonova koja sadrži cijeli ljudski genom naziva se "BAC biblioteka".

U metodi temeljenoj na BAC-u, svaki BAC klon se "mapira" kako bi se odredilo odakle dolazi DNK u BAC klonovima u ljudskom genomu. Korištenje ovog pristupa osigurava da znanstvenici znaju i točan položaj DNK slova koja su sekvencionirana iz svakog klona i njihov prostorni odnos prema sekvenciranoj ljudskoj DNK u drugim BAC klonovima.

Za sekvenciranje, svaki BAC klon je izrezan na još manje fragmente duljine oko 2000 baza. Ti se dijelovi nazivaju "podklonovi". Na tim se subklonovima provodi "reakcija sekvenciranja". Produkti reakcije sekvenciranja zatim se učitavaju u stroj za sekvenciranje (sekvencer). Sekvenser stvara oko 500 do 800 parova baza A, T, C i G iz svake reakcije sekvenciranja, tako da se svaka baza sekvencira oko 10 puta. Računalo zatim sastavlja te kratke sekvence u neprekidne dijelove sekvence koje predstavljaju ljudsku DNK u BAC klonu.


3. Opis referentne vrijednosti

3.1. Skupovi podataka

Alati za mapiranje ocjenjuju se u dva slična eksperimenta. Prvi eksperiment (nazvan u nastavku) izvodi se na ljudskom genomu (25 kromosoma za 2,7 Gbp). Drugi eksperiment (nazvan ) izvodi se na bakterijskim genomima (904 genomske sekvence za 1,7 Gbp).

U eksperimentu provedenom na ljudskom genomu ( ), referentni genom je uzet iz sklopa 37.1 koji je izradio NCBI. Napravili smo dva skupa čitanja, sve duljine 40. Prvi skup čitanja ( ) sastoji se od 10 milijuna očitanja jednoliko izvučenih iz referentnog genoma . Crtanje se radi s wgsimom. 1 Ljudski kromosomi ponekad sadrže veliki udio, čak 30%, slova N. Mapiranje čitanja s dugim nizovima N je malo informacija za procjenu učinkovitosti alata za mapiranje jer bi se ta očitanja trebala mapirati na brojnim mjestima. Stoga smo prethodno odlučili ukloniti nizove dulje od 10 Ns iz referentnog genoma. 2 Većina čitanja (8,877,107) iz događa se samo jednom, 3 ali neka se čitanja mogu ponoviti više puta duž referentnog genoma kao što je prikazano na slici 8. Za čitanja koja se događaju više puta, srednji broj pojavljivanja je 722,81 sa standardnim odstupanje od 2424,86. Štoviše, najčešće čitanje događa se 53.162 puta. Drugi skup čitanja ( ) izgrađen je od dodavanja točno tri neslaganja svakom čitanju. Stoga sadrži i 10 milijuna čitanja. Svjesni smo da je mala vjerojatnost da će moderni sekvenceri proizvesti očitanja s takvom stopom pogreške, ali razlog za ovaj skup podataka je da mnogi projekti sada proizvode ponovno sekvenciranje i metagenomske podatke, koji se mogu uvelike razlikovati od već sekvenciranih genoma. Pozicije za tri neusklađenosti izvlače se jednoliko unutar 40 pozicija. 4 Nukleotid A, C, G ili T mutiran je u bilo koji od tri druga nukleotida s jednakom vjerojatnošću 1/3, dok je N mutiran u A, C, G ili T s vjerojatnošću 1/4. Među 10 milijuna čitanja iz i, samo 49 čitanja sadrži neke N-ove broj N-ova po čitanju dat je u tablici 1.

Sl. 8. Histogram logaritma broja pojavljivanja 1.122.893 (odnosno 2.620.394) čitanja iz (odnosno ) koja se pojavljuju više od jednom u referentnom genomu (lijevo) (odg. (pravo)).

Tablica 1. Broj čitanja s zadanim brojem Ns, iz svakog od četiri skupa podataka , , ,

U drugom eksperimentu ( ), referentni genom se sastoji od 904 bakterijska genoma pronađena u Genome Reviews izdanju 111.0 (Kersey i sur., 2005.). Također smo napravili dva seta čitanja od 40 bps. Prvi skup čitanja () sastoji se od 10 milijuna čitanja jednoliko izvučenih iz . 5 Postoji 7 379 606 čitanja s jedinstvenim pojavljivanjem i 2 620 394 čitanja koja se pojavljuju više puta (prosjek 8,82 i SD 39,03). Najčešće čitanje iz događa se 1685 puta. Drugi skup čitanja () izgrađen je od jednolikog dodavanja tri nepodudaranja u svakom čitanju kao što je opisano za . 231 čitanje iz i 219 čitanje iz sadrži neke Ns (tablica 1).

3.2. Alati za mapiranje

Procijenili smo izvedbu sljedećih devet alata za mapiranje: BWA_v0.5.8, Novoalign_v2.06.09, Bowtie_v0.12.7, SOAP_v2.20, BFAST_v0.6.5a, SSAHA2_v2.5.2, MPscan, GASSST_v1.9.2.

Tablica 2 okuplja globalne karakteristike alata, odnosno vrstu algoritama na kojima se temelje, njihov izlazni format, njihovu sposobnost da dopuste nepodudarnosti i/ili indele u poravnanjima i mogu li koristiti više niti.

Tablica 2. Globalne karakteristike alata za kartiranje

SAM, karta poravnanja sekvenci.

Dodatne informacije sada se daju zasebno za svaki alat, posebno o načinu izvođenja usporedbi. Za svaki alat, naš je cilj doista dohvatiti sva poravnanja (takozvana pogotka u nastavku), bilo bez nepodudaranja ili s najviše 3 nepodudaranja, naših čitanih skupova podataka (vidi odjeljak 3.1).

3.2.1. BWA

Izvođenje BWA sastoji se u korištenju uzastopnih tri naredbe: prva (bwa indeks) indeksira referentni genom, druga (bwa aln) pronalazi koordinate pogodaka svakog pojedinca pročitanog u nizu sufiksa, a posljednja (bwa samse ) pretvara koordinate niza sufiksa u referentne koordinate genoma i generira poravnanja u SAM formatu. Prema zadanim postavkama, u drugom koraku radi se neiscrpna pretraga kako bi se smanjilo vrijeme izračunavanja, a zatim smo koristili opciju −N da onemogućimo ovo ponašanje i tražimo sve moguće pogotke. Korištenje ove opcije ili ne ima dramatičan učinak na rezultate kada su nepodudarnosti dopuštene, kao što ćemo vidjeti u sljedećem odjeljku. Moguće je postaviti maksimalni broj nepodudaranja po pogotku (opcija −n u drugom koraku) i također po sjemenu (opcija −k) koristili smo istu vrijednost za oba parametra. Štoviše, može se odrediti maksimalni broj pogodaka za izlaz (opcija -n u trećem koraku). Ako čitanje ima više pogodaka u referenci, izlazni pogoci se nasumično biraju. Jedini način za dobivanje svih pogodaka po čitanju je postavljanje maksimalnog broja pogodaka za izlaz na vrijednost veću od maksimalnog broja pojavljivanja čitanja u svakom skupu čitanja. Zatim smo uzeli granice 54 000 za i , 6 i 2 000 za i 7 BWA nasumično mijenja Ns u referentnom genomu u regularne nukleotide.

3.2.2. Novoalign

Pokretanje Novoalign-a sastoji se od pokretanja dvije uzastopne naredbe: prva (novoindex) indeksira referentni genom, a druga (novoalign) poravnava očitanja s indeksiranom referencom. Novoalign (barem u njegovoj akademskoj verziji) ne dopušta korisniku postavljanje maksimalnog (ili točnog) broja nepodudarnosti između očitanog i referentnog genoma. Zatim smo naknadno obrađivali rezultate kako bismo dohvatili točna podudaranja ( i ) ili podudaranja s najviše tri nepodudaranja ( i ). Za čitanja s više pogodaka, moguće je prijaviti sve pogotke (opcija −r A) ili najviše fiksni broj nasumično odabranih pogodaka.

3.2.3. Leptir leptir

Pokretanje Bowtie sastoji se od uzastopne upotrebe dviju naredbi, bowtie-build koja indeksira referentni genom i bowtie koja uzima indeks i skup čitanja kao ulaz i izlazi popis poravnanja. Kravata leptir omogućuje korisniku da postavi maksimalni broj nepodudaranja po pogotku (opcija -v). Prema zadanim postavkama, Bowtie vraća samo jedan pogodak po čitanju ako se želi dohvatiti više ili sve pogodaka po čitanju, potrebno je navesti maksimalni broj pogodaka za prijavu (opcija -k). Što se tiče BWA, ovaj maksimalni broj trebao bi biti postavljen na maksimalni broj pojavljivanja skupa čitanja 8 za dohvat svih pogodaka. Poravnanja koja uključuju jedan ili više dvosmislenih znakova, kao što je Ns, u referenci, Bowtie smatra nevažećim, dok u obzir uzimaju nepodudarnosti ako pripadaju čitanjima.

3.2.4. SOAP2

Izvođenje SOAP2 sastoji se u korištenju uzastopnih dviju naredbi: prva (2bwt-builder) stvara Burrows-Wheeler indeks referentnog genoma, a druga (sapun) izvodi poravnanje. SOAP2 dopušta korisniku da postavi maksimalni broj nepodudaranja po pogotku (opcija -v), ali ovaj maksimalni broj je ograničen na 2. SOAP2 sustavno ispisuje sva učitavanja (nema ograničenja). Nemapirana čitanja mogu se dobiti u FASTA datoteci. Čini se da SOAP2 zamjenjuje sve N-ove u čitanjima s G.

3.2.5. BFAST

Pokretanje BFAST-a zahtijeva pet koraka: (1) referentni genom se prvo prepisuje u posebnom formatu (bfast fasta2brg), (2) bfast indeks indeksira referentni genom korištenjem razmaknutih sjemenki koje je postavio korisnik (ovaj korak treba učiniti s nekoliko sjemena, što je dovelo do nekoliko indeksa, upotrijebili smo 10 sjemenki predloženih u Homer et al., [2009]), (3) tada naredba bfast match uzima skup čitanja i pretražuje skup indeksa kako bi pronašla kandidatske lokacije poravnanja (ili CAL-ove) za svako čitanje, (4) naredba bfast localalign uzima CAL-ove za svako čitanje i izvodi lokalno poravnanje s referencom, i (5) konačno se kreira izlazna datoteka (brzi postproces). Što se tiče Novoaligna, korisnik ne može postaviti maksimalni (ili točan) broj nepodudaranja, pa smo naknadno obrađivali izlazne pogotke. BFAST može ispisati sve pogotke (opcija -a).

3.2.6. SSAHA2

Izvođenje SSAHA2 sastoji se od dva koraka: indeksiranja referentnog genoma (naredba ssaha2Build) i mapiranja čitanja (ssaha2). Moguće je odrediti broj dopuštenih nepodudarnosti ili ekvivalentno postotak identiteta (opcija -identitet). Broj prijavljenih pogodaka po čitanju ograničen je na 500 i ne može se promijeniti. Tražili smo "najbolje" (Smith-Waterman rezultat) preslikavanje za svako čitanje (−najbolji 1), što se čini prikladnim za točno preslikavanje, ali vjerojatno ne za i (zapravo smo također koristili −najbolji 0 u slučaju nepodudaranja).

3.2.7. MPscan

Za pokretanje MPscan-a postoji samo jedna naredba (mpscan), ali se mora koristiti dvaput, jedna za mapiranje na izravnom nizu, a druga za obrnuti niz (opcije −rev −ac). Nepodudaranje nije dopušteno u poravnanjima i sva se poravnanja prijavljuju u izlaznoj datoteci (ne u SAM formatu).

3.2.8. GASSST

Koraci indeksiranja i mapiranja izvode se izdavanjem naredbe Gassst. Moguće je odrediti broj dopuštenih nepodudarnosti ili ekvivalentno postotak identiteta (opcija -p). Kako bismo iscrpno dohvatili sve pogotke za svako čitanje, onemogućili smo proces filtriranja koji se koristi prema zadanim postavkama za smanjenje vremena izračuna (opcija -l 0) i postavili smo osjetljivost na maksimalnu vrijednost (opcija -s 5). Poravnanja koja uključuju dvosmislene znakove nužno uzimaju u obzir nepodudarnosti. GASSST izvješćuje o poravnanjima u određenom formatu, a izlazna datoteka se može pretvoriti u SAM format korištenjem naredbe gassst_to_sam što se činilo prilično dugotrajnim.

3.2.9. PerM

Koraci indeksiranja i mapiranja izvode se pokretanjem naredbe perm. Moguće je postaviti maksimalni broj nepodudaranja po pogotku (opcija −s) i odrediti maksimalan broj pogodaka za pronalaženje (opcija −k). Da bismo prijavili sve pogotke, postavili smo prethodnu opciju na najveći broj pojavljivanja pronađenih u našim setovima za čitanje (kao za Bowtie i BWA) i također smo aktivirali opciju "sve" -A. Konačno, budući da neka od čitanja sadrže neke Ns (tablica 1), koristili smo opciju ––includeReadsWN nakon čega slijedi 40, 37 ili 10 ovisno o skupu za čitanje.


MATERIJALI I METODE

Sekvenciranje

Sekvenciranje Bacillus subtilis genom je izveden korištenjem Illumina GA II. Genomska DNK od B. subtilis ekstrahiran je s kompletom DNeasy Blood and Tissue (Qiagen). Knjižnice ove genomske DNK pripremljene su prema protokolu proizvođača (Illumina) (8). Pet mikrograma genomske DNA fragmentirano je na prosječnu duljinu od 200 bp korištenjem Covaris S2 sustava (Covaris). Fragmentirana DNA popravljena je korištenjem T4 polinukleotid kinaze i Klenow fragmenta (New England Biolabs), a 3'-kraj popravljene DNA je adeniliran korištenjem Klenow fragmenta (New England Biolabs). Zatim, Index PE Adapters Oligo Mix (Illumina) je ligiran na fragmente korištenjem Quick T4 DNA ligaze (New England Biolabs). Proširenje adaptera na 5′-kraju i obogaćivanje biblioteke izvedeno je korištenjem 18 ciklusa PCR-a s primerima InPE1.0, InPE2.0 i PCR indeksnim primerom (Illumina). Generacije klastera izvedene su na Illumina cluster stanici koristeći Paired-End Cluster Generation Kit v4. Sedamdeset i šest ciklusa multipleksiranog uparenog sekvenciranja provedeno je korištenjem Illumina GA II sustava sa SBS 36-ciklusnim kompletom za sekvenciranje v4, prema specifikacijama proizvođača. Nakon što su reakcije sekvenciranja dovršene, za obradu sirovih podataka sekvenciranja korišten je Illumina analizator (CASAVA 1.6.0). Referentni slijed mapiranja bio je B. subtilis str. 168 (NC_000964.3). Očitani podaci (DRX000504) pohranjeni su u DRA (DDBJ Sequence Read Archive).

Analiza podataka

Napravili smo novi softverski program za mapiranje čitanja sekvencera Illumina (MPSmap) i vizualizaciju rezultata mapiranja (PSmap). Detaljan opis i procjena softvera pojavit će se na drugom mjestu ovdje, ukratko opisujemo našu metodu. U početku, jednostavan indeks od k -mers je pripremljen za referentnu sekvencu. Zatim su sve baze očitanja uspoređene s referentnim za svako podudaranje indeksa očitanja. Ova je usporedba provedena za sva podudaranja indeksa i identificirana je najbolja pozicija za svako očitanje. Ograničenje indeksnog pristupa je to što se neke od pozicija bliskog podudaranja možda neće identificirati ako postoje neusklađenosti unutar indeksa. Kako bismo minimizirali ovaj problem, ponovili smo pretraživanje indeksa dok smo pomicali poziciju indeksa na sekvencama čitanja. Na primjer, tri puta smo ponovili pretraživanje indeksa kako bismo ispravno locirali pozicije za čitanje, dok smo dopuštali dva nepodudaranja. Slično, ponovili smo pretraživanje indeksa ( n + 1) puta, gdje n je broj nepodudaranja po čitanju dopuštenih u pretraživanju. Svaki indeksni pogodak poravnava se na referenci kako bi se tražila najbolja lokacija, dopuštajući do navedenog broja nepodudaranja bez praznine. Indeksni pristup je brz, ali ne jamči osjetljivost za čitanja kraća od k ( n + 1), gdje, k je duljina indeksa. Za mapiranje od B. subtilis dopuštajući 35 nepodudarnosti, usporedili smo pretraživanja s duljinama indeksa od k = 2 i k = 10 kako bi se potvrdilo da je razlika u rezultatima mala (Dopunska tablica S1). Također smo izvršili mapiranje s BWA i BFAST koristeći Tablet (29) za vizualizaciju, kako bismo potvrdili da više algoritama za mapiranje otkriva SSE (Dopunski podaci S1). Program za vizualizaciju (PSmap) pretvara rezultate mapiranja u PostScript datoteku. Programi, izvršni na sustavima Linux (CentOS5.3) i MacOSX (ver. 10.6.6), dostupni su za preuzimanje na našoj web stranici (http://metalmine.naist.jp/maps/).

Javni podaci

Analizirali smo nekoliko javnih skupova podataka preuzetih sa poslužitelja baze podataka SRA u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI). Pristupni brojevi ovih uzoraka i odgovarajući referentni nizovi su ERX006616 (NC_02945.3 Mycobacterium bovis AF2122/97), SRX007714 (NC_010079, NC_012417.1 i NC_010063.1 Staphylococcus aureus USA300) i ERX002218 (NC_002929.2 Bordetella pertussis Tohama I).


Sažetak

Sekvencioniranje s jednom molekulom u stvarnom vremenu koje je razvio Pacific BioSciences nudi duže duljine čitanja od tehnologije sekvenciranja druge generacije (SGS), što ga čini vrlo prikladnim za neriješene probleme u istraživanju genoma, transkriptoma i epigenetike. Visoko susjedni de novo skupštine korištenje PacBio sekvenciranja može zatvoriti praznine u trenutnim referentnim sklopovima i karakterizirati strukturne varijacije (SV) u osobnim genomima. Dužim čitanjem možemo sekvencirati kroz proširena područja koja se ponavljaju i otkriti mutacije, od kojih su mnoge povezane s bolestima. Štoviše, sekvenciranje PacBio transkriptoma je korisno za identifikaciju izoforma gena i olakšava pouzdana otkrića novih gena i novih izoforma označenih gena, zbog svoje sposobnosti sekvenciranja transkripata pune duljine ili fragmenata značajnih duljina. Osim toga, PacBio tehnika sekvenciranja pruža informacije koje su korisne za izravno otkrivanje osnovnih modifikacija, kao što su metilacija. Uz samo korištenje PacBio sekvenciranja, mnogi hibridno sekvenciranje razvijene su strategije za korištenje preciznijih kratkih čitanja u kombinaciji s PacBio dugim čitanjem. Općenito, hibridno sekvenciranje strategije su pristupačnije i skalabilnije, posebno za male laboratorije nego korištenje samo PacBio sekvenciranja. Pojava PacBio sekvenciranja učinila je dostupnim mnogo informacija koje se nisu mogle dobiti samo putem SGS-a.


Rasprava

Nedavna dostignuća u tehnologijama sekvenciranja predstavljaju priliku za brzo i po niskoj cijeni izvođenje sekvenciranja cijelog genoma laboratorijskih sojeva. To omogućuje učinkovito otkrivanje genetskih razlika između sojeva na molekularnoj razini. Nadalje, nove tehnologije sekvenciranja nude mogućnosti za razvoj novih aplikacija i/ili za uvelike pojednostavljenje prethodno napornih eksperimenata, kao što je detekcija točkastih mutacija. U ovom smo izvješću istražili nekoliko korisnih programa metode sekvenciranja sljedeće generacije za razumijevanje biologije dobro proučene bakterije— B. subtilis. Pokazali smo da se nova platforma za sekvenciranje sačmarica Solexa, koja čita veliki volumen kratkih fragmenata DNK, može koristiti za dobivanje više vrsta genomskih informacija iz laboratorijskih sojeva B. subtilis. Prvo, ova tehnologija je lako primjenjiva za otkrivanje mutacija. Dobivene su genomske sekvence široko korištenih sojeva JH642, 168, SMY i NCIB 3610 te su identificirane poznate mutacije kao i dosad nepoznate promjene. Ovi rezultati pokazuju da je izravno sekvenciranje vrlo osjetljiv i točan pristup za otkrivanje supstitucija jedne baze. Drugo, otkrili smo velike delecije od 18 kb i 9 kb, kao i deleciju jednog gena (relA) u sojevima izvedenim iz JH642. Ono što je najvažnije, ova metoda omogućuje identifikaciju višestrukih mutacija supresora u jednom soju i stoga pruža moćan alat za rješavanje često teškog problema identifikacije supresora.

Izravno sekvenciranje kao novi alat i njegovo daljnje poboljšanje

Veliki napor koji smo uložili tijekom obrade informacija o sekvenciji bio je postizanje točnosti, kombiniranjem neovisnih metoda sastavljanja sekvenci (MAQ, SOAP i Edena) za obradu očitanja iz analizatora genoma. Zatim smo potvrdili i nadopunili rezultate uzorkovanjem Sangerovim sekvenciranjem i opsežnom eksperimentalnom provjerom.

Ažurirani nacrt 168 referentnog niza

Naše ponovno sekvenciranje 168 referentnog genoma otkrilo je � supstitucije baza, uz insercije i delecije. Uspjeli smo testirati točnost očitavanja Solexe na nekoliko neovisnih načina i isključiti pogreške u sekvenciranju Solexe kao vjerojatni uzrok ovih razlika. To ne čudi jer je izvorni nacrt objavljen prije više od deset godina [4]. Nadalje, primijetili smo da gubitak izogenosti između neovisnih izolata istog soja nije bio dovoljno visok da objasni uočene razlike. Također smo otkrili regije s većom varijansom sekvence, što je vjerojatno zbog razlika sojeva u segmentima DNK korištenih u konzorciju za sekvenciranje iz 1997. (Danchin A, osobna komunikacija). Stoga smo zaključili da se referentna sekvenca može ažurirati na temelju naših Solexa rezultata (pristupni broj projekta DDBJ/EMBL/GenBank <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"ABQK00000000","term_id ":"195984424">> ABQK00000000). Ova verzija ne uključuje neku heterogenost koju smo primijetili u operonima ribosomske RNA, budući da se oni ne mogu mapirati samo sekvenciranjem sačmarice. Uz naš nacrt, u pripremi je cjelovito ažuriranje prethodno objavljene sekvence 168 [4] s komentarima i koja će koristiti B. subtilis zajednica strahovito (Danchin A, neobjavljeno).

Pročitajte Pokrivenost i CGH

Komparativna hibridizacija genoma (CGH) je tehnologija zasnovana na mikromrežu za proučavanje genomskih preuređivanja uključujući duplikacije i delecije u više organizama, a korištena je za proučavanje statusa replikacije DNA u bakterijama, uključujući E coli i B. subtilis [32], [33]. Proučavajući pokrivenost sekvence, otkrili smo da izravno sekvenciranje i brojanje pokrivenosti čitanjem predstavlja alternativu hibridizaciji mikromreža kao CGH metodi (slika 1), zaobilazeći probleme zbog nespecifične hibridizacije u metodama mikromreža. Pokrivenost čitanja je broj kratkih fragmenata DNA koje čita analizator genoma, a taj broj treba biti proporcionalan broju fragmenata DNA u specifičnoj genomskoj regiji koja je prisutna u ulaznoj DNK. Oblik krivulje pokrivenosti očitavanjem varira ovisno o uvjetima rasta i gotovo je ravan za stanice u stacionarnoj fazi (Slika 1A, C, D, E), što ukazuje da te stanice imaju potpuno repliciranu DNK, kako se očekivalo. Zanimljivo je da je pokrivenost nešto veća oko početka replikacije, a najniža je u blizini terminatora replikacije, vjerojatno zato što je mala podpopulacija stanica još uvijek replicirala DNK. Važno je da smo u uzorku koji se aktivno replicira (Slika 1B, F) pronašli mnogo veću pokrivenost čitanja u blizini ishodišta (na genomskom položaju 0/4,2 Mbp), a ne u krajnjoj regiji (na genomskom položaju 2,1 Mbp). Pri višoj razlučivosti primijetili smo šum u pokrivenosti, koji odgovara različitim sadržajima AT-a. Ne znamo u kojem je koraku došlo do ovog specifičnog obogaćivanja AT sekvenci, međutim, to se može potencijalno eliminirati ako koristimo kartu pokrivenosti stacionarne faze kao referencu za ispravljanje sadržaja AT i drugih nepoznatih varijacija. Pokrivenost čitanjem također daje točne informacije visoke razlučivosti o brisanjem, čak i do razine jednog gena, kao što je prikazano relA- (Slika 1E, F i umetak).

Grupiranje mutacija

Naši rezultati sekvenciranja otkrili su regije s visokom gustoćom varijacija sekvenci između srodnih sojeva (slika S1). Te su regije mogle nastati na dva moguća načina. Prvo, ove regije mogu biti vrlo promjenjive. Regije hiper-mutabilnosti su vizualizirane prije [34], a metode sekvenciranja cijelog genoma mogle bi ubrzati karakterizaciju ovih promjena, učinkovito olakšavajući napore za razumijevanje mehanizama genomske nestabilnosti, važnog čimbenika u tumorigenezi. Second and more likely, these regions might correspond to DNA of foreign origin. For example, we observed changes clustered in a 4 kb region that were likely to have arisen by horizontal gene transfer during the genetic manipulation to obtain JH642 (Figure S1). These changes are very difficult to find with traditional methods but can be easily identified by plotting the mutation distribution as shown in Figure S1. In addition, we found that the majority of the differences between 168 and SMY were located within a 6.4 kb span that includes the trpC-D-E, aroH-B-F i cheR genes (Figure S1). This heterogeneous cluster was identified previously by the comparison of two laboratory strains (L1437 and JH642) by microarray analysis [35],[36], and is shown to be acquired by horizontal transfer of DNA from a related Bacil strain (Zeigler D, unpublished). We found that the genomic sequences of NCIB 3610 and 168 were highly similar, suggesting that they are closely related, supporting results from an independent study showing that NCIB 3610 is most likely the ancestor of 168 (Zeigler D, personal communication).

There are certain limitations to our current method. For example, while using MAQ to perform variant identification, we eliminated false positives by raising the quality score cutoff to 40. This cutoff score was chosen empirically, by shuffling and randomly dividing the Solexa sequence reads of one genome, calling the sequences independently, comparing independent calls and choosing a score that did not give any discrepancies ( Figure 2 ). We verified that the scores obtained by MAQ were very close to the Phred scores, indicating that score 40 meant that the error rate was 0.01%. If all bases had a score of 40, we would expect � errors per genome (0.01 errors for every 100 bases of the 𢏄 megabase genome). However, since most bases had scores much higher than 40, the final number of errors per genome is much closer to 0. This helped us to limit false positives so that almost all changes that we identified were bona-fide genetic differences. When this cutoff value was lowered, we obtained dramatically increased false positives. However, as a trade-off, we might not have been able to identify certain existing changes that had lower quality scores. It is also possible that the error rate we obtained might be an underestimate if there are systematic errors, although we did not identify any systematic errors while verifying our results by Sanger sequencing. In addition, although our shotgun sequencing originally identified a large number of insertions and deletions, many of these were not included in our current draft sequence since we used a high threshold to prevent the inclusion of false positives. If these changes are real, they are likely to have significant impacts including the disruption of open reading frames, which sometimes results in dominant negative or null alleles. Verification of these changes will lead to further updated versions. Similarly, certain large deletions are also not reflected in our present draft. Our current approach is also insufficient for detecting heterogeneities, such as mutation rates, in a given cell population. This is because the inherent error rate of each read is higher than the spontaneous mutation rate in cells, while each sequence call is based on the majority consensus. Despite these potential limitations, we were able to obtain a considerable number of genetic insights using whole genome shotgun sequencing. Finally, with the improvement of sequence analysis software and wider use of de novo sequence assembly programs, this method can be used to detect additional types of mutations, including DNA rearrangements.

Genome Diversity and Phenotypic Variations between Laboratory Strains

B. subtilis is one of the most extensively investigated Gram-positive bacteria. Microarray-based comparative genomic hybridization (M-CGH) studies have demonstrated that there is considerable genome diversity within naturally occurring populations of B. subtilis strains collected from diverse geographic locations [19]. Much of the diversity was attributed to genes required for phage-related functions or those which were likely acquired by horizontal transfer. Other genes that were found to diverge significantly included those that encoded environmental sensors, detoxifying enzymes and proteins involved in antibiotic production. Essential metabolic functions were mostly encoded by less divergent genes in different populations of B. subtilis. Overall, as many as 28% of the genes in these strains were found to be significantly different from 168. However, between the two cultivated B. subtilis strains 168 and NCIB 3610, M-CGH studies revealed almost no significant sequence divergence [19]. The whole genome sequences of B. subtilis and its close relatives that have evolved in nature are available [37] (http://www.bacillusgenomics.org/bsubtilis).

Using whole genome sequencing to achieve near-complete coverage, we compared, base by base, the differences between related laboratory strains that have 𠆎volved’ in different laboratories, and between independent isolates of several strains. We confirmed that the genomes of 168 and NCIB 3610 have few base differences, and that NCIB 3610 possesses an extra-chromosomal plasmid, that we named pAS32 [19]. We also found that individual isolates of the same strain appear to be quite isogenic, differing by only tens of bases. In particular, two different isolates of JH642 utilized in different laboratories only diverge by 𢏆 bases (The actual difference between the isolates might be even smaller, since we sequenced only a single colony per isolate after streaking it out on LB plates, potentially introducing further mutations). Among these 6 variants, only 3 are missense mutations, and they are in the genes yckJ, phoB and ylmF, which encode a putative L-cystine permease, a secreted protein induced by phosphate starvation, and a hypothetical cell division protein, respectively. We have not examined the possible phenotypic differences resulting from these three missense mutations, and it remains possible that there may not be any phenotypic differences between the two isolates of JH642. Such studies provide a reasonable framework for estimating the reproducibility of experimental results obtained with independently propagated isolates.

We further discovered that several laboratory strains that are reportedly related also display tens to hundreds of base differences and insertions and deletions, including regions of horizontal transfer. Some of the variations we identified lead to phenotypic differences. For example, we discovered a novel defect in the citrate signal transduction pathway of JH642. citS encodes the histidine kinase sensor of a two-component system regulating the transport of citrate into B. subtilis. JH642, unlike its ancestral strains, has a loss of function mutation in citS, leading to the inability to utilize citrate as a carbon source. The revelation and our subsequent experimental verification of this defect demonstrate the power of whole-genome sequencing.

Tripartite Genetic Interaction between (p)ppGpp Synthases in B. subtilis

B. subtilis is a powerful model system to identify genetic pathways. One common approach to identify components of a given genetic pathway is through genetic modifier screens- enhancer and suppressor screens. However, identification of the molecular nature of the mutations obtained in a genetic screen is often laborious. Furthermore, in some cases, it can be difficult to identify mutations using traditional genetic mapping for example, in the absence of an expression library or when the phenotype observed is due to the combinatorial effect of multiple mutations rather than one mutation alone. The potential difficulty due to multiple suppressors can be easily resolved with whole-genome sequencing, as we have demonstrated by identifying in a single strain, two relA- suppressor mutations in the relA homolozi yjbM i ywaC.

U B. subtilis, the pre-existing paradigm for stringent control was that a single synthase/hydrolase of (p)ppGpp, the RelA protein, modulated the stringent response to nutritional stress [30]. Using whole-genome sequencing, we found that within one B. subtilis relA- strain, two suppressor mutations spontaneously arose, each mapping to a different homolog of relA and contributing to the partial recovery of growth. Multiple suppressors of relA- which are generated independently and spontaneously had mutations that mapped almost exclusively to ywaC i yjbM. These two small homologs of RelA were independently identified using bioinformatics approaches in Streptococcus mutans i B. subtilis and possess only the synthesis, but not the hydrolysis and regulatory activities of RelA [10],[11]. Our results demonstrate strong genetic interactions among the three genes, and that RelA, rather than acting alone, acts in concert with these two other (p)ppGpp synthases ( Figure 7A ). Brisanje od relA abolishes the cells' ability to degrade (p)ppGpp, thus leading to poor growth likely because they produce too much (p)ppGpp rather than too little. This growth defect might subsequently trigger mutations in yjbM i ywaC, which encode (p)ppGpp synthases. Finally, the strain evolves to eliminate (p)ppGpp synthesis activity, and is not as viable as a wild type strain that has all three genes, but nonetheless attains a strong growth advantage with respect to the relA- naprezanje. Intriguingly, (p)ppGpp is virtually undetectable both in the relA-* suppressor strain and the relA- deletion strain (data not shown) [30], by thin layer chromatography (TLC), likely because relA- cells possess levels of (p)ppGpp that are below the limit of detection of TLC. In addition, within a population of relA- cells, individual cells that accidentally produce (p)ppGpp will not be able to degrade it and therefore will fail to grow and divide, resulting in a further diluted level of the nucleotide in a population. Our results do not rule out the possibility that RelA interacts directly with YjbM and/or YwaC to modulate their function and prevent any deleterious effects caused by their unregulated activity.

A). Metabolism of (p)ppGpp in B. subtilis. (p)ppGpp is synthesized by the enzymes YjbM, YwaC and RelA, but degraded only by RelA. B). Metabolism of (p)ppGpp in E coli. (p)ppGpp is synthesized by the enzymes RelA and SpoT, but degraded only by SpoT.

A comparison can be made with E coli, where (p)ppGpp is synthesized by two proteins, RelA and SpoT ( Figure 7B ). RelA produces (p)ppGpp, and SpoT can both produce and hydrolyze (p)ppGpp. The mjesto- strain is not viable and can only be relieved by relA- mutations, while relA- alone is viable. Similarly, in B. subtilis, relA- is relieved by yjbM- i ywaC- mutacije. B. subtilis razlikuje od E coli in having two enzymes that purely synthesize (p)ppGpp ( Figure 7A ). Therefore, loss of function of either enzyme alone is not sufficient to relieve the effect of loss of RelA hydrolase activity. Our experiments support an emerging paradigm that Gram-positive bacteria utilize three enzymes for (p)ppGpp production and/or degradation, all of which perhaps play important roles in bacterial stress responses [10],[11].

The tripartite genetic network that controls (p)ppGpp levels determines the evolutionary landscape that leads to the generation of multiple suppressors. Conversely, the pathways that generate suppressors can reveal the evolutionary landscape of an organism and subsequently illuminate its cellular infrastructure [38],[39]. Velika većina od relA- suppressor strains have mutations in yjbM ili ywaC, and almost all colonies eventually develop mutations in both genes. The occurrence of dual mutations is likely due to strong evolutionary pressure for increased fitness, and hence is a natural consequence of the tripartite regulation. The nature of this evolutionary landscape supports genetic interactions that involve three loci, instead of the more traditional module of two loci like mjesto i relA u E coli. Similar regulatory networks involving more than two gene loci are likely to be more common than previously believed and whole-genome sequencing is a powerful tool to uncover such systems.

Close examination of the molecular nature of the suppressive genomic changes indicates that there is no obligatory cascade of mutagenic events that is triggered by relA deletion ( Tables 4 , ​ ,5). 5 ). Diverse types of mutations arise, including insertions, deletions, and different types of point mutations (both transitions and transversions), which are likely mediated by different mechanisms. We did notice that mutations in ywaC seemed to involve a higher incidence of deletions, although larger sequencing-based sampling is required before a conclusion can be drawn. Alleviation of the relA- growth defect does not require concurrent mutations in yjbM i ywaC, but can be achieved by sequential inactivation of these genes ( Figure 5B ). This result confirms the ability of bacteria to manipulate their genomes quickly to generate mutations that counter an unfavorable genetic change. The process of stress-induced mutagenesis is likely behind this plasticity [40]. Intriguingly, (p)ppGpp is strongly implicated in the mechanism of stress-induced mutagenesis and it is thought that genes whose transcription is up-regulated by (p)ppGpp are more susceptible to (p)ppGpp-induced mutagenesis [41],[42]. Jesu yjbM i ywaC such genes and therefore specifically targeted for mutagenesis? What are the respective roles of YjbM, YwaC and RelA in sensing separate environmental stresses? These are intriguing questions that remain to be elucidated.


The POSSIBLE Gamma Squeeze (No we don't 'need' it, its POSSIBLE though)

I know you are tired of hearing claims about the ‘the next big squeeze’, but hear me out. BN-GO's stock price has literally gone >90% up from May 13th yet the short interest povećana by over 6M shares. Uz open interest of calls' outweighing the puts' open interest massively and isteka on June 18th, if the stock price keeps rising, we COULD see ATHs extremely fast.

I believe there is a possibility for a gamma and/or short squeeze if the stock can either hold where it is now or continue the move higher mostly because as you will soon learn, many shorts have an average price of <$7 and lower, i margin calls are no doubt coming if this continues to run. Price target is at the very least all-time-highs but we could see >$30 easily (imo) if the word actually gets out on how auspicious of an opportunity this may be.

To my understanding there are a few main things that are needed for a gamma squeeze & reasons why this may happen -

Short dated expiration call options that far outweigh puts

"A gamma squeeze can happen when there’s widespread buying activity of short-dated call options for a particular stock. This can effectively create an upward spiral in which call buying triggers higher stock prices, which results in more call buying and even higher stock prices." - Source - This is exactly what we have seen the last few days yet the shorts seem to think they will be successful in pushing the price lower based on the dramatic increase of nearly 6M shares in the short interest count in less than two weeks WITH the price going nearly 2x in less than a month!

A high short interest only increases the proclivity for gamma squeezes to occur. In BN-GO's case, the short interest has only increased since May 13th when the share price was $4.41, now we are seeing an SI of the SO of around 15% or 41.5M shares according to Ortex data -

5. Open interest of call options compared to puts is absolutely overwhelming, along with the volume. This means that people are buying and holding way more calls than puts, betting on the stock price going higher before June 18th, ten days from typing this. Not only is this bullish short term but it fits an important requirement for a gamma squeeze - more calls than puts being bought.

Market Manipulation in BN-GO's Stock Price? -

Market manipulation is essentially proven (to the degree of proof goes with MM, not provable in a court of law, but nonetheless it has happened and is still happening imo) and here are some reasons why I believe market manipulation has and is occurring in BN-GO's price action -

Trajectory of price action since Feb. 16th is nearly identical (until this week) with the majority of high growth stocks. Yet the fundamental exponential increase in value that Bio-nano Genomics has experienced over the course of 4 months is not something that many stocks have. The SI increase and FTD increase along with naked shorting (imo) would explain this. Find me a stock that has increased in fundamental value as much as BN-GO has since February 16th with a similar chart. Sretno.

Here are the catalysts and fundamental value increases in the stock price that I can name of the top of my head that all are between February 16th and May 25th-

CEO and 3 C-suite members getting LEAPS with share exercisability valuing in the hundreds of millions WITH an exercise price of $7.83 which is NEAR the current and then stock price, announcement of 5 studies that in the company's own words would act as important marketing events that would likely lead to increased sales,

CFO projection of 'substantial double-digit revenue growth' along with his 20-40% YOY operating expense increase projection for the 'next few years' (According to own company estimates as far as sales and adoption profitability chances based on their numbers are likely to come at least one year before analysts are projection ((imo)),

MORE bullish insider transactions in the form of the CMO picking up more LEAPS after her original one mentioned above,

CEO and COO being awarded tens of millions of dollars in profit in the form of hundreds of thousands of shares 840k to be exact and as of now they have not sold any,

New EXTREMELY innovative product confirmation-nanonozzle (imo), added to MSCI index, confirmation of several large sales - Sequencing Coming to Bio-nano, United States Patent: 10995364

Several studies proving 100% concordance and increased accuracy of their main product compared to 'gold standard' of the market this company is trying to disrupt,

HUGE institutional ownership increase, from around 4-5% at lows up to 15.60% currently.

Announcement of five large clinical studies with the most important one (NIPT) coming out this year. These are likely to increase academic praise of Saphyr and increase sales in the aggregate.

Three (1 was extremely recent, so do not count it if you do not want to) China Saphyr adoptions totaling almost 1M in revenue.

Countless Saphyr adoptions and installations (see ER webcast replay)

Saphyr 2.0 prototype in Q4 2021 confirmation

Announcement of $450-$550 per genome to be reduced to $100 per genome by end of 2023 or sooner.

CEO Asked about TAM, “So in cytogenetics, broadly speaking, there's roughly 2,500 labs worldwide. Probably somewhere between 2 million samples per year being processed for this type of molecular pathology. And overall, that represents somewhere in the neighborhood of a $3 billion to $3.5 billion market for us. That includes some of the research market as well. But it's something that I would really emphasize for these investors who are asking questions is that that's the market that is right in front of us today. And with the technology accelerating capabilities as quickly as it is, being used in research to discover new applications, the total market opportunity for optical genome mapping goes well beyond that low single-digit billion number, and it's substantially larger. It's harder for us to quantify it specifically because some of the applications haven't even been developed, others are still on the come.” - Erik ------- THIS MEANS THAT the CEO thinks the TAM of BN-GO is 'substantially larger' than the current 3-3.5B estimate BECAUSE there are applications of optical genome mapping that 'have not even been developed'.

There are a myriad more listed in this document, ctrl f for best results or see 'Market Manipulation' section.

Why BN-GO is Fundamentally Undervalued-

A higher life expectancy for everyone in the aggregate along with a better quality of life is what would happen should their goal of 'global Saphyr adoption be effectuated. ɼhemotherapeutic drug enhancements' is one of many of the revolutions that we could see specifically because of what this company does. Paraphrasing the CEO, 'we believe that the next big wave of innovation in Biology will derive from optical genome mapping', which is what BN-GO's Saphyr does-optical genome mapping, and they do it better than anyone. According to the company itself, >500bp detection in SVs with Saphyr compared to the CMA, FISH, and KT competition is cost effective, requires less hands on time, and has a faster turnaround time. Not to mention it has more accurate readings and has less false positives. LOH and SNV detection are said to be in the works, currently zero of the three competing methods can detect these. Nor can FISH, CMA, or KT detect the wide range of variant classes Saphyr can.

With this knowledge, one wonders why Saphyr has not already been adopted in all 2,500 cytogenetic labs, most of this can be attributed to resistance of change and relatively low academic praise and exposure of Saphyr's capabilities, but with FIVE large clinical studies in the works on NIPT, postnatal screening, hematological malignancies in leukemia and lymphomas, and solid tumor research, that is sure to change all in due time. Not to mention cost per genome reducing from $450-$550 currently to $100 by at maximum 2023 (Saphyr is already cost effective, just imagine how cheap it will be compared to other methods once the price more than halves per genome). Throughput to increase by 14x from the already immense maximum of 5000 genomes per year with the current Saphyr system. Throw in in the nanonozzle release that 'may' include SNV detection and will ɿill in the gaps of what current NGS is missing', and one has a strong case to make that this company will revolutionize healthcare and the entire genomic sector as we know it.

My Plan & Position For Transparency Reasons -

My goal is 10k shares in total by the end of summer. I will certainly have 10k BN-GO shares by EOY. I will hodl and add for years as this is not only auspicious short term but potentially even more lucrative for long term investors (imo).

I will be adding shares this month and would not be surprised if I have >2k shares soon.

TLDR: BN-GO has a high chance (imo) of gamma squeezing and short squeezing all the way to ATHs and beyond. Add in the fact that we are fundamentally undervalued and have definitely been manipulated for months and are finally starting to see the tables turn and you have a case that this is long term hodl.

TLDR for the TLDR: BN-GO go moon this week, invest soon or fomo in at >$10, then >ATHs


Gledaj video: Генетичний код. Біосинтез білка (Kolovoz 2022).