Informacija

Genotip -/- vs delta/delta

Genotip -/- vs delta/delta



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

U https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.07.033, Pan i sur. koristite oznaku TMC1^delta/delta da opišete soj miša kojem nedostaje funkcionalni TMC1 gen. Što ako postoji razlika između delta/delta superscripta i -/- superscripta u ovom kontekstu?


Delta se odnosi na a mutantni alel, u ovom slučaju cistein točkasti mutant. -/- se odnosi na homozigot nulti alel, u ovom slučaju nokaut.


Istraživanje odnosa između TMPRSS6 ekspresija gena, genetske varijante i klinički nalazi u karcinomu dojke

Rak dojke jedna je od najčešćih vrsta raka među ženama diljem svijeta. The TMPRSS6 (Transmembrane Serine Protease 6) gen kodira matriptazu-2, koja igra važnu ulogu u hemostazi željeza kao regulator hepcidina i može igrati ulogu u osjetljivosti na rak dojke. U ovoj studiji ispitali smo razine ekspresije TMPRSS6 gena u zdravim tkivima i tumorskim tkivima oboljelih od karcinoma dojke te odnos između tih razina i patoloških nalaza. Odnos između TMPRSS6 polimorfizmi (rs733655, rs5756506, rs2413450, rs855791, rs2235324, rs4820268) i hematološki parametri pacijenata. Studija ekspresije gena obuhvatila je 47 pacijenata s rakom dojke, a studija polimorfizma gena sastojala se od 181 bolesnika s rakom dojke i 100 zdravih kontrolnih skupina. Analiza ekspresije gena provedena je pomoću qRT-PCR. Genotipizacija TMPRSS6 polimorfizam je izveden RT-PCR. TMPRSS6 Utvrđeno je da su razine ekspresije gena u tumorskim tkivima 1,88 puta veće od razina ekspresije u kontrolnim tkivima. Ispitali smo odnos između TMPRSS6 razine ekspresije gena i patoloških podataka, utvrđena je statistički značajna povezanost između pacijentovog estrogenskog receptora (ER) i HER2 nalaza i TMPRSS6 ekspresija gena (p = 0,02, p = 0,002). Kada je odnos između TMPRSS6 istražena je distribucija genotipova vezanih uz polimorfizam gena i hematološki nalazi, utvrđena je značajna povezanost između parametra srednje koncentracije korpuskularnog hemoglobina (MCHC) i polimorfizma samo rs733655. Prema našim nalazima, povećanje u TMPRSS6 ekspresija gena u kancerogenim tkivima pokazuje da matriptaza-2 može biti učinkovita u procesu raka. Tako TMPRSS6 polimorfizmi gena mogu utjecati na proces bolesti utječući na krvne parametre pacijenata.


Pozadina

Hepatitis delta virus (HDV) je mali defektni RNA virus s negativnim ulančanim genomom. Zahtijeva pomoćni virus, virus hepatitisa B (HBV), za opskrbu proteinima ovojnice (HBsAgs) za dovršetak sklapanja i izlučivanja viriona [1-3]. HDV genom dugačak je oko 1700 nukleotida i kružnog je oblika, čini se da tvori nerazgranatu štapićastu strukturu zbog visokog stupnja intramolekularnog komplementarnog sparivanja baza [4,5]. Slijed genoma HDV podijeljen je na sekvencu sličnu viroidu i sekvencu koja kodira protein [1,6]. Pretpostavlja se da je HDV rezultat rekombinacije RNA između viroidne sekvence i stanične mRNA koja kodira protein DIPA (delta interacting protein) [6,7]. Analiza HDV sekvenci iz cijelog svijeta otkrila je da one iz Afrike imaju najveću raznolikost, što sugerira da je prvi HDV mogao nastati u Africi [8,9]. Nakon dodatne izolacije novih HDV sekvenci iz Afrike, klasifikacija HDV-a je promijenjena s one koja uključuje genotipove I do III u onu koja uključuje kladove 1 do 8 [8].

U posljednja tri desetljeća, intenzivne studije molekularne biologije uvelike su otkrile funkcije i uloge HDV kodiranih proteina u replikaciji. Tijekom HDV replikacije, kodirajuća sekvenca se prevodi u dva delta antigena (HDAgs), mali i veliki oblik (SDAg i LDAg), iz istog okvira čitanja to su 195 odnosno 214 aminokiselina duljine [10,11] . Proizvodnja LDAg odvija se kroz proces poznat kao uređivanje RNA, koji se izvodi staničnim ADAR-om [12,13] koji pretvara jantarni stop kodon (UAG) SDAg u kodon triptofana (UGG), što rezultira dodatnim 19 ili 20 aminokiselina. kiseline na C-kraju LDAg [14]. SDAg je bitan za HDV replikaciju dok LDAg antagonizira funkciju SDAg i potreban je za interakciju s HBsAg tijekom sastavljanja i sazrijevanja viriona [15,16]. Postoji CaaX-box (211 CRPQ 214, 211 CTPQ 214 i 211 CTQQ 214 u različitim HDV genotipovima, vidi sliku ​ sl.1A) 1A) na C-terminusu LDAg, koji djeluje kao signal izoprenilacija. Mutacija izoprenilacijskog signala LDAg dovodi do neuspjeha sastavljanja i izlučivanja viriona [17-19].

Značajke LDAg aminokiselinskih sekvenci HDV-a i sintetskih oligonukleotida koji kodiraju 13-aminokiselinski peptid LDAg. (A) Poravnavanje aminokiselina (u jednoslovnim simbolima) pune duljine LDAg iz tri genotipa. Genotip I je iz američkog soja (pristupni broj <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"M28267","term_id":"602445","term_text":"M28267">> M28267), genotip II iz soja Tajvan-3 (pristupni broj <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"U19598","term_id":"1480437","term_text":" U19598">> U19598), i genotip III iz soja Peru (pristupni broj <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"L22063","term_id":"410182","term_text ":"L22063">> L22063). Pretpostavljene domene za vezanje klatrina prikazane su pravokutnim okvirima, a zadnjih 19 ili 20 aminokiselina LDAg označene su podebljanim slovima. Konsenzus aminokiselina za posttranslacijsku modifikaciju naznačene su kako slijedi: Ac (acetilacija) na aminokiselini 72, Pi (fosforilacija) na pozicijama 2, 123 i 177 i Py (izoprenilacija) na poziciji 211. Položaji aminokiselina označeni su brojevima. (B) Dva komplementarna oligonukleotida dizajnirana su za ekspresiju odgovarajućih kratkih aminokiselinskih sekvenci (kao što je naznačeno jednoslovnim simbolima iznad oligonukletida) LDAg. 5'- i 3'-kraj oligonukleotida dizajnirani su tako da uključuju restrikcijska mjesta EkoRI i Salja, odnosno. Mjesto zabrane odmah pored Saljesam EkoRV, koji je posebno dizajniran da omogući brz odabir klonova.

Uz sekvencu signala izoprenilacije, na C-terminusu LDAg-a također je identificiran nuklearni izvozni signal (NES) [20]. Unutar uobičajene sekvence 195 aminokiselina SDAg i LDAg, identificirana su dva navodna motiva leucinskog zatvarača, motiv vezanja RNA i dva signala nuklearne lokalizacije [21-24]. I SDAg i LDAg su fosfoprotieni s različitim stupnjem modifikacije [25]. Nakon što ih fosforiliraju PKC [26], CKII [18,26], PKR [27] ili ERK1/2 [28], utječu na replikaciju HDV-a ili su ciljani na SC-35 mrlje [18,26-28] . Također je pokazano da i acetilacija HDAg na lizinu-72 i metilacija SDAg na argininu-13 utječu na replikaciju HDV-a [29-31]. Očuvanje ovih posttranslacijskih mjesta HDAg među svim poznatim HDV genotipovima sugerira da su stanični enzimi odgovorni za posttranslacijske modifikacije HDAg barem djelomično, ako ne i svi, uključeni u replikaciju HDV.

Koinfekcija i superinfekcija HDV-a s HBV-om obično uzrokuju težu bolest jetre od pojedinačne infekcije HBV-om [32]. Različiti HDV genotipovi pokazuju različite geografske distribucije i povezani su s različitim obrascima bolesti [7,33]. HDV genotip I rasprostranjen je diljem svijeta i povezan je sa širokim spektrom bolesti, u rasponu od fulminantnog hepatitisa do asimptomatske kronične bolesti jetre. Genotip II se uglavnom nalazi u Aziji, uključujući Japan, Tajvan i Sibir, i čini se da uzrokuje manje tešku bolest od genotipa I. Genotip III uglavnom se nalazi u sjevernom dijelu Južne Amerike i proizvodi teški oblik fulminantnog hepatitisa [ 33]. Čini se da mehanizam patogeneze HDV-a proizlazi iz kompliciranih interakcija između HDV-a, HBV-a i/ili čimbenika domaćina i nije u potpunosti shvaćen.

Dvije nedavne studije su pokazale da bi LDAg umjesto SDAg mogao igrati značajnu ulogu u patogenezi HDV-a [34,35]. Jedna studija pokazala je izravno vezanje LDAg na Smad-3, koji modulira TGF-β signalizaciju za aktiviranje ekspresije inhibitora aktivatora plazminogena-1 i c-Jun-inducirane signalne kaskade, što bi moglo dovesti do ciroze jetre [35]. Druga studija je pokazala da se citoplazmatski oblik LDAg veže na teški lanac klatrina (CHC) i nadalje sugerira da je ova interakcija LDAg-CHC potrebna za sastavljanje HDV-a. Nadalje, čini se da interakcija LDAg-CHC ometa endocitozu i egzocitozu posredovanu klatrinom, što bi konačno moglo dovesti do oštećenja hepatocita [34]. Međutim, klatrinska kutija (199 LFPAD 203) identificirana u LDAg genotipa I nije konzervirana u istom položaju u genotipu II i III (slika ​ (slika 1A). 1A). Ova studija je provedena s ciljem provjere je li aktivnost vezanja klatrina očuvana u tri glavna genotipa LDAg.


Klasifikacija

HDV je priznat od strane Međunarodnog odbora za taksonomiju virusa (ICTV), kao novu vrstu virusa kralježnjaka, jedini predstavnik Deltaviridae obitelj, Deltavirus rod [17]. Iako je HDV po strukturi i načinu umnožavanja prilično sličan fitopatogenima, viroidima i virusoidima, dovoljno je različit da bi se mogao svrstati u zaseban rod. HDV se obično klasificira kao satelitski virus HBV-a, jer se temelji na biološkom principu da HDV nije sposoban za infekciju u odsutnosti HBV-a [14, 18].


Rasprava

Nedavne studije iz našeg laboratorija 10,26,27 i drugih 28,29 povezale su promijenjenu ekspresiju SGTA s proliferacijom tumorskih stanica i/ili prognozom raka. To nije iznenađujuće, s obzirom na to da je SGTA bio uključen u stanični ciklus i apoptozu 5,45,46 te u molekularnu pratnju brojnih proteinskih klijenata kako bi se osiguralo njihovo ispravno savijanje, razdvajanje i/ili trgovina 1 . Svaki od ovih procesa, ako je defektan, može doprinijeti tumorigenezi. Osim uloge u patofiziologiji nekoliko bolesnih stanja 10,18,26,27,28,29,30,31, malo se zna o normalnoj fiziološkoj ulozi SGTA.

In vitro, SGTA Knockdown u stanicama bubrega (NBE) 34 , raka vrata maternice (HeLa) 5 i raka prostate (C4-2B) 26 smanjuje proliferaciju i održivost zbog poremećene mitoze 5,34, u vezi s defektnom citokinezom 34 i neuspjelim dovršenjem kromosomskog poravnanja. Zbog ovoga i činjenice da Sgta je sveprisutno izražen i dokumentiran je širok raspon interakcija proteina sa SGTA 1 , pretpostavili smo da Sgta bio bi vitalan za život i da bi se njegova ablacija kod miševa pokazala smrtonosnom. No, naprotiv, ovdje smo pokazali da je to održivo Sgta −/− životinje su proizvedene iz uzgoja Sgta-deficirani miševi, kao što je slučaj u nokautu/downu konzerviranih SGTA ortologa 32,33 u C. elegans, D. melanogaster i S. cerevisiae 14,15,33 . Uočena je tendencija smanjenja broja Sgta −/− potomstvo u usporedbi s očekivanim Mendelovim nasljeđem je u skladu s onim kod mutanata za sličan protein koji sadrži TPR, FKBP52 (Fkbp4) 47,48 . S obzirom na značajne dokaze da je SGTA uključen u inserciju proteina usidrenog repom (TA) 16,22,49 i kako je biogeneza TA ključna za rani razvoj i genetska ablacija koja ometa ovaj proces povezana je s embrionalnom smrtnošću 50,51, moguće je da aberantna obrada TA proteina može doprinijeti smanjenom prinosu mutantnih životinja. Uzrok prenatalne smrtnosti ostaje neutvrđen, međutim, u slučaju FKBP52 −/−, genetska pozadina je pridonijela penetraciji djelovanja FKBP52. To jest, neovisna generacija FKBP52 -/− miševa na pozadini C57BL/6J 47 i 129SvEv 48 dala je smrtnost kod 50% odnosno 30% embrija iz heterozigotnog parenja. Štoviše, povratno križanje mutanata FKBP52-129SvEv na soj C57BL/6 povećalo je smrtnost na gotovo 100% 52 naglašavajući upozorenje da temeljna genetika mutantnog modela utječe na predstavljeni fenotip. Da li je izraženiji fenotip od Sgta −/− bi bilo opaženo da je okarakterizirano na drugom pozadinskom soju miševa, tek treba utvrditi. Za razliku od FKBP52 −/−, delecija sličnog proteina, FKBP51 (Fkbp5), nije imao utjecaja na rano preživljavanje i nije izazvao očito promijenjeni fenotip kod miševa 53 , iako FKBP51 nokaut (pozadina C57BL/6J) u kombinaciji s delecijom FKPB52 (pozadina 129SvEv) uzrokovao je potpunu smrtnost u ranom embrionalnom životu 54 . To naglašava da redundancija postoji u sustavu supraćaja. U skladu s ovim pojmom, FKBP52 −/− mužjaci su razvili normalne testise, ali su pokazivali hipospadiju penisa 53 . Povećana ekspresija mRNA FKBP51 i proteina u FKBP52 −/− testisu, ali ne i u penisu, može aktivno spriječiti disgenezu testisa. U kontekstu homozigotnih Sgta ablacije, moguće je da strukturno sličan protein(i) koji sadrži TPR intervenira, ispunjavajući ulogu SGTA u njegovoj odsutnosti. Povećana Danac7 (TPR2) mRNA u jajniku može poslužiti ovoj svrsi, međutim ekspresija mRNA 7 proteina koji sadrže TPR ostala je nepromijenjena u prostati, testisima i mliječnoj žlijezdi. Da li promjene u ekspresiji proteina i/ili lokalizaciji proteina koji sadrže TPR nadoknađuju gubitak SGTA u normalnoj fiziologiji zaslužuje daljnje istraživanje i može objasniti zašto samo blagi Sgta-null fenotip je uočen u trenutnoj studiji. Otvoreniji fenotip može se inducirati primjenom stresora na Sgta-null mutanti, kao ko-chaperoni, bitni su za optimalno savijanje/ponovno savijanje i promet klijentskih proteina pogođenih stresom 55 . U kvascu null za SGTA ortolog, Sgt-2, dva različita stanična stresora smanjila su vitalnost kvasca 15 , rast i stvaranje kolonija 20 u usporedbi s divljim tipom kvasca. To nadalje podupire da je SGTA bitan u određenim staničnim uvjetima i da je vjerojatno da se njegov gubitak nadoknađuje kako bi se spriječila disfunkcija kada se ti uvjeti pojave.

U Sgta-null miševi, smanjena veličina tijela koja uključuje proporcionalno smanjenje tjelesne težine i duljine bila je najočiglednija uočena fenotipska promjena i bila je ograničena na homozigotne mutante. Neadekvatna prehrana može dovesti do zastoja u razvoju Sgta −/− rast, pogotovo jer su se razlike u težini poklopile s fazom u kojoj je ovisnost o dojenju smanjena. Čini se da to nije slučaj jer je učinkovitost hrane ostala nepromijenjena Sgta −/− miševi, iako njihova sposobnost da apsorbiraju i iskoriste hranjive tvari iz konzumirane hrane ostaje nepoznata. Da li Sgta ablacija je potaknula promjene u signaliziranju hormonskih medijatora rasta zahtijevala je istragu, posebno jer su miostatin 23 i GHR 12 proteini klijenta SGTA. Defektan razvoj i promijenjena masa skeletnih mišića mogli bi se predvidjeti ako Sgta nedostatak je utjecao na sazrijevanje i signalizaciju miostatina, negativnog regulatora mišićne mase 56, međutim ni patologija mišića ni masa nisu bili pogođeni. GH, koji djeluje putem GHR-a, bitan je za somatski rast, staničnu diferencijaciju 57 i parakrinu proizvodnju IGF-1 36 . Aberantna GHR signalizacija i otpornost na GH, uzrokuje prestanak proizvodnje IGF-1 i usporavanje rasta. Unatoč tome što su i GH i GHR normalno izraženi u ranoj embriogenezi, promjene rasta zbog promijenjene signalizacije GH uočene su samo iz postnatalnog d14-21 kod miševa 36,58. Patuljastost nakon 3 tjedna kod GHR-null miševa je povezana s povišenim GH i sniženim razinama IGF-1 u cirkulaciji 36,58. Isto tako, smanjenje funkcionalnog IGF-1R u miševa (IGF-1Rneo) dovodi do usporavanja rasta od 4-9 tjedana starosti, što odgovara platou veličine, koji se održava 59 . Analogno nedostatku GHR/IGF-1R 58,59 , Sgta-null mutanti su se pojavili kao fizički manji od WT at

6 tjedana, u to vrijeme ženke su bile 93%, a mužjaci 87% težine WT životinja. Slično GH/GHR, SGTA se detektira prenatalno u embriju, ali njegova funkcionalnost tijekom ranog razvoja nije poznata. S obzirom na njegovu interakciju s ubikvitin-ovisnim endocitoznim motivom prekursora i zrelog GHR-a, nagađa se da SGTA sprječava interakciju GHR-a s ubikvitinskim strojevima dok se prometuje iz endoplazmatskog retikuluma, gdje se nalazi prekursor GHR, u staničnu membranu, gdje zreli GHR funkcionira 57 . Aberantna trgovina GHR/IGF-1R i potencijalno ubikvitinom posredovana degradacija GHR-a mogu biti potaknuta Sgta ablacija. Pretpostavljamo da bi to moglo doprinijeti usporavanju rasta uočenom u Sgta −/− miševa, pod uvjetom da gubitak SGTA nije nadoknađen drugim ko-prateljem. Snižene razine IGF-1 u serumu i tkivnoj mRNA u Sgta −/− životinje mogu odražavati defektnu signalizaciju GHR-a, dok povišeni GH u serumu i povišeni GHR u jajniku u Sgta −/− može ukazivati ​​na kompenzaciju za nedostatak signala GH/IGF-1, međutim, potonji zahtijeva potvrdu na razini proteina.

Za razliku od homozigotne delecije FKBP52 koja je učinila miševe sterilnim 53 , Sgta nedostatak je u ovoj studiji izazvao samo blagu subfertilnost. Disgeneza u spolnim organima ovisna o razvoju uzrokovanom androgenom/AR bila je vodeći uzrok defektne FKBP52 −/− muške reprodukcije 53 , dok je neuspjeh implantacije maternice ovisne o progesteronskom receptoru donio sterilitet kod FKBP52 −/− žena 48 . Povećane zamjenske mjere (AGD, veličina penisa i prepucijalne žlijezde) za signalizaciju androgena u maternici, kako u predpubertetu tako i u pubertetu, u cijelosti ili djelomično Sgta nedostatak upućuju na promijenjenu AR signalizaciju i/ili hiperandrogenizaciju. Međutim, nekoliko drugih organa ovisnih o androgenu nije zahvaćeno Sgta ablacija u muškaraca i žena, kao što je bila ekspresija mRNA Ar i geni koji reagiraju na AR. Bez obzira na to, učinak Sgta ne može se isključiti ablacija na proizvodnju spolnih steroida.Osim regulacije AR, SGTA također pokazuje regulatornu specifičnost za progesteron i glukokortikoidne receptore 1,60 pa utjecaj SGTA ablacije na biološke procese kontrolirane progesteronom i glukokortikoidnom signalizacijom također jamči buduća istraživanja. Smanjena nuklearna AR imunoreaktivnost bez popratnog povećanja citoplazme u Sgta +/− prostata, upućuje na Sgta, kao i drugi proteini koji sadrže TPR TPR2/Danac7 i CHIP/Stub1, igrajući ulogu u stabilizaciji i/ili degradaciji AR 61 . Čini se da je to slučaj s GHR 12, gdje njegova stabilizacija nije kompenzirana u okruženju djelomičnog Sgta nedostatak.

Ukratko, ova studija pružila je intrigantan prvi uvid u višestruku ulogu SGTA in vivo. Potpuna, ali ne djelomična, ablacija SGTA donijela je subfertilnost i ograničila održivost i rast potomstva. Složena međudjelovanja molekularnih ko-šaperona i važnost redundancije u njihovim fiziološkim ulogama, osobito u sazrijevanju hormonskih receptora i signaliziranju, istaknuti su trenutnim nalazima. Ovaj Sgta-null model podložan je daljnjem proučavanju nekoliko kliničkih poremećaja, uključujući bolesti ovisne o hormonima i β-amiloidne bolesti, gdje je implicirana uloga SGTA.


3 REZULTATA

3.1 Skeletni mišići TRα1 definira sastav vlakana u mišićima koji se sporo trzaju, ali je uvelike neophodan za kapacitet vježbanja i energetsku homeostazu

Da bismo proučavali ulogu signalizacije receptora hormona štitnjače u skeletnim mišićima na energetski metabolizam cijelog tijela, generirali smo TRα specifičan za skeletne mišiće.1 model miša s gubitkom funkcije (TRα HSACre ) (slika S1A-C). Nisu uočene razlike u tjelesnoj težini, masnoći i nemasnoj masi ili toleranciji glukoze između genotipova (slika 1B-D). Iscrpan kapacitet trčanja na traci za trčanje i samovoljno trčanje na kotačima, mjereni tijekom 6 tjedana, također se nisu razlikovali između genotipova (Slika 1E,F).

Druga skupina životinja hranjena je HFD tijekom 22 tjedna. Uočili smo sporiju putanju povećanja tjelesne težine za TRα HSACre miševe u odnosu na miševe WT kao odgovor na prehrambeni izazov (slika 1H), što se ne može objasniti razlikama u unosu hrane (slika 1I). Nakon 18 tjedana izlaganja HFD-u, miševi TRα HSACre težili su isto kao i WT miševi. Kod miševa koji su hranjeni HFD-om podjednake težine nisu pronađene razlike u genotipu u tjelesnom sastavu, toleranciji glukoze ili tjelesnoj temperaturi kao odgovoru na umjerenu hladnoću (14°C tijekom 4 sata) (slika 1J-L). Značajno je da su TRα HSACre miševi pokazali povećanje vlakana tipa I i smanjenje vlakana tipa IIA u mišiću soleusa koji se sporo trza (SOL) u usporedbi s miševima WT (slika 1N). Ova razlika, međutim, nije bila prisutna u mišićima koji se brzo trzaju ekstenzorom digitorum longus (EDL) (slika 1O). Promjena tipa vlakana u mišićima koji se sporo trzaju bila je popraćena povećanjem (72%) cirkulirajućeg faktora diferencijacije rasta 15 (GDF15), sistemskog markera staničnog i mitohondrijalnog stresa (slika 1P).

3.2 TRα1 u skeletnim mišićima potreban je za T3-induciranu potrošnju energije, ali je neophodan za T3-induciranu elevaciju tjelesne temperature

Proučiti važnost TRα skeletnih mišića1 na potrošnju energije uzrokovanu hormonima štitnjače, pet različitih kohorti TRα HSACre i WT legla miševa tretirano je dnevno tijekom 5, 7 ili 14 dana s.c. injekcije T3 ili vehikuluma. Koncentracije T3 i T4 u plazmi bile su slične između mršavih i DIO TRα HSACre i WT kontrola legla koje su tretirane nosačem (Slika 2A-C,F-H). Kao što se očekivalo, liječenje T3 rezultiralo je povećanjem T3, ali smanjenim koncentracijama T4 u plazmi nakon 7 dana liječenja T3 (100 nmol/kg) i bez razlika između genotipova (Slika 2B,C,G,H). Neizravna kalorimetrija otkrila je povećanje potrošnje energije kao odgovor na liječenje T3 u mršavih i pretilih miševa WT (slika 2D,E,I,J, slika S2A,B). Tretman T3 nije značajno povećao potrošnju energije kod mršavih TRα HSACre miševa (slika 2D,E). U DIO WT miševa učinak T3 na brzinu metabolizma bio je izraženiji nego u mršavih WT miševa što sugerira da je termogeni učinak T3 povezan s masnom masom. U tom kontekstu, može se dogoditi da odsutnost funkcionalnog TRα1 u mišićima će imati manji utjecaj na potrošnju energije kod DIO miševa, nego u mršavog miša. Sukladno tome, tijekom dana T3 posredovano povećanje brzine metabolizma bilo je slično kod WT i TRα HSACre miševa, dok je tijekom tamne faze T3 posredovano povećanje potrošnje energije uočeno samo u WT miševa (Slika 2I,J). Uzastopno povećanje potrošnje energije stimulirane T3 kod DIO miševa slično je onome što smo prethodno primijetili u ovom modelu prehrane. 11

Da bi se dešifrirao specifičan učinak T3 na mitohondrijalno disanje kod miševa WT i TRα HSACre, mišići sa T3 liječenim T3 izrezani su spori (SOL) i brzi (EDL) mišići i procijenjeni mitohondrijski respiratorni kapacitet (slika 2K, L). U SOL-u, propuštanje disanja (stanje 2) bilo je slično između genotipova, ali, u kontekstu liječenja T3, disanje se povećalo samo u WT miševa, odražavajući podatke neizravne kalorimetrije cijelog tijela (slika 2K). Kapacitet oksidativne fosforilacije s kompleksom I povezanim supstratom otkrio je poremećeno disanje u SOL u nestimuliranom stanju kod TRα HSACre miševa u odnosu na WT miševe. Procjenom disanja povezanog s kompleksom I i kompleksom I + II utvrđeno je da je T3 stimulacija u TRα HSACre povećala disanje u mjeri sličnoj onoj kod WT miševa. U EDL-u nisu uočene razlike u mitohondrijskom disanju (slika 2L).

Mehanizmi kojima hormoni štitnjače povećavaju tjelesnu temperaturu su nedostižni. Testirati moguću ulogu mišićnog TRα1 u T3-posredovanom povišenju tjelesne temperature, mjerili smo tjelesnu temperaturu u WT i TRα HSACre miševima koji su svakodnevno liječeni bilo T3 ili nosačem tijekom 7 dana. U skladu s prethodnim studijama, tretman T3 značajno je povisio tjelesnu temperaturu kod WT miševa i na sobnoj temperaturi (22°C) i u termoneutralnim uvjetima (30°C) (slika 2M,N). Primjetno, TRα HSACre miševi liječeni T3 reagirali su slično kao WT miševi liječeni T3 u smislu povećanja tjelesne temperature i na 22°C i na 30°C (slika 2M,N). Nadalje, nisu uočene kompenzacijske razlike u težini BAT ili ekspresiji UCP1 proteina u BAT i iWAT kod DIO TRα HSACre miševa u odnosu na DIO WT miševe kao odgovor na 14 dana tretmana T3 ili nosačem (slika S2C-G). Zajedno, ovi nalazi upućuju na to da 1) signalizacija hormona štitnjače u skeletnim mišićima ne doprinosi T3-induciranoj pireksiji, i 2) povećanju potrošnje energije posredovanom hormonima štitnjače i T3-inducirana pireksija nisu u potpunosti međusobno povezani procesi.

3.3 Strukturni i metabolički putovi dominiraju transkriptomom kao odgovor na T3 posredovanu aktivaciju TRα1 u mišiću soleusa

Kako bismo secirali mehaničku podlogu indukcije povezane s mišićima u potrošnji energije cijelog tijela kao odgovor na tretman T3, izvršili smo sekvenciranje RNA (RNA-seq) WT i TRα HSACre SOL iz liječenih i neliječenih stanja. Ove analize su otkrile da je 788 transkripata različito izraženo između WT SOL i TRα HSACre SOL (slika 3A). U nestimuliranim uvjetima, više gena povezanih sa sastavom vlakana i morfologijom mišića različito je izraženo u TRα HSACre miševima u usporedbi s WT miševima (slika 3A). Nadalje, geni povezani s termogenezom mišića, kao što su sarkolipin i MSS51, bili su različiti između genotipova. Kao odgovor na tretman T3, profiliranje ekspresije identificiralo je obogaćivanje gena ontološkim terminima "NADP biosinteza" i "metabolizam aminokiselina razgranatog lanca (BCAA)" koji će biti različito regulirani kod WT miševa u odnosu na TRα HSACre miševe (slika 3B). Relativna ekspresija transkripata koji reagiraju na T3 u SOL od WT miševa u usporedbi s TRα HSACre miševima otkrila je jasnu razliku u regulaciji transkripcije (slika 3C, slika S3A). Značajno, jasan transkripcijski odgovor u SOL-u na sistemsku primjenu T3 ostao je unatoč mutaciji TRα1 u mišićima. To bi moglo odražavati sistemske učinke T3 koji naknadno uvode sekundarne učinke na mišićni transkriptom. Procjena ključnih gena uključenih u mišićnu termogenezu (slika 3D) i morfologiju tipa mišićnih vlakana (slika 3E) pokazala je diferencijalnu ekspresiju između WT miševa i TRα HSACre miševa u nestimuliranim i T3-induciranim uvjetima. Primjetno, nestimulirano povećanje mRNA sarkolipina kod TRα HSACre miševa također je bilo očito u mišićima EDL, gastrocnemius i kvadricepsa (slika S3B). Markeri povezani s termogenezom BAT-a i signalizacijom hormona štitnjače u BAT-u ispitani su kako bi se odredila specifičnost TRα1-promjene mišićne transkripcije povezane s transkripcijom (slika 3E). Dok T3 jasno utječe na transkripte uključene u termogenezu BAT, nije primijećena razlika između TRα HSACre miševa u odnosu na WT miševe, što implicira da mutacija specifična za mišiće nema sistemsko "prelijevanje" na metaboličke programe u drugim termogenim tkivima (slika 3F) .


Analiza genetske varijacije u CD40 i CD40L: Odnos s relativnom ekspresijom mRNA i topivim proteinima u akutnom koronarnom sindromu

1 Instituto de Investigación en Ciencias Biomédicas (IICB), Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Sierra Mojada #950, Colonia Independencia, C.P, 44340 Guadalajara, Meksiko

2 Doctorado en Ciencias Biomédicas, Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Guadalajara, Jalisco, Meksiko

3 Doctorado en Genética Humana, Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), Universidad de Guadalajara (UdeG), Guadalajara, Jalisco, Meksiko

4 Especialidad en Cardiologia, Unidad Médica de Alta Especialidad, Centro Médico Nacional de Occidente (CMNO), Departamento de Cardiologia, Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), Guadalajara, Jalisco, Meksiko

Sažetak

Akutni koronarni sindrom (ACS) može biti potaknut prisutnošću upalnih čimbenika koji pospješuju aktivaciju imunoloških stanica kostimulatornim molekulama kao što su CD40 i njegov ligand CD40L. Okolišni i genetski čimbenici uključeni su u etiologiju ACS-a. Cilj ovog istraživanja bio je istražiti ekspresiju gena i proteina povezana s CD40 i CD40L genetske varijante u bolesnika s ACS-om iz zapadnomeksičke populacije. Regrutirano je ukupno 620 osoba iz zapadnog Meksika: procijenjeno je 320 pacijenata s ACS-om i 300 osoba bez anamneze ishemijske kardiopatije. Genotip je određen korištenjem TaqMan SNP testova genotipizacije. CD40 i CD40L ekspresije na razini mRNA su kvantificirane pomoću TaqMan genskih ekspresijskih testova. Izoforme topivih proteina mjerene su enzimskim imunosorbentnim testom. Nismo pronašli dokaze o povezanosti između CD40 (rs1883832, rs4810485 i rs11086998) i CD40L (rs3092952 i rs3092920) genetske varijante i osjetljivost na ACS, iako su rs1883832 i rs4810485 značajno povezani s visokim razinama sCD40 u plazmi. Na razine sCD40L u plazmi mogu utjecati spol i klinički spektar akutnog koronarnog sindroma. Naši rezultati ne upućuju na funkcionalnu ulogu CD40 i CD40L genetske varijante u ACS-u. Međutim, oni bi mogli odražavati upalni proces i aktivaciju trombocita u bolesnika s AKS-om, čak i kada su pod farmakološkom terapijom. Zbog važne uloge CD40-CD40L sustava u patogenezi ACS-a, potrebne su longitudinalne studije kako bi se utvrdilo mogu li topive razine CD40 i CD40L biti klinički korisni markeri ponavljajućeg kardiovaskularnog događaja nakon ACS-a.

1. Uvod

Kardiovaskularne bolesti vodeći su uzrok smrti u svijetu [1], točnije akutni koronarni sindrom (ACS) karakteriziran akutnim smanjenjem koronarnog protoka krvi i ishemijom ili nekrozom miokarda. Razlikuju se tri klinička entiteta: infarkt miokarda s elevacijom ST segmenta (STEMI), infarkt miokarda s elevacijom ST segmenta (NSTEMI) i nestabilna angina (UA), sa zajedničkom etiologijom, međutim, mogu imati različite ishode [2]. Iz tog razloga, rana prognoza i stratifikacija rizika prva su linija djelovanja za smanjenje rizika od ponovnih epizoda ili čak smrti nakon ACS-a [3].

U etiologiju ACS-a sudjeluju metabolički, genetski, okolišni i među ostalim čimbenicima, stanja koja mogu povećati upalu i endotelnu disfunkciju, ključni elementi u razvoju ateroskleroze [4, 5]. Procijenjeno je da je postotak heritabilnosti 40-55% interindividualne varijacije u riziku od ACS-a koji podupire značajan genetski utjecaj [6].

CD40 je kostimulatorna molekula koja se konstitutivno eksprimira u B limfocitima i eksprimira u drugim stanicama kao što su monociti, makrofagi, endotelne stanice (EC) i stanice glatkih mišića (SMC) [7]. Njegov ligand, CD40L, izražen je uglavnom na površini trombocita (95%), T limfocita, EC, SMC i makrofaga [7, 8].

Interakcija CD40 i CD40L uključena je u imunopatogenezu ACS [9] zbog svog sudjelovanja u dvosmjernoj aktivaciji stanica putem signalnih puteva c-Jun, NF-κB i ERK 1/2, potičući povećanje adhezijskih molekula, izlučivanje proupalnih citokina i aktivaciju trombocita [7]. Međutim, topivi oblici CD40 i CD40L povezani su s endotelnom disfunkcijom ili kao markeri štetnih kardiovaskularnih događaja u bolesnika s ACS [10, 11] što ih sugerira kao potencijalne mete terapijskih sredstava [9].

U tom smislu, jednonukleotidni polimorfizmi (SNP) su identificirani u CD40 i CD40L gene koji mogu povećati osjetljivost na razvoj ACS-a, kroz studije asocijacija na genomu [7] i studije gena kandidata [12–16]. Ove genetske varijante povezuju se s upalnim i autoimunim bolestima [17, 18], s promjenama u CD40 i CD40L ekspresija mRNA [19-25] kao i regulacija topivih oblika koji modificiraju njihovu funkciju [15, 20] koji utječu na inicijaciju, razvoj i napredovanje ateroskleroze [26, 27].

Upala i endotelna disfunkcija čimbenici su koji potiču razvoj ateroskleroze, međutim, temeljne stanične i molekularne interakcije, koje povezuju postojeće čimbenike rizika s aterosklerotskim procesom, nisu dobro okarakterizirane. Prema našim saznanjima, ne postoje studije koje ocjenjuju doprinos CD40 i CD40L polimorfizmi u populaciji iz zapadnog Meksika povezani s kardiovaskularnim bolestima posebno s ACS.

Sukladno tome, cilj ovog istraživanja bio je istražiti povezanost jednonukleotidnih polimorfizama u CD40 (rs1883832 (c.-1C>T), rs4810485 (c.51+914G>T) i rs11086998 (c.679C>G)) i CD40L (rs3092952 (g.1615A>G) i rs3092920 (18656G>T)) geni i osjetljivost na ACS. Također istražujemo povezanost između ovih polimorfizama s CD40 i CD40L ekspresija u leukocitima periferne krvi i topivih razina kvantificiranih u uzorcima plazme dobivenim od pacijenata s ACS-om i ispitanika bez ishemijske kardiopatije uključenih u kontrolnu skupinu (CG).

2. Materijali i metode

2.1. ACS pacijenti i ispitanici u kontrolnoj skupini

Ispitna skupina sastojala se od 320 pacijenata s dijagnozom ACS-a klasificiranih prema American College of Cardiology [28] i 300 ispitanika s čimbenicima rizika za ACS, ali bez anamneze ishemijske kardiopatije (utvrđene upitnikom) kao CG. Sve osobe uključene u studiju iz zapadnog Meksika regrutirane su iz Hospital de Especialidades del Centro Medico Nacional de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro Social (CMNO-IMSS). Razdoblje istraživanja bilo je od veljače 2016. do lipnja 2018. godine.

2.2. Etička razmatranja

Studija je provedena u skladu s Helsinškom deklaracijom iz 2013. godine. Svi su pojedinci pristali sudjelovati u istraživanju i potpisali informirani pismeni pristanak. Etičko odobrenje dobio je Centro Universitario de Ciencias de La Salud (CUCS), UdeG (CI/065/2014).

2.3. Genotipizacija i kontrola kvalitete

Genetske varijante bile su genotipizirane korištenjem TaqMan testova za CD40 (rs1883832 (C__11655919_20), rs4810485 (C___1260190_10) i rs11086998 (C___1260325_10)) i za CD40L (rs3092952 (C__26154899_10) i rs3092920 (C__27452204_10)) koristeći TaqMan Genotyping Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD), slijedeći protokol proizvođača. Kao kontrola kvalitete, izvršena je dvostruko slijepa genotipizacija 25% uzoraka za sve polimorfizme, bez varijacija u dodjeli genotipa.

2.4. PCR analiza u stvarnom vremenu

Ukupna RNA ekstrahirana je iz leukocita periferne krvi pomoću TRIzol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema uputama proizvođača za dobivanje ukupne RNA prema metodi Chomczynskog i Sacchija [29]. Jedan mikrogram ukupne RNA reverzno je transkribiran pomoću reagensa za reverznu transkripciju kako bi se dobila cDNA prema protokolu proizvođača (Promega Corporation, SAD). PCR u stvarnom vremenu proveden je pomoću TaqMan sondi: gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) (Hs02786624_g1), CD40 (Hs01002915_g1), i CD40L (Hs00163934_m1) prema uvjetima navedenim u Protokolu analize ekspresije gena TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) korištenjem Roche LightCycler 96® sustava. Relativna ekspresija je normalizirana na razinu ekspresije pomoću GAPDH kao interna kontrola i evaluiran je metodom 2 -ΔΔCq i 2 -ΔCq [30]. Rezultati su izraženi kao relativno višestruko povećanje u usporedbi s kontrolnom i jediničnom relativnom ekspresijom (URE), respektivno. Metoda 2 -∆∆Cq izračunata je kako su predložili Livak i Schmittgen [30], a cilj ove metode je usporediti mjere ekspresije gena od interesa kroz normalizaciju na referentni gen u ovom slučaju GAPDH. Koristeći sljedeću jednadžbu:

, pri čemu se ∆Cq kalibrator odnosi na prosjek ∆Cq kontrolne skupine. Odredili smo relativnu ekspresiju mRNA CD40 u leukocitima periferne krvi pacijenata s ACS (

). Za procjenu razine ekspresije, karakteristike kohorte bile su sljedeće: dob (

), spol (omjer žene/muškarci ACS: 1,7, CG: 1,6) i prisutnost sličnog faktora rizika, te je isti broj pacijenata uključen za svaki od tri klinička entiteta ACS (14 UA, 14 NSTEMI i 14 STEMI ).

2.5. Detekcija sCD40, sCD40L i IFN-γ

Razine sCD40, sCD40L i IFN-γ određivani su na uzorcima plazme pomoću enzimskih imunosorbentnih testova (ELISA) (Human CD40 Quantikine ELISA Kit, Human CD40 Ligand Quantikine, and Human IFN-gamma Quantikine ELISA Kit, R&D Systems) prema protokolu proizvođača. Osjetljivost testa za sCD40, sCD40L i IFN-γ iznosio je 5,56 pg/mL, 10,1 pg/mL, odnosno 8 pg/mL.

2.6. Statistička analiza

Statistička analiza provedena je korištenjem SPSS softvera verzije 22 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Podaci su prikazani kao medijan i interkvartilni raspon (IQR), osim ako nije drugačije naznačeno. Mann-Whitney

za usporedbu razlika između skupina korišteni su test i Kruskal-Wallisov test. Genotip i učestalost alela CD40 i CD40L uspoređene su genetske varijante između bolesnika s ACS-om i kontrolne skupine. Omjeri vjerojatnosti (OR) i 95% intervali pouzdanosti (CI) izračunati su korištenjem Hi-kvadrata i Fisherovih točnih testova kada je to prikladno. Bonferronijeva korekcija primijenjena je kako bi se smanjila statistička pogreška tipa 1 (pc) u više usporedbi. Hardy-Weinbergova ravnoteža izračunata je iz distribucije genotipa, a neravnoteža veze (LD) između polimorfizama izračunata je pomoću Lewontinovog

između genetskih markera. Haplotipovi i njihove učestalosti procijenjeni su pomoću softverske platforme SHEsis (http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php). Multilinearni regresijski model korišten je za procjenu povezanosti uobičajenih čimbenika rizika (komorbiditeti, spol, uzimanje lijekova, itd.) s razinama ekspresije sCD40, sCD40L i mRNA. Korelacijska analiza utvrđena je Spearmanovom korelacijom.

3. Rezultati

3.1. Kliničke značajke

Klinički podaci za 320 bolesnika s ACS-om i 300 kontrolnih ispitanika zabilježeni su u Tablici 1. Pacijenti s ACS-om i ispitanici s CG imali su prosječnu dob od 62 (±11 standardna devijacija (SD)) odnosno 55 (±10 SD) godina. U ACS skupini ima 3,32 više muškaraca nego žena, dok je u CG omjer muško/žensko bio gotovo 1/1. Pacijenti s ACS-om pokazali su visoke razine markera srčane funkcije uključujući CK, CK-MB i troponin I u odnosu na referentne vrijednosti, biokemijski parametri su značajno povišeni u bolesnika s ACS-om u usporedbi s kontrolom kao što je prikazano u Tablici 1. Čimbenici rizika s najvećom prevalencijom u ACS-u su bili visoki krvni tlak, pušenje i dijabetes melitus tip 2. Reinfarkt je pronađen u 49 slučajeva (15,3%). Uzimanje lijekova uključivalo je antiagregacijske lijekove (acetilsalicilna kiselina, klopidogrel), statine, antikoagulanse (heparin i enoksaparin) i antihipertenzive (kaptopril, enalapril, spironolakton i furosemid).

test ACS: akutni koronarni sindrom Apo AI: apolipoprotein AI Apo B: apolipoprotein B CG: kontrolna skupina CK: kreatinin kinaza CK-MB: kreatinin kinaza mišića i mozga CRP: C-reaktivni protein HDL-c: lipoprotein visoke gustoće IQR: interkvartil raspon LDL-c: lipoprotein niske gustoće NSTEMI: infarkt miokarda bez elevacije ST segmenta NA: nije primjenjivo UA: nestabilna angina STEMI: infarkt miokarda s elevacijom ST segmenta (STEMI). Podaci su izraženi kao medijan i interkvartilni raspon (Q25-Q75), osim ako nije drugačije naznačeno. a Podaci navedeni u

3.2. Analiza genotipa i alela

Genotip i učestalost alela CD40 (rs1883832, rs4810485 i rs11086998) i CD40L (rs3092952 i rs3092920) polimorfizmi prikazani su u tablicama 2–4. Distribucija genotipa slagala se s očekivanjima ravnoteže Hardy-Weinberga (

vrijednost za alelni model između spolova.

ILI: omjer izgleda. Haplotip je predstavljen sa rs1883832, rs4810485, odnosno rs11086998.

Ni genotip ni distribucija alela od tri CD40 polimorfizmi su bili statistički različiti kada su uspoređivani ACS i kontrolna skupina.

Jer CD40L nalazi se na X kromosomu, analizu smo izvršili prema spolu (tablica 3). Važno je napomenuti da nismo pronašli razlike za frekvencije alela na CD40L varijante među spolovima (rs3092952 A/G:

). Genetska distribucija oba polimorfizma bila je slična između pacijenata i kontrolne skupine ili objedinjene (podaci nisu prikazani) ili odvojeno po spolu.

3.3. Analiza haplotipa CD40 i CD40L

Analizirali smo povezanost između haplotipova pronađenih u našoj zapadnomeksičkoj kohorti CD40/CD40L gena i ACS. Analiza je pokazala da rs1883832, rs4810485 i rs11086998 od CD40 bili u neravnoteži veze ( , , ). Pronašli smo jedan glavni haplotip (CCG) koji je činio 67,1% odnosno 65,5% u bolesnika s ACS-om i kontrolnih ispitanika. Pronašli smo i zaštitni haplotip (CTC, OR: 0,22) (tablica 4).

CD40L polimorfizmi nisu bili u LD ( ), što ukazuje da 3092952 i rs3092920 treba analizirati odvojeno.

3.4. CD40 Ekspresija mRNA

Pacijenti s ACS-om pokazali su viši medijan ekspresije CD40 mRNA u leukocitima periferne krvi u usporedbi s kontrolama (0,82 puta više), međutim, ova usporedba nije bila značajna. Slično, stratifikacija prema kliničkoj dijagnozi u skupini ACS (UA, NSTEMI i STEMI) nije pokazala razlike u razini ekspresije mRNA CD40. Zatim smo analizirali podatke od pacijenata s ACS-om i CG stratificirajući rezultate noseći genotipove rs1883832, rs4810485 i rs11086998. Zbog niskih frekvencija sporednih alela, pretpostavili smo dominantan model povezivanja (rs1883832: C/C vs. C/T+TT, r4810485: G/G vs. G/T+TT, i rs11086998: C/C vs. C/G+G/G), iako nismo pronašli razlike u razini CD40 ekspresija između genetskih varijanti u bilo kojoj skupini (podaci nisu prikazani).

3.5. CD40L Ekspresija mRNA

Analiza metodom 2 -ΔΔCq pokazala je da CD40L Ekspresija mRNA u bolesnika s ACS-om bila je 1,25 puta veća od one u CG (slika 1(a)) ova razlika je značajno utvrđena metodom 2-ΔCq (p=0,035) (Slika 1(b)). Prema kliničkim entitetima, nismo pronašli nikakvu razliku (podaci nisu prikazani).

). ACS: akutni koronarni sindrom CG: kontrolna skupina.

S obzirom na mjesto na X kromosomu i zaključak drugih studija da CD40L Na ekspresiju mRNA može utjecati spol [20], analizirali smo zasebno za svaki spol u obje grupe istraživanja bez ikakvih dokaza o povezanosti. Prema spolu, bilo ženski ili muški bolesnici imali su tendenciju pokazivati ​​više ekspresije u usporedbi s kontrolnom skupinom (Slika 2(a)). Kada smo stratificirali prema kliničkoj dijagnozi AKS-a i spolu, pacijentice UA pokazale su najveću ekspresiju (5,12 URE), iako niti jedna od usporedbi nije bila statistički značajna (muški pacijenti, pacijentice, ) (Slika 2(b)).

Važno je napomenuti da smo istražili CD40L mRNA ekspresija u obje grupe istraživanja prema genetskim varijantama (rs3092952 i rs3092920), slijedeći dominantni model, međutim, nismo pronašli razlike.

3.6. Povezanost između sCD40 i sCD40L s ACS-om

Procijenili smo razine CD40 i CD40L u plazmi u obje studijske skupine. Otkrili smo da pacijenti s ACS-om imaju značajno više razine sCD40 ( ) u usporedbi s kontrolnom skupinom (843,3 naspram 492 pg/mL). Multilinearni regresijski model označava da se ova povezanost može maskirati klopidogrelom ( ). Čini se da dijagnoza ACS nije povezana s sCD40 (UA: 677,1 pg/mL NSTEMI: 661,7 pg/mL i STEMI: 782,4 pg/mL, ).

Analizirane su i razlike između razina sCD40 među CD40 genetskim varijantama uz pretpostavku dominantnog modela povezanosti. Kao što je prikazano na slici 3, C/C nosači su imali više razine sCD40 u plazmi od rs1883832 C/T+T/T (561 vs. 475,7 pg/mL, ). Slično, homozigotni nosači rs4810485 pokazali su višu koncentraciju topljivog CD40 od ​​G/T+T/T nosača (562,5 naspram 489,7 pg/mL, ).

U bolesnika s ACS-om nije bilo takve povezanosti ovih CD40 genetskih varijanti niti povezanosti CD40 rs11086998 polimorfizam s razinama CD40 u plazmi u obje grupe studija uz pretpostavku dominantnog modela povezanosti C/C naspram C/G+G/G (ACS: 846 pg/mL vs. 725 pg/mL, CG: 509 pg/mL vs. 540 pg/mL, ) (Slika 4).

Što se tiče razina sCD40L u plazmi, pacijenti pokazuju više razine sCD40L u usporedbi s kontrolama, međutim, ova usporedba nije postigla statističku značajnost (1080 vs. 868,9 pg/mL, ). Prema dijagnozi ACS-a i sCD40L stratificiranom prema spolu, pacijentice sa STEMI imale su više razine u usporedbi s pacijentima s UA (1489,5 naspram 533,8 pg/mL, ). Muški pacijenti s UA imali su više razine sCD40L u usporedbi s pacijentima s UA pacijentima (1714,3 naspram 533,8 pg/mL, , Slika 5). Kada se zbroje, razine sCD40L bile su slične prema dijagnozi ACS ( , podaci nisu prikazani).

Lijekovi nisu imali značajan učinak na sCD40L u plazmi u skupini s ACS kada su uvedeni u multiregresijski model (

: 0,003, ), tj. razlike između pacijenata s ACS-om sCD40L nisu uzrokovane lijekovima.

Analizirali smo povezanost između genetskih varijanti na CD40L i razine sCD40L u plazmi u obje skupine ispitivanja bez ikakvih dokaza o povezanosti.

Konačno, uočili smo pozitivnu linearnu korelaciju između sCD40L i IFN-γ u bolesnika s ACS ( , ) (Slika 6).

4. Rasprava

CD40 i CD40L imaju važne funkcije koje uključuju staničnu aktivaciju i proizvodnju proupalnih citokina. To potiče upalu koja može ubrzati procese ateroskleroze i imati funkcionalnu ulogu u razvoju kardiovaskularnih bolesti [8]. Stoga su genetske varijante bile zanimljive za njihov odnos s povećanim rizikom od kardiovaskularnih bolesti [14, 15].

SNP na CD40 gen, rs1883832, povezan je s ACS u prisutnosti glavnog C alela i povezan je sa smanjenim razinama sCD40 u prisutnosti manjeg T alela i rizikom od kardiovaskularnih bolesti [31, 32]. U zapadnomeksičkoj skupini, ovo nije identificirano kao genetski čimbenik rizika za reumatoidni artritis (RA) [25]. Ovaj polimorfizam je povezan sa smanjenom ekspresijom mRNA CD40 [21, 22] rs1883832 je pronađen u visokoj LD s rs4810485, pri čemu je potonji značajno povezan s formiranjem lezija koronarne arterije u populaciji Tajvana [33]. S obzirom na lokalizaciju na regiji 5 UTR i intronu 1 ovih SNP-ova, respektivno, oni su povezani s promjenama u ekspresiji mRNA jer su u gotovo potpunom LD ( ) s rs6074022, koji se nalazi unutar CD40 promotora i utječe na razine mRNA [20 ]. Inače, prema našim saznanjima, rs11086998 nije povezan kao genetski čimbenik rizika za kardiovaskularne bolesti, ali je poznato da je povezan s modulacijom razine proupalnih citokina, TNF-a.α i IL-6, jer se nalazi na eksonu 9 koji kodira protein unutarstanične domene koji je uključen u signalne putove CD40 [34].

Ovi polimorfizmi su prethodno identificirani kao genetski markeri kardiovaskularnih bolesti uglavnom u kineskoj i europskoj populaciji: Li i sur. proučavali su 160 pacijenata s ACS-om i 92 kontrolne skupine u populaciji kineskih Han [12] Tian i sur. analizirali su 248 bolesnika s ACS-om i 206 kontrola u kineskoj populaciji [13] Wang i sur. izvijestili su o analizi u 474 bolesnika s koronarnim aterosklerotskim plakovima i 225 kontrola u kineskoj populaciji [14] i García-Bermúdez i sur. analizirali su 290 bolesnika s reumatoidnim artritisom (RA) s kardiovaskularnim događajima i 1285 bolesnika s RA, ali bez kardiovaskularnih događaja [17]. Međutim, u našem istraživanju ne možemo podržati ovu udrugu. To se može objasniti genetskim razlikama među populacijama [35]. Tri varijante na CD40 pronađene su u LD što znači da ih je potrebno zajedno analizirati barem u našoj populaciji. U tom kontekstu, otkrili smo da je blok haplotipa rs1883832 (C)-rs4810485 (T)-rs11086998 (C) povezan sa smanjenim rizikom od ACS-a (OR: 0,22) i da može biti zaštitni čimbenik ACS-a u zapadnom Meksiku. populacije, iako se ne može isključiti da su i drugi obližnji SNP u LD bloku povezani s osjetljivošću na bolesti [21].

Analiza genetske varijacije u X kromosomu u bolestima je područje interesa. U skladu s gore navedenim, u CD40L, procijenili smo dva SNP-a smještena u 5 UTR (rs3092952) i 3 UTR (rs3092920), oni se nalaze u različitim blokovima haplotipova i imaju slabu LD [36] kao što smo potvrdili. rs3092952 je opisan kao funkcionalna varijanta modulacijom razina sCD40L u uzorcima plazme. Dok je rs3092920 proučavan kao genetski marker kardiovaskularnih bolesti u bolesnika s RA i infarkta miokarda, neke studije nisu pronašle takvu povezanost [15, 17], što je u skladu s našim rezultatima, jer nismo pronašli povezanost između genetskih varijanti na the CD40L gen i rizik od ACS-a.

Unatoč tome, drugi čimbenici mogu povećati rizik od ACS-a i utjecati na nuspojave [5] naši rezultati ne pokazuju značajnu ulogu ovih polimorfizama u akutnim koronarnim događajima. Međutim, stanični i molekularni mehanizmi koji su u osnovi učinka ovih genetskih varijanti i ACS-a potencijalno bi mogli biti posredovani promjenama u ekspresiji gena i proteina CD40 i CD40L.

Druge analizirane studije CD40/CD40L Razine ekspresije mRNA u koronarnoj arterijskoj bolesti (CHD), nakon odvajanja mononuklearnih stanica periferne krvi i qRT-PCR-a, te su pronađene značajno povećane razine ekspresije oba gena u skupini s CHD u usporedbi s kontrolnom skupinom [24].

Nismo pronašli razlike između CD40 Razine mRNA u ukupnim leukocitima periferne krvi bolesnika s ACS-om i kontrolnih ispitanika. To može biti posljedica činjenice da su glavni izvor CD40 u perifernoj krvi B stanice [21]. Field i sur. nisu pronašli povezanost između genotipa i ekspresije mRNA CD40 mjerene u punoj krvi, međutim, genotip C/C rs1883832 bio je povezan s većom ekspresijom CD40 u B stanicama [21]. Predlažemo da se daljnje studije koje analiziraju ove subpopulacije trebaju provesti kako bi se razumjela funkcionalnost ovih genetskih varijanti u ekspresiji gena CD40 mRNA.

Nedostatak povezanosti između genetskih polimorfizama i ekspresije CD40 slaže se s onim što su objavili Jacobson i sur. [22], budući da sugeriraju da genetska varijanta rs1883832, koja je u visokoj neravnoteži veza s rs4810485 (

), djeluje na razini translacije, a ne transkripcije, ispoljavajući svoje učinke kao funkcionalni polimorfizam u etiologiji bolesti kroz regulaciju učinkovitosti translacije, u nedostatku bilo kakvog učinka genotipa na razine mRNA. U istoj liniji, rs4810485 SNP bio je povezan s ekspresijom proteina CD40 na CD14 + monocitima i CD19 + B stanicama pacijenata s eritematoznim lupusom procijenjenim protočnom citometrijom [18]. Druge studije su izvijestile o povećanim razinama sCD40 u ispitanika koji nose manji alel polimorfizama rs1883832 i rs4810485 [25, 32].

Uočili smo povećane razine sCD40 u uzorcima plazme akutnih koronarnih bolesnika u usporedbi s kontrolnom skupinom ( ). Tijekom upalnih procesa, sCD40 ima biološka svojstva opisana kao imunomodulatorna, jer inhibira imunološki odgovor [37]. Proupalni sistemski odgovor ima ključnu ulogu u patofiziologiji ovog sindroma doprinoseći kardiovaskularnom ishodu u tom smislu, sCD40 predstavlja potencijalni element pomoću kojeg se CD40-CD40L sustav može modulirati kroz njegov antagonistički učinak na aktivaciju CD40 [38].

Klinički entiteti ACS-a nisu se razlikovali u razinama sCD40 u plazmi ( ) čak i kada imaju različite ishode, a sCD40 je uključen u nekoliko faza razvoja ACS-a [39]. Naglašavamo da naše rezultate treba uzeti s oprezom budući da je klopidogrel objasnio 25% ukupne varijabilnosti razine CD40 u plazmi kod ACS-a, a povećane koncentracije lipida u krvi su se pojavile kao značajni prediktori razine sCD40 (označeno linearnom regresijom, ). Smanjena sinteza kolesterola farmakološkom terapijom u bolesnika s ACS-om povezana je s povišenim razinama sCD40 [40]. Važno je pojasniti da je klopidogrel jedan od lijekova koji čine kamen temeljac u shemi liječenja ovih bolesnika, pa je to interventna varijabla koju treba uzeti u obzir u budućim studijama. Nažalost, broj pacijenata koji se ne liječe klopidogrelom prilično je mali što otežava robusne usporedbe.

Farmakološka terapija može utjecati na razine CD40 u plazmi [41], što je okolnost koja bi objasnila nedostatak povezanosti polimorfizama na CD40 lokus i topive razine uzoraka plazme u bolesnika s ACS. Argument u prilog tome su nalazi u kontrolnoj skupini za koje smo otkrili da su homozigotni nositelji glavnog alela rs1883832 i rs4810485 imali značajno više razine sCD40 (slika 3).

Bolesnici s ACS imali su povećanu razinu CD40L mRNA u usporedbi s kontrolama. Važno je da su povišene razine CD40L Ekspresija mRNA na T limfocitima povezana je s akutnim koronarnim događajima [42]. Iako nismo pronašli značajne razlike između ACS i CG u razinama sCD40L u plazmi, primijetili smo da pacijenti imaju više razine sCD40L i pozitivnu linearnu korelaciju između sCD40L i IFN-a.γ (Slika 6) stoga se može nagađati da pacijenti s akutnim koronarnim događajem imaju pojačane T-stanične odgovore koji potiču endotelnu disfunkciju i sistemsku upalu [43, 44].

To je zaključeno u prethodnom izvješću CD40L Na ekspresiju mRNA može utjecati spol [20] osim toga, smanjena razina CD40L mRNA i povećanje koncentracije sCD40L mogu odražavati veću aktivnost trombocita koja podržava funkciju CD40L u imunopatologiji ACS [7]. Sukladno tome, samo smo pronašli višu koncentraciju sCD40L u plazmi u bolesnika s AKS-om. Prema kliničkim entitetima, žene s UA imale su nižu koncentraciju od onih sa STEMI, a suprotan učinak uočen je kod muškaraca. Važno je napomenuti da tri klinička spektra ACS-a često imaju istu simptomatologiju [45] i znanstvena zajednica se poziva da pronađe biomarkere koji nadopunjuju dijagnozu.

Štoviše, objavljeno je da 4% do 30% pacijenata s kardiovaskularnim ishemijskim bolestima ima slab odgovor na antiagregacijske terapije označene kao “slabo reagiraju” ili “ne reagiraju” [46] posebno, zabilježeno je da su muški pacijenti 2,9 puta vjerojatniji ne reagiraju na antitrombocitnu terapiju od žena [47] i povezuju se s rekurentnim kardiovaskularnim događajem kao što je smrt zbog koronarne bolesti srca, veliki nefatalni koronarni događaj (infarkt miokarda, hospitalizacija zbog nestabilne angine pektoris ili reanimirani srčani zastoj) ili smrtonosna ishemija moždani udar [48].

Postojanost reaktivnosti trombocita čak i uz upotrebu antitrombocitnih sredstava pobudila je interes za strategije koje mogu identificirati subjekte s visokim rizikom od ponovnih kardiovaskularnih događaja nakon ACS-a. U tom smislu, koncentracija CD40L u plazmi bila je povezana kao marker oštećenja miokarda i neovisno predviđa smrt i ponovni IM u bolesnika s ACS [10]. Stoga bi prilagodba antitrombocitne terapije koja se koristi u ACS-u prema spolu i čimbenicima rizika mogla smanjiti rizik od nuspojava i poboljšati ishod bolesnika.

Ipak, imamo na umu da naše rezultate treba tumačiti s oprezom i replicirati zbog učinka veličine uzorka u stratificiranoj analizi.

Konačno, analiza povezanosti dviju genetskih varijanti CD40L nije u korelaciji s ekspresijom mRNA i koncentracijom proteina. Potrebne su daljnje studije s obzirom na promjenjive čimbenike koji mogu promijeniti ekspresiju gena kako bi se razumio funkcionalni učinak ovih polimorfizama u ekspresiji CD40 i CD40L.

5. Zaključci

Individualno analizirane genetske varijante CD40 i CD40L nisu markeri osjetljivosti na ACS u ovoj meksičkoj skupini. Međutim, CTC haplotip CD40 bio je povezan sa smanjenim rizikom od ACS-a.

Pacijenti s ACS-om pokazali su više CD40L mRNA relativna ekspresija od kontrole.

Topive razine CD40 bile su povišene u bolesnika s ACS-om, međutim, na njih utječe terapija klopidogrelom.

U kontrolama, nositelji genotipa rs1883232 C/C i rs4810485 G/G pokazali su više topive razine CD40.

Pacijentice sa STEMI imale su više razine sCD40L u usporedbi s UA. Inače, muški pacijenti s UA imali su više razine sCD40L u usporedbi s UA. Lijekovi nisu imali značajan učinak na sCD40L u plazmi.

Ovi rezultati mogli bi odražavati upalni proces i aktivaciju trombocita u bolesnika s AKS-om, čak i kada su na antitrombocitnoj i protuupalnoj terapiji. Zbog važne uloge CD40-CD40L sustava u imunološkim procesima u patogenezi ACS-a, potrebne su longitudinalne studije kako bi se utvrdilo mogu li topive razine CD40 i CD40L biti klinički korisni markeri recidivirajućeg kardiovaskularnog događaja nakon ACS-a.

Dostupnost podataka

Podaci korišteni za potporu nalaza ove studije uključeni su u članak.

Sukob interesa

Autori izjavljuju da ne postoji sukob interesa u vezi s objavom ovog članka.

Priznanja

Autori iznimno cijene sudjelovanje svake osobe u ovom istraživanju. Ovaj rad je djelomično podržan od strane PROSNI 2017 i PROSNI 2018 koje je YV dodijelilo Sveučilište Guadalajara.

Reference

  1. A. Gisterå i G. K. Hansson, “Imunologija ateroskleroze”, Nature Reviews Nefrologija, sv. 13, br. 6, str. 368–380, 2017, unaprijed online publikacija. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  2. J. L. Anderson i D. A. Morrow, “Akutni infarkt miokarda”, New England Journal of Medicine, sv. 376, br. 21, s. 2053–2064, 2017. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  3. R. S. Rosenson, H. B. Brewer i D. J. Rader, “Lipoproteini kao biomarkeri i terapijski ciljevi u postavljanju akutnog koronarnog sindroma”, Istraživanje cirkulacije, sv. 114, br. 12, s. 1880–1889, 2014. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  4. M. K. Reriani, A. J. Flammer, A. Jama, L. O. Lerman i A. Lerman, “Novi funkcionalni čimbenici rizika za predviđanje kardiovaskularnih događaja u ranjivih pacijenata nakon akutnog koronarnog sindroma,” Tiraž časopis, sv. 76, br. 4, str. 778–783, 2012. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  5. M. Franchini, “Genetika akutnog koronarnog sindroma”, Anali translacijske medicine, sv. 4, br. 10, str. 192, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  6. R. Elosua, C. Lluis i G. Lucas, “Estudio del componente genético de la cardiopatía isquémica: de los estudios de ligamiento al genotipado integral del genoma,” Revista Española de Cardiologia Suplementos, sv. 9, br. 2, str. 24–38, 2009. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  7. N. A. Michel, A. Zirlik i D. Wolf, “CD40L i njegovi receptori u aterotrombozi – ažuriranje”, Granice u kardiovaskularnoj medicini, sv. 4, str. 40, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  8. E. Lutgens, D. Lievens, L. Beckers, M. Donners i M. Daemen, “CD40 i njegov ligand u aterosklerozi”, Trendovi u kardiovaskularnoj medicini, sv. 17, br. 4, str. 118–123, 2007. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  9. C. Antoniades, C. Bakogiannis, D. Tousoulis, A. S. Antonopoulos i C. Stefanadis, “Sustav liganda CD40/CD40: povezivanje upale s aterotrombozom,” Journal of the American College of Cardiology, sv. 54, br. 8, str. 669–677, 2009. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  10. N. Varo, J. A. de Lemos, P. Libby et al., "Topljivi CD40L: predviđanje rizika nakon akutnih koronarnih sindroma", Cirkulacija, sv. 108, br. 9, str. 1049–1052, 2003. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  11. M. T. Rondina, J. M. Lappé, J. F. Carlquist i sur., “Topljivi CD40 ligand kao prediktor koronarne arterijske bolesti i dugoročnih kliničkih ishoda u stabilnih pacijenata koji su podvrgnuti koronarnoj angiografiji,” Kardiologija, sv. 109, br. 3, str. 196–201, 2008. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  12. Y. Li, C.-X. Tian, ​​M. Wang i Z.-E. Xia, “Korelacija polimorfizama gena CD40 s akutnim koronarnim sindromom, hipertenzijom i dijabetesom,” Zhonghua Yi Xue Za Zhi, sv. 87, br. 10, str. 690–694, 2007. Pogled na: Google Scholar
  13. C. Tian, ​​W. Qin, L. Li, W. Zheng i F. Qiu, “Uobičajeni polimorfizam u CD40 Kozakovom slijedu (-1C/T) povezan je s akutnim koronarnim sindromom,” Biomedicina i farmakoterapija, sv. 64, br. 3, str. 191–194, 2010. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  14. C. Wang, J. Yan, P. Yang, R. Du i G. Chen, “Odnos između polimorfizma gena CD40 i nestabilnih koronarnih aterosklerotskih plakova,” Klinička kardiologija, sv. 33, br. 6, str. E55–E60, 2010. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  15. A. Mälarstig, B. Lindahl, L. Wallentin i A. Siegbahn, “Razine topljivih CD40L regulirane su polimorfizmom -3459 A>G i predviđaju infarkt miokarda i učinkovitost antitrombotičkog liječenja u akutnom koronarnom sindromu bez elevacije ST”, Arterioskleroza, tromboza i vaskularna biologija, sv. 26, br. 7, str. 1667–1673, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  16. K. P. Burdon, C. D. Langefeld, S. R. Beck i sur., "Varijante gena CD40, ali ne i CD40L gena, povezane su s kalcifikacijama koronarne arterije u studiji o srčanom dijabetesu (DHS)" American Heart Journal, sv. 151, br. 3, str. 706–711, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  17. M. García-Bermúdez, C. González-Juanatey, R. López-Mejías i dr., “Studija povezanosti polimorfizama gena CD40-CD154 s osjetljivošću na bolesti i kardiovaskularnim rizikom u španjolskih pacijenata s reumatoidnim artritisom,” PLOS JEDAN, sv. 7, br. 11, str. e49214, 2012. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  18. V. M. Vazgiourakis, M. I. Zervou, C. Choulaki i dr., “Uobičajeni SNP u CD40 regiji povezan je sa sistemskim eritematoznim lupusom i korelira s promijenjenom ekspresijom CD40: implikacije za patogenezu,” Anali reumatskih bolesti, sv. 70, br. 12, str. 2184–2190, 2011. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  19. K. S. Gandhi, F. C. McKay, M. Cox et al., “Transkriptom mRNA pune krvi multiple skleroze i genetske asocijacije ukazuju na disregulaciju specifičnih puteva T stanica u patogenezi,” Ljudska molekularna genetika, sv. 19, br. 11, str. 2134–2143, 2010. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  20. M. Wagner, M. Sobczyński, M. Bilińska i sur., “Alel rizika za MS rs1883832T povezan je sa smanjenom ekspresijom mRNA CD40,” Časopis za molekularnu neuroznanost, sv. 56, br. 3, str. 540–545, 2015. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  21. J. Field, F. Shahijanian, S. Schibeci et al., “Alel rizika za MS CD40 povezan je sa smanjenom ekspresijom vezanom za staničnu membranu u stanicama koje predstavljaju antigen: implikacije za funkciju gena,” PloS One, sv. 10, br. 6, str. e0127080, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  22. E. M. Jacobson, E. Concepcion, T. Oashi i Y. Tomer, “Polimorfizam jednonukleotidnog slijeda Kozakove sekvence povezan s Gravesovom bolešću poboljšava učinkovitost translacije gena CD40: slučaj translacijske patofiziologije,” Endokrinologija, sv. 146, br. 6, str. 2684–2691, 2005. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  23. Z.-L. Liu, J. Hu, S.-P. Zhao, X.-Z. Xiao i M.-S. Yang, “The CD40 rs1883832 Polimorfizam utječe na osjetljivost na sepsu i razine sCD40L,” BioMed Research International, sv. 2018., ID članka 7497314, 8 stranica, 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  24. J. Chen, J.-H. Li, S.-J. Zhao, D.-Y. Wang, W.-Z. Zhang i W.-J. Liang, “Klinički značaj kostimulatornih molekula CD40/CD40L i CD134/CD134L u koronarnoj bolesti srca,” Lijek, sv. 96, br. 32, članak e7634, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  25. I. V. Román-Fernández, D. F. Ávila-Castillo, S. Cerpa-Cruz et al., “CD40 funkcionalni genski polimorfizmi i ekspresija mRNA u pacijenata s reumatoidnim artritisom iz zapadnog Meksika,” Genetika i molekularna istraživanja, sv. 15, br. 4, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  26. P. Gururajan, P. Gurumurthy, P. Nayar i sur., “Povećane serumske koncentracije topljivog CD40 liganda kao prognostički marker u bolesnika s akutnim koronarnim sindromom,” Indijski časopis za kliničku biokemiju, sv. 24, br. 3, str. 229–233, 2009. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  27. D. Engel, T. Seijkens, M. Poggi et al., “Imunobiologija interakcija CD154-CD40-TRAF u aterosklerozi,” Seminari iz imunologije, sv. 21, br. 5, str. 308–312, 2009. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  28. CP Cannon, RG Brindis, BR Chaitman et al., „2013 ACCF/AHA ključni elementi podataka i definicije za mjerenje kliničkog liječenja i ishoda pacijenata s akutnim koronarnim sindromom i koronarnom arterijskom bolešću: izvješće American College of Cardiology Foundation/ Radna skupina American Heart Association za standarde kliničkih podataka (pisaći odbor za razvoj standarda kliničkih podataka o akutnim koronarnim sindromima i koronarnim bolestima),” Cirkulacija, sv. 127, br. 9, str. 1052–1089, 2013. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  29. P. Chomczynski i N. Sacchi, “Metoda izolacije RNA u jednom koraku ekstrakcijom kiselog gvanidinij tiocijanat-fenol-kloroform: dvadeset i nešto godina kasnije,” Protokoli prirode, sv. 1, br. 2, str. 581–585, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  30. K. J. Livak i T. D. Schmittgen, “Analiza podataka o relativnoj ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u stvarnom vremenu i 2(-delta delta C(T)) metode”, Metode San Diego Kalifornija, sv. 25, br. 4, str. 402–408, 2001. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  31. M. Wang, Y. Li, W. Li, Z. Xia i Q. Wu, “Polimorfizam gena CD40 rs1883832 povezan je s rizikom od akutnog koronarnog sindroma u kineskoj studiji slučaj-kontrola,” DNK i stanična biologija, sv. 30, br. 3, str. 173–178, 2011. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  32. J.-M. Chen, J. Guo, C. D. Wei i sur., “Povezanost polimorfizama CD40 s razinama CD40 u serumu i rizik od sistemskog eritematoznog lupusa”, BMC genetika, sv. 16, br. 1, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  33. H.-C. Kuo, M. C. Chao, Y. W. Hsu et al., “Polimorfizmi gena CD40 povezani s osjetljivošću i lezijama koronarnih arterija Kawasakijeve bolesti u populaciji Tajvana,” The Scientific World Journal, sv. 2012., ID članka 520865, 5 stranica, 2012. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  34. A. L. Peters, R. M. Plenge, R. R. Graham i sur., “Novi polimorfizam ljudskog CD40 receptora s poboljšanom funkcijom,” Krv, sv. 112, br. 5, str. 1863–1871, 2008. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  35. R. Rubi-Castellanos, G. Martínez-Cortés, J. Francisco Muñoz-Valle i dr., “Pre-Hispanska mezoamerička demografija približava današnjem porijeklu Mestiza na cijelom teritoriju Meksika,” Američki časopis za fizičku antropologiju, sv. 139, br. 3, str. 284–294, 2009. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  36. S. Chadha, K. Miller, L. Farwell i sur., “Struktura haplotipa TNFRSF5-TNFSF5 (CD40-CD40L) i analiza povezanosti kod sistemskog eritematoznog lupusa”, Europski časopis za ljudsku genetiku, sv. 13, br. 5, str. 669–676, 2005. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  37. C. van Kooten i J. Banchereau, “CD40-CD40 ligand,” Časopis za biologiju leukocita, sv. 67, br. 1, str. 2–17, 2000. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  38. B. D. Hock, J. L. McKenzie, N. W. Patton i sur., “Razine u cirkulaciji i klinički značaj topljivog CD40 u bolesnika s hematološkim malignitetima,” Rak, sv. 106, br. 10, str. 2148–2157, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  39. M. Tsuzuki, I. Morishima, T. Yoshida et al., “Inverzna korelacija između topljivog CD40 liganda i topljivog CD40 je odsutna u pacijenata s nestabilnom anginom,” Srčane žile, sv. 20, br. 6, str. 245–250, 2005. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  40. M. Luomala, H. Päivä, R. Laaksonen i dr., “CD40 topiv u plazmi povezan je s metabolizmom kolesterola u bolesnika s umjerenom hiperkolesterolemijom,” Skandinavski kardiovaskularni časopis, sv. 40, br. 5, str. 280–284, 2006. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  41. T. Sexton, E. Wallace i S. Smyth, “Antitrombotički učinci statina u akutnim koronarnim sindromima: na sjecištu tromboze, upale i interakcija trombocita i leukocita,” Trenutni kardiološki pregledi, sv. 12, br. 4, str. 324–329, 2016. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  42. S. X. Anand, J. F. Viles-Gonzalez, J. J. Badimon, E. Cavusoglu i J. D. Marmur, “Membrane-associated CD40L and sCD40L in atherothrombotic disease”, Tromboza i hemostaza, sv. 90, br. 09, str. 377–384, 2003. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  43. J. F. McDyer, T. J. Goletz, E. Thomas, C. H. June i R. A. Seder, “CD40 ligand/CD40 stimulacija regulira proizvodnju IFN-aγ iz mononuklearnih stanica ljudske periferne krvi na način ovisan o IL-12 i/ili CD28”, Imunološki časopis, sv. 160, br. 4, str. 1701–1707, 1998. Pogled na: Google Scholar
  44. K. Y. Stokes, L. Calahan, C. M. Hamric, J. M. Russell i D. N. Granger, “CD40/CD40L doprinosi mikrovaskularnoj upali izazvanoj hiperkolesterolemijom,” American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, sv. 296, br. 3, str. H689–H697, 2009. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  45. Srčani troponin visoke osjetljivosti za brzu dijagnozu akutnog koronarnog sindroma u hitnoj službi: klinička procjena i procjena isplativosti, Kanadska agencija za lijekove i tehnologije u zdravstvu, Ottawa, 2013., CADTH Optimal Use Report, No. 2.1A.
  46. T. K. W. Ma, Y.-Y. Lam, V. P. Tan i B. P. Yan, "Varijabilitet u odgovoru na klopidogrel: koliko su važne farmakogenetika i interakcije lijekova?" Br. J. Clin. Pharmacol., sv. 72, br. 4, str. 697–706, 2011. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  47. R. E. J. Roach, S. C. Cannegieter i W. M. Lijfering, “Diferencijalni rizici kod muškaraca i žena za prvu i rekurentnu vensku trombozu: uloga gena i okoliša,” Časopis za trombozu i hemostazu, sv. 12, br. 10, str. 1593–1600, 2014. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  48. G. G. Schwartz, C. M. Ballantyne, P. J. Barter i sur., “Povezivanje lipoproteina (a) s rizikom od ponovnih ishemijskih događaja nakon akutnog koronarnog sindroma: analiza randomiziranog kliničkog ispitivanja dal-Outcomes,” JAMA kardiologija, sv. 3, br. 2, str. 164–168, 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar

Autorsko pravo

Autorska prava © 2019. D. E. Martínez-Fernández et al. Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod licencom Creative Commons Attribution License, koja dopušta neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorno djelo ispravno citirano.


Metode

Sudionici

Sudionici su bili 105 muškaraca bijele rase u dobi od 18 do 77 godina (M = 28,51, SD = 13,82) koji su regrutirani sa Sveučilišta Stony Brook i okolnih zajednica putem letaka, novinskih i internetskih oglasa. Sudionici su telefonski provjereni da li ispunjavaju uvjete. Svi sudionici nisu prijavili prethodnu dijagnozu psihičkih poremećaja ili korištenje bilo kakvih povezanih lijekova. Pojedinosti o drugim kriterijima isključenja dane su u Dodatnoj datoteci 1. Mjere ranog života i kroničnog stresa, 5-HTTLPR genotip i DNA metilacija (vidi dolje) bile su dostupne od svih ovih sudionika. Podskup (N = 71) sudjelovao je u TSST-u (M dob = 29,79, SDdob = 15,24). Dodatni podaci o nedavnim simptomima depresije, ekspresiji gena i odgovoru kortizola na TSST bili su dostupni od ovih sudionika. Studiju je odobrio Institucionalni odbor za reviziju Sveučilišta Stony Brook, a sudionici su dali pismeni pristanak prije sudjelovanja u eksperimentalnim sesijama. Na kraju svake sesije, sudionici su usmeno i pismeno ispitani i nadoknađeni sa 100 USD plus nadoknada za sve troškove javnog prijevoza.

Eksperimentalne sesije

Kako bi se standardizirale biološke mjere pod utjecajem dnevnih varijacija, sve eksperimentalne sesije su započele između 12:00 i 14:00 sati. Sudionici su dobili upute da se suzdrže od jela, pića (osim vode) i vježbanja najmanje 1 h prije dolaska. Ukupna procedura, koja je trajala oko 4 h, uključivala je pristanak, ispunjavanje upitnika, TSST, razgovor o životnom događaju i ispitivanje. Sudionici su također dali uzorke krvi za genotipizaciju i analizu metilacije DNA, jedan na početku sesije (45 minuta prije TSST-a) i jedan na kraju (105 minuta nakon TSST-a). Razine kortizola procijenjene su pomoću uzoraka sline prikupljenih u devet različitih vremenskih točaka tijekom sesije.

Procjena stresa u ranom životu

Rani životni stres procijenjen je Upitnikom o traumi u djetinjstvu (CTQ) [47], koji je često korištena mjera maltretiranja u djetinjstvu koja se sastoji od 28 stavki s podskalama fizičkog, seksualnog i emocionalnog zlostavljanja te fizičkog i emocionalnog zanemarivanja. Svaka podskala sastoji se od pet stavki, plus tri stavke koje služe za kontrolu poricanja zlostavljanja. Stavke se ocjenjuju na Likertovoj ljestvici od 5 točaka (od 1 do 5), s višim ocjenama koje ukazuju na višu razinu maltretiranja. Bodovi se zbrajaju kako bi se izračunao ukupni rezultat CTQ, koji može biti u rasponu od 25 do 125.

Procjena kroničnog stresa i nedavnih simptoma depresije

Kronični stres u posljednja 3 mjeseca procijenjen je Trierovim inventarom kroničnog stresa (TICS) [48,49]. TICS je mjera samoprocjene s 12 stavki o učestalosti ponašanja povezanih s kroničnim stresom, kao što su 'Brinem se da neću moći ispuniti svoje zadatke' i 'Isživljavam da imam previše posla'. ocjenjuju se od 0 (nikad) do 4 (vrlo često), a stavke se zbrajaju kako bi se izračunao ukupni rezultat kroničnog stresa, koji može biti u rasponu od 0 do 48.

Sudionici koji su izvodili TSST također su ispunili Beck Depression Inventory II BDI-II [50] za procjenu nedavnih simptoma depresije. BDI-II je mjera samoprocjene s 21 stavkom o nedavnim simptomima depresije (posljednja 2 tjedna) kao što su tuga, beznađe i samookrivljavanje. Svaka se stavka ocjenjuje na ljestvici od 0 do 3, a rezultati se mogu kretati od 0 do 63. Viši rezultati ukazuju na veće simptome depresije.

Procjena razine kortizola i reaktivnosti na stres

Za procjenu razine kortizola kao odgovor na TSST, uzorci sline sudionika su prikupljeni pomoću saliveta (Sarstedt, Rommelsdorf, Njemačka). Četrdeset pet minuta nakon prvog vađenja krvi i neposredno prije početka TSST-a, sudionici su dali osnovne uzorke sline i zatim su odvedeni u sobu za TSST. TSST je izveden kako je opisano u Kirschbaumu et al. [22]. Ukratko, zadatak se sastojao od pripremne faze (5 min), nakon čega je uslijedio javni govor (5 min) o tome zašto bi sudionik bio najbolji kandidat za posao iz snova i zadatak brojanja unatrag (5 min) . Zadatak se odvijao pred povjerenstvom od dvije osobe koje nije davalo verbalne ili neverbalne povratne informacije. Aktivni član povjerenstva, koji je davao instrukcije subjektu tijekom TSST-a, uvijek je bio suprotnog spola (žena), a neaktivni član povjerenstva, koji nije komunicirao s sudionikom, uvijek je bio istog spola (muškarac) kao i sudionik. Nakon TSST-a, sudionici su se vratili u početnu sobu za testiranje i dali drugi uzorak sline odmah nakon TSST-a i ispunili vizualno analognu skalu od 8 stavki (VAS) procjenjujući svoje iskustvo s TSST-om, kao što su smatrajući da je to stresno, prijeteće, ili izazovno. Dodatni uzorci sline prikupljeni su 10, 20, 30, 45, 60, 90 i 105 minuta nakon TSST-a. Uzorci sline pohranjeni su na -20°C odmah nakon sesije do otpreme na Sveučilište Brandeis u Bostonu za analizu koncentracije kortizola. Svaki uzorak je analiziran u duplikatima korištenjem komercijalno dostupnog kemiluminiscentnog imunoeseja (RE62019) s osjetljivošću od 0,16 ng/ml (IBL International, Toronto, ON, Kanada). Koeficijenti varijacije među i unutar testa bili su manji od 7%, odnosno 4%. Povećanje vrha kortizola procijenjeno je kao razlika između vršne razine kortizola nakon TSST-a i početne vrijednosti kako je korišteno u prethodnim studijama [23,24]. Za sve sudionike, najveći odgovor nakon TSST-a uočen je unutar 10 do 20 minuta nakon TSST-a. Koristili smo vršni odgovor, a ne područje ispod krivulje, kao mjeru reaktivnosti kortizola, jer je prvi potencijalno uže povezan s promjenama u ekspresiji gena, dok drugi može biti bliži povezan s ukupnim hormonalnim izlazom [51].

Obrada uzoraka krvi

Kako bi se započelo s ujednačenom grupom stanica, mononuklearne stanice periferne krvi (PBMC) izolirane su iz krvi odmah nakon vađenja krvi pomoću Leucosep® epruveta (Greiner Bio-One Inc., Monroe, NC, USA) i Ficoll-Paque (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SAD) medij za odvajanje prema protokolu proizvođača. Izolirane PBMC pelete pohranjene su na -80°C za naknadne postupke ekstrakcije DNA i RNA.

Ekstrakcije DNA i RNA iz PBMC peleta provedene su pomoću AllPrep DNA/RNA/Protein Mini kita (Qiagen, Valencia, CA, SAD) prema uputama proizvođača. Količina i kvaliteta DNA i RNA procijenjeni su putem NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), uzorci DNA pohranjeni su na -20°C, a uzorci RNA pohranjeni su na -80°C.

Genotipizacija 5-HTTLPR i rs25531

Genotip 5-HTTLPR određen je PCR amplifikacijom 25 ng DNA pri temperaturi žarenja od 67,5°C korištenjem primera korištenih u prethodnom radu [5]. Slučajni podskup od 24 uzorka dvaput je obradio tehničar koji nije vidio početne rezultate kako bi se utvrdila pouzdanost test-retest, koja je bila 100%. Kao rezultat genotipizacije, pojedinci su genotipizirani kao S/S, S/L ili L/L.

Za genotipizaciju A/G SNP-a (rs25531), 6 μl 5-HTTLPR PCR proizvoda je probavljeno s 5 jedinica HpaII restrikcijski enzim (New England Biolabs, Ipswich, MA, SAD) 3 h na 37°C. Kao rezultat toga, pojedinci su genotipizirani kao S/S, S/LA, S/LG, LA/LA, LA/LG, i LG/LG. S obzirom na taj izraz LG Predloženo je da je alel sličan S alelu [52], trialelu (S, LA, LG) klasifikacijska shema grupirana S/LG i LG/LG pojedinci kao 'S/S' i LA/LG pojedinci kao 'L/S'. Distribucije genotipova bile su u Hardy-Weinbergovoj ravnoteži prema bialelnoj i trialelnoj klasifikacijskoj shemi (P > .05).

Analiza metilacije DNA

Za analizu metilacije DNA, 500 ng DNA od svakog sudionika na početku je tretirano bisulfitom korištenjem Epitect Bisulfite kita (Qiagen, CA) prema uputama proizvođača i pohranjeno na -20°C do korištenja u analizama metilacije. Osim toga, u svim analizama metilacije, 500 ng nemetiliranih (0%) i potpuno metiliranih (100%) uzoraka ljudske DNA (Zymo Research, Irvine, CA, SAD) tretirano je bisulfitom zajedno s uzorcima sudionika koji se koriste kao konverzija bisulfita kontrole.

Globalna metilacija DNK

Metilacija dugo isprepletenog nuklearnog elementa-1 (LINIJA 1) korištena je kao mjera globalne metilacije i za istraživanje povezanosti s ELS-om (slično [39]) i za kontrolu globalne metilacije pri istraživanju gen-specifične metilacije (slično [31]). LINIJA 1 metilacija je kvantificirana u duplikatima korištenjem kompleta PyroMark Q96 CpG LINE-1 (Qiagen, Kalifornija) u PyroMark Q96 MD sustavu u Stony Brook University Genomics Core Facility u skladu s protokolom proizvođača i s komercijalnim primerima isporučenim uz komplet. Detalji postupka navedeni su u Dodatnoj datoteci 1.

SLC6A4 CpG otočna DNA metilacija

Metilacija CpG otoka uzvodno od SLC6A4 kvantificiran je sustavom Sequenom Epityper MassArray (San Diego, CA, SAD). Dva su seta primera dizajnirana da pojačaju 79 CpG mjesta na CpG otoku u dva amplikona slična Philibertu et al. [40] pomoću softvera Epityper (Sequenom, CA). Ovom tehnikom, metilacija od CpG jedinice analizira se, koji se može sastojati od jednog ili više susjednih CpG mjesta. Ukupno 37 CpG jedinica pokriveno je s dva amplikona, koji se sastoje od 79 CpG mjesta. Svi uzorci su rađeni u tri primjerka. Nakon predobrade, podaci o metilaciji iz 26 CpG jedinica u amplikonima 1 i 2 uključeni su u sve analize (Slika 1). Pojedinosti postupka, nizovi početnica i analiza podataka dati su u Dodatnoj datoteci 1.

SLC6A4 CpG otočni amplikoni za analizu metilacije DNA. Analizirane CpG jedinice su numerirane od 1 do 26. Netranslirani egzon obuhvaća CpG jedinice od 12 do 15, a 5-HTTLPR se nalazi uzvodno od CpG otoka. Zvjezdice pokazuju CpG jedinice koje pripadaju faktorima 1, 2 i 3 (F1 do F3). Opterećenja faktora F1 kretala su se od .35 do .83, opterećenja faktora F2 bila su od .37 do .76, a opterećenja faktora F3 bila su od .73 do .87.

Analiza ekspresije gena

Za svakog sudionika, dva uzorka RNA korištena su za analizu genske ekspresije, jedan 45 minuta prije TSST-a (osnovna vrijednost), a drugi 105 minuta nakon TSST-a (odgovor). Prije kvantifikacije ekspresije gena, integritet uzoraka RNA procijenjen je pomoću Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD). Brojevi integriteta RNA (RIN) uzoraka bili su visoki (M = 7,94, SD = 1,32), a RIN-ovi uzoraka prije i nakon TSST-a nisu se značajno razlikovali (P = .853). Nakon toga, 1 μg RNA iz svake vremenske točke pretvoren je u cDNA korištenjem QuantiTect kompleta za reverznu transkripciju prema protokolu proizvođača (Qiagen, CA). Uzorci cDNA su zatim razrijeđeni pet puta, a 1 μl razrijeđene cDNA korišteno je za analizu genske ekspresije gena kandidata kvantitativnim PCR (qPCR), koristeći Qiagen SYBR Green PCR + UNG kit (Qiagen, CA) i gen -specifični početnici dizajnirani s web stranice Roche Universal Probe Library (http://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl/ezhome.html). qPCR reakcije provedene su u tri primjerka u sustavu Roche 480 LightCycler (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, SAD) pri temperaturi žarenja od 60°C.

Kako bi se identificirali najbolji referentni geni u PBMC-ima, ekspresija šest referentnih gena kandidata analizirana je iz pet uzoraka RNA pojedinaca, dobivenih na početnoj liniji i vremenskim točkama odgovora. Ova metoda identificirana HPRT1 (hipoksantin fosforiboziltransferaza 1) i GAPDH (gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza) kao najbolji referentni geni u PBMC-ima. CT vrijednosti koje su dobivene qPCR-om korištene su za procjenu promjene ekspresije gena između polaznih uzoraka i uzoraka odgovora, koristeći delta-delta-CT metoda [53]. Promjene u ekspresiji gena za svaki uzorak, normalizirane za referentne gene, prikazane su kao vrijednosti fold-change, što predstavlja promjenu puta u SLC6A4 i NR3C1 nakon TSST-a u odnosu na početnu liniju. Pojedinosti o qPCR analizama i sekvencama prajmera dane su u Dodatnoj datoteci 1.

Statistička analiza

Sve statističke analize provedene su pomoću SPSS-a za Windows verzije 16.0 (Chicago, IL, USA), s razinom značajnosti postavljenom na α = 0,05. Kako bismo procijenili je li TSST uspješno izazvao odgovor kortizola, koristili smo ANOVA ponovljenih mjera za devet uzoraka sline prikupljenih tijekom eksperimenta. Prije svih analiza, podaci o kortizolu su testirani na normalnu distribuciju Kolmogorov-Smirnov testom. Zbog kršenja normalnosti za uzorke u više vremenskih točaka (P < .05), log transformacija je primijenjena na sve podatke o kortizolu. Zbog kršenja sferičnosti (P < .05), primijenjena je korekcija Greenhouse-Geissera.

Da bi se ispitale korelacije između varijabli od interesa, Pearsonov koeficijent korelacije (r) korišten je za normalno raspoređene varijable, a Spearmanov rho koeficijent (rs) korišten je za nenormalno raspoređene varijable. Djelomične korelacije korištene su prema potrebi za kontrolu učinaka nekih varijabli kao što su dob i LINIJA 1 metilacija.

Kako bi se razumjeli obrasci metilacije na cijelom CpG otoku i smanjio broj istraživanih varijabli, provedena je faktorska analiza koja pokriva 26 CpG jedinica diljem otoka, slično Olssonu. et al. [41]. Kaiser-Meyer-Olkin mjera adekvatnosti uzorkovanja (.834) i Bartlettov test sferičnosti (P < .001) sugerira da je faktorska analiza prikladna za skup podataka. Kao rezultat analize, pojavilo se pet čimbenika koji objašnjavaju 75% varijance. Međutim, budući da je manje od tri varijable učitano na posljednja dva faktora, razmatrana su samo prva tri faktora: faktor 1 (F1), faktor 2 (F2) i faktor 3 (F3). Postotak varijance objašnjen s F1, F2 i F3 iznosio je 37, 15, odnosno 12. Opterećenja ovih čimbenika bila su takva da je F1 prvenstveno uključivao CpG jedinice na početku CpG otoka do početka egzona, dok je F2 uključivao one prema kraju otoka, a F3 je uključivao kraću regiju prema kraju otoka ( Slika 1).


UVOD

Kontrola kvalitete proteina (PQC) ključna je za održavanje homeostaze proteina u eukariotskim stanicama. Identificirani su PQC putevi specifični za više staničnih odjeljaka, uključujući one koji su posvećeni pogrešno savijenim proteinima u citosolu (Eisele i Wolf, 2008 Heck et al., 2010. Nillegoda et al., 2010.), jezgra (Gardner et al., 2005.), plazma membrana (Zhao et al., 2013.), te membrane endoplazmatskog retikuluma (Vembar i Brodsky, 2008.). Doista, postoje čak i PQC putevi koji napadaju defektne prevoditeljske proizvode dok oni izlaze iz ribosoma (Bengtson i Joazeiro, 2010 Brandman et al., 2012. Defenouillere et al., 2013. Verma et al., 2013.). Međutim, s obzirom na ogromnu raznolikost proteinske strukture i lokalizacije, vjerojatno je da je naše razumijevanje PQC daleko od potpunog.

U istraživanju krajolika izazova s ​​kojima se suočava biogeneza proteina, spustili smo se na ribosom kao zanimljivu metu za mehaničko istraživanje PQC. Formiranje ribosoma u kvascu je kompliciran proces koji zahtijeva transkripciju 35S i 5S rRNA, obradu 35S primarne rRNA, translaciju i nuklearni uvoz 79 različitih ribosomskih proteina te sastavljanje obrađenih rRNA i ribosomskih proteina u jezgrici (Kressler et al., 2010.). Sastavljanje ribosoma nije samo složeno, već također monopolizira impresivan dio biogenog kapaciteta. U brzo rastućim stanicama kvasca, 60% ukupne transkripcije je posvećeno rRNA, a 50% transkripcije RNA polimeraze II i 90% spajanja mRNA posvećeno je ribosomskim proteinima (Warner, 1999.). Ovaj ogroman fluks daje prednost učinkovitim PQC mehanizmima kako bi se minimiziralo stvaranje i nakupljanje neupotrebljivih komponenti. Međutim, unatoč brzom širenju našeg razumijevanja homeostatskih regulatornih mehanizama za sastavljene ribosome, homeostatski mehanizmi koji prate sastavljanje ribosoma i pomažu stanicama da se nose s pogreškama ili neravnotežama u procesu sastavljanja ostaju slabo shvaćeni.

Jedno jednostavno, ali duboko pitanje o sastavljanju ribosoma odnosi se na to kako stanica kontrolira ekspresiju ribosomskih gena kako bi osigurala stehiometrijsku proizvodnju svih proteina. Nekoliko studija sugerira da se neki ribosomski proteini mogu stvarati u suvišku, a stanica održava odgovarajuću razinu tih proteina razgradnjom nesastavljenih proteina. Postojanje takvog mehanizma potkrijepljeno je s nekoliko linija dokaza. Na primjer, novosintetizirani ribosomski proteini se brzo razgrađuju kada je poremećena obrada rRNA (Gorenstein i Warner, 1977. Warner, 1977.). Osim toga, u stanicama koje sadrže dodatne kopije gena ribosomskog proteina, prekomjerna proizvodnja odgovarajućeg proteina ne može se otkriti osim ako se ne provede izrazito kratko pulsno označavanje (∼45 s) (Abovich et al., 1985). Na temelju ovih zapažanja, predloženo je da se neki ribosomski proteini normalno sintetiziraju na razinama iznad potrebnih stanicama, ali suvišne količine se brzo razgrađuju, tako da se ne mogu detektirati. Međutim, mehanizam kojim se prekomjerno proizvedeni ribosomski proteini razgrađuju nije istražen. Ovu hipotezu podupiru dvije novije studije. Eksperimenti s pulsnim označavanjem stabilnih izotopa aminokiselinama u staničnoj kulturi pokazuju da se novosintetizirani ljudski ribosomski proteini brzo uvoze u jezgru radi sklapanja s rRNA, a višak se razgrađuje proteasomom (Lam et al., 2007.). Nadalje, dok stjecanje dodatnog kromosoma u kvascu dovodi do proporcionalnog povećanja razine mRNA i proteina za većinu gena na dodatnom kromosomu (Torres et al., 2007., 2010.), većina ribosomskih proteina se ne povećava proporcionalno s brojem kopija, već se posttranslacijsko atenuira neidentificiranim mehanizmom (Dephoure et al., 2014.). Višestruki mehanizmi mogu potencijalno posredovati u razgradnji viška ribosomskih proteina. Dok studije na ljudima upućuju na proteasom, nije utvrđeno je li degradacija ribosomskih podjedinica koju je primijetio Lam et al. (2007.) bio je povezan sa statusom okupljanja ili ovisi o sveprisutnosti. U stanicama kvasca, dva druga mehanizma povezana su s metabolizmom ribosoma. Stanice kvasca bez aminokiselina inkapsuliraju postojeće zrele ribosome u autofagosome u procesu koji se naziva ribofagija (Kraft et al., 2008.). Osim toga, stanice kvasca podvrgnute toplinskom šoku formiraju granule stresa koje sadrže 40S podjedinice, a one se također eliminiraju autofagijom (Grousl et al., 2009).

U ovoj studiji istražujemo sudbinu ribosomskih proteina koji se stvaraju u stehiometrijskom višku u odnosu na druge ribosomske podjedinice. Pokazali smo da se prekomjerno proizvedeni ribosomski proteini uglavnom ne uspijevaju sastaviti u ribosome i umjesto toga se brzo ubikvitiniraju i razgrađuju u jezgri na način ovisan o proteazomima.


Autori zahvaljuju GS i njegovoj obitelji za njihovu aktivnu i prijateljsku suradnju, O. Sthandieru i M. Marchioniju za tehničku pomoć, D. Cacchiarelliju za znanstveni savjet, V. Silenziju za čitanje rukopisa, Telethon Network Genetic Biobanks (GTB12001F) za biološke uzorci i SMART by Servier (https://smart.servier.com/) za dizajn figura. Ovaj rad je djelomično podržan grantovima ERC-2019-SyG (855923-ASTRA), Telethon (GGP16213), Parent Project Italia, AIRC (IG 2019 Id. 23053) i PRIN 2017 (2017P352Z4) za I.B. Španjolsko ministarstvo gospodarstva, industrije i konkurentnosti (MEIC) (BFU2016-75008-P) za L.D.C.i Sapienza Research Calls (RM118164363B1D21) J.M.

Konceptualizaciju i dizajn rada izveli su JM, LDC i IB. Eksperimente su izveli i analizirali JM, ML, FC, AR, VDC, DM, TS i LP. Bioinformatičku analizu podataka izvršili su EB, AS i AC. Izvorni nacrt rukopisa napisali su JM i IB. Nacrt su pregledali i uredili svi autori.


Gledaj video: Naruto akhirnya berhadapan dengan Raja Otsutsuki - Dewa otsutsuki sebenarnya yg bisa membunuh naruto (Kolovoz 2022).