Informacija

Tehnike za otkrivanje fosforilacijskih mjesta u proteinima?

Tehnike za otkrivanje fosforilacijskih mjesta u proteinima?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Želio bih znati kako se u praksi otkrivaju fosforilirana mjesta u proteinima. Pročitao sam neke radove u kojima su autori govorili o tehnikama masene spektrometrije.

Ali moje je pitanje zašto rendgenska kristalografija ili NMR tehnike ne mogu uhvatiti fosforilirana mjesta?

(Napomena: Moje iskustvo je inženjerstvo elektronike, tako da nisam stručnjak za ovo područje.)


U principu rendgenska kristalografija ili NMR mogu otkriti mjesta fosforilacije, ali to su mnogo složenije i skuplje tehnike od spektra mase. Dakle, za jednostavno otkrivanje obrazaca fosforilacije u proteinu puno je lakše pomoću masenih specifikacija.

Detaljni razlozi:

Za rendgensko snimanje trebate kristalizirati protein što je često vrlo teško/nemoguće i zahtijeva dosta materijala uzorka. Nakon toga trebate dobar izvor rendgenskih zraka (idealno sinkrotronski snop) i snimite uzorak raspršenja u proširenom rasponu kutova (najmanje 180 stupnjeva) prije nego što vaš kristal ispari u intenzivnoj snopi X-zraka. Posljednje, ali ne i najmanje važno, potrebni su vam dodatni kemijski trikovi, razrađeni matematički modeli i velika količina računalne snage kako biste nadoknadili činjenicu da u rendgenskoj kristalografiji gubite informacije o fazi (jer ne postoje prikladne leće za X-zrake).

Za NMR su vam potrebni veliki, vrlo jaki supravodljivi magneti, sofisticirani radio odašiljači i prijemnici, komplicirana matematika i računalna snaga. Međutim, čak i ako imate sve to, i dalje ste ograničeni na vrlo male proteine ​​jer je inače NMR spektar jednostavno previše kompliciran da bi se mogao riješiti.

Nasuprot tome, za masene specifikacije potreban vam je (visoko sofisticiran) pištolj za raspršivanje, umjereno magnetsko polje i detektor za umnožavanje elektrona. Ovo je još uvijek vrlo sofisticiran stroj, ali mnogo jednostavniji u usporedbi s gore navedenim. Osim toga, analiza podataka je jednostavnija nego u gore navedenim slučajevima.

Uglavnom, ako ne trebate znati strukturne promjene uzrokovane fosforilacijom (za što biste trebali usporediti strukture dvaju kristala), držali biste se masenih specifikacija.


Rentgenska kristalografija korištena je za otkrivanje fosforiliranih mjesta.

Baza podataka RCSB proteina trenutno sadrži 856 struktura koje imaju razlučivost ispod 3 angstroma i ključnu riječ "fosforilirano" u svom popisu.

Također se čini da je moguće koristiti NMR za proučavanje fosforiliranih proteina.

Razlikuju se situacije u kojima se koristi NMR/rendgenska kristalografija ili masena spektrometrija. Ove razlike mogu objasniti zašto se u radu koji raspravlja o detekciji fosforilacije pomoću masene spektrometrije ne spominje NMR ili rendgenska kristalografija.

NMR/rendgenska kristalografija daje strukturne podatke i gotovo uvijek koristi poznate proteinske sekvence.

Masena spektrometrija ima dvije glavne prednosti za detekciju mjesta fosforilacije i one naglašavaju razloge za njezinu upotrebu. Prva snaga je sposobnost dobivanja informacija o mnogim događajima fosforilacije, uključujući one nepoznate, iz jedne tekućinske kromatografije MS/MS. Druga snaga je potencijal za kvantificiranje višestrukih fosforilacijskih mjesta iz najmanje 3 serije jednog uzorka.


Mapiranje mjesta fosforilacije proteina izoliranih u gelu pomoću nanoelektrosprej tandem masene spektrometrije: potencijali i ograničenja

Pregledi članaka su zbroj preuzimanja cijelog teksta članaka od studenog 2008. (i PDF i HTML) u skladu s COUNTER-om za sve institucije i pojedince. Ti se mjerni podaci redovito ažuriraju kako bi odražavali korištenje do posljednjih nekoliko dana.

Citati su broj drugih članaka koji citiraju ovaj članak, izračunan od strane Crossrefa i ažuriran svakodnevno. Pronađite više informacija o broju citata Crossref.

Altmetric Attention Score kvantitativna je mjera pažnje koju je istraživački članak dobio na internetu. Klikom na ikonu krafne učitat će se stranica na altmetric.com s dodatnim detaljima o rezultatu i prisutnosti na društvenim mrežama za dati članak. Pronađite više informacija o Altmetric Attention Score i kako se rezultat izračunava.


Proučite fosforilaciju proteina na staromodan način

Jedna od starijih metoda za proučavanje fosforilacije proteina je označavanje proteina radioaktivno obilježenim 32P-ortofosfatom. Kinaza će prenijeti radiooznaku na njen supstrat omogućujući vam da otkrijete aktivnost. Obično inkubirate žive stanice s radiooznakom određeno vrijeme prije sakupljanja stanica, pripremate stanične ekstrakte i razdvajate proteine ​​gel elektroforezom (+/- korak imunoprecipitacije za određeni protein). Zatim osušite gel i izložite ga filmu ili fosforimageru kako biste otkrili označene trake.

Radioobilježavanje dobro funkcionira ako želite utvrditi je li vaš protein fosforiliran bez poznavanja mjesta fosforilacije ili uključene kinaze. Također ga možete koristiti u formatu pulsiranja ili tijekom različitih eksperimentalnih uvjeta kako biste odredili kada dolazi do fosforilacije in vivo. Budući da je protein izložen i kinazama i fosfatazama, također možete dobiti dobar osjećaj za stabilnu razinu fosforilacije.

Radioobilježavanje vam govori je li vaš ciljni protein fosforiliran ili vam daje opću ideju o aktivnosti kinaze u populaciji, ali vam ne daje informacije o uključenim kinazama(ama). Radioaktivno obilježavanje je radno intenzivno i naravno zahtijeva dodatne sigurnosne, regulatorne i uvjete zbrinjavanja zbog radioizotopa. Također, možda ćete morati izlagati svoj gel filmu danima za adekvatan signal. Tko ima vremena za to?


Kemijski pristupi proučavanju fosforilacije labilnih aminokiselina

Fosforilacija ostataka serina, treonina i tirozina je arhetipska posttranslacijska modifikacija proteina. Dok je fosforilacija ovih ostataka postala standardno znanje iz udžbenika, fosforilacija drugih bočnih lanaca aminokiselina je nedovoljno cijenjena i minimalno karakterizirana usporedbom. Ova razlika je ukorijenjena u relativnoj nestabilnosti ovih kemijski različitih dijelova bočnog lanca aminokiselina, naime fosforamidata, acil fosfata, tiofosfata i fosfoanhidrida. U slučaju O-fosforilirane aminokiseline, sintetski konstrukti bili su kritični za procjenu njihove stabilnosti i razvoj alata za njihovo proučavanje. Kako je zajednica kemijske biologije postala svjesnija ovih alternativnih mjesta fosforilacije, razvijena je metodologija za sintezu dobro okarakteriziranih standarda i bliskih oponašanja ovih fosforiliranih aminokiselina. U ovom članku osvrćemo se na sintetičku kemiju koja je preduvjet za napredak u ovom području.

Ovo je pregled sadržaja pretplate, pristup preko vaše institucije.


Rasprava

Fosforilacija proteina je jedan od najbolje proučavanih PTM-a i navodno je uključen u regulaciju brojnih staničnih procesa u prokariotskim stanicama 8,57. Godine 2015. prikupili smo 7 391 poznato p-mjesta od 3 750 proteina u 96 prokariota iz objavljene literature i razvili dbPSP 1.0 22 koji sadrži ove skupove podataka. Zbog nakupljanja informacija o fosforilaciji, ovdje smo objavili dbPSP 2.0 dodajući 11.905 novih unosa koji uključuju novootkrivene fosfoproteine ​​i p-mjesta u prokariotima. Nadalje, integrirane su bogate bilješke izvedene iz 88 javnih baza podataka. Ukupno, dbPSP 2.0 sadržavao je 19.296 poznatih p-mjesta u 8.586 fosfoproteina i zauzimao je veličinu

9 GB, uz 300-struko povećanje u odnosu na verziju 1.0.

U ovoj studiji, kako bismo pokrili različite biološke uloge prokariotskih fosfoproteina, uključili smo višeslojno znanje iz drugih baza podataka kako bismo sveobuhvatno označili fosfoproteine. Na primjer, prokariotski enzim ClpP igra važnu ulogu u moduliranju različitih bioloških procesa, kao što su odgovor na stanični stres, patogeneza i homeostaza 58 . Zabilježeno je da inhibicija funkcije ClpP utječe na infektivnost i virulentnost mikrobnih patogena 59 . Štoviše, fosforilacija arginina ClpP bila je neophodna za održavanje njegove funkcije 20,21,60. Kao što je prikazano na slici 6, B. subtilis proteaza ClpP označena je kao serinska peptidaza i sudjeluje u eliminaciji oštećenih proteina tijekom toplinskog šoka, a njezinu aktivnost može potisnuti CtsR kao i 20 697 spojeva. U međuvremenu, ClpP bi mogao stupiti u interakciju s 9 partnera i samostalno se sastavljati u heksamerne prstenaste strukture (slika 6). Konkretno, pronašli smo gotovo 15.700 zapisa iz 6 ortolognih baza podataka kako bi pokazali da je ClpP visoko konzervirana podjedinica u prokariota, a rezultati su u skladu s prethodnim studijama. Osim toga, također su dostavljene informacije o funkcionalnoj domeni i p-mjestu ClpP-a. U dbPSP 2.0, odabrani izvori podataka p-mjesta i fosfoproteina, kao i informacije o napomenama, mogu se preuzeti na http://dbpsp.biocuckoo.cn/Download.php.

Pregled višeslojnih bilješki za B. subtilis ClpP u dbPSP 2.0.

Ukratko, baza podataka dbPSP 2.0 će se kontinuirano održavati i ažurirati kada se identificiraju nova p-mjesta u prokariotima. Uz dodavanje dodatnih napomena iz drugih javnih baza podataka, dalje ćemo razvijati računske alate za predviđanje prokariotskih p-mjesta. Očekujemo da ova baza podataka može pružiti korisnu podršku za bolje razumijevanje regulatornih mehanizama i funkcija fosforilacije u prokariota.


Fosforilacija proteina uobičajena je vrsta posttranslacijske modifikacije (PTM) koja je prisutna u svim biološkim vrstama, a utječe na ključna svojstva proteina uključenih u brojne stanične događaje. U živim stanicama, kontinuirana i dinamička fosforilacija i defosforilacija proteina na specifičnim aminokiselinskim ostacima kontrolirana je složenim signalnim mrežama, što rezultira proizvodnjom raznih fosfoproteina s različitim stanjima fosforilacije. Fosforilacija proteina događa se na nekoliko aminokiselinskih ostataka, uključujući His, Asp, Glu, Lys, Arg i Cys, na kojima je vrlo labilna i teško ju je detektirati, dok se stabilnija fosforilacija odvija na tri specifična ostatka, Ser, Thr i Tyr. U bakterijskim stanicama, His- i Asp-fosforilirani proteini dobro su poznati po svojoj vodećoj ulozi u dvokomponentnom sustavu za prijenos signala. U višim eukariotskim stanicama, s druge strane, prevladavaju Ser-, Thr- i Tyr-fosforilirani proteini. Budući da su standardne slobodne energije za veze imidazol-fosfata na His ostatku i karboksil-fosfata na Asp ostatku velike, fosforilirani His i Asp imaju potencijal da služe kao intermedijari u reakcijama fosfotransfera na druge aminokiseline. Stoga, uz Ser-, Thr- i Tyr-fosforilirane proteine, His- i Asp-fosforilirani proteini igraju ključnu ulogu senzorskog aparata i regulatora odgovora dvokomponentnog sustava u brzom odgovoru na intra- i izvanstanični signali u prokariota kao i u gljivama i biljkama.

Ovaj reverzibilni PTM općenito je kataliziran suprotnim aktivnostima velikih obitelji enzima protein kinaze i fosfataze. Na primjer, ljudski genom kodira više od 500 protein kinaza i oko 300 protein fosfataza. Otprilike 13000 ljudskih proteina ima mjesta koja su fosforilirana i defosforilirana. Ovi brojevi odražavaju važnost i složenost fosforilacije proteina. Abnormalna fosforilacija koja je rezultat neravnoteže u enzimskim reakcijama kinaza i fosfataza upletena je u širok raspon ljudskih bolesti, uključujući rak, dijabetes melitus, neurodegeneraciju i imunološke/upalne i vaskularne poremećaje. Stoga su metode kvantitativnog i kvalitativnog praćenja promjena u fosforilacijskim stanjima pojedinih proteina također vrlo važne za proučavanje proteoma, posebice u vezi s rasvjetljavanjem molekularnog podrijetla bolesti i racionalnog molekularnog dizajna lijekova.

Ovo posebno izdanje će se usredotočiti na ulogu fosforilacije proteina u svim živim stanicama. Vrlo su dobrodošli originalni rukopisi i recenzije koje se bave bilo kojim aspektom fosforilacije proteina i povezanom patofiziologijom i metodologijom.

dr. Eiji Kinoshita
dr. Emiko Kinoshita-Kikuta
Gosti urednici

Podaci o predaji rukopisa

Rukopise je potrebno poslati online na www.mdpi.com registracijom i prijavom na ovu web stranicu. Nakon što ste registrirani, kliknite ovdje da biste otišli na obrazac za podnošenje. Rukopisi se mogu predati do isteka roka. Svi radovi će biti recenzirani. Prihvaćeni radovi bit će kontinuirano objavljivani u časopisu (čim budu prihvaćeni) i zajedno će biti navedeni na web stranici za posebno izdanje. Pozivaju se znanstveni članci, pregledni članci kao i kratka priopćenja. Za planirane radove naslov i kratak sažetak (oko 100 riječi) mogu se poslati Redakciji radi objave na ovoj web stranici.

Prijavljeni rukopisi nisu trebali biti prethodno objavljeni, niti biti razmatrani za objavljivanje na nekom drugom mjestu (osim radova u zbornicima skupova). Svi rukopisi se temeljito recenziraju kroz jednoslijepi proces recenzije. Vodič za autore i druge relevantne informacije za predaju rukopisa dostupni su na stranici Upute za autore. Biomolekule je međunarodni recenzirani mjesečnik otvorenog pristupa koji izdaje MDPI.

Prije slanja rukopisa posjetite stranicu Upute za autore. Naknada za obradu članka (APC) za objavljivanje u ovom časopisu otvorenog pristupa iznosi 2000 CHF (švicarskih franaka). Prijavljeni radovi trebaju biti dobro formatirani i koristiti dobar engleski jezik. Autori mogu koristiti MDPI-jevu uslugu uređivanja na engleskom prije objave ili tijekom revizija autora.


Uvod

Transdukcija signala je proces kojim se podražaj ili stres pretvara u signal unutar stanica. Signal se zatim prenosi do konačnih efektora, čija je aktivnost neophodna za stvaranje odgovarajućih staničnih odgovora. Prijenos signala se postiže omogućavanjem početnog stimulusa ili stresa da kontrolira nekoliko međuregulatora koji mogu istovremeno mijenjati funkcije mnogih meta. Među srednjim regulatorima, protein kinazama i fosfatazama posvećuje se velika pozornost.

Protein kinaze su velika genska superfamilija uključena u modificiranje funkcija proteina kroz posttranslacijsku fosforilaciju serina/treonina/tirozina. Ove kinaze igraju bitnu ulogu u kontroli različitih događaja kao što su dioba stanica i signalizacija, te diferencijacija i metabolizam (Hanks & Hunter 1995 Nishizuka 1988, 1992 Norbury & Nurse 1992). U mnogim slučajevima, pojedinačne protein kinaze reguliraju višestruke stanične procese kroz fosforilaciju različitih supstrata, iako su njihovi precizni molekularni mehanizmi uglavnom nepoznati. Fosforilacija proteina je reverzibilan događaj koji je reguliran razrađeno usklađenom ravnotežom između aktivnosti protein kinaza i fosfataza (Cohen 1989.). Budući da je fosforilacija proteina vitalna funkcija, dugo se ulažu napori da se razjasni fiziološko značenje različitih protein kinaza i njihovih supstrata. In vitro biokemijske analize, korištenjem pročišćenih kinaza i supstrata, korisne su u karakterizaciji katalitičkih svojstava kinaza i za otkrivanje funkcionalnih promjena supstrata povezanih s fosforilacijom. Međutim, takve analize ne odražavaju uvijek pojave koje se događaju in vivo.

Brojne protein kinaze mijenjaju substaničnu lokaciju staničnom signalizacijom (za pregled vidi Inagaki et al. 1994.). Najšire proučavani primjer je protein kinaza C (PKC) za koju je prvi put biokemijski dokazano da se translocira iz citosola u membransku frakciju nakon aktivacije pomoću forbol estera (za pregled vidi Nishizuka 1995.). Ova zapažanja su implicirala da je substanična distribucija kinaza važan čimbenik u određivanju interakcija kinaza-supstrat in vivo. Nekoliko često korištenih metoda pomaže u istraživanju aktivnosti kinaze in vivo. Biokemijsko substanično frakcioniranje olakšava stjecanje prostornih informacija o lokalizaciji kinaze. Međutim, ovaj pristup ne pomaže u boljem razumijevanju in vivo stanje aktivnosti kinaze aktivnost enzima odvojena ovom metodom ne odražava se uvijek in vivo aktivnost, a tehnička ograničenja otežavaju dobivanje jasnih slika distribucije kinaze. Pratiti in vivo Vremenska aktivnost kinaze, označavanje stanica radioaktivnim fosfatom je jedna od strategija, međutim, i ovdje je teško dobiti informacije o stanju prostorne aktivacije kinaze. Analize lokalizacije kinaze korištenjem specifičnih antitijela omogućuju prikaz distribucije "cijelog" enzima, što naravno ne znači nužno "aktivni" enzim.

Uzeti zajedno, klasične tehnike kao što su biokemijsko frakcioniranje stanica, označavanje izotopa i specifična antitijela za kinaze imaju zajednički ozbiljan nedostatak, a podaci dobiveni ovim metodama ne daju važne "in vivo' prostorno-vremenske informacije o 'aktivnim' kinazama (stanje fosforilacije/defosforilacije ciljnih proteina). Sve do (1990), akumulirani dokazi snažno sugerirali su da je substanična distribucija aktivnosti protein kinaze dinamički organizirana tijekom različitih procesa kao što su stanična signalizacija i sam stanični ciklus. Budući da se čini da prostorno-vremenska dinamika aktivnosti kinaze objašnjava razrađenu koordinaciju staničnih funkcija, s nestrpljenjem se očekivala nova metoda koja rješava gore spomenute probleme. Tijekom našeg istraživanja na intermedijarnim filamentima (IF) imali smo sličnih zastoja, te su se pokušali uspostaviti novi pristup praćenju prostorno-vremenskih promjena fosforilacije/defosforilacije pomoću in vivo kinaza/fosfataza. Slijedom toga, 1990. godine osmislili smo metodu i postupke za razvoj antitijela specifičnih za mjesto i fosforilaciju (Yano et al. 1990., 1991. Nishizawa et al. 1990, 1991). Kako su antitijela prikladna za korištenje, studije o staničnoj i razvojnoj biologiji, medicinskom i biokemijskom polju su se proširile, a brojna antitijela specifična za mjesto i stanje fosforilacije protiv različitih proteina postala su komercijalno dostupna (za pregled pogledajte Inagaki et al. 1997 ).

Ovdje opisujemo povijest i nedavni napredak u antitijelima specifičnim za mjesto i stanje fosforilacije, u vezi s različitim staničnim biološkim i kliničkim događajima.

Povijest antitijela specifičnih za mjesto i stanje fosforilacijes

Budući da se dugo smatralo da su IF-ovi relativno stabilni u usporedbi s drugim citoskeletima kao što su mikrotubule i aktinski filamenti, bilo je toliko neočekivano otkriti da fosforilacija specifična za mjesto izaziva dramatično rastavljanje vimentinskih filamenata in vitro ( Inagaki et al. 1987.). Od tada slično in vitro Rastavljanje ovisno o fosforilaciji zabilježeno je u mnogim drugim IF proteinima, uključujući glija fibrilarni kiseli protein (GFAP), desmin, keratin, α-interneksin, neurofilament (NF)-L i lamin (za recenzije pogledajte Inagaki et al. 1996., 1997. Omary et al. 1998), snažno sugerirajući da su funkcije IF-a usko uključene u njihovu fosforilaciju. Proveli smo opsežna istraživanja kako bismo odredili fiziološko značenje fosforilacije IF proteina i identificirali kinaze odgovorne za fosforilaciju in vitro (za pregled pogledajte Inagaki et al. 1989.). Sljedeći korak bio je vizualizacija prostorno-vremenske fosforilacije/defosforilacije IF proteina, a za to smo razvili antitijela specifična za mjesto i stanje fosforilacije. Najvažnija prednost ovih antitijela je da mjesto fosforilacije može biti unaprijed dizajnirano kao epitop, imunizacijom životinja sintetskim peptidom koji sadrži fosforilirani aminokiselinski ostatak. (Prvo smo upotrijebili kao antigen sintetski peptid fosforiliran pročišćenim protein kinazama. Sada postoji uspostavljena metoda za sintetizaciju fosfopeptida, bez kinaze.) Ovom metodom, IF studije su napredovale, budući da ova metoda sustavno povezuje biokemijske i stanične biološke analize ( Sl. 1). Ova strategija je primjenjiva na bilo koju analizu proteina koja uključuje fosforilaciju. Detaljno su opisani eksperimentalni postupci na antitijelima specifičnim za mjesto i stanje fosforilacije ( Inada et al. 2000 ).

Strategija za proučavanje dinamike srednjeg filamenta promatranjem događaja povezanih s fosforilacijom.

U sljedećem odjeljku osvrnut ćemo se na primjere u kojima smo analizirali fosforilaciju IF proteina specifičnu za mjesto i identificirali odgovorne in vivo kinaze, korištenjem antitijela specifičnih za mjesto i stanje fosforilacije. Važno je napomenuti da je ova analiza dala informacije o fosforilaciji/defosforilaciji na razini jedne stanice.

Potencijal antitijela specifičnih za mjesto i stanje fosforilacije za praćenje in vivo Aktivnosti IF protein kinaze

Antitijela specifična za mjesto i stanje fosforilacije doista su korisna za in vitro studija i dokazali su svoju vrijednost u in vivo analize. Identificirali smo nekoliko in vitro mjesta fosforilacije IF proteina, uključujući vimentin, GFAP i desmin raznim kinazama kao što su cAMP-ovisna protein kinaza (PKA), PKC, Ca 2+/kalmodulin-ovisna protein kinaza II (CaM-K II), cdc2 kinaza i Rho- kinaza, a razvijen je niz antitijela koja prepoznaju fosforilacijsko stanje odgovarajućih ostataka kako je navedeno u Tablici 1 (za dodatne informacije vidi Inagaki et al. 1996, 1997). Otkrili smo da je nekoliko ostataka fosforilirano jednom kinazom, npr. Ser33 i Ser82 ostaci vimentina su mjesta specifična za PKC i CaM-K II, respektivno. Ova specifična mjesta služe kao odgovarajući supstrat za otkrivanje ciljane aktivnosti kinaze in vivo, pomoću Western blotinga ili imunocitokemije.

Protein stranica kinaza Opis Godina Izvor*
GFAP Ser34 Rho kinaza brazda cijepanja u citokinezi 1990,1991 1,2
Ser8 Cdc2 kinaza rana mitotska faza 1990,1991 3,4,5
Ser7 Rho kinaza brazda cijepanja u citokinezi 1992 5
Ser13 Rho kinaza brazda cijepanja u citokinezi 1992 5
sinapsin I Ser9 PKA stimulacija forskolinom 1991 6
CaM-K II
DARPP-32 Thr34 PKA povećanje razine cAMP ili cGMP izazvano agonistom 1992 7
CREB Ser133 PKA nuklearni ulazak PKA 1993 8
fosfolambana Ser16 PKA β-adrenergička stimulacija 1994 9
Thr17 CaM-K II β-adrenergička stimulacija
kalponin Thr184 PKC in vitro fosforilacija slobodnog kalponina 1994 10
tirozin hidroksilaze Ser40 PKA povećanje razine cAMP-a izazvano agonistom 1995 11
RNA polimeraza II YSPTSPS motivi u domeni izvješća karboksi terminala ? transkripcija na razvojnim i toplinskim šokovima 1993 1994 12 13
erbB-2 Tyr1248 autofosforil. c-erbB-2 aktivacija 1992 14
EGF stimulacija 1992 15
tau Ser396 MAPK upareni spiralni filamenti u Alzheimerovoj bolesti, 1992 16,17,18,19
Ser404 MAPK razvoj mozga fetusa, mozak odrasle osobe dobiven biopsijom 1994
β1-integrin toplazmatski v-Src podosomi RSV-transformiranih stanica 1994 20
inzulinski receptor Ser1327 PKC glavno mjesto nakon stimulacije forbol estera
Thr1348 PKC forbol ester ili stimulacija inzulinom 1994 21
vimentin Ser55 Cdc2 kinaza rana mitotska faza 1994 22
Ser82 CaM-K II Fosforilacija ovisna o Ca 2+ -signalu 1995 23
Ser33 PKC reorganizacija membrane tijekom mitoze 1996 24
Ser50 PKC reorganizacija membrane tijekom mitoze
keratin 18 Ser52 ? S amd G2/M faza 1995 25
glutamatni receptor Ser696 ? AMPA stimulacija u postsinaptičkim gustoćama 1995 26
CaM-K II Thr286 autofosforil. raspoređeni uglavnom u neuronskim somama osim neuropila 1993 27
GAP-43 Ser41 PKC 1994 28
GFAP Ser13 Rho-kinaza javlja se u brazdi cijepanja u citokinezi 1996 29
Ser34 Rho-kinaza javlja se u brazdi cijepanja u citokinezi 1996
tau Ser202 ? 1995 30
Thr205 ? 1995
N-myc S51 ERK potrebno za aktivnost represije transkripcije N-myc 1996 31
Rb Ser780 CyclinD1/CDK4 javlja se u G1 fazi, a RB se ne veže na E2F-1 1996 32
bazični protein mijelina Thr98 ERK uočeno u glavnoj gustoj liniji bijele tvari mozga in vivo 1996 33
tau Ser422 ERK nakupljene u neurofibrilarnim lezijama Alzheimerove bolesti 1996 34
Rb Ser608 CyclinA/CDK2 reguliran staničnim ciklusom i javlja se prije ulaska u S fazu 1997 35
CyclinD1/CDK4
tau Ser199 ERK2 mogu proizvesti mnoge alternativne fosforilacije mjesta 1997 36
Ser202 ERK2 ista konformacija tau.
Thr205 ERK2
Ser235 ERK2
NMDA-R NR1 Ser890 PKC fosforilacija pomoću PKC i PKA utječe na substanične 1997 37
Ser896 PKC lokalizacija NR1 podjedinice.
Ser897 PKA
BtK Y223 autofosforil. serijska fosforilacija Y551 i Y223 može regulirati 1997 38
Y551 Src Brutonova tirozin kinaza (BtK)
p53 Ser15 DNA-PK javlja se kao odgovor na oštećenje DNK 1997 39
Ser37 DNA-PK
p53 Ser33 CAK fosforilacija može biti uključena u popravak DNA 1997 40
histon H3 Ser10 ? događa na način specifičan za mitozu 1997 41
ERK Thr202 ? Kinaza mješovite loze 2 (MLK2) neizravno aktivira ERK 1998 42
Tyr204 ?
JNK/SAPK Thr183 MKK7 MLK2 kinaza neizravno aktivira JNK/SAPK zajedno 1998 42
Tyr185 MKK7 mikrotubule
c-lip Ser63 ? reguliran neidentificiranim mehanizmima u neuronima malog mozga 1998 43
c-Src Tyr416 autofosforil. Src i FAK moduliraju Ca 2+ signalizaciju u stanicama glatkih mišića 1998 44
vimentin Ser71 Rho-kinaza uočeno na brazdi cijepanja tijekom citokineze 1998 45
S6 kinaza Thr252 ? Aktivnost S6 kinaze in vivo je najbliži Thr412 1998 46
Ser394 ? stanje fosforilacije
Thr412 ?
adducin PKC uočeno u dendritskim bodljama 1998 47
PAK2 Thr402 autofosforil. aktivnost kinaze regulirana je fosforilacijom 1998 48
aplizija elF4E Ser207 PKC 1998 49
tau Ser262 CaM-K II uključeni u regulaciju vezanja tau/mikrotubula 1998 50
moesin Thr558 Rho-kinaza važno za strukture nalik mikroresicama 1998 51
p53 Ser389 ? javlja se posebno uz UV zračenje 1998 52
miozin svijetli chian Ser19 MLCK inducira aktivaciju miozin ATPaze 1998 53
XCAP-D2 Thr1314 Cdc2 kinaza fosforilacija može potaknuti mitotički kromosom 1998 54
Thr1348 kondenzacija
Thr1353
BtK Tyr551 Src BtK signalizacija se događa u području Ig receptora 1999 55
Tyr223 autofosforil. signalni kompleks
p53 Ser37 ATR kinaza javljaju se u stanicama oštećenim DNK 1999 56
Ser15 ATM/ATR kinaza važno za stabilizaciju p53 nakon oštećenja DNK 1999 57
Ser20 ? javlja se u roku od nekoliko minuta od oštećenja DNK 1999 58
Ser15 DNA-PK nije bitno za aktivaciju zaustavljanja p53 i G1 nakon ionizirajućeg zračenja 1999 59
Ser389 p38MAPK Događaj koji reagira na UV zrake 1999 60
Rb Ser601 ? fosforiliran kao odgovor na retinoičnu kiselinu 1999 61
Ser605 ? fosforilirani u kontrolnim stanicama i stanicama tretiranim retinojskom kiselinom
Ser773 ? fosforiliran kao odgovor na retinojsku kiselinu
EGF receptor Tyr1173 ? mogu biti uključeni u smanjenje proliferacije hepatocita povezano sa dobi 1999 62
Cdk inhibitor p27 Thr187 CDks djeluju kao signal za ubikvitinaciju p27 1999 63
Stat3 Ser727 ? javlja se putem ERK-ovisnih i -neovisnih puteva 1999 64
NF-L Ser473 Kazein kinaza II obiluju u neuronskoj perikariji moždane kore 1999 65
tau Ser214 PKA uočeno u moždanim tkivima Alzheimerove bolesti 1999 66
Ser409 PKA
kaldesmon Ser759 ERK glavno mjesto za ERK u karotidnim arterijama i može imati ulogu u 1999 67
Ser789 ERK dijeljenje stanica
PKCα Thr250 autofosforil. 1999 68
GFAP Thr7 ? javlja se u brazdi cijepanja u citokinezi 1999 69
histon H3 Ser28 javlja se u kromosomima tijekom rane mitoze 1999 69
desmin Thr16 Rho-kinaza javlja se u brazdi cijepanja u citokinezi 70
Thr75 Rho-kinaza
Thr76 Rho-kinaza
glutamatni receptor 1 Ser845 PKA Stimulacija receptora D1-dopamina potiče fosforilaciju 1999 71
ciljna podjedinica miozin fosfataze 1 Thr695 Rho-kinaza inhibitorno mjesto fosforilacije na molekuli 1999 72
miozin vezujuća podjedinica miozin fosfataze Ser854 Rho-kinaza javlja se kao odgovor na TPA- ili HGF-stimulaciju 1999 73
FKHRL1 Thr32 Akt/PKB IGF-1 inducira fosforilaciju pomoću Akt 1999 74
Ser253
Raf Ser338 ? fosforilacija je inhibirana Akt signalizacijom 1999 75
Raf Ser259 Akt/PKB IGF-1 inducira fosforilaciju i rezultira inaktivacijom Raf-a 1999 76
adducin Thr445 Rho-kinaza fosforilacija inhibira vezanje aducina na F-aktin 1999 77
nuklearni protein ANO39 Ser145 Cdc2 kinaza 2000 78
NF-L Ser55 PKA moduliran fosfatazom osjetljivom na okadaičnu kiselinu 2000 79
akvaporin-2 Ser256 PKA(?) nastaje nakon stimulacije arginin vazopresinom 2000 80
CDc25C Ser216 Chk2/Cds1 kofein ukida G2/M kontrolnu točku inhibicijom 2000 81
Chk2/Cds1 Ser68 ATM kinaza ATM kinaza
Transkripcijski faktor SOX9 Ser211 PKA pojačavaju transkripcijsku i DNA-vezujuću aktivnost SOX9 2000 82
FAK Tyr397 autofosforil. inhibirano Src aktivacijom 2000 83
KARTA2 Thr1620 GSK-3 fosforilacija može modificirati stabilnost mikrotubula 2000 84
Thr1623
CPI-17 Thr38 Rho-kinaza fosforilacija je povećala aktivnost CPI-17 2000 85
CPI-17 Thr38 PKN fosforilacija je povećala aktivnost CPI-17 2000 86
p53 Ser392 ? javlja se kao odgovor na UV zračenje i inducira funkciju vezanja DNA p53 2000 87
Ser20 Chk1/Cds1 Chk1 i Cds1 mogu igrati ulogu u regulaciji p53 nakon oštećenja DNK 2000 88
Ser15 ATM kinaza ionizirajuće zračenje pojačava aktivnost ATM kinaze koja fosforilira p53 na Ser15 2000 89
Thr55 ? prvo izvješće o Thr fosforilaciji p53 2000 90
Ser315 ? javlja se kao odgovor na oštećenje zračenja 2000 91
Ser46 ? nastaje nakon ozbiljnog oštećenja DNK kojim se inducira apoptoza 2000 92
myc Thr58 ? kritičan za određivanje stabilnosti Myc 2000 93
Ser62 ? kritičan za određivanje stabilnosti Myc
PAK Thr423 autofosforil. aktivira se autofosforilacijom 2000 94
PAK Thr423 PDK1 neovisno o aktivnosti PI3-kinaze 2000 95
Waf1/Cip p21 Ser146 ? fosforilacija modulira interakciju p21-PCNA in vivo 2000 96
tau Thr212 ? dvostruko fosforilirani tau se nakuplja u Alzheimerovoj bolesti 2000 97
Ser214 ? i druge neurodegenerativne bolesti
GSK-3β Ser9 Akt/PKB inducira inhibiciju aktivnosti GSK-3β 2000 98
CRMP-2 Thr555 Rho-kinaza izaziva kolaps češera rasta 2000 99
MARCKS Ser159 Rho-kinaza stimulacija lizofosfatidnom kiselinom povećala je fosforilaciju 2001 100
  • * Izvori: 1. Stanična struktura. Func.15, 497 (1990) 2. J. Biol. Chem.266, 3074 (1991) 3. Stanična struktura. Func.15, 497 (1990) 4. Biochem. Biophys. Rez. komun.175, 1144 (1991) 5. EMBO J.11, 2895 (1992) 6. Meth. Enzymol.201, 264 (1991) 7. J. Neurosci.12, 3071 (1992) 8. Mol. stanica. Biol.13, 4852 (1993) 9. J. Biol. Chem.269, 25073 (1994) 10. Biochem. Biophys. Rez. komun.203, 1502 (1994) 11. J. Neurochem.64, 2281 (1995) 12. Genes Dev.7, 2329 (1993) 13. Priroda370, 75 (1994) 14. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD89, 10435 (1992) 15. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD89, 11637 (1992) 16. Cancer Res.55, 1946 (1995) 17. Biochem. Biophys. Rez. komun.187, 783 (1992) 18. J. Biol. Chem.267, 564 (1992) 19. J. Neurosci. Rez.39, 669 (1994) 20. J. Cell Biol.126, 1299 (1994) 21. Biochem. J.303, 893 (1994) 22. J. Biol. Chem.269, 31097 (1994) 23. J. Cell Biol.131, 1055 (1995) 24. J. Cell Biol.133, 141 (1996) 25. J. Cell Biol.131, 1291 (1995) 26. Neurone 15, 697 (1995) 27. Mol. Biol. stanica4, 159 (1993) 28. J. Neurochem.62, 291 (1994) 29. J. Cell Biol.132, 635 (1996) 30. Neurosci Lett.189, 167 (1995) 31. Biochem. Biophys. Rez. komun.219, 813 (1996) 32. EMBO J.15, 8060 (1996) 33. J Neuroimmunol.65, 55 (1996) 34. FEBS Lett.384, 25 (1996) 35. Onkogen14, 249 (1997) 36. J. Biol. Chem.272, 4509 (1997) 37. J. Biol. Chem.272, 5157 (1997) 38. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD94, 11526 (1997) 38. stanica91, 325 (1997) 39. Mol. Cell Biol.17, 7220 (1997) 40. Kromosom.106, 348 (1997) 42. EMBO J.17, 149 (1998) 43. J. Neurosci.18, 751 (1998) 44. J. Biol. Chem.273, 5337 (1998) 45. J. Biol. Chem.273, 11728 (1998) 46. J. Biol. Chem.273, 16621 (1998) 47. J. Cell Biol.142, 485 (1998) 48. Biochem. J.334, 121 (1998) 49. J. Biol. Chem.273, 29469 (1998) 50. FEBS Lett.436, 471 (1998) 51. J. Biol. Chem.273, 34663 (1998) 52. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD95, 6399 (1998) 53. J. Cell Biol. 140 119 (1998) 54. Znanost282, 487 (1998) 55. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD66, 2221 (1999) 56. Genes Dev. 13 152 (1999) 57. Mol. stanica. Biol.19, 2828 (1999) 58. EMBO J.18, 1815 (1999) 59. J. Biol. Chem.274, 17139 (1999) 60. Biochem. Biophys. Rez. komun.261, 464 (1999) 61. Brain Res.842, 342 (1999) 62. J. Biol. Chem.274, 11424 (1999) 63. Genes Dev.13, 1181 (1999) 64. Biochem. J.341, 691 (1999) 65. FEBS Lett.455, 83 (1999) 66. J. Neurosci.19,7486 (1999) 67. J. Biol. Chem.274, 30115 (1999) 68. Znanost283, 2085 (1999) 69. J. Biol. Chem.274, 25543 (1999) 70. J. Biol. Chem.274, 34932 (1999) 71. J. Neurochem.73, 2441 (1999) 72. J. Biol. Chem.274, 37385 (1999) 73. J. Cell. Biol.147, 1023 (1999) 74. stanica96, 857 (1999) 75. Znanost286, 1738 (1999) 76. Znanost286, 1741 (1999) 77. J. Cell Biol.145, 347 (1999) 78. Eur. J. Biochem.267, 295 (2000) 79. J. Neurochem.74, 949 (2000) 80. Am. J. Physiol. Bubrežni. Physiol.278, 388 (2000) 81. J. Biol. Chem.275, 10342 (2000) 82. Mol. Cell Biol.20, 4149 (2000) 83. J. Biol. Chem.275, 23333 (2000) 84. Eur. J. Cell Biol.79, 252 (2000) 85. FEBS Lett.475, 197 (2000) 86. Biochem. Biophys. Rez. komun.274, 825 (2000) 87. Onkogen19, 385 (2000) 88. Genes Dev.14, 289 (2000) 89. Onkogen19, 1386 (2000) 90. Biokemija39, 9837 (2000) 91. J. Biol. Chem. 14 (2000) 92. stanica102, 849 (2000) 93. Genes Dev.14, 2501 (2000) 94. J. Cell Biol.151, 1449 (2000) 95. J. Biol. Chem.275, 41201 (2000) 96. J. Biol. Chem.275, 11529 (2000) 97. Citoskelet pokretnih stanica47, 236 (2000) 98, J. Biol. Chem.275, 32475 (2000) 99. J. Biol. Chem.275, 23973 (2000) 100. Biochem. Biophys. Rez. komun.280, 605 (2001).

Razvili smo monoklonsko antitijelo koje specifično prepoznaje fosforilaciju vimentina izazvanu CaM-K II. U kombinaciji s antitijelom koje prepoznaje PKC-inducirano mjesto specifične fosforilacije vimentina, pokazalo se da je aktivnost CaM-K II prostorno regulirana, budući da je istovremena stimulacija endogenog PKC i CaM-K II hidrolizom fosfoinozitida posredovanom receptorom dovela do ekskluzivnog vimenta -fosforilacija CaM-K II, ali ne i PKC (Ogawara et al. 1995.). Dakle, PKC i CaM-K II, od kojih su oba aktivirana preko zajedničkih receptora, regulirani su odvojeno, u fiziološkim uvjetima, možda zbog različitog substanijskog ciljanja ovih kinaza. U vezi s tim, primjetno je da je signalizacija Ca 2+ posredovana receptorima u lokaliziranom području astrocita inducirala CaM-K II ovisnu fosforilaciju vimentina u istom ograničenom području, ali ne i u drugim dijelovima stanice, dok je stimulacija receptora dovoljna da izazove Ca 2+ valove inducira CaM-K II ovisnu fosforilaciju vimentina u cijelom staničnom tijelu (Slika 2) ( Inagaki et al. 1997.). Tipičan primjer primjene antitijela specifičnih za mjesto i stanje fosforilacije za aktivaciju prostorne kinaze je CaM-K II.

Lokalna i globalna signalizacija CaM kinaze II definirana područjem Ca 2+ signala. (A) Lokalna Ca 2+ signalizacija izaziva lokaliziranu signalizaciju CaM kinaze II. a-c, [Ca 2+ ]i u astrocitu prije (a), i na 30 s (b) i 4 min (c) nakon lokalne primjene 10 µm PGF2α tijekom 15 s. Strelica u (a) označava mjesto primjene PGF2α. Strelice u (b) označavaju proces koji je pokazao Ca 2+ signalizaciju. (d) Fosforilacija vimentina na Ser82 pomoću CaM kinaze II u istom astrocitu u (a-c). Fotografija se povećava kako bi se prikazalo područje označeno pravokutnikom u (b). Stanica je fiksirana 5 minuta nakon mjerenja [Ca 2+ ]i u (c) i imuno obojena MO82. Strelice označavaju proces koji je uključivao signalizaciju CaM kinaze II. Bar = 20 µm (B) Ca 2+ val izaziva globalnu signalizaciju CaM kinaze II. a–c, [Ca 2+ ]i u astrocitu prije (a), i na 30 s (b) i 90 s (c) nakon lokalne primjene 10 µm PGF2α tijekom 15 s. Strelica u (a) označava mjesto primjene PGF2α. d, fosforilacija vimentina na Ser82 pomoću CaM kinaze II u istom astrocitu u (a-c). Stanica je fiksirana 5 minuta nakon mjerenja [Ca 2+ ]i u (c). Bar = 20 µm. Izmijenjeno uz dopuštenje Inagaki N. et al. (1997) .

Drugi primjer uspješnog praćenja stanja aktivacije prostorno-vremenske kinaze je Rho-kinaza. Razvili smo antitijela koja prepoznaju fosforilirane Ser7, Ser13 i Ser38 ostatke GFAP-a (Nishizawa et al. 1991. Matsuoka et al. 1992. Sekimata et al. 1996) i otkrio an in vivo aktivnost kinaze koja fosforilira GFAP u brazdi cijepanja tijekom citokineze (slika 3A). Aktivnost kinaze nazvana "kinaza brazde cijepanja (CF kinaza)" dugo je bila neidentificirana, ali se smatralo da je sveprisutna kinaza. Mnoga opažanja su ukazala na ulogu male GTPaze, Rho, u citokinezi induciranjem i održavanjem kontraktilnog prstena (za pregled vidi Kaibuchi et al. 1999 Bishop & Hall 2000), a Rho-kinaza, jedna Rho meta, pronađeno je da fosforilira GFAP na istim mjestima (Thr7, Ser13 i Ser38) kao CF kinaza in vitro ( Kosako et al. 1997.). The in vitro Također se pokazalo da su fosforilirana mjesta fosforilacije Rho-kinaze na drugim IF proteinima, vimentinu (Ser38 i Ser71) i desminu (Thr16, Thr75 i Thr76). in vivo at the cleavage furrow where Rho and Rho-kinase accumulate during cytokinesis ( Goto et al. 1998 Inada et al. 1999 ). We propose that Rho-kinase is activated in a spatiotemporal manner and facilitates efficient type III-IF segregation as a CF kinase during cytokinesis.

Site-specific phosphorylation of GFAP during mitosis and bridge-like structures of GFAP with mutations in CF kinase phosphorylation sites. (A) Metaphase or anaphase U251 cells stained with the antibody MO389 (anti-GFAP), YC10 (anti-phosphoSer8 on GFAP), TMG7 (anti-phosphoThr7 on GFAP), KT13 (anti-phosphoSer13 on GFAP), or KT34 (anti-phosphoSer38 on GFAP green). DNAs are stained with propidium iodide (red). Modified with permission from Matsuzawa et al. (1998) . (B) GFAP bridge-like structures in T24 cells expressing a mutant GFAP (Thr7, Ser13 and Ser38 are changed into Ala). Green and red colours represent GFAP stained with MO389 and propidium iodide, respectively. Bar = 10 µ m . Modified with the permission from Yasui et al. (1998) .

We then constructed a series of mutant GFAPs, where Rho kinase (CF kinase) phosphorylation sites were variously mutated, and expressed them in type III IF-negative cells. The mutations thus induced impaired the segregation of glial filaments into postmitotic daughter cells. As a result, an unusually long bridge-like cytoplasmic structure formed between the unseparated daughter cells. An alteration of other sites, including the cdc2 kinase-phosphorylation site, led to no remarkable defect in glial filament separation (Fig. 3B)( Yasui et al. 1998 ). We also demonstrated that site-specific mutations of vimentin at CF kinase (Rho kinase and Ser72-kinase) and PKC induced the formation of an IF bridge between the unseparated daughter cells ( Yasui et al. 2001 ). These findings are direct evidence that the phosphorylation of IF proteins is essential for filament segregation during mitosis.

Application of site- and phosphorylation state-specific antibodies for signal transduction and transcription studies

Some kinases, such as PKC, cdc2 kinase, mitogen-activated protein kinases (MAP kinases) and p21-activated kinase (PAK), are activated by phosphorylation at specific amino acid residues. Since site-specific phosphorylation of these kinases reflects their catalytically activated states, site- and phosphorylation state-specific antibodies against these sites may be useful for detecting active kinases. Spatiotemporal activation of PKCα in living cells was successfully imaged, using a site-specific antibody to phosphorylated Thr250, in combination with fluorescence resonance energy transfer (FRET) ( Ng et al. 1999 ). The temporal and spatial distribution of activated PAK1 following platelet-derived growth factor (PDGF) stimulation or during wound closure, was also monitored using a specific antibody against phosphorylated Thr423 ( Sells et al. 2000 ). During closure of a fibroblast monolayer wound, PAK1 was rapidly activated and was localized at the leading edge of motile cells, then gradually tapered off with wound closure.

The protein-tyrosine kinase group, first recognized among retroviral oncoproteins, includes a large number of enzymes that specifically phosphorylate Tyr residues, and are widely recognized for their roles in transducing growth and differentiation signals. Site- and phosphorylation state-specific antibodies have been developed and used for functional analyses of tyrosine kinases. In differentiated smooth muscle cells, an anti-phospho Src antibody revealed that the autophosphorylated active c-Src (P416Y) level dramatically increased following PDGF receptor stimulation. The phosphorylation is thought to be important for the association of focal adhesion kinase (FAK) and c-Src, and may modulate basal Ca 2+ channel activity and the l -type Ca 2+ current ( Hu et al. 1998 ). FAK, a nonreceptor protein tyrosine-kinase, plays a key role at cellular adhesion sites. With an antibody against autophosphorylation at Tyr397 of FAK, the possible importance of integrin and Src in FAK signalling was proposed ( McLean et al. 2000 ). As for the epidermis growth factor (EGF) receptor, an antibody against phospho-Tyr1173, which interacts with an adaptor protein Shc, was produced ( Palmer et al. 1999 ). Analyses made using this antibody demonstrated that age-dependent decreases in the ability of the EGF receptor to associate with Shc are due to differences in the Tyr-phosphorylation state of the receptor.

On the other hand, MAP kinases such as extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun-N terminal kinase (JNK)/stress-activated protein kinase (SAPK) and p38 are activated by dual phosphorylation at Thr and Tyr residues. Using synthetic diphosphopeptides as antigens, specific antibodies recognizing active dual phosphorylated MAP kinases were developed. These antibodies led to evidence that ERK translocates to the nucleus upon stimulation and is activated there ( Yung et al. 1997 ), while activated JNK/SAPK was observed along with microtubules as well as in the nucleus ( Nagata et al. 1998 ). Various kinds of anti-dualphospho-MAP kinase antibodies are commercially available and are in wide use in various researches.

A research field where site- and phosphorylation state-specific antibodies have exhibited notable power, is p53 signalling. In response to various stresses to the cell, for example DNA damage, transcription factor p53 is activated and induces cell cycle arrest and apoptosis ( Giaccia & Kastan 1998 ). Although p53 contains multiple phosphorylation sites in its N- and C-termini, the physiological significance of the phosphorylation remained largely unknown. Various Ser and Thr residues, including Ser15, Ser20, Ser33, Ser37, Ser46, Thr55, Ser315, Ser376, Ser378, Ser389 and Ser392, were found to be phosphorylated (Table 1). Phosphorylation of Ser15 and Ser20 by ataxia-telangiectasia mutated (ATM) kinase or the related kinase ATR (ATM and Rad3-related) kinase inhibits degradation of p53 through dissociation from MDM2 ( Shieh et al. 1997 Unger et al. 1999 Chehab et al. 2000 ). Ser33 was found to be phosphorylated by CDK-activating kinase (CAK) in the presence of p36 in vitro (Ko et al. 1997), while Ser37 was reported to be phosphorylated in vivo when DNA damage occurred ( Shieh et al. 1997 ). The physiological significance of these phosphorylations remains to be clarified. Ser315 of p53 is phosphorylated by CyclinB/Cdc2 or CyclinA/CDK2 in vitro, and this phosphorylation enhanced binding to the p53-responsive element ( Wang & Prives 1995 ). Ser376 and Ser378 are phosphorylated under normal conditions, and Ser376 is selectively dephosphorylated in case of DNA damage ( Waterman et al. 1998 ), 14-3-3 can bind to this region and DNA-binding ability of p53 is increased through conformational changes. It was also reported that Ser46 is phosphorylated an event noted upon DNA damage severe enough to induce apoptosis ( Oda et al. 2000 ). All these data clearly demonstrate that site- and phosphorylation state-specific antibodies contribute greatly to cancer research.

The antibody is also used in studies on medical research into Alzheimer's disease and diabetes mellitus. tau is a microtubule-binding protein which is mainly distributed in neuronal axons, and its microtubule-assembling activity is regulated by phosphorylation. To date, 9 Ser/Thr residues have been reported to be phosphorylated, determined using respective site- and phosphorylation state-specific antibodies (Table 1). It is notable that phosphorylation at Ser214 and Ser409 was seen to be increased in brain tissues from Alzheimer's patients ( Jicha et al. 1999 ). Moreover, dual phosphorylation at Thr212 and Ser214 occurs in brain tissues from Alzheimer's patients and also in other neurodegenerative diseases ( Ksiezak-Reding et al. 2000 ). Site- and phosphorylation state-specific antibodies were also used for studies on noninsulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM). Antibodies against phospho-Ser1327 and -Thr1348 of insulin receptor were developed, and Ser1327 was seen to be phosphorylated by phorbol ester, while Ser1348 was phosphorylated upon phorbol ester and insulin stimulation ( Coghlan et al. 1994.). These antibodies were also used for medical research on NIDDM ( Kellerer et al. 1995 ). Will phospho-specific antibodies become pertinent tools for elucidating the molecular basis of Alzheimer's disease, NIDDM and other diseases?

In addition to the examples described here, numerous antibodies recognizing the phosphorylation of a specific site(s) (see Table 1) are widely used in various researches.


Materijali i metode

Priprema uzorka

HEK cells were transfected with FLAG-GIT1 (4 μg per 100 mm dish) using lipofectamine. After 48 hours, cells were incubated with 1 mM peroxovanadate for 30 minutes and extracted with 25 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, pH 7.4. In some experiments, cells were incubated with 1 mM peroxovanadate and 5 nM calyculin A for 30 minutes, and then extracted. The lysates were precleared twice with mouse IgG-agarose for 1 hour at 4°C and immunoprecipiatated with FLAG-agarose (Sigma) for 2 hours at 4°C. Samples were washed twice with 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4 and FLAG-tagged GIT1 was eluted by incubating the beads with 0.2 mg/ml FLAG peptide in 25 mM Tris for 30 minutes at 4°C.

Sample analysis

Eluted samples were reduced and alkylated with dithiothreitol and iodoacetamide, respectively, as described by Schroeder et al. (Schroeder et al., 2004). Immunopurified amounts of GIT1 were estimated by visualization of the corresponding silver-stain band separated by SDS-PAGE. An aliquot of the immunopurified sample corresponding to an easily visible silver-stained band was digested with the desired enzyme (approximate ratio enzyme to substrate was 1:20) in 100 mM ammonium bicarbonate, pH 8.5 for 8-12 hours at room temperature. Generally, peptides from an aliquot that corresponded to 1-5% of the original immunoprecipitated sample were separated by reverse-phase chromatography using a 1-hour or 2-hour gradient as described by Schroeder et al. (Schroeder et al., 2004). Analysis of FLAG-eluted samples was with an LCQ XP or LTQ-FT (ThermoElectron, San Jose, CA) under conventional MS/MS mode according to Schroeder et al. (Schroeder et al., 2004). Reduction and alkylation steps were omitted for on-beads digestion (treatment with 100-500 ng of trypsin for 6 hours at room temperature (Schroeder et al., 2004) and analysis of the resulting peptides on an LTQ-FTMS). Enrichment of phosphopeptides was performed by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) according to Ficarro et al. (Ficarro et al., 2002) by using 10-20× more sample. Phosphopeptides were eluted with 250 mM ascorbic acid.


Sažetak

Reversible modification of proteins by phosphorylation of serine, threonine and tyrosine residues is the most common post-translational modification, which is estimated to occur in 30-90% of the cellular expressed protein component at any one time. Phosphorylation can alter proteins' subcellular distribution, enzymatic activity and specificity. Altered protein phosphorylation may correlate with disease states such as cellular transformation. The analysis of phosphorylated proteins is therefore of vital importance to the field of biology and in particular signal transduction. Protein phosphorylation sites are increasingly investigated using mass spectrometric methods, exploiting the inherent accuracy and sensitivity of these methods. However, the presence of unphosphorylated peptides in enzymatic digests of proteins causes ion suppression of phosphopeptides, reducing the effective sensitivity of detection this sensitivity is further decreased by the relative lability of the phosphate moiety in the mass spectrometer and the occurrence of sub-stoichiometric modification, which together further reduce the achievable sensitivity. This study has examined techniques for the analysis of protein phosphorylation sites, with particular emphasis upon mass spectrometry. The technique of immobilised metal ion affinity chromatography (IMAC) was investigated in detail as a method suited to phosphorylation site analysis. IMAC exploits the relatively specific affinity of phosphorylated peptides for metal ions, particularly Fe(III), to isolate phosphopeptides upon a solid-phase affinity matrix, separating the suppressing non- phosphorylated component and allowing improved detection of phosphorylated peptides. Conditions for the application of IMAC to phosphopeptide segregation have been established and applied. Using IMAC, protein phosphorylation site identification of both standards and signal transduction mediators has been carried out. Apparent sequence-specific binding of phosphorylated and non-phosphorylated peptides to IMAC resins has been found and investigated. IMAC methodology has been further improved to optimise phosphopeptide analysis using mass spectrometry. The developed methods have clear utility for phosphorylation site analysis, which is vital to the understanding of signal transduction.


Pripadnosti

Bioinformatics, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, Padualaan, 3584 CH, The Netherlands

Jos Boekhorst & Berend Snel

Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group, Bijvoet Center for Biomolecular Research and Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University, Sorbonnelaan, 3584, CA Utrecht, The Netherlands

Bas van Breukelen & Albert JR Heck

Academic Biomedical Centre, Utrecht University, Yalelaan, 3584, CL Utrecht, The Netherlands


Gledaj video: Préparation 30 gr Whey Pure Protein. HN Nutrition (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Conradin

    Trenutno ne mogu sudjelovati u raspravi - nema slobodnog vremena. Ali vratit ću se - definitivno ću napisati ono što mislim o ovom pitanju.

  2. Lavy

    samo što učiniti u ovom slučaju?

  3. Nekree

    I don't know what to say

  4. Biaiardo

    Stvarnosti suvremenog tržišta su takve da nas, potrošače, nerijetko varaju beskrupulozni dobavljači roba i usluga. Stručnjaci, prodajni savjetnici, čije ćete savjete pronaći u člancima ove web stranice, pomoći će da se to izbjegne.

  5. Reave

    Isto, beskonačno



Napišite poruku