Informacija

Pitanje o DNK triplexu

Pitanje o DNK triplexu


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kratki DNA triplex niti su identificirani u različitim organizmima. Ali, bi li ubrizgavanje jednog lanca DNA ili RNA (s njegovim bazama komplementarnim bazama DNA koje se nalaze u glavnom žlijebu određenog gena) uzrokovalo stvaranje DNA tripleksa na tom genu?


Moguće, da, ali postoje komplikacije.

Postoje i drugi uvjeti koji pomažu u stvaranju energetski povoljnih uvjeta da se baze vežu na način da tvore triplex, uključujući kiselost i prisutnost magnezijevih iona.

Područje DNK u kojem se nalazi vaš gen od interesa (ili njegove regulatorne regije, ovisno o tome što pokušavate učiniti) također bi trebalo biti raspakirano. DNK se obično pakira u kromatin. Histonski kompleksi, koji obavijaju DNK, pružaju određenu mjeru zaštite glavnog žlijeba. Da biste napravili triplex, trebali biste biokemijske uvjete koji razmotavaju histone i općenito podržavaju stvaranje tripleksa.

Korištenje RNK, konkretno, moglo bi biti komplicirano ako je ili bi se moglo preraditi u element kratke ili mikroRNA, koji bi se mogao potrošiti na smanjenje populacije molekula mRNA (koja, zauzvrat, u konačnici regulira ekspresiju gena). Nije korisno ako se potroši prije nego što se veže za vaš tripleks interesa.

Postoji određeni farmaceutski interes za TFO (oligonukleotide koji tvore tripleks) kao mehanizam za isporuku lijekova.

Ako je neki gen pokvaren i upleten u genetsku bolest, recimo, te se njegova DNK ili obližnja regulatorna područja mogu učiniti dostupnima, možda se može primijeniti TFO koji bi pomogao povećati ili smanjiti ekspresiju proteinskog proizvoda tog gena.

Radovi o TFO-ima vjerojatno bi vas mogli uputiti na druge inženjerske probleme s kojima su se istraživači susreli i koje bi trebali prevladati kako bi stvorili učinkovit lijek.


DNA Triplex i Quadruplex sastavljeni nanosenzori za korelaciju K+ i pH u lizosomima

Ostaje neodgovoreno pitanje jesu li protok K + i H + u lizosomima u korelaciji zbog poteškoća u simultanom prikazu ova dva iona. Ovo pitanje je od velike vrijednosti za razumijevanje lizosomske acidifikacije. Ovdje smo dizajnirali luminescentne nanosenzore temeljene na DNA kvadrupleksu i tripleksu koji mogu pratiti K+ i pH u lizosomskom lumenu. Svaki senzor je sadržavao luminofor za nanočestice s pretvorbom i gasitelj nanočestica zlata, proizvodeći zelene i plave signale luminiscencije za K+ i H+, respektivno. Senzori su testirani u puferima koji pokazuju dinamičke raspone od 5 do 200 mM K+ i pH 5,0 do 8,2. Zajedničko snimanje pomoću ova dva senzora u stanicama pokazalo je da je dotok H+ bio popraćen istjecanjem K+, rješavajući ovo dugotrajno pitanje lizosomske biokemije.

Kao usluga našim autorima i čitateljima, ovaj časopis pruža popratne informacije koje su dali autori. Takvi se materijali recenziraju i mogu se reorganizirati za isporuku putem interneta, ali se ne uređuju kopiranjem ili kucaju. Pitanja tehničke podrške koja proizlaze iz pratećih informacija (osim datoteka koje nedostaju) trebaju se obratiti autorima.

Naziv datoteke Opis
anie202013302-sup-0001-misc_information.pdf3,5 MB Dopunski

Napomena: Izdavač nije odgovoran za sadržaj ili funkcionalnost bilo koje prateće informacije koje su dali autori. Sve upite (osim sadržaja koji nedostaje) treba uputiti odgovarajućem autoru članka.


DNA Triplex i Quadruplex sastavljeni nanosenzori za korelaciju K+ i pH u lizosomima

DNA quadruplex i triplex nanosenzori dizajnirani su za istovremeno praćenje K+ i pH sastavljanjem luminofora nanočestica s pretvorbom i gasitelja nanočestica zlata. Zajednička isporuka dvaju senzora s ATP stimulacijom ukazuje da je lizosomsko zakiseljavanje popraćeno odljevom K+.

Sažetak

Ostaje neodgovoreno pitanje jesu li protok K + i H + u lizosomima u korelaciji zbog poteškoća u simultanom prikazu ova dva iona. Ovo pitanje je od velike vrijednosti za razumijevanje lizosomske acidifikacije. Ovdje smo dizajnirali luminescentne nanosenzore temeljene na DNA kvadrupleksu i tripleksu koji mogu pratiti K+ i pH u lizosomskom lumenu. Svaki senzor je sadržavao luminofor za nanočestice uz pretvorbu i gasitelj nanočestica zlata, proizvodeći zelene i plave signale luminescencije za K+ i H+, respektivno. Senzori su testirani u puferima koji pokazuju dinamičke raspone od 5 do 200 mM K+ i pH 5,0 do 8,2. Zajedničko snimanje pomoću ova dva senzora u stanicama pokazalo je da je dotok H+ bio popraćen istjecanjem K+, rješavajući ovo dugotrajno pitanje lizosomske biokemije.


Iako je naša DNK slična, ljudi izgledaju jako različiti jedni od drugih. Ali osobine koje koristimo da pogodimo nečiju rasu ne funkcioniraju uvijek dobro. Razmislite o boji kože. Ne postoji samo nekoliko boja: postoji više nijansi nego što možete izbrojati. Osobine koje koristimo također su neovisne jedna o drugoj. Na primjer, biti visok ne znači da ćete imati i tamnu kosu. Bez obzira koje osobine koristimo, ne postoji dobar način grupirati ljude pomoću izgleda ili DNK.

Umjesto toga, svi grupiraju ljude u rase na temelju osobina za koje misle da su najvažnije. S vremenom se mijenja i način na koji kategoriziramo ljude u rase. Razmislite o ljudima koje poznajete koji su Irci ili Talijani. Danas bismo ih mogli kategorizirati kao bijelci, kao i mnoge ljude iz Europe. No prije 100 godina nisu se smatrali istom rasom kao Amerikanci europskog podrijetla. Ljudi vole organizirati stvari u grupe. Ali kada je u pitanju rasa, ove nam skupine govore više o našoj kulturi nego o našoj biologiji.


MATERIJALI I METODE

Simulacije molekularne dinamike (MD).

Dupleks DNA od 30 mera sam i u kompleksu s trećim lancem DNA od 10 mera simuliran je u vodenoj otopini sa i bez spiralnog ograničenja Twist. Da bi se nametnulo spiralno ograničenje Twist, DNA dupleks je tretiran kao kontinuirani polimer. Što znači da je spirala DNK proširena s jednog kraja simulacijskog volumena na suprotni kraj, gdje se nastavlja kroz normalnu vezu (25). Sustav označavamo spiralnim Twist ograničenjem, stalan spirala, i ona bez, izolirani spirala.

Sve MD simulacije izvedene su korištenjem GROMACS paketa programa (verzija 4.5) (26, 27). Polje sile CHARMM27 (28, 29) korišteno je za opisivanje DNK struktura i natrijevih iona. DNA sustavi su smješteni u kubičnu kutiju od 12 nm. Za to je korištena pravokutna kutija visine 9 nm stalan DNK sustavi. Kutije su naknadno napunjene TIP3P molekulama vode (30). Kako bi se neutralizirao sustav, natrijevi ioni su nasumično stavljeni u kutiju za simulaciju.

Ewaldova metoda mreže čestica (31) korištena je za tretiranje Coulombovih interakcija korištenjem udaljenosti prebacivanja od 1,0 nm i mreže od 0,12 nm. Interakcije Lennard–Jonesa bile su isključene između 1,0 i 1,2 nm. Stalni pritisak str i temperaturu T održavani su slabim spajanjem sustava na vanjsku kupelj na 1 bar i 300 K, korištenjem Berendsenovog barostata (32) i termostata za promjenu brzine (33), respektivno. Sustav je spojen na temperaturnu kupelj s vremenom spajanja od 0,1 ps. Vrijeme spajanja tlaka bilo je 1,0 ps, ​​a izotermna kompresibilnost 4,5·10 -5 bar -1. Poluizotropna tlačna spojka primijenjena je u slučaju stalan DNA sustav (koji je izotropan u x i y smjerovima, ali ne u z smjer).

Vezne udaljenosti i kutovi vode bili su ograničeni pomoću SETTLE algoritma (34). Ostale udaljenosti veza bile su ograničene pomoću LINCS algoritma (35). Korišten je preskok integrator s vremenskim korakom integracije od 2 fs.

Početne strukture 30-mer 5′AACTGCTAAA-GAGGGAGGGA-CTTGATGTAT 3′ i 10-mer 5′AGGGAGGGAG 3′ DNA generirane su u obliku B kao dvolančane odnosno jednolančane pomoću (softverskog paketa 23DNA) . Za generiranje početne strukture DNA tripleksa, provedene su 10 ns MD simulacije korištenjem ograničenja udaljenosti između atoma donora i akceptora vodikove veze Watson-Crickove strane 30-mer purina i reverzne Hoogsteenove strane trećeg lanca. Nakon 10 ns ekvilibracije, 50 ns MD simulacije provedeno je za svaki sustav.

Strukturna analiza

Kako bismo izbjegli moguću pogrešnu klasifikaciju DNK konformacija kao što je spomenuto u uvodu, analiziramo dvostruke spiralne korake DNK u našim MD putanjama koristeći softver 3DNA ( 23, 36) i njegov skup rubin skripte pod nazivom x3dna_ensemble. Grafovi i statističke analize izrađeni su pomoću domaćih skripti napisanih R ( 37).

Parametri baznog para za Watson–Crickove korake i Hoogsteenove korake određeni su za svaki bazni par i vremenski su prosječni. Radi praktičnosti, spirala DNK podijeljena je u tri regije: prvi dupleks, homo-purinski i drugi dupleks. Prosječni parametri koraka za svaku regiju dobiveni su usrednjavanjem na vremenski prosječnim vrijednostima para baza. Standardna pogreška srednje vrijednosti izračunata je pomoću blokovskog prosjeka (38).

Za brzu i detaljnu interpretaciju konformacijskog prostora koraka baznog para istražujemo lokalne spiralne parametre Nagib naspram x-pomaka, parametri osnovnog koraka Roll naspram Slide (39) i projekcije vektora od fosfora do fosfora među lancima lokalne osi |$z$| str(h) u odnosu na |$z$| str za svaki korak u simuliranim DNK. Slajd (Dx) može razlikovati konformacije B DNA i A DNK budući da su njihove srednje vrijednosti jako razmaknute, dok Roll (ρ) može razlikovati A DNK i B DNK osim TA-DNK, ali ne i između njih (40). Pokazalo se da je projekcija vektora fosfora prema fosforu na |$z$| -os referentnog okvira lokalne zavojne osi |$z$| str(h), učinkovito razlikuje B DNA i TA-DNA konformacije ( 41), te da odgovarajuća projekcija na referentni okvir srednjeg koraka |$z$| str razlikuje konformacije A DNA i B DNA (42).

Za analizu globalnih značajki glavne i manje širine utora izračunavaju se kao razmaci između fosfora i fosfora među lancima (43). Ove vrijednosti mogu se povezati s lokalnim značajkama opisanim parametrima koraka osnovnog para. Dodatno, predstavljamo endociklička kao i egzociklička preklapanja parova baza koja su u korelaciji s geometrijama i interakcijama slaganja baza DNA (23, 39).

Kako bi se kvantificirao učinak trećeg lanca na spiralnu strukturu, izračunavaju se kutovi između središta mase Watson-Crickovih parova baza. Konkretno, izračunali smo kutove između srednjeg para baza (pozicija 15 u 30-mernoj DNK) i jednako udaljenih susjednih parova baza.

Kako bismo usporedili konformacijske fluktuacije spiralne strukture u prisutnosti i odsutnosti TFO-a, izvršili smo analizu glavnih komponenti (PCA) (44–46) spojenih putanja dvolančane DNA. Razmatraju se svi atomi. Prije izvođenja analize svaki koordinatni skup u putanji se translatira i rotira kako bi se najbolje pristajao srednjem spiralnom okviru (između parova baza 11 i 20) dupleksne referentne strukture. Prva četiri (od ukupno 5715) svojstvena vektora opisuju 86 % ukupnih fluktuacija.

Potencijal srednje sile (PMF)

Za modeliranje baznog okretanja PMF je izračunat korištenjem krovnog uzorkovanja s pristranošću harmonijskog potencijala |$w$| i = k(xxi) 2 /2 duž reakcijske koordinate x, definiran kao pseudo-diedralni kut između središta mase preokretne baze, odgovarajućeg šećera, prvog susjednog šećera i prvog susjednog para baza. Ova reakcijska koordinata naširoko se koristila za proučavanje okretanja baza u DNA i RNA (47-49) (za detaljnu definiciju vidjeti (47)). Proračuni PMF-a izvedeni su pomoću GROMACS paketa programa (verzija 4.5) korištenjem diedralnih ograničenja, koji rade na središtu mase putem virtualnih interakcijskih mjesta.

PMF-ovi okretanja baze dobiveni su izvođenjem 72 neovisna simulacijska prozora koji mijenjaju referentni pseudo-diedralni kut xi, od −180° do 180° u intervalima od 5°. Početne konformacije za svaki prozor generirane su trčanjem po 5 ps po koordinati reakcije s k = 20 000 kcal/(mol rad 2). U fazi proizvodnje, svaki prozor je radio 5 ns (od kojih su posljednje 4 ns korištene za analizu) s k = 2000 kcal/(mol rad 2). Korišteno je diedralno ograničenje koje djeluje na centar mase putem virtualnih interakcijskih mjesta. Vrijednosti za pseudo-diedralni kut bilježene su na svakom koraku. PMF krivulje generirane su iz rezultirajućih distribucija udaljenosti korištenjem metode analize ponderiranog histograma (50, 51) s tolerancijom od 10 -6, 720 bina i provođenjem periodičnosti koordinata reakcije. Trake grešaka dobivene su dijeljenjem prikupljanja podataka u svakom prozoru na četiri dijela i izračunavanjem njihove standardne devijacije.

Promjene slobodne energije u otvaranju para baza izračunate su integracijom funkcije distribucije vjerojatnosti (dobivene iz PMF krivulje) preko zatvorenog i otvorenog stanja za A i T okretanje. Da bismo definirali otvorena i zatvorena stanja za bazni par, izračunali smo površinu dostupnu otapalu za atom H3 u pirimidinu i N1 u purinu. Površina pristupačne atomskom otapalu izračunata je numerički (52) postavljajući sondu otapala na radijus od 0,14 nm za ugljik, 0,13 nm za kisik i fosfor i 0,10 nm za vodik. Zatvoreni bazni par definira se kao da ima površinu dostupnu atomu otapalu manju od 0,001 nm 2 .

Energetske barijere za okretanje baze definirane su razlikom između minimalne i maksimalne vrijednosti PMF krivulje.


Lančana reakcija polimeraze: tehnike i varijacije

Pročitajte ovaj članak kako biste saznali više o tehnikama i varijacijama lančane reakcije polimeraze s dijagramom.

Lančana reakcija polimeraze:

Lančana reakcija polimeraze (PCR) je laboratorijska (in vitro) tehnika za generiranje velikih količina određene DNA.

Očito, PCR je tehnika amplifikacije bez stanica za sintezu više identičnih kopija (milijardi) bilo kojeg DMA od interesa. Razvijen 1984. od strane Karryja Mullisa PCR se danas smatra osnovnim alatom za molekularne biologe. Kao što je fotokopirni stroj osnovni zahtjev u uredu, tako je i PCR stroj u laboratoriju za molekularnu biologiju!

Princip PCR-a:

Dvolančana DNK od interesa se denaturira kako bi se odvojila u dva pojedinačna lanca. Svaki lanac se zatim pusti da se hibridizira s primerom (renaturacija). Dupleks primer-template koristi se za sintezu DNA (enzim-DNA polimeraza). Ova tri koraka – denaturacija, renaturacija i sinteza ponavljaju se iznova i iznova kako bi se stvorili višestruki oblici ciljne DNK.

Tehnika PCR-a:

Osnovni zahtjevi za PCR navedeni su u nastavku:

1. Ciljana DNK (duljine 100-35 000 bp).

2. Dva primera (sintetski oligonukleotidi duljine 17-30 nukleotida) koji su komplementarni regijama koje okružuju ciljnu DNK.

3. Četiri deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dCTP, dTTP).

4. DNA polimeraza koja može podnijeti temperaturu do 95°C (tj. termostabilna).

Reakcijska smjesa sadrži ciljnu DNA, dva primera (u suvišku), termostabilnu DNA polimerazu (izoliranu iz bakterije Thermus aquaticus (tj. Taq DNA polimeraza) i četiri deoksiribonukleotije. Stvarna tehnika PCR-a uključuje ponovljene cikluse za amplificiranje ciljna DNK.

Svaki ciklus ima tri faze:

Podizanjem temperature na oko 95°C oko jedne minute, DNK se denaturira i dva lanca se razdvajaju.

2. Renaturacija ili žarenje:

Kako se temperatura smjese polako hladi na oko 55°C, bazni par prajmera se spaja s komplementarnim regijama koje flankiraju ciljne DNA niti. Taj se proces naziva renaturacija ili žarenje. Visoka koncentracija primera osigurava žarenje između svakog lanca DNA i prajmera, a ne dva lanca DNA.

Pokretanje sinteze DNA događa se na 3′-hidroksilnom kraju svakog primera. Prajmeri se produžuju spajanjem baza komplementarnih DNA lancima. Sintetski proces u PCR-u prilično je usporediv s replikacijom DNK vodećeg lanca.

Međutim, temperatura se mora održavati optimalnom kako to zahtijeva enzim DNA polimeraza. Za Taq DNA polimerazu, optimalna temperatura je oko 75° C (za E. coli DNA polimerazu je oko 37° C). Reakcija se može zaustaviti podizanjem temperature (na oko 95°C).

3 faze PCR-a u odnosu na temperaturu i vrijeme prikazane su na slici 8.1. Svaki ciklus PCR-a traje oko 3-5 minuta. U uobičajenoj praksi, PCR se provodi u automatiziranom stroju.

Kao što je vidljivo iz slike 8.2 (ciklus I), novi lanac DNA spojen sa svakim primerom je izvan sekvence koja je komplementarna drugom prajmeru. Ovi novi pramenovi nazivaju se dugim predlošcima i koristit će se u drugom ciklusu.

Za drugi ciklus PCR-a, lančići DNA (izvorni + novosintetizirani dugački šablon) se denaturiraju, žare s početnicima i podvrgavaju sintezi DNA. Na kraju drugog kruga formiraju se dugi predlošci i kratki predlošci (DNA lanci sa slijedom prajmera na jednom kraju, a sekvenca komplementarna drugom kraju prajmera).

U trećem ciklusu PCR-a, izvorni DNA lanci zajedno s dugim i kratkim predlošcima su početni materijali. Ponavljaju se tehnika denaturacije, renaturacije i sinteze. Ovaj postupak se ponavlja uvijek iznova za svaki ciklus. Procjenjuje se da se na kraju 32. ciklusa PCR-a sintetizira oko milijun puta ciljne DNK (tablica 8.1). Akumuliraju se kratki predlošci koji posjeduju upravo ciljnu DNK kao dvolančane molekule.

Izvori DNK polimeraze:

U originalnoj tehnici PCR-a korišten je Klenow fragment E. coli DNA polimeraze. Ovaj enzim se denaturira na višoj temperaturi, stoga se za svaki ciklus morao dodati svježi enzim. Proboj se dogodio uvođenjem Taq DNA polimeraze iz termofilne bakterije Thermus aquaticus. Taq DNA polimeraza je otporna na toplinu stoga nije potrebno svježe dodavati ovaj enzim za svaki ciklus PCR-a.

Ključni čimbenici za optimalni PCR:

Primeri igraju značajnu ulogu u određivanju PCR-a. Primeri (17-30 nukleotida) bez sekundarne strukture i bez komplementarnosti među sobom su idealni. Komplementarni primeri mogu se hibridizirati kako bi tvorili dimer prajmera i amplificirali se u PCR-u. Time se sprječava umnožavanje ciljne DNK.

Kao što je već opisano, Taq DNA polimeraza je poželjna jer može izdržati visoku temperaturu. U protokolu hot-start, DNA polimeraza se dodaje nakon koraka toplinske denaturacije prvog ciklusa. Time se izbjegava proširenje neusklađenih primera koji se obično javljaju pri niskoj temperaturi.

Taq polimerazi nedostaje aktivnost egzonukleaze (3′-5′) koja bi mogla pridonijeti greškama u produktima PCR-a.Identificirane su neke druge termostabilne DNA polimeraze s aktivnošću čitanja, npr. Tma DNA polimeraza iz Thermotoga maritama Pfu DNA polimeraza iz Pyrococcus furiosus.

Općenito, što je kraći slijed ciljne DNK, to je bolja učinkovitost PCR-a. Međutim, posljednjih godina zabilježeno je pojačanje fragmenata DNA do 10 kb. Slijed ciljne DNA također je važan u PCR-u. Dakle, CC-bogate regije lanca DNA ometaju PCR.

Promotori i inhibitori:

Dodatak proteina poput goveđeg serumskog albumina (BSA) poboljšava PCR štiteći enzim DNA polimerazu. Huminske kiseline, koje se često nalaze u arheološkim uzorcima ciljne DNA, inhibiraju PCR.

Varijacije PCR-a:

Opisana je osnovna tehnika PCR-a. Budući da je svestrana tehnika, PCR se modificira prema specifičnim zahtjevima situacije. Dakle, postoje mnoge varijacije u izvornom PCR-u, neke od njih su razmotrene u nastavku.

Ugniježđeni PCR:

Sličnosti sekvenci između ciljne DNK i srodne DNK vrlo su često vidljive. Kao rezultat toga, početnici se mogu vezati za obje DNA i stoga se čak i neželjena DNK također pojačava u PCR-u. Korištenje ugniježđenih početnica povećava specifičnost PCR-a i selektivno umnožava ciljnu DNK. Ugniježđeni PCR ilustriran je na slici 8.3. U prvom ciklusu PCR-a proizvodi su i iz ciljne DNK i iz neželjene DNK. Sada se koristi drugi set unutarnjih temeljnih premaza. Oni će se selektivno vezati za ciljanu DNK i amplifikacija se nastavlja.

Inverzni PCR:

U inverznom PCR-u, amplifikacija DNA nepoznatih sekvenci se provodi iz poznate sekvence (slika 8.4). Ciljana DNA se cijepa restrikcijskom endonukleazom koja ne reže poznati slijed, ali reže nepoznati slijed s obje strane. Tako formirani fragmenti DNA se invertiraju i cirkulariziraju (DNA ligaza se koristi kao sredstvo za brtvljenje).

Krug koji sadrži poznate sekvence sada je izrezan drugim restrikcijskim enzimom. Time se cijepa samo poznati niz. Tako formirana ciljna DNK sadrži poznatu sekvencu na oba kraja s ciljnom DNK na sredini. PCR amplifikacija se sada može provesti. Može se primijetiti da se početnici stvaraju u smjeru suprotnom od normale, budući da je izvorna sekvenca invertirana tijekom cirkularizacije.

Usidreni PCR:

U usidrenom PCR-u, mali slijed nukleotida može se vezati (označiti) na ciljnu DNK, tj. DNA je usidrena. Ovo je osobito korisno kada sekvenca koja okružuje ciljnu DNK nije poznata. Sidro je često poli G rep na koji se koristi poli C temeljni premaz. Sidrenje se može obaviti i korištenjem adaptera. Kako adapteri posjeduju poznatu sekvencu, temeljni premaz se može odabrati.

PCR reverzne transkripcije:

PCR tehnika se također može koristiti za amplifikaciju RNA molekula u kojem slučaju se naziva reverzna transkripcija - PCR (RT-PCR). U tu svrhu, molekula RNA (mRNA) mora se prvo pretvoriti u komplementarnu DNA (cDNA) pomoću enzima reverzne transkriptaze. cDNA tada služi kao predložak za PCR. Za sintezu prvog lanca cDNA mogu se koristiti različiti početnici. To uključuje korištenje nasumičnih primera, oligo dT primera i primera specifične za sekvencu (slika 8.5).

Asimetrični PCR:

PCR tehnika se također može koristiti za sintezu jednolančanih DNA molekula, osobito korisna za sekvenciranje DNA. U asimetričnom PCR-u koriste se dva primera u omjeru 100:1. Nakon 20-25 ciklusa PCR-a, jedan primer je iscrpljen. Rezultat je da se u sljedećih 5-10 PCR ciklusa stvaraju samo jednolančani DNA.

Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu:

Kvantifikacija PCR proizvoda u različitim ciklusima nije tako jednostavna kao što se predviđa teorijskim razmatranjima (Tablica 8.1). U praksi se javljaju velike varijacije. Najčešće korištena tehnika za mjerenje količine PCR-a je korištenje fluorescentnog spoja poput eitidijevog bromida.

Princip je da se dvolančane molekule DNA vežu na etidijev bromid koji emitira fluorescenciju koja se može detektirati i kvantificirati DNK. Sinteza gena PCR-om i uloga PCR-a u mutagenezi usmjerenoj na mjesto opisani su na drugom mjestu.

Nasumično pojačana polimorfna DNK (RAPD):

Obično je cilj PCR-a generirati definirane fragmente DNA iz visoko specifičnih početnica. U slučaju RAPD-a (izgovara se kao brzi), kratki oligonukleotidni prajmeri su proizvoljno odabrani kako bi se pojačao skup fragmenata DNA koji su nasumično raspoređeni po genomu. Ova tehnika, nasumično pojačana polimorfna DNA također je poznata kao proizvoljno pripremljeni PCR (AP-PCR).

Postupak RAPD-a usporediv je s općom tehnikom PCR-a. Ova metoda u osnovi uključuje korištenje jednog temeljnog premaza niske strogosti. Jedan kratki oligonukleotid (obično prajmer od 9-10 baza) veže se na mnoga mjesta u genomu i iz njih se umnožavaju fragmenti DNA. Strogost vezanja primera može se povećati nakon nekoliko PCR ciklusa. To omogućuje pojačanje najboljih neslaganja.

RAPD se može pažljivo osmisliti tako da konačno dobije uzorke vrpca specifičnih za genom koji su korisni za komparativnu analizu. To je moguće budući da genomska DNK od dvije različite osobe često proizvodi različite pojačane obrasce pomoću RAPD-a. Dakle, određeni fragment DNA može se generirati za jednu osobu, a ne za drugu, a to predstavlja polimorfizam DNA koji se može koristiti kao genetski marker.

RAPD naširoko koriste biljni molekularni biolozi za genetsku identifikaciju biljnih vrsta. U tu svrhu dizajnirane su različite kombinacije nukleotida, od kojih većina nasumičnih oligonukleotidnih početnica, koje su komercijalno dostupne. Kako se svaki nasumični primer žari na različitu regiju DNK, može se identificirati mnogo različitih regija lokusa na DNK. RAPD je stoga koristan za izradu genetskih karata i kao metoda za genomsko otiske prstiju.

Ograničenja RAPD-a:

Glavni problem RAPD-a povezan je s ponovljivošću. Često je teško dobiti slične razine vezivanja temeljnog premaza u različitim eksperimentima. Stoga je teško korelirati rezultate dobivene od strane različitih istraživačkih skupina o RAPD-u.

Pojačani polimorfizam duljine fragmenta (AFLP):

AFLP je vrlo osjetljiva metoda za otkrivanje polimorfizma u genomu. Temelji se na principu polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata i RAPD-a. AFLP se može prikladno smatrati dijagnostičkom tehnikom otiska prsta koja otkriva genomske restriktivne fragmente.

U AFLP-u se za detekciju restrikcijskih fragmenata koristi PCR amplifikacija, a ne Southern blotting (uglavnom se koristi u RFLP). Može se primijetiti da se AFLP koristi za otkrivanje prisutnosti ili odsutnosti restrikcijskih fragmenata, a ne duljine tih fragmenata. Ovo je glavna razlika između AFLP-a i RFLP-a. AFLP se vrlo široko koristi u biljnoj genetici.

Nije se pokazala korisnom u mapiranju životinjskih genoma, budući da se ova tehnika uglavnom temelji na prisutnosti visokih stopa supstitucijskih varijacija koje se ne nalaze kod životinja. S druge strane, zamjenske varijacije koje rezultiraju RFLP-ima češće su u biljkama. Osnovno načelo AFLP-a uključuje pojačavanje podskupova RFLP-a pomoću PCR-a (slika 8.6).

Genomska DNA se izolira i probavlja istovremeno s dvije različite restrikcijske endonukleaze — EcoRI s mjestom za prepoznavanje 6 para baza i Msel s mjestom za prepoznavanje 4 para baza. Ova dva enzima mogu cijepati DNA i rezultirati malim fragmentima (< 1 kb) koji se mogu pojačati PCR-om. U tu svrhu fragmenti DNA su vezani s EcoRI i Msel adapterima.

Ove uobičajene adaptacijske sekvence (bočne genomske sekvence) služe kao mjesta za vezanje početnica na restrikcijskim fragmentima. Fragmenti DNA mogu se amplificirati s AFLP primerima od kojih svaki ima samo jedan selektivni nukleotid. Ovi PCR proizvodi se razrijede i koriste kao šabloni za selektivnu amplfikaciju koristeći dva nova AFLP primera koji imaju 2 ili 3 selektivna nukleotida.

Nakon selektivne amplifikacije PCR-om, DNA produkti se odvajaju na gelu. Dobiveni otisak DNK identificira se autoradiografijom. AFLP fragmenti predstavljaju jedinstvene položaje u genomima, te se stoga mogu koristiti kao orijentiri za premošćivanje jaza između genetskih i fizičkih mapa genoma. U biljkama, AFLP je koristan za generiranje karata visoke gustoće i za otkrivanje genomskih klonova.

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE):

Kao što je već opisano (vidi str. 115), reverzna transkripcija, praćena PCR (RT-PCR) rezultira umnožavanjem RNA sekvenci u obliku cDNA. No, glavno ograničenje RT-PCR-a povezano je s nepotpunim DNA sekvencama u cDNA. Ovaj problem je riješen korištenjem tehnike brze amplifikacije cDNA krajeva. UTRKA je prikazana na slici 8.7 i ukratko opisana u nastavku.

Ciljna RNA se pretvara u djelomičnu cDNA produžavanjem DNA prajmera. Ovaj DNA prajmer je prvo žaren na intervalnom položaju RNA, nedaleko od 5′-kraja molekule. Sada dodatak dATP (As) i terminalne deoksinukleotidil transferaze proširuje 3′-kraj cDNA.

To se događa zbog dodavanja niza cDNA. Ove serije sada djeluju kao temeljni premaz za žarenje na sidreni temeljni premaz. Drugi lanac DNA može se formirati produžavanjem sidrenog primera. Dvolančana DNK je sada spremna za amplificiranje PCR-om. Gore opisani postupak naziva se 5′- RACE, budući da se provodi amplifikacijom 5′-kraja početne RNA. Sličan protokol se može koristiti za provedbu 3′-TRKE kada je poželjna sekvenca RNA s 3′ kraja.

Ograničenja RACE:

Budući da se koristi specifičan primer, specifičnost amplifikacije RACE možda neće biti vrlo visoka. Drugi nedostatak je taj što reverzna transkriptaza možda neće u potpunosti doseći 5′-krajeve RNA, a to ograničava korisnost RACE. Posljednjih godina napravljene su neke izmjene kako bi se poboljšala RACE.


Dio I: Putovanje do otkrića &mdash

Uvrnuti put do dvostruke spirale DNK

[Definiranje kemijske prirode gena] "jedan je od velikih hitnih zadataka čovječanstva. Jednom kada smo ga izvršili, granice naših horizonata šire se izvan mašte, konačno naziremo ono što jesmo."

- Florence Bell, iz doktorske disertacije (1939.). Vidi reference.

Problem

Kako se osobine prenose s roditelja na potomstvo? Prvi proboj u ovom problemu napravio je Gregor Mendel, redovnik iz 19. stoljeća koji je proučavao grašak. Mendel je pokazao da se osobine nasljeđuju kao diskretne jedinice, koje su kasnije postale poznate kao geni (vidi Tilghmanovu priču o nasljeđivanju). Gen je postao vrlo važan koncept u biologiji, a početkom 20. stoljeća bilo je poznato da geni mogu:

1) Pohranite informacije. Prethodni rad je pokazao da jedan gen sadrži informaciju koja daje upute za proizvodnju jednog proteina.

2) Replicirati. Mora postojati mehanizam kopiranja koji omogućuje razmnožavanje genetskih informacija s jedne generacije na drugu.

3) Mutirajte. Povremene promjene gena proizvode potomstvo s različitim osobinama od svojih roditelja. Ova varijacija je pokretač evolucije kroz prirodnu selekciju (vidi Pripovijed o mutacijama Douga Koshlanda).

Ali što je gen? Od čega je napravljeno? Kako izgleda? Kad bi netko znao fizičku/kemijsku prirodu gena, možda bi mogao razumjeti kako geni pohranjuju informacije, repliciraju i mutiraju.

Dokazi na prijelazu u 20. stoljeće upućuju na to da se geni nalaze na kromosomima (vidi Dig Deeper 1). Kromosomi se sastoje od DNK i proteina. Koji je bio gen? Veći dio prve polovice 20. stoljeća znanstvenici su mislili da su geni napravljeni od proteina, a ne DNK, iz sljedećih razloga:

1) Polipeptidi (drugi naziv za proteine) su linearni lanci sastavljeni od 20 različitih građevnih blokova - aminokiselina. DNK se, s druge strane, sastoji od samo 4 različita građevna bloka – baza. Budući da su proteini složeniji od DNK, na polipeptide se gledalo kao na bolju opkladu za pohranjivanje složenih informacija o životu.

2) Smatralo se da je DNK monoton, ponavljajući niz nukleotida, koji ne bi bio koristan za pohranu informacija. Phoebus Levene promovirao je ovo gledište svojom "tetranukleotidnom hipotezom", koja je pretpostavila da su četiri baze DNK prisutne u jednakim količinama i da se ponavljaju uvijek iznova duž kromosoma u fiksnom uzorku. Ova se hipoteza pokazala potpuno pogrešnom, ali je u svoje vrijeme bila utjecajna.

Kao rezultat ovog okvira razmišljanja, mnogi znanstvenici su mislili da je DNK dosadan otprilike prvih 80 godina nakon njegovog otkrića. DNK je primjer zašto je uklanjanje netočnih ideja često jednako važno kao i stvaranje novih.

U našem Putovanju do otkrića susrest ćemo se s dva poznata eksperimenta, jedan od strane Avery–MacLeod–McCartyja i drugi od Hershey–Chasea, koji su zajedno poništili ideju da su proteini molekula naslijeđa i uperili prst u DNK (objašnjeno u Clueu 3 u nastavku). Tetranukleotidnu hipotezu konačno su poništili podaci opisani u nastavku u Clue 4.

Ipak, čak i s tim pogreškama ispravljenim do 1952., nitko nije mogao zamisliti kako DNK funkcionira u naslijeđu. Čak i pojam da DNK sadrži šifru, osnovna činjenica o DNK koju većina ljudi danas zna, u to vrijeme nije bila cijenjena. Max Delbruck (poznati znanstvenik predstavljen u Koshlandovoj pripovijesti o mutacijama i Meselson-Stahl Key Experiment) rekao je:

"Nitko, baš nitko, do dana Watson-Crickove strukture, nije pomislio da se specifičnost može nositi na ovaj krajnje jednostavan način, nizom, šifrom."

- Citat iz Osmog dana stvaranja (vidi popis referenci)

Naše putovanje do otkrića završava modelom dvostruke spirale DNK koji su predložili Jim Watson i Francis Crick. Struktura je neočekivano sugerirala elegantan mehanizam za replikaciju i nasljeđivanje gena, rješavajući zagonetku koju je Mendel postavio stoljeće ranije. Nekada dosadna molekula DNK od tada je u centru pažnje.

Naznaka 1: Kemija DNK

Godine 1869. Johann Friedrich Miescher proučavao je kemijsku prirodu "gnoja", koji je dobio od odbačenih kirurških zavoja iz lokalne kirurške klinike. Njegovo proučavanje gnoja dovelo je do otkrića nove tvari koju je nazvao "nuklein" koja je bila kisela, bogata fosforom i bez sumpora, što ga je razlikovalo od proteina. Ubrzo nakon toga pronašao je još bolji izvor nukleina - spermu lososa. Ono što je Miescher otkrio danas je poznato kao deoksiribonukleinska kiselina ili DNK.

Otkriveno je da se nuklein sastoji od četiri različite kemijske jedinice zvane baze — adenin, gvanin, timin, citozin (Slika 1.). Guanin (skraćeno kao "G") prvi je put pronađen 1844. u izmetu ptica (zvanom "guano"). Adenin (skraćeno "A") izoliran je 1885. iz goveđeg gušterače. Gvanin i adenin slični su jedan drugome (šesterokut ugljika spojen na peterokut sa zajedničkom stranom) i nazivaju se "purini". Ostale baze DNK, timin (T) i citozin (C), prvo su izolirane iz timusnih žlijezda teleta. Timin i citozin (šesterokuti) nazivaju se pirimidini.

Slika 1. Baze DNK i njihov izvor/datum otkrića.

Kemijska struktura DNK dodatno je razjašnjena kroz rad nekoliko znanstvenika, ponajviše Alexandera Todda koji je za svoj rad dobio Nobelovu nagradu. Više pojedinosti bit će predstavljeno u Pregledu znanja, ali ovdje su predstavljene osnove budući da se odnose na otkriće strukture DNK. Osnovni gradivni blokovi DNK nisu same baze već su nukleotidi. Nukleotid je baza (jedna od četiri) povezana sa šećerom (deoksiriboza za DNK), koja je pak povezana s fosfatom (slika 2). DNK je dugi polimer nukleotida i ponekad se naziva polinukleotidom (mnogo nukleotida). Nukleotidi su povezani na način od glave do repa vezama koje nastaju između jednog fosfata i dva susjedna šećera, jedna od veza povezuje fosfat s onim što se naziva 5′ ugljikom na jednom šećeru, a druga veza nastaje s 3′ ugljik na drugom šećeru. Dakle, fosfati i šećeri stvaraju kontinuiranu okosnicu molekule DNA s bazama koje strše u pravilnim intervalima. DNA lanac ima usmjerenost, kako je definirano načinom na koji su ugljici 5' i 3' na šećerima usmjereni (slika 2).

Slika 2 DNK je polimer nukleotida. DNA polimer ima polaritet definiran orijentacijom 5′ i 3′ ugljika na šećeru deoksiriboze.

Naznaka 2: Prva rendgenska struktura DNK Florence Bell

Rosalind Franklin je 1952. proizvela poznatu rendgensku fotografiju DNK, o kojoj ćemo uskoro raspravljati. Međutim, prvu rendgensku fotografiju DNK dobila je 14 godina ranije na Sveučilištu u Leedsu mlada diplomirana studentica Florence Bell.

Rođena u Londonu 1913. godine, Florence Bell (slika 3.) studirala je kemiju i fiziku na koledžu, a dva vodeća znanstvena stručnjaka podučavala su je rendgensku kristalografiju. Dobro uvježbana, zatim se preselila u Leeds 1937. kako bi započela doktorat. studije s Williamom Astburyjem, još jednim poznatim kristalografom X-zraka. Bell je doktorirala. 1939. godine njezin rad nosi naslov "Rentgenske i srodne studije strukture proteina i nukleinskih kiselina" (vidi reference). Bell je napravio izvanredan doktorat, što je uglavnom zanemareno. ne bi trebalo biti.

Slika 3. Fotografija Florence Bell (dobivena s Wikipedije) zalijepljena na naslovnu stranicu njezine teze iz arhive knjižnice Sveučilišta u Leedsu (dobivena uz dopuštenje i dostupna na popisu referenci).

Bellovo istraživanje uključivalo je sjaj snopa X-zraka kroz usklađena biološka vlakna, poput DNK. Vlakna raspršuju dio rendgenskih zraka, koje se zatim snimaju kao slika pomoću filma osjetljivog na X-zrake. Nejasna, difuzna slika na filmu ukazuje na nedostatak pravilnog reda molekula u vlaknu. Međutim, uzorak mrlja ili linija odražava temeljni redoslijed atoma u vlaknu. Kao što će se kasnije raspravljati, informacije o rasporedu atoma u vlaknu potencijalno se mogu zaključiti iz uzorka X-zraka. Međutim, Bell je radio u prvim danima korištenja X-zraka za ispitivanje strukture molekula. X-zrake su korištene za određivanje rasporeda atoma u jednostavnim kristalima soli, ali strukture bioloških molekula, koje su kompliciranije od jednostavnih soli, još nisu bile riješene ovom metodom.

Bell je propuštao rendgenske zrake kroz izniman broj bioloških tvari, koje zvuče kao vještičji napitak - tetive žabljih nožnih prstiju, meduza, ljudska kosa, rebra peraja morskog psa, itd. Ovi uzorci su napravljeni od proteina. Međutim, Bell je također pogledao DNK iz različitih izvora. Jedan uzorak DNK (iz timusa teleta) dao je zanimljive rezultate.

Ako ste pripremali DNK od jagoda u osnovnoj ili srednjoj školi, možda se DNK sjećate kao gnjecave mrlje. Kao što je gore objašnjeno, mrlja neorganiziranih molekula će proizvesti nejasnu rendgensku sliku lišenu informacija. Stoga je Bell prvo morao pronaći način da uskladi molekule DNK. To je učinila tako što je DNK osušila na okviru koji se mogao polako rastezati.Istezanje je pomoglo da se molekule DNK poravnaju u istom smjeru, stvarajući tako određeni stupanj reda.

Bell je prošla snop rendgenskih zraka kroz njezina DNK vlakna timusa teleta i raspršene rendgenske zrake proizvele su sliku na fotografskom filmu (slika 4). Bilo je malo zamazano, ali postojao je uzorak. Samo promatranje uzorka bio je veliki rezultat, to je bio prvi pokazatelj da DNK ima neku vrstu molekularnog reda. Ovo nije bio unaprijed dogovoren zaključak. Na primjer, rendgenske zrake ne bi proizvele nikakav uzorak ako se prođu kroz pripravak RNA (drugi polinukleotid) ili polisaharida (polimeri šećera) ovi polimeri mogu usvojiti brojne 3D strukture i tako proizvesti nepravilna vlakna.

Slika 4 Difrakcija rendgenskih zraka DNA vlakana koju je proučavala Florence Bell. Fotografija je iz Bellove teze (https://explore.library.leeds.ac.uk/special-collections-explore/650413).

Bell je naučila nekoliko stvari o DNK iz svojih rendgenskih fotografija. Prvo, velika polukružna traka na samom vrhu i dnu (koja se u izrazu difrakcije rendgenskih zraka naziva "refleksija") otkrila je da se neki element u DNK ponavlja u pravilnim intervalima od 3,4 angstroma (angstrom, skraćeno s simbol "Å" je 10-10 metara jedna desetina nanometra). Provjerila je ovu periodičnost u DNK dobivenoj iz virusa i gušterače, čime je pokazala da to mora biti univerzalno svojstvo DNK. Iz ostalih podataka na fotografiji, ona je odredila širinu molekule DNA kao 18,1 Å (blizu trenutno prihvaćene vrijednosti od 20 Å). Iz ovih podataka, Bell je izradila model u svojoj tezi (slika 5) koji pokazuje da:

1) DNK je dugačak stupac koji tvori krutu strukturu.

2) Osnove leže okomito na os stupa i slažu se svaki

3,4 Å. (Ovo je bio ključni parametar u modelu Watson i Crick, kao što ćemo uskoro vidjeti).

Slika 5 Model DNK Bella i Astburyja prikazuje baze koje se slažu duž krutog stupa u pravilnim intervalima od

3,4 Å (https://explore.library.leeds.ac.uk/special-collections-explore/650413.). Također su nagađali da je ova pravilna struktura DNK stvorila skelu za proteine, koji bi mogli biti potrebni za nasljeđe (Dig Deeper 2).

Da je DNK kruti stupac širine ∼20 Å i njegove baze se slažu svakih 3,4 Å je točna. Međutim, Bell nije došao do zaključka da je DNK dvostruka spirala. Njezina priprema DNK (kao i rane Franklinove) bila je mješavina dvaju oblika DNK, što je zakompliciralo stvari i zamaglilo sliku. Čak i da je imala "pravu" fotografiju, teorija za tumačenje rendgenskog uzorka spiralne strukture u to vrijeme nije postojala.

Iako model DNK prikazan na slici 5 nije u potpunosti točan, Bellov pionirski rad 1938. predstavljao je značajno postignuće, punih 15 godina prije poznatih DNK dokumenata koji su se pojavili 1953. Bell je bio prva osoba koja je pokazala da DNK ima uredan temeljna struktura. Njezin je rad pokazao da je dobivanje strukture za DNK izvediv pothvat i privukao je druge (Franklin, Wilkins) da problem prenesu na sljedeću razinu. Zapravo, Franklin je nastavila proučavati DNK timusa, isti izvor DNK za koji je Bell otkrila da najbolje djeluje u njezinim strukturalnim studijama. Znanost napreduje u koracima, što postavlja nužne temelje za veliki napredak.

Mnogo godina kasnije, 1951., Bellov savjetnik William Astbury napravio je bolju rendgensku fotografiju DNK, doista sličnu poznatoj fotografiji koju je napravila Rosalind Franklin (o kojoj se govori u nastavku). Međutim, Astbury nikada nije objavio niti javno prezentirao ovaj rezultat, vjerojatno je da nije shvatio njegov značaj. Da je objavljen i dostupan Linusu Paulingu i Francisu Cricku, povijest dvostruke spirale DNK vrlo bi vjerojatno bila izmijenjena.

Je li Florence Bell mogla riješiti problem dvostruke spirale DNK? Ne možemo znati odgovor. Drugi svjetski rat poremetio je njezin znanstveni rad (kao što je vrijedilo za Francis Crick, kao što ćemo vidjeti kasnije). Astbury je pokušao intervenirati u njezino regrutiranje od strane Britanskog ratnog ureda, navodeći da "teško da može nastaviti bez njezine pomoći". Ali Bell se pridružila ratnim naporima kao radiooperaterka u ženskom pomoćnom zrakoplovstvu. Potom se udala za američkog vojnika, došla u SAD i zauvijek napustila znanost. Vratit ćemo se Florence Bell u Završnim mislima.

Naznaka 3: Eksperimenti Avery-MacLeod-McCartyja i Hershey-Chasea ukazuju na DNK, a ne na protein, kao materijal naslijeđa

Kao što je ranije rečeno, kromosomi se sastoje od proteina i DNK. Ali koji pohranjuje informacije o genu? Proteini su bili favorizirani, ali je bio potreban eksperiment da se riješi ovaj problem. Taj su eksperiment 1944. godine izveli Oswald Avery, Collin MacLeod i Maclyn McCarty.

Avery, MacLeod i McCarty nadovezali su se na izvanredno zapažanje Fredericka Griffitha 1928. Griffith je proučavao dva srodna soja bakterije Streptococcus pneumonia – jedan soj koji je bio virulentan i izazivao upalu pluća kada se ubrizgao u miševe i drugu mrlju koja nije bila virulentan (nije izazvao bolest). Razlika između ova dva soja bila je u tome što je virulentni soj imao premaz koji ga je štitio od uništenja od strane imunološkog sustava. Griffith je napravio eksperiment u kojem je ubio virulentne bakterije toplinom i zajedno ubrizgao te mrtve bakterije sa živim nevirulentnim bakterijama kod miševa. Što ga je natjeralo da izvede ovaj eksperiment nije jasno iz mog čitanja, ali rezultati su bili zapanjujući. Griffith je otkrio da su neke od nevirulentnih bakterija trajno "transformirane" u virulentne bakterije koje bi proizvele upalu pluća (slika 6). Ovaj rezultat sugerirao je da su se geni (u ovom slučaju oni koji daju zaštitni omotač koji bi bakterije učinili virulentnima) prenosili između bakterija, čak, nevjerojatno, s mrtvih na žive. Ovo je bila prva eksperimentalna demonstracija prijenosa gena, metode koja pokreće današnju biotehnološku industriju. Pacijenti s dijabetesom, na primjer, liječe se ljudskim inzulinom napravljenim od bakterija transformiranih genom za ljudski inzulin.

Slika 6 Griffithov eksperiment koji pokazuje da se geni mogu prenijeti s jedne bakterije (u ovom slučaju čak i mrtve) u drugu. Taj je proces nazvan "transformacija".

Što je bio kemijski agens koji se prenosio između bakterija tijekom genetske "transformacije?" Avery, MacLeod i McCarty otkrili su da je DNK, a ne protein, odgovorni agens. Tvrdili su da su geni napravljeni od DNK. Taj je rezultat bio iznenađujući i protivio se dogmi tog vremena. Više o eksperimentu Avery, MacLeod i McCarty možete saznati u Videozapisu 1.

Video 1 Video na ploči s objašnjenjem eksperimenta Avery, MacLeod i McCarty.

Mnogi su se znanstvenici, međutim, odupirali zaključku da su geni napravljeni od DNK. Znanstvenici koji se ne slažu mislili su da su možda postojali neki preostali proteini koji su kontaminirali DNK pripravak. Unatoč eleganciji eksperimenta Avery, MacLeod i McCarty, kemijska priroda gena ostala je neriješena u glavama mnogih ljudi.

Dugotrajne ideje često je teško svrgnuti s trona. Međutim, pogrešne ideje će se na kraju srušiti pod teretom znanstvenih dokaza. Sljedeći dokaz u prilog DNK došao je 8 godina kasnije (1952.) u eksperimentu koji su izveli Alfred Hershey i Martha Chase. Hershey i Chase proučavali su replikaciju virusa, nazvanih bakteriofag (skraćeno fag), koji inficiraju bakterije. Fag slijeće na površinu bakterije i ubrizgava molekulu unutra. Tada se u bakterijama stvara mnogo novih faga. Molekula koja je ubrizgana u bakteriju zasigurno mora biti odgovorna za nasljeđe jer posjeduje informacije koje određuju proizvodnju novog faga. Hershey i Chase otkrili su da je DNK, a ne protein, u bakteriju ubrizgan fagom. Da biste saznali kako su Hershey i Chase izveli svoj eksperiment, pogledajte Video 2.

Video 2 Video na ploči s objašnjenjem Hershey-Chase eksperimenta.

Budući da su i pokusi Avery–MacLeod–McCarty i Hershey–Chase, koristeći vrlo različite metode, oba došla do istog zaključka, znanstvena je zajednica počela šire prihvaćati ideju da su geni napravljeni od DNK.

U našem sljedećem tragu naići ćemo na znanstvenika koji je odmah prepoznao važnost Avery–MacLeod–McCartyjevog eksperimenta i prebacio svoj istraživački program s proteina na DNK. Taj pojedinac bio je Erwin Chargaff.

Naznaka 4: Chargaffovi nalazi

Erwin Chargaff bio je biokemičar koji se pozabavio jednostavnim pitanjem: koliko je svake od četiri baze prisutno u DNK? Tetranukleotidna hipoteza, koju je predložio Phoebus Levene, navodi da baze trebaju biti prisutne u jednakim omjerima (jedna četvrtina svaka). Chargaff je kemijski analizirao DNK kako bi vidio je li to istina ili ne. Chargaffovi rezultati sažeti su na slici 7.

Slika 7 Chargaffovi rezultati o osnovnom sastavu DNK. Gore navedeni rezultati su sastavljeni iz dvije Chargaffove publikacije (vidi popis referenci). Rezultati su preračunati u postocima svake baze (gdje su četiri baze u zbroju do 100%), a ne u % fosfata, kao u originalnim radovima.

Pitanje istraživača: Što ovi rezultati govore o "tetranukleotidnoj hipotezi?"

Odgovor: Tetranukleotidna hipoteza predlaže da se baze ponavljaju na pravilan način duž DNK, što predviđa jednake (25%) količine četiri baze. Chargaffovi podaci, međutim, pokazali su da to nije tako. U drugim podacima, Chargaff je također otkrio da se obilje baza u određenoj mjeri razlikuje u različitim organizmima (npr. kvasac, bakterije, čovjek), dok je tetranukleotidna hipoteza predviđala sličan postotak baza u svim organizmima.

Pitanje istraživača: Primjećujete li ikakve sličnosti u relativnim količinama nukleotidnih baza?

Odgovor: Postoci adenina i timina su slični. Isto tako i postoci gvanina i citozina (iako se donekle razlikuju u ljudskom timusu, vjerojatno zbog eksperimentalnih varijacija ili pogreške).

Nalaz Erwina Chargaffa o jednakim postotcima adenina i timina, te gvanina i citozina danas je poznat kao "Chargaffovo pravilo". Međutim, to se tada činilo manje očitim kao "pravilo". Činilo se da sam Chargaff u svom radu iz 1950. nije siguran u značenje:

"Vrijedno je primijetiti, iako vjerojatno ne više nego slučajno, da u svim dosad ispitanim deoksipentoznim nukleinskim kiselinama molarni omjer ukupnih purina prema ukupnim pirimidinima nije daleko od 1. Ne treba više čitati u ove brojke."

Ako je vjerovati Chargaffovim podacima, jedinstveni omjeri G prema C i A prema T snažno su upućivali na neku vrstu komplementarnosti. Odgovarajuća brava i ključ primjer su strukturalne komplementarnosti. Jesu li G-C i A-T komplementarne brave i ključevi?

Vratit ćemo se Chargaffovim podacima, jer su oni dali potvrdu Watson-Crickovog modela DNK. Tragove je lakše vidjeti unatrag i često ih se u tom trenutku promaši. Čak ni Watson i Crick nisu rano shvatili značenje Chargaffovih podataka. Međutim, kada su u potpunosti shvatili njegovo značenje, dva lanca DNK su se u njihovim mislima spojila u dvostruku spiralu, kao što ćemo uskoro vidjeti.

Otkriće: DNK je dvostruka spirala

Slika 8 ilustracija je jedne od najpoznatijih fotografija u biologiji: Jim Watson i Francis Crick stoje ispred svog 3-D metalnog modela dvostruke spirale DNK u Cambridgeu u Engleskoj u ožujku 1953. Znanstveni detektivski rad koji je doveo do ovaj model se razvio u nevjerojatno kratkom vremenskom razdoblju, otprilike 4 tjedna. Istražit ćemo što se dogodilo u ovom čudesnom mjesecu.

Slika 8. Watson i Crick stoje ispred svog modela dvostruke spirale DNK.

Prije nego što ispitamo kako su Watson i Crick došli do svog trijumfalnog trenutka, uvedimo znanstvenike u priču.

Linus Pauling: Favorit

Da se netko kladio na to tko će riješiti strukturu DNK, pametan novac bi bio stavljen na Linusa Paulinga. Pauling, profesor na Caltechu, bio je jedan od najpoznatijih znanstvenika 20. stoljeća, doslovno je "napisao knjigu" o modernoj kemiji: Priroda kemijske veze. Pauling je također bio pionir u primjeni kemije na biologiju. Godine 1949. ispravno je pretpostavio da je anemija srpastih stanica bolest koja uključuje molekularni defekt u hemoglobinu. Godine 1951., samo 2 godine prije strukture DNK, Pauling je napravio još jedan veliki udar izgradnjom atomskog modela za alfa-helix, uobičajeni strukturni motiv u proteinima. Linus Pauling je također artikulirao koncept molekularne komplementarnosti, mehanizam nalik bravi i ključu za način na koji dvije molekule mogu jedinstveno komunicirati jedna s drugom. Godine 1948. izjavio je zašto bi komplementarnost mogla biti relevantna za način na koji gen pravi kopiju samog sebe, što je doista nagovijestilo veliki koncept iza dvostruke spirale DNK:

„Ako se struktura koja služi kao predložak (molekula gena ili virusa) sastoji od, recimo, dva dijela, koji su sami po sebi komplementarni po strukturi, onda svaki od tih dijelova može poslužiti kao kalup za proizvodnju replike drugog dio, a kompleks dvaju komplementarnih dijelova tako može poslužiti kao kalup za proizvodnju duplikata samog sebe."

Jim Watson i Francis Crick: Underdogs

Watson i Crick, nepoznati mladi znanstvenici koji su radili u Laboratoriju Cavendish u Cambridgeu u Engleskoj, imali su komplementarne vještine i osobnosti, što im je omogućilo da dođu do modela dvostruke spirale.

Jim Watson: Watson je prvo studirao ornitologiju kao preddiplomski studij na Sveučilištu u Chicagu, a kasnije se zainteresirao za genetiku. Odbijen od strane Caltecha i Harvarda za diplomski studij, Watson je završio na usavršavanju u U. Indiani kod izvrsnog bakterijskog genetičara Salvadora Lurije (Luria je prikazana u Koshlandovom narativu o mutacijama). Nakon stjecanja doktorata. u dobi od 22 godine, Watson odlazi u Europu na postdoktorski studij u Dansku. Nakon što je vidio da Maurice Wilkins (o kojem se raspravlja u nastavku) predstavlja svoj rad X-zrakama na DNK na znanstvenom skupu, Watson je odlučio da bi istraživanje strukture DNK s Wilkinsom bilo uzbudljivije od njegovog trenutnog rada u Kopenhagenu, međutim, Wilkins nije pozvao Watsona da se pridruži njegovoj grupi . Watson se tada prijavio u Cavendish Laboratory u Cambridgeu, vodeći centar za rendgenske studije. U Cambridge je stigao u listopadu 1951., tada star 23 godine, gdje je upoznao Francisa Cricka. Tijekom prvog susreta, oboje su izrazili veliki interes za DNK i odlučili zajedno raditi na tome, iako to nije bio primarni posao koji im je dodijeljen.

Francis Crick: Crick je prvi započeo doktorat. studira fiziku na University Collegeu u Londonu, ali je njegov rad poremećen kada se njegov odjel morao evakuirati u Wales početkom Drugog svjetskog rata. Crick se tada pridružio ratnim naporima, projektirajući pomorske mine. Nakon što je rat završio, Crick se vratio znanosti, ali se zainteresirao za to kako se fizika može primijeniti na biologiju (vidi također priču o Luriji i Delbrucku, dvojici školovanih fizičara koji su se okrenuli biologiji u Koshlandovoj pripovijesti). Crick je zatim 1949. godine ušao u Cavendish Laboratorij za doktorat. trening. Kada su se Watson i Crick upoznali 1951., Crick je bio 12 godina stariji od Watsona, ali još više zaostajao u svom usavršavanju, budući da je još uvijek bio diplomski student dok je Watson bio postdoktorant. Iako je prepoznat po svom ogromnom intelektu, Crick je također mogao biti glasan, hrabar i ponekad dosadan starijim znanstvenicima. Kako bi dobili malo predaha od Cricka, stariji znanstvenici u laboratoriju Cavendish premjestili su Cricka i novog regruta Watsona u njihovu sobu. Bi li se model dvostruke spirale pojavio da su Watson i Crick bili dodijeljeni da rade u odvojenim sobama? Ne može se reći, ali sigurno, njihova bliskost dopuštala je stalnu raspravu, što je bio ključni sastojak njihovog uspjeha.

Rosalind Franklin i Maurice Wilkins: Eksperimentalisti koji su dobili podatke

Informacije s rendgenske fotografije koju je dobila Florence Bell (opisane ranije u Clue 2) bile su nedostatne za određivanje strukture DNK. Sljedeća generacija rendgenskih kristalografa prihvatila je izazov — Maurice Wilkins i Rosalind Franklin na King’s Collegeu u Londonu.

Maurice Wilkins: Wilkins je, kao i Crick, izvorno bio obrazovan kao fizičar (doktorirao je 1940.) i pomogao je britanskim i američkim ratnim naporima u Drugom svjetskom ratu. Wilkins se tada pridružio novoj jedinici za biofiziku na King's Collegeu u Londonu i započeo rendgenske studije DNK. Dobio je pristojne rendgenske fotografije DNK 1950., koje je Watson vidio godinu dana kasnije. Wilkins je održavao blisku komunikaciju s Watsonom i Crickom između 1951.-1953. Watson i Crick pozvali su Wilkinsa da bude koautor njihovog dokumenta o strukturi DNK, ali je Wilkins odbio ponudu i objavio svoj vlastiti rad na rendgenskim snimkama. Wilkinsov stalni rad na DNK pomogao je učvršćivanju modela dvostruke spirale, a on je bio suprimatelj Nobelove nagrade s Watsonom i Crickom 1962. godine.

Rosalind Franklin: Franklin je rođen u Londonu i pohađao je sveučilište Cambridge. Prvobitno školovana kao fizikalna kemičarka, radila je u Parizu kao postdoktorant, gdje je postala vrsni kristalograf X-zraka. Franklin je dobio trogodišnju stipendiju za rad na proteinima na King's College London. Međutim, John Randall, direktor King's Collegea, premjestio ju je da radi na DNK. Loša komunikacija između Randalla, Wilkinsa i Franklina dovela je do oštrog odnosa između Franklina i Wilkinsa. Wilkins je mislio da je Franklin dodijeljena da radi s njim, a Franklin je mislio da će joj biti dopušteno da radi samostalno. Vratit ćemo se na ovu točku u Završnim mislima.

Pristupi: Eksperimentalisti i Modelari

Eksperimentalisti: Maurice Wilkins i Rosalind Franklin

Franklin i Wilkins tražili su izravan pristup rješavanju strukture DNK koristeći rendgenske podatke. Uzorak mrlja na rendgenskoj fotografiji pruža informacije koje bi se u načelu mogle koristiti za rekonstrukciju 3D slike molekule DNK.

Kako koristiti X-zrake za stvaranje slike DNK? Fotoaparat koristi vidljivo svjetlo i leće za ponovno stvaranje slika makroskopskog svijeta. Mikroskop koristi iste principe, sa snažnijom lećom, kako bi napravio slike mikroskopskog svijeta stanica. Međutim, manji atomski svijet ne može se vizualizirati vidljivom svjetlošću. Umjesto toga, kraća valna duljina X-zraka (∼0,1 nm u usporedbi s 400-700 nanometara za vidljivu svjetlost) dobro je usklađena s dimenzijama atoma. No, budući da nije moguće izraditi leće koje fokusiraju X-zrake, izravne slike atoma ne mogu se generirati pomoću X-zraka. Međutim, nefokusirane X-zrake raspršene uzorkom mogu se uhvatiti na film, stvarajući uzorak mrlja ili linija koji se naziva difrakcijski uzorak. Difrakcijski uzorak sadrži informacije o 3D rasporedu atoma u uzorku. Matematička obrada (Fourierova transformacija) uzorka difrakcije može ponovno stvoriti sliku, služeći na taj način usporedivu funkciju s lećom.

Korištenje informacija o difrakciji rendgenskih zraka za rekonstrukciju detaljnog 3D modela atoma u molekuli danas je vrlo uobičajeno (ako se može postići da molekula formira dobro uređen kristal ili vlakno).Međutim, u vrijeme Bella, Wilkinsa i Franklina, ova metoda je još bila u povojima, a struktura biološke molekule složene poput proteina ili DNK tada još nije bila riješena. Što stvar čini još težim, matematička rekonstrukcija slike morala se izračunati ručno u 1950-ima, dok moćna računala danas obavljaju te zadatke.

Modeleri: Watson i Crick i, zasebno, Pauling

Watson i Crick željeli su odrediti strukturu DNK, ali bez sporog i teškog rada na rješavanju kroz rekonstrukciju rendgenskih podataka. Osim toga, bili su svjesni da Wilkins i Franklin na King’s Collegeu idu tim putem i činilo se da nema smisla udvostručiti njihov trud. Watson je posebno bio nestrpljiv i želio je riješiti zagonetku što je prije moguće. Tako su se Watson i Crick okrenuli modeliranju. Međutim, drugi projekti su im zauzimali većinu vremena, a oni su se sporadično okretali izgradnji DNK modela.

Izrada modela je proces dedukcije na temelju ograničene količine poznatih informacija. To je pomalo igra, nešto kao "imenuj tu melodiju". Prepoznavanje pjesme nakon što čujete minutu glazbe može biti relativno jednostavno. Ali možda će biti teško pogoditi iz 2 ili 3 bilješke. Rad Florence Bell generirao je dvije informacije: (1) udaljenost između baza i (2) širinu molekule DNK. Ali to nije bilo dovoljno informacija da se napravi ispravan model. Trebalo je više informacija, ali koliko više? Izgradnja modela također jako ovisi o dobrim podacima. Netočni podaci će dovesti do zablude i dovesti do pogrešnog modela.

Linus Pauling bio je tipičan graditelj modela. Paulingova sposobnost da zaključi strukturu proteinske alfa spirale putem intuicije i kemijskih pravila inspirirala je Watsona i Cricka. Watson pripovijeda:

"Ubrzo su me naučili da je Paulingovo postignuće proizvod zdravog razuma, a ne rezultat kompliciranog matematičkog razmišljanja. Jednadžbe su se povremeno uvlačile u njegovu argumentaciju, ali u većini slučajeva riječi bi bile dovoljne. Ključ Linusova uspjeha bilo je njegovo oslanjanje na jednostavni zakoni strukturne kemije. Alfa-helix nije pronađena samo gledanjem u rendgenske slike, bitni trik, umjesto toga, bio je pitati koji atomi vole sjediti jedan pored drugog. Umjesto olovke i papira, glavni radni alati bili su skup molekularnih modela koji su površno nalikovali igračkama predškolske djece. Stoga nismo mogli vidjeti razlog zašto ne bismo riješili DNK na isti način. Sve što smo trebali učiniti je konstruirati skup molekularnih modela i početi igrajte se - uz sreću, struktura bi bila spiralna. Bilo koja druga vrsta konfiguracije bila bi puno kompliciranija."

U Osmom danu stvaranja (vidi popis referenci)

Model nije činjenica, to je hipoteza o tome kako nešto funkcionira što je potrebno proučiti i testirati. Ponekad se znanstvenici zaljube u lijepe modele koji nisu točni. Kako znanstvenici dolaze do zaključka da je model ispravan? Ovo je često teško pitanje jer nekoliko modela može biti u skladu s dostupnim eksperimentalnim podacima, osobito ako su podaci ograničeni. Međutim, dobar model daje nova predviđanja koja usmjeravaju nove eksperimente koji će dodatno testirati je li model ispravan ili razlikuje konkurentske modele.

Prije nego što ispitamo kako su Watson i Crick došli do svog trijumfalnog trenutka, ispitajmo izbor izbora uključenih u pretvaranje 2D kemijske strukture DNK u trodimenzionalnu strukturu:

1) Koliko je lanaca DNK prisutno u biološkoj molekuli DNK? Je li jedan, dva, tri ili više?

2) Ako je više od jednog, kako su lanci orijentirani? Trče li u istim ili suprotnim smjerovima?

3) Ako je više od jednog lanca, kako oni međusobno djeluju? Međudjeluju li lanci na ravninski način ili se uvijaju jedan oko drugog? Ako je uvijen, koji je smjer uvijanja i na kojoj udaljenosti zavoj se potpuno okreće?

4) Ako je više od jednog lanca, jesu li fosfati iznutra, a baze izvana? Ili obrnuto?

Zbog ograničenog broja parametara u izradi 3D modela ovo bi se moglo učiniti kao zagonetka za jednostavno rješavanje. Međutim, da je DNK dvostruka spirala samo retrospektivno izgleda očito. Watson/Crick i Pauling najprije su favorizirali pogrešne izbore prije nego što je identificirano ispravno rješenje. DNK priča otkriva da je teško pronaći ispravno rješenje za nepoznati problem. Znanstvenici obično ne gravitiraju odmah pravom odgovoru, već do njega dolaze kroz iterativni proces.

Watson i Crick proizveli su svoj prvi model u studenom 1951., neposredno nakon što je Watson čuo prezentaciju o rendgenskom radu na DNK od znanstvenika s King's Collegea. Prvi Watson-Crickov model sastojao se od tri lanca DNK omotane u trostruku spiralu s fosfatima u središtu i bazama usmjerenim prema van. Ta je ideja bila ugodna u to vrijeme. Kad bi se baze, najzanimljiviji i najpromjenjiviji dio DNK, smjestile izvana, tada bi mogle lakše komunicirati s proteinima.

Watson i Crick predstavili su svoj model s tri spirale Wilkinsu i Franklinu. Bilo je prerano. Watson nije u potpunosti probavio rendgenske informacije koje je predstavio Franklin, što je dovelo do pogrešaka u njihovom modelu. Franklin je odmah skrenuo pozornost na te pogreške, uključujući fosfate u središtu. Bio je to ponižavajući trenutak, ne samo za Watsona i Cricka, već i za Cavendish Laboratorij općenito. Direktor laboratorija u Cavendishu, Sir Lawrence Bragg, zabranio je Watsonu i Cricku da rade na DNK i naznačio da bi trebali ostaviti strukturu DNK na rješavanje King's Collegea. Postojala je duga pauza (više od godinu dana) prije nego što su se Watson i Crick ponovno vratili ozbiljnom radu na DNK.

U međuvremenu, Linus Pauling dolazio je na red u izgradnji DNK modela na Caltechu. Watson i Crick bili su prijatelji s Linusovim sinom, Peterom Paulingom, koji je u to vrijeme studirao na Cambridgeu. Krajem siječnja 1953. Linus Pauling je na kraju napravio rukopis koji opisuje svoj model za DNK, koji su Watson i Crick vidjeli preko Petera.

Paulingov model (koji se pojavio u tisku u veljači 1953.) imao je istu grešku kao i prvi model Watsona i Cricka. To je također bila trolančana spirala s fosfatima u središtu (slika 9).

Slika 9. Netočna struktura Linusa Paulinga za DNK, koja je fosfate smjestila u središte trolančane spirale. Ponovno nacrtano s modifikacijama iz Paulingovog rada iz 1953. (vidi popis referenci).

Zašto je Pauling, heroj proteinske alfa-heliksa 2 godine ranije, smislio pogrešnu strukturu DNK? Pauling nije imao pristup informativnoj DNK fotografiji Rosalind Franklin, o kojoj će biti riječi u nastavku. No, njegov model također nije bio u skladu s poznatom kemijom, kao što su sile privlačnosti i odbijanja između atoma (stavljanje negativno nabijenih fosfata u centar odbijalo bi, a ne držalo lance zajedno). Njegov model također nije uključivao njegovu vlastitu ideju (ranije opisanu) o genima koji imaju komplementarne polovice.

Neki nagađaju da je Pauling smatrao da je u utrci za strukturu DNK i da treba brzo nešto izvući. Međutim, vjerojatnije objašnjenje bilo je da DNK nije bio veliki prioritet za Paulinga. Pauling je možda mislio da će DNK biti još jedna biološka spirala, možda zanimljiva sa strukturne točke gledišta, ali ne i struktura koja bi otključala "tajnu života". Matt Meselson (autor Ključnog eksperimenta o tome kako se DNK replicira) bio je u to vrijeme diplomski student kod Paulinga i nije znao da njegov savjetnik uopće radi na DNK (osobnoj komunikaciji). I sam Pauling je kasnije rekao: "Nismo puno radili na tome. Nisam ulagao puno svog vremena u određivanje strukture." (Osmi dan stvaranja vidi reference). Da je očekivao da će struktura DNK otkriti zagonetku nasljeđa, vjerojatno bi rješavanje njezine strukture stavio kao veći prioritet.

Uspjeh: Put do dvostruke spirale DNK

Uz bolju rendgensku opremu, Franklin i Wilkins poboljšali su rendgenske fotografije DNK u odnosu na one koje su napravili Florence Bell i William Astbury. Međutim, njihove početne fotografije još uvijek je bilo teško protumačiti. Franklin je tada shvatio da su fotografije mutne jer su bile pomiješana slika koju su proizvela dva različita oblika DNK u vlaknu. Kontrolirano mijenjajući količinu vlage, tada je pronašla uvjete za stvaranje čistih vlakana dvaju oblika DNK, koje je nazvala "A-oblik" i "B-oblik". Franklinov eksperimentalni napredak bio je veliki doprinos i važna prekretnica u priči.

2. svibnja 1952. Franklin i njezin diplomski student Raymond Gosling razvili su fotografiju 51, >60-satnu ekspoziciju X-zrakama DNA B-oblika, koja je otkrila uzorak kratkih linija koje su formirale "X" (slika 10). O ovoj slici, jednoj od najpoznatijih u biologiji, napisana je cijela kazališna predstava (Fotografija 51).

Slika 10 Fotografija 51 od Rosalind Franklin. Pogledajte Dig Deeper 3 za informacije sadržane u ovom uzorku difrakcije X-zraka.

Međutim, fotografija 51 nije dovela do trenutka eureke, njezine tragove u to vrijeme nije bilo lako uočiti. Franklin se odlučila usredotočiti na A-oblik DNK, za koji je mislila da je bogatiji informacijama i da bi mogao pružiti izravno rješenje za strukturu. U nedostatku punog napretka na A-oblici, Franklin se vratio analizi jednostavnijeg B-oblika 1953. godine, otprilike u isto vrijeme kada su Watson i Crick započeli svoj sprint do dvostruke spirale opisane u nastavku.

"Čarobni mjesec" dvostruke spirale započeo je 30. siječnja 1953. na taj dan, Jim Watson je vlakom otišao do King's Collegea kako bi podijelio vijest o Paulingovom netočnom DNK rukopisu s Wilkinsom i Franklinom. Prilikom tog posjeta Wilkins je pokazao Watsonu fotografiju 51, ne znajući da se ta informacija Watsonu može protumačiti. Watson je, eksplodirajući od uzbuđenja, odjurio natrag u Cambridge kako bi podijelio vijest o onome što je vidio, jasan dokaz da je DNK spirala. Watson je uvjerio Bragga, direktora laboratorija u Cavendishu, da dopusti ponovni napor u modeliranju DNK. Mislili su da će Pauling uskoro shvatiti pogreške u svom DNK modelu i potencijalno shvatiti ispravnu strukturu. Watson i Crick su se vratili u poslovno modeliranje DNK 1. veljače 1953. U tom trenutku znali su da je DNK spirala, ali su potencijalno još uvijek bili daleko od cjelovitog rješenja. Zanimljivo je da su četiri tjedna kasnije stigli do uspješnog modela. Dana 28. veljače, kako legenda kaže, Crick je u Eagle Pubu izjavio da su on i Watson otkrili "tajnu života". Glavni događaji u priči o dvostrukoj spirali DNK prikazani su na vremenskoj liniji na slici 11.

Slika 11 Vremenska linija događaja koji su doveli do modela dvostruke spirale.

Tri značajna dijela slagalice spojila su se kako bi napravili konačni model.

Dio slagalice 1: DNK je dvostruka spirala

Nakon prvog neuspjelog pokušaja DNK modela, Crick se vratio rendgenskoj kristalografiji proteina, posebice keratina, glavnog proteina kose. Keratin se sastoji od spirala polipeptidnih lanaca. Crick, Cochran i Vand razvili su teoriju o tome kako bi rendgenski uzorak spirale trebao izgledati kao definirajuća značajka je uzorak mrlja u obliku X.

Watson, bakterijski genetičar po obrazovanju, ni fizičar ni kristalograf, počeo je učiti difrakciju X-zraka od Cricka i drugih u Cavendishu. Zahvaljujući Crickovom radu na spiralnim strukturama i njihovim stalnim raspravama, Watson je shvatio da uzorak mrlja u obliku X na rendgenskoj fotografiji označava spiralnu strukturu. Podstaknut tim znanjem, Watson je odmah znao da je DNK spirala kada je 30. siječnja ugledao fotografiju 51 na King’s Collegeu.

Redovno raspoređene linije koje čine uzorak u obliku slova X na fotografiji 51 također su Watsonu dale još jednu kritičnu informaciju: udaljenost ponavljanja spirale (34 Å vidi Dig Deeper 3). Ovo je udaljenost na kojoj se lanac DNA okreće i dolazi do iste relativne točke duž osi (slika 12). Sada su Watson i Crick znali tri kritična numerička parametra za izradu 3D modela – udaljenost ponavljanja spirale (34 Å), širinu molekule (20 Å) i razmak između baza (3,4 Å).

Watson se brzo vratio modeliranju. Međutim, na temelju svoje inspekcije fotografije 51, Watson nije znao je li spiralna struktura DNK sastavljena od jednog, dva ili tri lanca. Pretpostavio je da bi to mogla biti dva lanca usmjerena u istom smjeru. Međutim, njegov model nije uspio. Možda nešto nije u redu.

Slika 12 Na temelju svog pregleda Franklinove fotografije 51, Watson je zaključio da je DNK neka vrsta spiralne strukture s razmakom ponavljanja od 34 Å. Nije znao koliko je niti u spiralnoj strukturi, ali je početno pretpostavio da se radi o dvije niti orijentirane u istom smjeru.

Dio slagalice 2: DNK se sastoji od dva lanca koji se kreću u suprotnim smjerovima

Budući da je Watson zapeo u svom modeliranju, Crick je bio taj koji je pružio sljedeći kritički uvid. Voditeljska skupina u Cavendish Laboratories primila je izvješće o napretku od King's Collegea koje je postalo dostupno Cricku. Informacija je prethodno bila javno prezentirana i na prvi pogled možda nije djelovala odveć korisno. Međutim, Crick je uhvatio frazu koja opisuje DNK A-oblika kao "monokliniku usmjerenu na lice". Ovaj tehnički detalj pružio je informaciju o simetriji molekula u DNK vlaknu. Crick je shvatio, što Wilkins i Franklin u to vrijeme nisu shvatili, da ta simetrija znači da je DNK sastavljena od dva identična dijela, od kojih jedan odgovara drugom, ali u obrnutoj orijentaciji. Crick je zaključio da DNK mora biti napravljena od dva lanca orijentirana u suprotnim smjerovima (slika 13). Ekstrapolirajući da je simetrija A-oblika DNK također istinita i za B-oblik DNK, Watson i Crick su sada bili uvjereni da je DNK dvostruka spirala i sada su znali orijentaciju lanaca.

Slika 13 Crick dobiva uvid iz rendgenskih podataka da je DNK dvostruka spirala sastavljena od dva lanca orijentirana u suprotnim smjerovima.

Pitanje istraživača: Gradite model spiralnog stubišta dvostruke spirale DNK s razmakom ponavljanja od 34 Å. U spiralnom stubištu, stepenice su pomaknute pod određenim kutom. Koji biste kut uveli između baza u vašem modelu DNK? (Savjet: Upotrijebite informacije iz Florence Bell o udaljenosti između baza, kao i o udaljenosti ponavljanja koju otkriva fotografija 51 Rosalind Franklin).

Odgovor: Jedan potpuni okret dvostruke spirale je 34 Å. Udaljenost između baza je 3,4 Å. Stoga deset baza čini potpuni okret spirale. Kutni pomak između dvije susjedne baze bio bi

36° (360° (jedna potpuna rotacija)/ 10 baza).

Dio slagalice 3: Komplementarno uparivanje baza drži dvije niti zajedno

Rentgenski podaci A- i B-oblika DNK otkrili su dvostruku spiralu s razmakom ponavljanja od 34 Å i niti koje se kreću u suprotnim smjerovima. Ali Watsonu i Cricku nedostajali su daljnji detalji. Gdje su baze? Što drži dvije niti zajedno?

Watsonov i Crickov model iz 1951. i Paulingov model iz 1953. postavili su fosfate u središte. Nakon što ih je Franklin upozorio na probleme s ovom orijentacijom, Watson i Crick su sada počeli graditi modele s bazama postavljenim u sredini i fosfatima s vanjske strane.

Watson je započeo slaganjem baza svakih 3,4 Å, kao u modelu Florence Bell (Clue 3). Ali za razliku od Bellovog modela, koji je bio od jednog lanca, Watson je morao tražiti uvjerljive načine na koje bi baze mogle međusobno djelovati kako bi držale dvije niti dvostruke spirale zajedno. Dobro poznata privlačna sila je vodikova veza, koja uključuje donorski vodik u interakciji s "akceptorom" (obično elektronegativnim atomom kao što je dušik (N) ili kisik (O)) (vidi Pregled znanja). Watson je počeo tražiti moguće načine na koje se mogu formirati vodikove veze između baza preko dvostruke spirale.

Da bi započeo ovaj napor, Watson je potražio kemijske strukture baza iz dobro cijenjenog udžbenika. (Kao što ćete uskoro vidjeti, ne možete uvijek vjerovati onome što čitate u udžbeniku!). Watson je smislio ono što je mislio da je rješenje: slično stupa u interakciju sa sličnim. U ovoj ideji sparivanja homo (što znači "isto") baza, adenin se uparuje s adeninom, gvanin s gvaninom, citozin s citozinom i timin s timinom (slika 14.).

Slika 14 Watsonov model za homo uparivanje između identičnih baza (netočan i kratkotrajan model). Kovalentne veze su označene punim linijama, a vodikove veze su označene isprekidanim linijama.

Pitanje istraživača: Pruža li model uparivanja homo baza DNK rješenje za to kako bi se gen mogao replicirati?

Odgovor: Da. Homo uparivanje baza je oblik komplementarnosti i pruža jednostavno pravilo o tome kako se novi lanac DNK može kopirati iz već postojećeg lanca. U ovom modelu, dva bi niza bila sastavljena od identičnih nizova slova.

Pitanje istraživača: Možete li se sjetiti problema s ovim modelom uparivanja homo baza?

Odgovor: Model ima veliki problem za stvaranje dvostruke spirale konstantnog promjera. Purinski parovi (G-G i A-A) su širi (budući da su dvostruki prstenovi) od pirimidinskih parova (T-T i C-C) (jednostruke baze prstena), što rezultira varijacijama u širini molekule.

Pitanje istraživača: Je li model uparivanja homo baza u skladu s Chargaffovim podacima?

Odgovor: Ne. Model uparivanja homo baza ne daje obrazloženje zašto su omjeri G prema C i A prema T jednaki 1.

Watson je bio uzbuđen zbog modela uparivanja homo baza jer je pružao jednostavno pravilo za replikaciju gena. Međutim, bilo je problema s modelom, kao što je objašnjeno u gore navedenim pitanjima Explorera.

Zatim se dogodio još jedan slučajan događaj u čarobnom mjesecu. Jerry Donohue, stručnjak za kemiju nukleotidnih baza, posjetio je Cavendish laboratorij i dobio zadatak da radi u istoj prostoriji kao i Watson i Crick. Kada je Watson predstavio svoj model uparivanja homo baza, Donohue mu je rekao da su kemijske strukture za gvanin i timin iz "udžbenika" vjerojatno netočne. Nukleotidne baze mogu usvojiti dvije malo različite kemijske strukture, zvane tautomeri, koji sadrže isti skup atoma, ali se razlikuju u položaju jednog atoma vodika. Iako je ova razlika mala, vrlo je važna za određivanje pravog skupa vodikovih veza između baza. Donohue je rekao da su tautomeri gvanina i timina korišteni u Watsonovom modelu uparivanja homo baza vjerojatno netočni. Ako netko ima pogrešnu ideju ili model, najbolje što se može dogoditi je brzo ga odbaciti. Watsonov model se razotkrio u roku od 2 dana.

Sada koristeći ispravne osnovne strukture koje je opisao Donohue, Watson je 28. veljače 1953. počeo graditi nove modele. Počeo se igrati s komadićima kartona izrezanim u oblicima četiri baze, tražeći načine na koje bi mogli biti u interakciji.Zatim je došlo ono što se može smatrati "trenutom eureke" u priči o dvostrukoj spirali DNK, koju je Jim Watson ponovio mnogo godina kasnije u ovom kratkom videu (Video 3). Tog istog dana, Watson i Crick uživali su u slavljeničkoj pinci u Eagle Pubu, objavljujući "tajnu života" klijenteli koja pije pivo i koja možda nije u potpunosti shvatila povijesni značaj tog trenutka.

Video 3 Jim Watson se prisjeća kako je došao do ispravnog uparivanja baza u DNK. Ovaj video isječak je izveden iz dužeg videa o dvostrukoj spirali koju je napravio HHMI Biointeractive. https://www.biointeractive.org/classroom-resources/double-helix

Ono što je Watson otkrio 28. veljače 1953. bila su neka vrlo jednostavna pravila za uparivanje baza. Guanin (tautomerna struktura na koju je ukazao Donohue) stvorio je odgovarajuće vodikove veze s citozinom. Koristeći ispravnu strukturu timina, Watson je također vidio da adenin i timin tvore savršen par vodikove veze. Watson i Crick su shvatili da je G-C i A-T vodikova veza ključni sastojak potreban za držanje dvostruke spirale zajedno (slika 15.).

Slika 15 Parovi baza adenina s timinom i gvanina s citozinom drže dvostruku spiralu zajedno. Isprekidane linije predstavljaju vodikove veze koje nastaju između ovih baza. Fosfatno-šećerna okosnica obojena je ljubičastom bojom.

Pitanje istraživača: Je li novi model uparivanja baza G-C i A-T pružio rješenje za to kako bi se gen mogao replicirati?

Odgovor: Da. Poput modela homo-uparivanja, ovo pruža jednostavno pravilo za stvaranje novo repliciranog niza iz predloške niti. Ako roditeljski lanac ima G, tada partnerski lanac koji se replicira treba staviti C nasuprot njemu.

Pitanje istraživača: Zašto je model uparivanja A-T i G-C bio bolje strukturalno rješenje od modela homo-uparivanja?

Odgovor: Dva para purin-pirimidin (G-C i A-T) identične su širine. Bez obzira na redoslijed nukleotida u DNK, širina dvostruke spirale bit će konstantna.

Pitanje istraživača: Je li model baznog uparivanja A-T i G-C u skladu s Chargaffovim podacima?

Odgovor: Da. U ovom modelu postoji strukturno objašnjenje zašto je omjer G prema C i A prema T jednak 1. Međutim, Watson i Crick u početku nisu uključili Chargaffove podatke u izradu modela, kao što Crick objašnjava u The Eighth Day Stvaranja: "Paradoks cijele stvari je u tome što kada je riječ o izgradnji, u početku nismo koristili ideju. Nismo sve dok nismo bili potaknuti na to... I mogu se sjetiti trenutka kada smo to shvatili, Bože, mogli bismo izgraditi strukturu u kojoj bi baze bile komplementarne. I na taj način objasniti Chargaffove omjere jedan prema jedan."

Danas znanstvenici koriste računala za izgradnju molekularnih modela. Međutim, u danima prije računala, Watson i Crick izgradili su fizički model, slično kao model zrakoplova. Strojarnica u laboratoriju Cavendish izrezala je limene ploče u oblike baza, vjerne njihovim relativnim dimenzijama, ali ∼300 000 000 puta veće od života. Watson i Crick pričvrstili su baze na okosnicu od metalnih šećera i fosfata, stvarajući skulpturu koja se uvija. Bio je to model atomskog biološkog svijeta začetog u ljudskom umu. Metalna dvostruka spirala bila je lijepa, ali njezin oblik nije bio važan proboj. Umjesto toga, bila je to moćna ideja komplementarnosti (uparivanje A-T i G-C). Pauling i drugi su smatrali da bi komplementarnost mogla pružiti mehanizam za kopiranje gena. Sada, u modelu Watson i Crick, komplementarnost je pružila fizičko objašnjenje za to kako su se dva lanca u dvostrukoj spirali DNK držala zajedno. Osim toga, pružio je moguće objašnjenje kako se geni repliciraju, o čemu će se raspravljati u sljedećim odjeljcima Što se sljedeće dogodilo i Pregled znanja. Bell, Astbury, Watson, Crick, Pauling, Wilkins i Franklin na početku svojih studija nisu mogli zamisliti da će jasno razumijevanje replikacije gena proizaći iz strukture DNK. Međutim, činjenica da se jednostavno objašnjenje ipak pojavilo učinila je model dvostruke spirale još uvjerljivijim. Kao što je Watson rekao,

"Bilo je previše dana kada smo Francis i ja bili zabrinuti da bi struktura DNK mogla ispasti površno vrlo dosadna, ne upućivajući ništa na njezinu replikaciju ili njezinu funkciju u kontroli stanične biokemije. Ali sada, na moje oduševljenje i čuđenje, Ispostavilo se da je odgovor bio vrlo zanimljiv." U The Double Helix (vidi reference).

Mnogi čitatelji ove pripovijesti vjerojatno su upoznati s igrom "Clue". U ovoj igri igrači skupljaju tragove, sve dok jedan igrač ne osjeti da je prikupio dovoljno tragova da objavi rješenje zločina: "gospodin Green je počinio ubojstvo užetom u knjižnici." Nakon objave, igrač nestrpljivo čeka da vidi može li netko od drugih igrača opovrgnuti njihovo rješenje.

Watson i Crick objavili su svoj prvi model strukture DNK 1951. Bilo je prerano da nisu akumulirali dovoljno tragova i bili su izvan igre, barem privremeno. Sada su Watson i Crick bili spremni najaviti svoj novi model i vidjeti može li ga netko srušiti: DNK je dvostruka spirala s parovima G-C i A-T baza u središtu. Predstavili su ga Donohueu i stručnjaku za nukleotide Alexanderu Toddu (vidi trag 1), koji obojica nisu mogli pronaći nedostatak s kemijske točke gledišta. Pozvali su Lawrencea Bragga, voditelja laboratorija Cavendish, koji nije mogao dati nikakav prigovor sa strukturalne točke gledišta. Tada je došlo vrijeme da se Wilkins i Franklin pozovu u Cambridge da vide njihov model. Franklin i Wilkins su odmah znali da je model Watsona i Cricka u skladu s njihovim podacima i stoga je vjerojatno, iako ne sigurno, u pravu.

Što se dogodilo sljedeće?

Rukopis o modelu dvostruke spirale Watson i Crick su poslali Nature. Bacanje novčića odlučilo je redoslijed autora na papiru. (Mogli bismo to nazvati modelom Cricka i Watsona da je novčić sletio drugačije.) Franklin i Wilkins pripremili su odvojene radove o rendgenskim podacima, koji su u isto vrijeme dostavljeni Nature. Sva tri rada objavljena su zajedno 25. travnja 1953. godine.

Papir Watson i Crick na strukturi modela DNK u biti je zauzimao jednu ispisanu stranicu (vidi Vodeni papir). Čitatelju je ostavila ovu provokativnu poruku:

"Nije nam promaklo da specifično uparivanje koje smo pretpostavili odmah sugerira mogući mehanizam kopiranja genetskog materijala."

Watson i Crick su se suzdržali od predlaganja detaljnijih razmišljanja o replikaciji u svom prvom radu, jer još nisu vidjeli sve rendgenske podatke Wilkinsa i Franklina. Još uvijek su bili pomalo nesigurni je li njihov model točan. Međutim, nakon što su vidjeli papire Wilkinsa i Franklina, postali su sigurniji. Watson i Crick su zatim objavili svoje provokativnije ideje o replikaciji DNK u naknadnom Nature radu objavljenom 30. svibnja. U ovom su radu Watson i Crick dali više informacija o uparivanju baza. Međutim, oni su pretpostavili samo dvije vodikove veze za G-C bazni par, za koje je Pauling kasnije ispravno istaknuo da bi trebale biti tri. Čak i klasični papiri imaju nedostatke. U svom modelu replikacije, Watson i Crick sugerirali su da su vodikove veze koje drže lance zajedno prekinute (nekako) i da svaki pojedinačni lanac služi kao predložak za stvaranje nove komplementarne niti. Taj je model kasnije nazvan "polukonzervativna replikacija" (slika 16).

Slika 16. Polukonzervativna replikacija DNK kako su predložili Watson i Crick. Dvostruka spirala se raspliće i svaki roditeljski lanac (prikazan ljubičastom bojom) djeluje kao predložak za sintezu novog lanca DNK.

Model spirale DNK i njegova replikacija primljeni su s mješavinom entuzijazma i opreza. Pauling je graciozno priznao da je model Watsona i Cricka, a ne njegov, točan. Drugi znanstvenici ostali su skeptični, shvaćajući da podaci iz rendgenskog rada ne mogu u potpunosti podržati detalje Watson-Crickovog modela. Štoviše, Watson-Crickovoj hipotezi za replikaciju DNK nedostajao je ikakav podupirući dokaz.

Modele je potrebno testirati eksperimentima. Dva 24-godišnja znanstvenika, Matthew Meselson i Frank Stahl, prihvatila su se izazova. Njihov eksperiment (koji je skovan "najljepši eksperiment u biologiji") podržao je hipotezu Watsona i Cricka o polukonzervativnoj replikaciji i isključio konkurentske modele (Video 4). O ovom eksperimentu možete saznati iz prve ruke od Meselsona i Stahla u njihovom Key Experimentu u XBio. Publikacija Meselsona i Stahla iz 1958. imala je značajan utjecaj na ovo polje. Nakon što smo vidjeli ove jasne rezultate, skepticizam prema Watsonovom i Crickovom modelu je nestao, a prihvaćanje modela dvostruke spirale otvorilo je novu eru molekularne biologije. Iste godine kad i Meselson-Stahl eksperiment, Arthur Kornberg najavio je otkriće enzima zvanog DNA polimeraza koji može kopirati DNK (o čemu se govori u Pregledu znanja).

Video 4 Videozapis bijele ploče koji opisuje Meselson-Stahl eksperiment.

Zanimljivo je da je Watson-Crickov model tek definitivno dokazan 1980. godine, kada je atomska struktura B-oblika DNA određena korištenjem rendgenskih podataka visoke razlučivosti iz kristala, a ne iz vlakna (prikazano kasnije u Videozapisu 6). Bio je to rezultat o kojem je sanjala Rosalind Franklin, ali dogodit će se tek 30 godina kasnije.

Što se dogodilo s glavnim likovima nakon dvostruke spirale DNK? Watson i Crick ostali su prijatelji, ali su se razišli zbog različitih znanstvenih potrage. Watson je počeo raditi na strukturi RNA. Ali munja nije dvaput udarila. RNA ima složenu i promjenjivu strukturu, a njegovi napori nisu uspjeli. Međutim, Watson je dao i druge važne doprinose, uključujući zajedničko otkrivanje glasničke RNA. Francis Crick je doktorirao 1954. u dobi od 37 godina, a zatim je skrenuo pozornost na to kako DNK služi kao šifra. Crick je predložio Središnju dogmu — koja kaže da informacije DNK teku jednosmjerno od DNK do RNK do proteina (iako se kasnije otkriće obrnute transkripcije pokazalo iznimkom od ovog pravila). O kodu se ukratko govori u Pregledu znanja, ali će biti detaljnije obrađen u drugom Narativu.

Franklin i Wilkins također su se razišli. Zbog svojih poteškoća na King’s Collegeu, Franklin se dogovorila da se pridruži Birkbeck Collegeu u lipnju 1952., samo mjesec dana nakon što je dobila fotografiju 51, a zatim se preselila sredinom ožujka 1953., netom nakon što su Watson i Crick razvili svoj DNK model. Kao dio ove tranzicije, Franklin je zamoljena da sumira svoj rad 28. siječnja 1953., a zatim da prenese svoje DNK podatke na King's College. Nakon što je napustio King's, Franklin je iza sebe ostavio DNK. Prebacila se na proučavanje strukture virusa, objavila 17 radova i napravila revolucionarni rad na tom području. Wilkins je nastavio raditi na DNK i davati važan doprinos na DNK, uključujući razvoj uvjerljivijih dokaza za dvostruku spiralu koristeći rendgenske podatke i precizniju izgradnju modela.

Franklin je umro od raka u dobi od 37 godina 1958., 4 godine prije no što je dodijeljena Nobelova nagrada za strukturu DNK. Prije njezine smrti nije bilo gorčine između Franklina i Watsona i Cricka, naprotiv, razvila je prijateljstvo s obojicom, pa je čak i ostala u Crickovoj kući u Cambridgeu dok se oporavljala od liječenja raka.

Pravilnu i jednostavnu strukturu DNK bilo je mnogo lakše riješiti nego strukturu proteina i RNA, koji imaju složenije oblike. Međutim, relativno brzo nakon dvostruke spirale, Max Perutz i John Kendrew iz Laboratorija Cavendish uspjeli su riješiti 3D strukturu mioglobina, proteina iz mišića koji nosi kisik koji je sličan hemoglobinu. Sada je riješeno preko 150.000 proteinskih struktura, a većina eksperimentalnog predviđanja strukture proteina još je uvijek vrlo teško čak i sa modernim superračunalima. Svaka od tih proteinskih struktura priča zanimljivu priču, iako DNK još uvijek zauzima tron ​​kao najsvjetlijuća i najupečatljivija struktura svih vremena.

Slika 17 sažima znanstveno putovanje DNK, počevši od Mendelovog graška. Ali vremenska crta počinje barem nekoliko milijardi godina ranije. U to vrijeme postojala je molekula DNK s istom strukturom kakva je danas pronađena. Ta se DNK širila i evoluirala te na kraju proizvela bića sposobna dešifrirati strukturu molekule odgovorne za njihovo postojanje.

Slika 17. Vremenska crta nekih od najvećih napretka u genetici i DNK tehnologiji.

Odgovori iz biologije

1. O: Svi organizmi započinju život kao jedna stanica.
2. B: Znanstvenici sugeriraju da se evolucija dogodila kroz proces koji se naziva prirodna selekcija.
3. D: Dvije vrste mjerenja važne u znanosti su kvantitativna (kada se koristi numerički rezultat) i kvalitativna (kada se navode opisi ili kvalitete).
4. C: Normalni spermij mora sadržavati po jedan od svakog od parova ljudskih kromosoma. Ukupno ima 23 para kromosoma. Od toga su 22 autosomna kromosoma, koji ne igraju ulogu u određivanju spola. Preostali par se sastoji od dva X kromosoma u slučaju žena ili od X i Y kromosoma u slučaju muškaraca. Stoga će normalna stanica spermija sadržavati 22 autosomna kromosoma i X ili Y kromosom, ali ne oba.
5. E: Svi živi organizmi na Zemlji koriste isti triplet genetski kod u kojem sekvenca od tri nukleotida nazvana kodon daje informacije koje odgovaraju određenoj aminokiselini koja se dodaje proteinu. Nasuprot tome, mnogi organizmi, osobito određene vrste bakterija, ne koriste kisik. Ti organizmi žive u okolišu siromašnom kisikom i mogu proizvoditi energiju fermentacijom. Drugi organizmi mogu živjeti u mračnim okruženjima, kao što su špilje ili duboko pod zemljom. Mnogi se organizmi razmnožavaju aseksualno pupanjem ili samooplodnjom, a samo evolucijski najnapredniji organizmi koriste neurotransmitere u svom živčanom sustavu.
6. B: Seksualna reprodukcija omogućuje miješanje genetskih informacija od dva roditelja. Događaji rekombinacije između dvije roditeljske kopije pojedinačnih gena mogu se dogoditi, stvarajući nove gene. Proizvodnja novih gena i novih kombinacija gena dovodi do povećanja raznolikosti unutar populacije, što je prednost u smislu prilagodbe promjenama u okolišu.
7. O: Drugi dio znanstvenog imena organizma je njegova vrsta. Sustav imenovanja vrsta naziva se binomna nomenklatura. Prvo ime je rod, a drugo ime vrsta. U binomnoj nomenklaturi vrsta je najspecifičnija oznaka. Ovaj sustav omogućuje korištenje istog imena na globalnoj razini kako bi znanstvenici mogli međusobno komunicirati. Rod i vrsta samo su dvije od kategorija u biološkoj klasifikaciji, inače poznatoj kao taksonomija. Razine klasifikacije, od najopćenitije do najspecifičnije, su kraljevstvo, tip, klasa, red, obitelj, rod i vrsta. Kao što je prikazano, binomna nomenklatura uključuje samo dvije najspecifičnije kategorije.
8. D: Fisija je proces cijepanja bakterijske stanice u dvije nove stanice. Fisija je oblik aseksualne reprodukcije u kojoj se organizam podijeli na dvije komponente, a svaki od ova dva dijela će se razviti u poseban organizam. Dvije stanice, poznate kao stanice kćeri, identične su. Mitoza je, s druge strane, dio diobe eukariotske stanice u kojoj se stanična jezgra dijeli. U mejozi se homologni kromosomi u diploidnoj stanici razdvajaju, smanjujući broj kromosoma u svakoj stanici za polovicu. U replikaciji, stanica stvara duple kopije DNK.
9. O: Bakterijske stanice ne sadrže mitohondrije. Bakterije su prokarioti sastavljeni od pojedinačnih stanica, njihove stanične stijenke sadrže peptidoglikane, a funkcije koje se normalno obavljaju u mitohondrijima obavljaju se u staničnoj membrani bakterijske stanice. DNK je nukleinska kiselina koja sadrži genetske informacije organizma. Oblikovan je kao dvostruka spirala. DNK se može reproducirati i može sintetizirati RNA. Vezikula je mala šupljina koja sadrži tekućinu. Ribosom je sićušna čestica sastavljena od RNA i proteina u kojoj su izgrađeni polipeptidi.


DNK 'četvorostruke spirale' otkrivena u ljudskim stanicama

Godine 1953. istraživači s Cambridgea Watson i Crick objavili su rad koji opisuje isprepletenu strukturu DNK 'dvostruke spirale' - kemijski kod za cijeli život.

Sada, u godini 60. godišnjice tog znanstvenog orijentira, istraživači s Cambridgea objavili su rad koji dokazuju da četverolančane strukture DNK 'četvorolančane spirale' - poznate kao G-kvadrupleksi - također postoje unutar ljudskog genoma. Nastaju u regijama DNK koje su bogate građevnim blokom gvaninom, obično skraćeno 'G'.

Nalazi označavaju kulminaciju više od 10 godina istraživanja znanstvenika kako bi pokazali ove složene strukture in vivo -- u živim ljudskim stanicama -- radeći od hipotetskog, preko računskog modeliranja do sintetskih laboratorijskih eksperimenata i konačno identifikacije u ljudskim stanicama raka pomoću fluorescentnih biomarkera .

Istraživanje, objavljeno 20. siječnja god Kemija prirode i financiran od strane Cancer Research UK, pokazuje jasne veze između koncentracija četverolančanih kvadrupleksa i procesa replikacije DNK, koji je ključan za diobu i proizvodnju stanica.

Usmjeravanjem na kvadruplekse sa sintetičkim molekulama koje zarobljavaju i sadrže te DNK strukture -- sprječavajući stanice da repliciraju svoju DNK i posljedično blokiraju staničnu diobu -- znanstvenici vjeruju da bi moglo biti moguće zaustaviti odbjeglu staničnu proliferaciju u korijenu raka.

"Vidimo veze između hvatanja kvadrupleksa molekulama i sposobnosti zaustavljanja dijeljenja stanica, što je iznimno uzbudljivo", rekao je profesor Shankar Balasubramanian s Odjela za kemiju Sveučilišta u Cambridgeu i Cambridge Research Institute, čija je skupina proizvela istraživanje.

"Istraživanje pokazuje da je vjerojatnije da će se kvadrupleksi pojaviti u genima stanica koje se brzo dijele, kao što su stanice raka. Za nas snažno podupire novu paradigmu koju treba istražiti - koristeći ove četverolančane strukture kao mete za personalizirane tretmane u budućnosti."

Fizičke studije u posljednjih nekoliko desetljeća pokazale su da se četverostruka DNK može formirati in vitro -- u 'epruveti', ali se smatralo da je struktura zanimljivost, a ne značajka koja se nalazi u prirodi. Istraživači sada po prvi put znaju da se zapravo formiraju u DNK ljudskih stanica.

"Ovo istraživanje dodatno naglašava potencijal za iskorištavanje ovih neobičnih DNK struktura za borbu protiv raka - sljedeći dio ovog procesa je otkriti kako ih ciljati u tumorskim stanicama", rekla je dr. Julie Sharp, viši menadžer za znanstvene informacije u Cancer Research UK .

"Prošlo je šezdeset godina otkako je njezina struktura riješena, ali ovakav rad nam pokazuje da se priča o DNK-u nastavlja izvrtati."

Studiju objavljenu 20. siječnja vodila je Giulia Biffi, istraživačica u Balasubramaninanovom laboratoriju na istraživačkom institutu Cambridge.

Nadovezujući se na prethodna istraživanja, Biffi je uspio generirati proteine ​​antitijela koji detektiraju i vežu se na područja u ljudskom genomu bogata četverostruko strukturiranom DNK, dokazujući njihovo postojanje u živim ljudskim stanicama.

Koristeći fluorescenciju za označavanje antitijela, istraživači su tada mogli identificirati 'vruće točke' za pojavu četverolančane DNK - i gdje u genomu i, što je kritično, u kojoj fazi stanične diobe.

Dok se kvadrupleksna DNK nalazi prilično dosljedno u cijelom genomu ljudskih stanica i ciklusima njihove diobe, vidljivo je povećanje pokazalo se kada je fluorescentno bojenje postalo intenzivnije tijekom 's-faze' - točke u staničnom ciklusu u kojoj se DNA replicira prije stanica dijeli.

Rakove obično pokreću geni zvani onkogeni koji su mutirali kako bi povećali replikaciju DNK - uzrokujući da proliferacija stanica izmiče kontroli i dovodi do rasta tumora.

Povećana stopa replikacije DNA u onkogenima dovodi do intenziteta u kvadrupleksnim strukturama. To znači da se potencijalno štetna stanična aktivnost može ciljati sintetičkim molekulama ili drugim oblicima liječenja.

"Otkrili smo da hvatanjem kvadrupleksne DNK sintetičkim molekulama možemo ih sekvestrirati i stabilizirati, pružajući važne uvide u to kako bismo mogli zaustaviti diobu stanica", rekao je Balasubramanian.

"Postoji mnogo toga što još ne znamo. Jedna od ideja je da bi ove kvadrupleksne strukture mogle biti malo smetnje tijekom replikacije DNK - poput čvorova ili zapetljavanja koji se formiraju.

"Jesu li se razvili za neku funkciju? Filozofsko je pitanje jesu li tu po dizajnu ili ne - ali postoje i priroda se mora nositi s njima. Možda ciljanjem na njih pridonosimo poremećaju koji oni uzrokuju."

Studija je pokazala da ako se koristi inhibitor za blokiranje replikacije DNK, razine kvadrupleksa se smanjuju - što dokazuje ideju da je DNK dinamična, sa strukturama koje se stalno formiraju i neformiraju.

Istraživači su također prethodno otkrili da je preaktivan gen s višom razinom Quadruplex DNA osjetljiviji na vanjske smetnje.

"Podaci podupiru ideju da se u određene gene raka mogu korisno utjecati male molekule dizajnirane da vežu specifične sekvence DNA", rekao je Balasubramanian.

"Mnogi trenutačni načini liječenja raka napadaju DNK, ali nije jasno koja su pravila. Čak ni ne znamo gdje u genomu neki od njih reagiraju - to može biti pristup raspršivanju.

"Mogućnost da određene stanice raka koje sadrže gene s ovim motivima sada mogu biti ciljane, i čini se da su osjetljivije na smetnje od normalnih stanica, uzbudljiva je perspektiva.

"Struktura DNK 'četverostruke spirale' može biti ključ za nove načine selektivnog inhibiranja proliferacije stanica raka. Potvrda njenog postojanja u ljudskim stanicama pravi je orijentir."


Tn7: pametniji nego što smo mislili

Transpozoni - klasa mobilnih genetskih elemenata - široko su rasprostranjeni u prirodi, prisutni su u gotovo svakom organizmu koji je ispitan. Bakterijski transpozon Tn7 je od posebnog interesa zbog svoje sposobnosti korištenja nekoliko različitih vrsta ciljanih mjesta. Visoko razvijeni putevi odabira ciljanog mjesta Tn7 pomažu njegovu disperziju među bakterijskim populacijama usmjeravajući insercije na plazmide, ali obeshrabruju bilo kakve potencijalno štetne nasumične umetanja u bakterijske kromosome.

Tn7 proteini TnsA, TnsB i TnsC čine jezgreni stroj za transpoziciju Tn7. TnsA i TnsB surađuju kako bi formirali transpozazu. TnsC je regulator aktivnosti transpozaze, komunicirajući između TnsAB transpozaze i alternativnih proteina za odabir ciljanog mjesta, TnsD i TnsE.

Kada se protein TnsE koristi s jezgrom TnsABC strojeva, Tn7 prvenstveno usmjerava insercije u konjugirane plazmide, koji se mogu kretati između stanica. Interakcija između TnsE i strukture koja je povezana s replikacijom DNA u zaostatku vjerojatno je ključna za prepoznavanje cilja na ovom putu.

Kada se protein TnsD koristi s glavnim strojevima, insercije se usmjeravaju na jedno mjesto u bakterijskom kromosomu, tzv. attTn7. Ovo mjesto je visoko konzervirano među bakterijskim kromosomima. TnsD specifično prepoznaje attTn7 i inducira distorziju na 5′ kraju veznog mjesta što je vjerojatno ključno u regrutiranju TnsC. Rezultati otiska pokazuju da bi TnsC mogao formirati platformu ispod ciljne DNK za primanje i aktiviranje transpozaze TnsAB za provođenje rekombinacije.

TnsC djeluje kao regulator transpozicije Tn7 svojom sposobnošću interakcije i s transpozazom TnsAB i s ciljnom DNK koja je vezana TnsD ili TnsE. TnsC je također odgovoran za imunost na transpozon, proces koji sprječava umetanje u ciljnu DNK kada se kopija Tn7 već nalazi u toj DNK. TnsC bi mogao koristiti mehanizam sličan Ras molekularnom prekidaču da uravnoteži različite "ON" i "OFF" signale koji kontroliraju transpoziciju.

Buduća istraživanja s Tn7 trebala bi pružiti daljnji uvid u to kako se multiproteinski strojevi sastavljaju na DNK u replikaciji, popravku i rekombinaciji.


Gledaj video: Cledos - KYSYMYS feat. Pyhimys (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Thomdic

    Slažem se, ovo je izvrsna ideja

  2. Camden

    Tvoja ideja je veličanstvena



Napišite poruku