Informacija

Kako RNK nosača povećavaju prinos u pokusima sekvenciranja?

Kako RNK nosača povećavaju prinos u pokusima sekvenciranja?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Želio bih znati kako RNA nosača povećavaju prinos u eksperimentima sekvenciranja RNA/DNA. Je li njihova glavna funkcija u koracima precipitacije svakog protokola (tj. male količine je teško precipitirati, a RNA nosača dodaju materijal), ili imaju ulogu i u drugim fazama procesa?


Ako dodajete tRNA ekstrahiranu fenol-kloroformom, onda je to nosač za korake precipitacije. Neki ljudi koriste linearni akrilamid u istu svrhu.


Smjernice za eksperimente korištenjem antisense oligonukleotida i dvolančanih RNA

Odjel za biokemiju i molekularnu biologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Southern Illinois, Carbondale, Illinois.

Odjel za kemiju i biokemiju, Sveučilište Southern Illinois, Carbondale, Illinois.

Adresa za dopisivanje: David R. Corey, dr., Odjel za farmakologiju i biokemiju, UT Southwestern Medical Center u Dallasu, 6001 Forest Park, Dallas, TX 75390

Odjeli za farmakologiju i biokemiju, UT Southwestern Medical Center u Dallasu, Dallas, Texas.


Sažetak

Složene strukture RNA višeg reda igraju kritičnu ulogu u svim aspektima ekspresije gena, međutim, mreže interakcija kroz svemir koje definiraju tercijarne strukture i upravljaju uzorkovanjem višestrukih konformacija slabo su razumljene. Ovdje opisujemo analizu strukture RNA jedne molekule u kojoj se višestruka mjesta kemijske modifikacije identificiraju u pojedinačnim lancima RNA masivno paralelnim sekvenciranjem, a zatim analiziraju na korelirane i klasterirane interakcije. Strategija tako identificira RNA interakcijske skupine mutacijskim profiliranjem (RING-MaP) i omogućuje dvije ekspanzivne primjene. Prvo, identificiramo interakcije kroz svemir, stvaramo 3D modele za RNA koje obuhvaćaju 80-265 nukleotida i karakteriziramo široke klase intramolekularnih interakcija koje stabiliziraju RNA. Drugo, razlikujemo različite konformacije u ansamblima otopina i otkrivamo prethodno neotkrivena skrivena stanja i velike strukturne rekonfiguracije koje se javljaju u nesavijenim RNA u odnosu na nativna stanja. Ispitivanje strukture jedne molekule nukleinske kiseline RING-MaP omogućuje konciznu i laku analizu globalne arhitekture i višestrukih konformacija koje upravljaju funkcijom u RNA.

RNA ima središnju ulogu u ekspresiji i regulaciji gena. Ove funkcije posredovane su razinama informacija: Najjednostavniji je primarni slijed, a najsloženiji je struktura višeg reda koja upravlja interakcijama s ligandima, proteinima i drugim RNA (1, 2). Mnoge RNA mogu formirati više od jedne stabilne strukture, a te različite konformacije često imaju različite biološke aktivnosti (3, 4). Trenutno, stopa opisivanja novih RNA sekvenci uvelike premašuje sposobnost ispitivanja njihovih struktura.

Ovdje karakteriziramo interakcije kroz svemir i višestruke konformacije u pojedinačnim RNA spajanjem kemijskog sondiranja i masovno paralelnog sekvenciranja. Budući da masovno paralelno sekvenciranje izvještava o sekvencama pojedinačnih predložaka, svako očitanje u osnovi je promatranje jedne molekule (5). Prvo smo modificirali RNA s reagensom koji je osjetljiv na temeljnu strukturu RNA, a zatim smo otkrili više adukata u pojedinačnim lancima RNA (slika 1). Kemijski adukti otkriveni su kao mutacije sekvence na temelju njihove sposobnosti da induciraju učinkovito pogrešno čitanje šablonskog nukleotida enzimom reverzne transkriptaze, pristupom koji se naziva mutacijsko profiliranje ili MaP (6). Podaci o ispitivanju jedne molekule korišteni su na dva različita načina: za otkrivanje koreliranih RNA modifikacija koje odražavaju interakcije višeg reda kroz svemir (slika 1.A) i ispitati višestruke konformacije u pojedinačnim ansamblima u otopini (slika 1B).

Analiza strukture jedne molekule RNA masovno paralelnim sekvenciranjem. (A) Molekule RNA doživljavaju lokalne strukturne varijacije i “disanje” u kojem nukleotidi postaju reaktivni na kemijsku sondu na korelirani način. Statistička analiza asocijacija koristi se za otkrivanje i kvantificiranje snaga ovih međuovisnosti. (B) Molekule RNA mogu usvojiti više konformacija u otopini. Analiza spektralnog klasteriranja, temeljena na sličnosti obrazaca reaktivnosti nukleotida, može se koristiti za razdvajanje podataka o pojedinačnim RNA lancima u različite konformacije.


STRATEŠKO PLANIRANJE

Kada se pristupi sintezi i pročišćavanju nove RNA od interesa za NMR spektroskopsku analizu, potrebno je donijeti nekoliko važnih odluka u vezi s dizajnom konstrukta, označavanjem, strategijom pročišćavanja i sastavom pufera. U ovom odjeljku ćemo se pozabaviti različitim strateškim opcijama i dati mali vodič o tome kako planirati svoju sintezu RNA na temelju vaših specifičnih zahtjeva.

Radni uvjeti bez RNase

Za razliku od drugih biomolekula, rad s RNA predstavlja svoje izazove kada je u pitanju rukovanje uzorcima. Kako bi se zaštitili od RNA virusa, ljudi su razvili mnoštvo RNaza, enzima koji razgrađuju RNA koji se eksprimiraju na koži i dlačicama. Stoga se moraju poduzeti dodatne mjere opreza kako bi se izbjegla kontaminacija RNase koja bi kasnije dovela do oštećenja ili degradacije uzorka RNA proizvedenog u laboratoriju. Te se mjere odnose na osobno ponašanje u laboratoriju, kao i na kemikalije, otopine i laboratorijski pribor koji se koriste tijekom rukovanja RNA.

Ono što je najvažnije, uvijek nosite rukavice kako biste pažljivo izbjegli dovođenje vaše kože u izravan ili neizravan kontakt s uzorkom RNA. Koristite potrošni materijal i kemikalije za koje je proizvođač potvrdio da ne sadrže RNase što je više moguće. Ako nijedna opcija bez RNase nije komercijalno dostupna, može se poduzeti nekoliko drugih zaštitnih mjera kako bi se izbjegla kontaminacija RNase. Za tekućine se mogu filtrirati otopine prije upotrebe s graničnim vrijednostima od 1 do 2 kDa ili dodati inhibitor ribonukleaze (npr. RNasin® by Promega) izravno u reakcijsku smjesu. Instrumenti ili laboratorijsko posuđe mogu se tretirati otopinom dietil dikarbonata (DEPC), a stakleno posuđe otporno na toplinu također se može zagrijavati na 200°C tijekom 2 sata.

Dizajn konstrukcije

Budući da in vitro transkripcija prvenstveno koristi T7 RNA polimerazu (T7 RNAP) za sintezu RNA, potrebno je razmotriti dva ključna aspekta za dizajn konstrukta. Prvo, s pretežno korištenim (klasa III) T7 promotorskim slijedom, polimeraza zahtijeva najmanje dva gvanozinska ostatka kao početna nukleotida kako bi se transkribirala s odgovarajućom učinkovitošću, a prinosi su dramatično smanjeni u prisutnosti drugih početnih nukleotida.

Kao što je ilustrirano na slici 1, može se koristiti ili linearizirani DNA plazmid (Protokol podrške 1) ili proizvod lančane reakcije polimeraze (PCR) (Protokol podrške 2) kao DNK šablon za in vitro transkripciju.

Ako je kaseta za transkripciju RNA kodirana plazmidom, ona bi trebala uključivati ​​prikladno restrikcijsko mjesto na 3′ kraju kako bi se proizveli transkripci koji se odvode kada se linearizirani plazmid transkribira. Budući da priprema DNA plazmida zahtijeva kloniranje, amplifikaciju u bakterijskim stanicama, pročišćavanje plazmida i linearizaciju, to je prilično dugotrajno, dok je PCR znatno brža opcija. Ipak, ponekad doživljavamo veću učinkovitost transkripcije kada koristimo plazmidnu DNA preko PCR amplificiranih šablona, ​​što se može pripisati sposobnosti polimeraza da vežu DNA uzvodno od T7 promotora i zatim klize duž lanca dok ne dosegne sekvencu promotora. U slučaju PCR proizvoda ovo sekvencijalno skeniranje T7 RNAP-a nije moguće, pa samo izravniji susreti s T7 promotorom dovode do transkripcije.

Označavanje izotopa

Strategija označavanja RNA uvelike ovisi o cilju studije. Za početnu procjenu sekundarnih struktura putem imino protonskog uzorka ili dodjeljivanja malih RNA na temelju NOESY, često je već dovoljan neobilježeni uzorak visoke koncentracije (>250 µM). Štoviše, upotreba komercijalno dostupnih rNTP-ova obilježenih izotopom za proizvodnju RNA na NMR-u može biti prilično skupa i stoga se treba uzeti u obzir samo kada se uspostave protokoli transkripcije i pročišćavanja, a znanstvena pitanja ne mogu se riješiti s ¹H eksperimentima.

S povećanjem veličine RNA, čak i dodjeljivanje na temelju protona postaje teže zbog spektralnog preklapanja. Ovdje sofisticiraniji heteronuklearni NMR eksperimenti mogu pružiti dodatne informacije o identitetu nukleotida. 15 N označavanje ostataka gvanina i uracila, na primjer, unaprijedit će bazno-specifično dodjeljivanje rezonancija korištenjem 15 N HSQC eksperimenata, dok 13 C obilježeni nukleotidi mogu pomoći u razrješavanju rezonancija iz aromatskih i šećernih protona putem 13 C HSQC eksperimenata. Osobito s RNA sve veće duljine, preporučljivo je selektivno označiti samo jednu ili dvije vrste nukleotida odjednom kako bi se dramatično smanjilo preklapanje signala. U slučaju naprednijih strukturnih analiza, potpuno 13 C i 15 N označavanje, ponekad u kombinaciji s deuteracijom, je neophodno.

Nadalje, ako vaš projekt zahtijeva pozicijsko selektivnu, a ne jedinstvenu strategiju označavanja izotopa, preporučujemo korištenje pristupa kemo-enzimske sinteze opisanog u Osnovnom protokolu 2. Ova metoda ne samo da dopušta ugradnju jednog obilježenog nukleotida u inače neobilježen RNA, ali također stvara RNA konstrukte koji kombiniraju različito obilježene segmente u jedan lanac.

RNA pročišćavanje

Za pročišćavanje RNA za generiranje NMR uzoraka dovoljne koncentracije i čistoće, dostupna su tri glavna načina.

Osnovni protokol 1 opisuje široko korišteni kromatografski pristup, gdje se tečna kromatografija brzog proteina s anionskom izmjenom (FPLC) i RP-HPLC koriste za sukcesivno uklanjanje T7 RNAP, DNA predloška, ​​rezidualnih rNTP i nusproizvoda RNA uključujući ribozime iz RNA od interesa. Nakon kromatografskih koraka, RNA se osuši smrzavanjem i desoli prije nego što se istaloži s LiClO4/aceton. Konačno, RNA se presavije u idealno jednu homogenu konformaciju i prenese u odgovarajući NMR pufer. Imajte na umu da uvjeti ponovnog savijanja mogu varirati ovisno o RNK od interesa i stoga se moraju odrediti pojedinačno. Ova strategija pročišćavanja primjenjiva je na RNA unutar širokog raspona veličina i struktura.

Ako nije moguće u potpunosti odvojiti ribozime od vaše RNA od interesa putem RP-HPLC-a ili ako HPLC instrument nije dostupan, preporučujemo prelazak na pristup elektroforezi na preparativnom poliakrilamidnom gelu, kao što je prikazano u Alternativnom protokolu 1. Ovdje su RNA se odvajaju u denaturirajućoj gel elektroforezi velikih razmjera, a RNA od interesa se nakon toga ekstrahira iz matrice gela.

Najbrži put pročišćavanja opisan je u Alternativnom protokolu 2, gdje se samo komponente niske molekularne težine, kao što su Mg(OAc)₂ i zaostali rNTP, uklanjaju iz reakcijske smjese, a pufer se izmjenjuje ponovljenim ciklusima ispiranja pomoću centrifugalnih koncentratora (Helmling i sur., 2015.). U ovom se protokolu uglavnom održava konformacija koju je usvojila RNA tijekom transkripcije, jer se ne izvode nikakvi koraci pročišćavanja denaturacije. Ipak, ovu metodu treba koristiti samo kada transkripcija proizvodi jedan RNA proizvod, budući da RNA nusproizvoda poput ribozima nisu odvojene od RNA od interesa. U ovom slučaju, homogenost RNA na 3′-kraju postiže se korištenjem 2′-metoksi modificiranih početnica tijekom PCR-a. PCR proizvod koji nosi 2′-metoksi modifikaciju na 3′ kraju pokazao je da značajno povećava homogenost proizvoda za transkripciju otjecanja (Helmling i sur., 2015.). Preporučujemo korištenje ove strategije pročišćavanja za analizu strukture RNA visoke propusnosti, a ne za eksperimente s titracijom, jer bi prisutnost preostalog T7 RNAP-a mogla ometati vezanje liganda.

NMR puferski sastav

RNA NMR uzorci obično se pripremaju u puferu koji sadrži što je moguće manje protona (kako bi se izbjeglo korištenje deuteriranih puferskih sredstava) i pokazuju blago kiselu pH vrijednost (kako bi se zajamčila dugoročna stabilnost uzorka i smanjila izmjena labilnih protona otapala). Obično koristimo sljedeći puferski sastav kao početnu točku: 50 mM KCl, 25 mM K2HPO4/KH2PO4i 5% (v/v) D2O na pH 6,2. Ovisno o prirodi vaših eksperimenata i istraženoj RNA, bivalentni kationi kao što je Mg²⁺ mogu se dodati kako bi se stabilizirala struktura RNA. Kao referentnu tvar za ¹H spektre preporučujemo natrijev trimetilsililpropansulfonat (DSS), jer njegov kemijski pomak protona ne ovisi ni o temperaturi ni o pH. Za pojedinačne studije mogu biti potrebne daljnje prilagodbe u sastavu soli i pufera ili pH, osobito ako se RNA istražuje kao dio RNA proteinskog kompleksa.

1: PRIPREMA IZOTOPOM OBILJEŽENIH RNA UZORAKA S IN VITRO TRANSKRIPCIJOM KORIŠĆENJEM T7 RNAP, DEAE KROMATOGRAFIJOM I RP-HPLC PROČIŠĆAVANJEM

Analiza RNA putem NMR spektroskopije zahtijeva pripremu uzorka s dovoljnom količinom čiste RNA. Obično se koriste uzorci između 50 i 500 µM u 300 µl volumena pufera, ali veće koncentracije uzorka mogu biti korisne pod uvjetom da se mogu uspostaviti ispravni uvjeti savijanja. U nastavku opisujemo standardni protokol za pripremu izotopom obilježene RNA za NMR primjene koristeći T7 RNAP. Ova polimeraza se može kupiti ili pripremiti u kući, a odgovarajuće upute za pripremu opisane su u Protokolu podrške 3. U prvom koraku, DNA šablon iz kojeg će se transkribirati RNA je amplificiran. Za pojačanje su dostupne dvije metode. Prvi zahtijeva DNA plazmid, koji je amplificiran u stanicama, lineariziran i naknadno pročišćen (Protokol podrške 1). Drugi pristup koristi DNA šablon proizveden sintezom u čvrstoj fazi u kombinaciji s PCR-om pomoću Phusion® High-Fidelity DNA polimeraze (Protokol podrške 2). Nakon amplifikacije DNA, test-transkripcije se koriste za optimizaciju reakcijskih uvjeta kako bi se dobio najveći prinos ciljne RNA. Pod tim uvjetima može se izvesti reakcija preparativne transkripcije i pročistiti dietilaminoetanolom (DEAE) i RP-HPLC kromatografijom. Alternativni postupci za pročišćavanje prikazani su u Alternativni protokoli 1 i

Materijali

  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • DNK predložak (pogledajte protokole podrške 1 i 2)
  • T7 RNA polimeraza (T7 RNAP vidi Protokol podrške 3)
  • Anorganska pirofosfataza kvasca (YIPP vidi Protokol podrške 4)
  • 500 mM tris/glutamatni pufer, pH 8,1 (glutaminska kiselina Merck, kat. br. G1149)
  • Spermidin (Merck, kat. br. 85558)
  • magnezijev acetat (Mg(OAc)2 Carl Roth, mačka. Ne. 0275.1)
  • rNTP-ovi označeni izotopima (Silantes/Eurisotop)
  • DTT (Carl Roth, kat. br. 6908.4)
  • Dimetil sulfoksid (DMSO Carl Roth, kat. br. A994.2)
  • Denaturirajući pufer za punjenje RNA (vidi recept)
  • Otopina gela za denaturiranje PAGE (vidi recept)
  • Denaturiranje radnog međuspremnika PAGE (1× TBE vidi recept)
  • Dietilaminoetil-Sefaroza (DEAE-Sepharose® GE Healthcare, kat. br. 17-0709-01)
  • 3 M natrijev acetat (NaOAc), pH 5,5 (Carl Roth, kat. br. 6773,2)
  • 0,1% (v/v) dietil pirokarbonat (DEPC Carl Roth, kat. br. K028.2)
  • Apsolutni etanol (Merck, kat. br. 32205-2,5L-M)
  • HPLC pufer A (50 mM kalij fosfata, pH 5,9, 2 mM tetrabutilamonij hidrogen sulfat)
  • HPLC pufer B (HPLC pufer A plus 60% acetonitril acetonitril, Thermo Fisher Scientific, kat. br. A-0627/17)
  • 2% (w/v) litij perklorat (LiClO4)/aceton (LiClO4, Acros Organics, kat. Ne. 194711000)
  • 40% (v/v) glicerol (nativni pufer za punjenje RNA Carl Roth, kat. br. 3783.1)
  • Native PAGE otopina gela (vidi recept)
  • Izvorni PAGE međuspremnik (1× TA pogledajte recept)
  • NMR pufer (vidi recept)
  • Magnezijev klorid (MgCl2 Carl Roth, mačka. Ne. HN03.2)
  • Deuterijev oksid (D2O Deutero, mačka. Ne. 00507)
  • 3-(trimetilsilil)propan-1-sulfonat, natrijeva sol (DSS)
  • Inkubator
  • Inkubator za mućkanje
  • PAGE komora za lijevanje i staklene ploče (Biometra multigel tvrtke Analytik Jena)
  • Toplinski blok
  • Stakleni stupac za DEAE-Sepharose ® (npr. Econo)
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Liofilizator/centrifugalni vakuum koncentrator (Alpha 2-4, Christ vacuum concentrator plus, Eppendorf)
  • Shaker
  • HPLC uređaj (Elite LaChrom VWR-Hitachi)
  • HPLC kolona (npr. PerfectSil™ RP18, veličina pora: 300 Å, veličina čestica: 5 µm, 10 × 250 mm)
  • Ploča za tankoslojnu kromatografiju (TLC) (ALUGRAM ® Xtra SIL G/UV Macherey-Nagel)
  • Ultraljubičasta (UV) lampa, 245 nm (Hanau Fluotest Heraeus)
  • Centrifugalni koncentrator (npr. Vivaspin™, Sartorius™)
  • NMR cijev (Deutero, Shigemi)

1. Radite bez RNase. Rad na ledu.

2. Pripremite DNA predložak za in vitro transkripciju putem plazmidne amplifikacije (vidi Protokol podrške 1) ili PCR (vidi Protokol podrške 2).

3. Pripremite T7 RNAP u skladu s Protokolom podrške 3.

4. Pripremite YIPP prema Protokolu podrške 4.

5. Pripremite sve osnovne otopine za reakcije transkripcije, uključujući sve reakcije optimizacije (vidi korake 7-12).

Sljedeće koncentracije za osnovne otopine mogu biti od pomoći: 500 mM tris/glutamatnog pufera, 200 mM spermidina, 300 mM Mg(OAc)2, do 100 mM rNTP mješavine i 1 M DTT.

In vitro transkripcija

6. Provjerite sve testne transkripcije s analitičkom denaturirajućom PAGE (denat. PAGE).

Točan sastav za denat. Otopina PAGE mora se prilagoditi za svaki uzorak. Treba uzeti u obzir duljinu ciljne RNA i njezinih ribozima (ako postoje) te potrebnu učinkovitost odvajanja. Za RNA kraće od 20 nt, 20% denat. STRANICA se može koristiti. Za do 50 nt RNA, 15% denat. STRANICA se može koristiti. Za RNA dulje od 50 nt, 8%-10% denat. STRANICA se može koristiti. Za daljnje upute pogledajte članak Current Protocols: Andrus & Kuimelis, 2000.

7. Optimizirajte reakciju transkripcije (pogledajte korak 13) na test skali i počnite s optimizacijom koncentracije rNTP u odnosu na Mg(OAc)2 koncentracija (slika 2).

Za testne transkripcije dovoljan je volumen od 50 µl. Za optimizaciju koristite neoznačene rNTP-ove. Možete optimizirati sastav rNTP prema omjeru nukleotida u transkribiranoj RNA sekvenci. Koncentracije mogu biti u rasponu od 2-5 mM po rNTP i 5-60 mM Mg(OAc)2. Konačni Mg(OAc)2 koncentracija nadalje ovisi o vrsti DNA šablona (PCR proizvod ili plazmid).Ako RNA sadrži ribozim, morat ćete odabrati veći Mg(OAc)2 koncentracija za pomoć pri cijepanju. Cilj ove optimizacije je čist proizvod i maksimalni prinos ciljne RNA s razumnom količinom nusproizvoda, koji se naknadno može ukloniti.

8. Optimizirajte količinu DNK putem test-transkripcija.

Upotrijebite 4%-10% (v/v) PCR proizvoda. Može se koristiti neposredno nakon PCR-a bez ikakvih koraka pročišćavanja ako je proizvod homogen ili potencijalni nusprodukti nisu transkribirani. Kada koristite plazmidnu DNA, optimizirajte 25-200 ng/µl.

9. Provedite probne transkripcije s do 20% (v/v) DMSO.

DMSO može povećati homogenost ciljne RNA, ali se mora unaprijed testirati. Uočavamo pozitivan učinak prvenstveno za transkripcije s PCR DNA šablonima.

10. Optimizirajte vrijeme inkubacije na 37°C putem test-transkripcije.

Pripremite jednu testnu transkripciju i uzmite uzorke za analizu u odgovarajućim intervalima. Vrijeme inkubacije može se jako razlikovati s različitim RNA konstruktima. Možete inkubirati 4-24 sata.

11. Optimizirajte koncentraciju tris/glutamatnog pufera, ako je potrebno. Koristite 100-200 mM tris/glutamatni pufer.

12. Izvedite probnu transkripciju s optimiziranim parametrima i rNTP-ovima obilježenim izotopima.

13. Izvedite preparativnu transkripciju s optimiziranim uvjetima u reakcijskoj epruveti od 50 ml prema shemi pipetiranja prikazanoj u Tablici 1.

Ako se koristi PCR DNA šablon, dovoljan je volumen transkripcije od 10 ml. Ako se koristi predložak plazmidne DNA, obično je potreban volumen od 25 ml. Dodajte DNA predložak u smjesu redoslijedom prikazanim u Tablici 1 jer visoka koncentracija Mg 2+ može dovesti do taloženja DNA. Možete dodati 9,6 µg/ml YIPP nakon 1-2 sata inkubacije. Posljednje dodajte enzime.

Reagens Količina
ddH2O Dodati do 10-25 ml
Tris/glutamatni pufer (pH 8,1) 100-200 mM
Spermidin 2 mM
Mg(OAc)2 5-60 mM
rNTP-ovi 2-5 mM
DTT 20 mM
DNK Kao optimizirano
DMSO do 20%
YIPP 9,6 ug/ml
T7 RNA polimeraza 20 µg/ml

14. Inkubirajte transkripcijsku reakciju na 37°C i maksimalno 120 okretaja u minuti dok je optimizirano.

15. Provjerite je li ciljna RNA transkribirana denatom. STRANICA.

Anionska izmjenjivačka kromatografija

  1. Ulijte ∼10 ml DEAE sefarozne smole u praznu kromatografsku kolonu i pustite da se smola potpuno slegne. Ocijediti supernatant EtOH iz DEAE kolone i isprati s 20 ml ddH2O.
  2. Za inaktivaciju mogućih kontaminacija RNase, isperite kolonu s 50 ml 0,1% (v/v) DEPC i zatim inkubirajte s 0,1% (v/v) DEPC preko noći.

Ocijedite 0,1% (v/v) otopinu DEPC i isperite kolonu sa 100 ml vruće (∼60° do 90°C) ddH2O i uravnotežiti s 50 ml 0,1 M NaOAc.

Pokušajte izbjeći ometanje smole stupca pažljivim izlijevanjem vode duž unutarnje stijenke stupa. Za svaki korak pranja, provjerite je li smola potpuno slegla prije početka eluiranja.

Reakcija transkripcije centrifuge (15 min, 4000 × g, 4°C) i prenijeti supernatant na kolonu.

Prije početka eluiranja provjerite je li smola potpuno slegla.

Dodatno: Operite pelet soli s 5 ml H2O i ponovno centrifugirajte 15 minuta prije spajanja oba supernatanta.

Sakupiti protočne frakcije od 10 ml. Napunite i eluirajte uzastopno s 50 ml 0,6 M, 1,0 M, 2,0 M i 3,0 M otopine NaOAc.

Očekujte da će RNA eluirati na oko 2 M NaOAc.

17. Upotrijebite UV/vis apsorpcijsku spektroskopiju da identificirate frakcije s visokom apsorpcijom na 260 nm i provjerite odgovarajuće frakcije na analitičkom denatu. PAGE za određivanje frakcija koje sadrže RNA.

18. Razrijediti koncentraciju soli frakcija produkta s ddH2O do 0,3-0,6 M NaOAc.

Niža koncentracija NaOAc osigurava da sol ostane u otopini tijekom taloženja.

19. Frakcijama proizvoda dodajte četiri volumena ledeno hladnog apsolutnog etanola.

20. Inkubirajte na -80°C preko noći.

21. Centrifugirajte na 10 000 × g i 4°C 30-60 min.

Odredite maksimalnu brzinu koju tolerira epruveta s uzorkom.

22. Uklonite supernatant i sačuvajte ga za daljnje taloženje.

Ponekad se RNA ne taloži kvantitativno. Ponovite korake 20-22 dvaput sa supernatantom kako biste osigurali da RNK ne ostane u otopini. Inkubirajte supernatant od precipitacije 3-6 sati na -80°C.

23. Osušite kuglicu na zraku ili upotrijebite vakuumski koncentrator 2 minute i rekonstituirajte RNA peletu u ∼1 ml ddH2O. OD260 od ∼100 je prikladno.

24. Pročistite uzorak RNA pomoću HPLC. Prikladni gradijenti za različite duljine RNA koje koristimo u našim laboratorijima prikazani su u tablicama 2 i 3. U ovom slučaju se koristi RP HPLC s ionskim parom s kolonom PerfectSil RP18 na 60°C, što odgovara duljinama RNA do 180 nt. . Ova kolona je ekvilibrirana s HPLC puferom A tijekom 10-15 minuta i obično se koristi brzina protoka od 5 ml/min. Drugi uređaj ili drugi stupac može zahtijevati malo izmijenjen gradijent.

Ako se novi RNA konstrukt pročisti, potrebno je provesti analitičko ispitivanje kako bi se odredio odgovarajući gradijent. Gradijent ne ovisi samo o duljini RNA već i o njezinoj strukturi, slijedu i potencijalnim nečistoćama.

25. Uklonite HPLC pufer liofilizatorom ili centrifugalnim vakuum koncentratorom.

26. Rekonstituirajte pelet u 1 ml ddH2O.

27. Dodajte pet volumena 2% (w/v) LiClO4/aceton i inkubirajte 2 sata na -20°C.

28. Centrifugirajte na 10 000 × g i 4°C 30-60 min.

Ako je moguće, možete centrifugirati većom brzinom. Držite se ograničenja brzine navedenog u priručniku uređaja za reakcijsku cijev.

29. Uklonite supernatant i rekonstituirajte talog u ddH2O ili NMR pufer ovisno o metodi savijanja.

Ako koristite centrifugalni koncentrator od 20 ml, možete rekonstituirati u volumenu od ∼10 ml.

Preklapanje i razmjena međuspremnika

Protokol preklapanja bi se možda trebao prilagoditi za svaki pojedinačni konstrukt RNA. Stoga su ovdje predstavljeni neki uobičajeni putevi preklapanja. RNA se može presavijati u vodi ili u NMR puferu, kao i pri visokoj ili niskoj koncentraciji RNA. Uzmite u obzir da visoke koncentracije soli i RNA mogu potaknuti dimerizaciju. Nemojte zamrzavati uzorak nakon presavijanja.

30. Provjerite homogeni nabor putem izvorne PAGE. Napunjeni uzorak mora imati koncentraciju NMR uzorka (>100 µM). Učitajte 500 nmol RNA. Koristite UV sjenčanje kako biste otkrili trake.

Nemojte koristiti ureu ili EDTA za nativni PAGE. Nadalje, imajte na umu temperaturu, jer se RNA ne smije izlagati višoj temperaturi od 25°C. Stoga snaga ne smije biti veća od 1 W i ako je moguće, treba primijeniti sustav hlađenja.

31. Optimizirajte uvjete savijanja za ciljnu RNA ako su nepoznati i provjerite putem nativne PAGE.

Za sporo savijanje, denaturirajte RNA (3-5 min, 95°C) i ostavite uzorak na isključenom toplinskom bloku dok ne dosegne sobnu temperaturu. Za brzo savijanje, stavite uzorak izravno na led nakon denaturacije. Nakon denaturacije, RNA se može presavijati brzim razrjeđivanjem s pet do deset puta ledeno hladnim ddH2O ili ledeno hladan NMR pufer. Ova optimizacija se može izvesti u ovom trenutku u ddH2O ili u koraku 36 u NMR puferu.

32. Presavijte uzorak RNA u jednu konformaciju. Preklapanje se može dogoditi sada ili u koraku 40.

Nemojte zamrzavati uzorak nakon presavijanja.

33. Pripremite centrifugalni koncentrator kako je opisano u priručniku uređaja.

Odaberite graničnu vrijednost molekularne težine (MW), koja je oko trećine veličine ciljne RNA. Na taj način RNA konstrukt neće proći kroz filter.

34. Prenesite uzorak RNA u NMR pufer koristeći centrifugalni koncentrator i centrifugirajte preporučenom brzinom.

Pridržavajte se ograničenja brzine koje je odredio proizvođač inače bi se membrana mogla oštetiti. Temperatura unutar centrifuge treba biti u rasponu od 4°-25°C, ovisno o vrsti i stabilnosti ciljne RNA. Ako se koristi centrifugalni koncentrator od 20 ml, centrifugirajte dok se volumen ne smanji na 1 ml.

35. Ponovno napunite centrifugalni koncentrator NMR puferom i pažljivo ga promiješajte pipetom da ne oštetite membranu koncentratora. Zatim ga centrifugirajte da dobijete jednu desetinu volumena.

Miješanje uzorka sprječava agregaciju RNA jer se koncentracija postupno povećava prema membrani. Nadalje, može dovesti do bržih ciklusa ponavljanja.

36. Ponovite korak 35 tri do deset puta kako biste uklonili preostale soli.

Ukupni broj ciklusa ponavljanja uvelike ovisi o konstruktu RNA, uvjetima HPLC pufera i čistoći RNA potrebnoj za kasnije eksperimente. Neke RNA imaju tendenciju agregiranja tijekom izmjene pufera. Moraju se obnoviti nakon svakog ciklusa i trebaju proći ciklus izmjene pufera opisan u koraku 35 najmanje šest puta.

37. Centrifugirajte nakon posljednje iteracije kako biste smanjili volumen na 200-300 µl.

38. Uklonite RNA iz centrifugalnog koncentratora pomoću pipete.

RNA se mogu zalijepiti za membranu i stoga ih je potrebno energično ukloniti pipetom. Preporuča se da se otopina RNA pipetira duž unutarnje strane membrane i da se membrana ispere na isti način s malom dodatnom količinom NMR pufera (∼50 µl) nakon uklanjanja.

39. Odredite koncentraciju RNA pomoću UV/vis apsorpcijske spektroskopije.

Uzmite u obzir MgCl2, D2O i DSS koji se mogu dodati naknadno i razrijediti će uzorak. Preporučujemo koncentraciju RNA od najmanje 300 µM.

40. Presavijte RNA osim ako prije nije bila presavijena i provjerite konačni preklop putem nativne PAGE (vidi korak 30 i sliku 3).

Ako RNA ima tendenciju agregiranja tijekom izmjene pufera, treba je nakon toga presavijati.

41. Dodajte MgCl2 ako je potrebno, osim ako je prije dodano.

Ioni Mg 2+ mogu stabilizirati strukturu RNA. Svaki novi RNA konstrukt treba titrirati s MgCl2. Stoga dodajte MgCl2 postupno do RNA (1 mM) i izmjeriti 1 H-1D NMR spektar nakon svakog koraka, kako bi se otkrile razlike u strukturi i stabilnosti RNA. Možete dodati MgCl2 uzorku RNA nakon presavijanja jer bi se korak denaturacije trebao obaviti u odsutnosti Mg 2+ iona. MgCl2 se također može dodati u NMR pufer koji se koristi za izmjenu pufera (vidi korake 35 i 36).

42. Dodajte 5% D2O i 100 µM DSS na uzorak RNA.

Ako je temeljna otopina DSS pripremljena u D2O, provjeri je li dodatno D2O se mora dodati. Inače pripremite visoko koncentriranu DSS temeljnu otopinu u NMR puferu.

43. Operite Shigemi epruvetu s ddH2O i inkubirajte s 0,1% (v/v) DEPC otopinom preko noći. Više puta isperite epruvetu s ddH2O (najmanje pet ili više puta) i osušite ga u liofilizatoru ili sušionici.

44. Napunite Shigemi epruvetu NMR uzorkom (optimalna visina punjenja: 300 µl) i postavite umetak iznad uzorka tako da između umetka i uzorka ne budu zarobljeni mjehurići zraka.

Može biti korisno gurnuti umetak velikom brzinom i pritiskom u cijev. Donji dio umetka treba biti okružen otopinom uzorka.

45. Zabrtvite Shigemi cijev brtvenom folijom (npr. Parafilm) i označite cijev. Uzorak čuvati na 4°C.

Brtvljenje stabilizira umetak.

46. ​​Izvedite bitne NMR eksperimente (npr. 1 H 1D, 1 H 2D NOESY, 1 H, 15 N-HSQC) za dodjelu RNA. Za osnovne NMR eksperimente za RNA, pozivamo se na pregledni članak: NMR spektroskopija RNA (Fürtig, Richter, Wöhnert i Schwalbe, 2003.). Za sofisticiranije heteronuklearne eksperimente pogledajte Osnovne protokole 3-7.

1: PROČIŠĆAVANJE IZOTOPOM OBILJEŽENE RNK IZ IN VITRO TRANSKRIPCIJE S PRIPREMNOM STRANICOM

Alternativni protokol 1 opisuje drugi pristup za pročišćavanje izotopom obilježenih RNA iz in vitro transkripcije. Ova metoda koristi preparativnu PAGE umjesto RP-HPLC i stoga je alternativa ako HPLC uređaj nije dostupan ili ako uređaj ne odvaja dovoljno ciljni RNA proizvod od nusproizvoda (članak Trenutnih protokola: Hengesbach et al., 2008. Petrov, Wu, Puglisi, & Puglisi, 2013.). Ovaj protokol počinje nakon uspješne in vitro transkripcije ciljne RNA i daje čisti NMR uzorak. Ova metoda nije prikladna ako NMR uzorak mora biti bez ikakvih nečistoća akrilamida, koje bi se mogle eluirati zajedno s RNA iz preparativne PAGE. Ako akrilamid utječe na rezultate, HPLC provođenje kako bi se odvojio od RNA je neizbježan.

Dodatni materijali (vidi također Osnovni protokol 1)

  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • Dietilaminoetil-Sefaroza (DEAE-Sepharose® GE Healthcare, kat. br. 17-0709-01)
  • 3 M natrijev acetat (NaOAc), pH 5,5 (Carl Roth, kat. br. 6773,2)
  • 0,1% (v/v) dietil pirokarbonat (DEPC Carl Roth, kat. br. K028.2)
  • Denaturirajuća otopina PAGE gela, 8%-15% (vidi recept)
  • Formamid (denaturirajući pufer za punjenje RNA za preparativnu PAGE Merck, kat. br. 47671)
  • Denaturiranje radnog međuspremnika PAGE (1× TBE vidi recept)
  • Pufer za punjenje koji sadrži boju (vidi recept)
  • Pufer za eluiranje: 0,3 M natrijev acetat (NaOAc), pH 5,5
  • Apsolutni etanol (Merck, kat. br. 32205-2,5L-M)
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • NAP™ stupac (GE Healthcare)
  • Stakleni stupac za DEAE-Sepharose ® (npr. Econo)
  • Centrifugalni koncentrator (npr. Vivaspin™, Sartorius™)
  • Sterilni filteri, 0,2 µm (Carl Roth)
  • PAGE komora za lijevanje i staklene ploče (Biometra multigel Analytik Jena Company)
  • Toplinski blok
  • Sterilna površina
  • Ploča za tankoslojnu kromatografiju (TLC) (ALUGRAM ® Xtra SIL G/UV Macherey-Nagel)
  • UV lampa, 245 nm (Hanau Fluotest Heraeus)
  • Sterilni skalpel
  • Injekcija
  • Shaker
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifugalni vakuumski koncentrator (vakuumski koncentrator plus Eppendorf)

BILJEŠKA: Ovaj protokol počinje pročišćavanjem prethodno transkribirane RNA. Za in vitro transkripciju pogledajte Osnovni protokol 1, koraci 1-15.

2. Transkribirajte RNA kao što je opisano u Osnovnom protokolu 1, koraci 1-15.

3. Odredite količinu RNA i volumen uzorka koji se mora pročistiti i provjeriti koja veličina PAGE odgovara uzorku RNA. Uzmite u obzir dodatni formamid (vidi korak 9 u nastavku) i potrebnu učinkovitost odvajanja, npr. razliku u veličini između traka proizvoda.

Midi PAGE (oko 20 cm udaljenosti migracije) obično je dovoljan za količinu RNA dobivene iz 15-ml transkripcije ako se ne pojave nusprodukti, dok je maxi PAGE (oko 50 cm udaljenosti migracije) prikladan ako je transkripcija provedena u skali od 25 ml ili ako je potrebna veća učinkovitost odvajanja. Ovaj slučaj se događa ako se proizvodi više nusproizvoda ili ako ribozimi imaju sličnu duljinu kao ciljni RNA produkt.

4. Uklonite slobodne rNTP i višak soli iz reakcije transkripcije putem DEAE kromatografije prema Osnovnom protokolu 1, NAP stupca ili putem centrifugalnog koncentratora.

Možete precipitirati RNA za uklanjanje DMSO i smanjenje volumena ako koristite NAP stupac.

5. Pripremite TBE međuspremnik prema potrebi za vaš PAGE uređaj za lijevanje.

Provjerite ima li dovoljno međuspremnika za ponovno punjenje uređaja za lijevanje PAGE u slučaju curenja.

6. Pripremite 8%-15% otopinu PAGE gela i filtrirajte sa sterilnim filterima (0,2 µm).

Odredite prikladan postotak akrilamida. Više koncentracije mogu biti prikladnije za manje konstrukcije. Niže koncentracije općenito povećavaju prinos elucije. Koristite odgovarajuće čaše. Otprilike dva puta veći volumen otopine PAGE gela trebao bi biti dovoljan. Krajnji volumen otopine gela ovisi o vašem PAGE uređaju. U slučaju midi gela s udaljenosti migracije od ∼20 cm, 70 ml otopine PAGE gela može biti dovoljno. Za maxi gel s udaljenosti migracije od ∼50 cm, može se pripremiti 250 ml otopine PAGE gela. Provjerite postoji li višak otopine gela u slučaju curenja, u nekim slučajevima, brzo punjenje ili selektivna injekcija tetrametiletilendiamina (TEMED) može pomoći.

7. Postavite PAGE staklene ploče i provjerite curenje.

Provjerite jednaku debljinu odstojnika i češlja. PAGE uređaj i staklene ploče moraju biti bez RNase.

8. Dodajte amonijev persulfat (APS) i TEMED otopini PAGE gela da započnete polimerizaciju neposredno prije izlijevanja.

Podesite APS i TEMED na željeni volumen i uzmite u obzir vrijeme potrebno za nanošenje gela. Za midi PAGE gelove treba koristiti 0,1% (w/v) APS i 0,1% (v/v) TEMED. Za maxi PAGE gelove koristite oko 0,06% (w/v) APS i 0,06% (v/v) TEMED. Vrijeme polimerizacije je 10-20 min.

9. Dodajte najmanje 0,5 volumena formamida svom uzorku i denaturirajte RNA 3-5 minuta na 95°C.

Provjerite stane li krajnji volumen uzorka u džepove za gel (pogledajte korak 3). Nemojte koristiti nikakve boje.

10. Postavite gel u PAGE uređaj. Ako koristite maxi gel, prethodno nanesite gel 30 min.

Jažice temeljito isperite tekućim puferom neposredno nakon postavljanja gela i prije stavljanja gela kako bi se spriječilo taloženje uree.

11. Dodajte 20 µl pufera za punjenje koji sadrži boju u jedan rezervni džep za gel kako biste odredili napredak rada gela.

12. Ubacite denaturirani uzorak RNA u slobodne džepove gela.

Ako imate pri ruci samo jednu vrstu češlja (s više džepova), možete lagano uništiti džepove kako biste povećali volumen za punjenje uzorka. Koristite sterilnu iglu ili lopaticu.

Radni parametri ovise o vrsti PAGE i veličini ciljne RNA. Za midi PAGE postavite ∼30 W, a za maxi PAGE dovoljno je 50 W. Nakon 15-30 min provjerite curenje međuspremnika u radu PAGE. Ako je potrebno i dostupno, pokrenite ventilator nakon 30 minuta kako biste spriječili da se uzorak vrti. Druge vrste hlađenja mogu se započeti od početka. Vrijeme rada uvelike ovisi o duljini vaše ciljne RNA. Stoga pratite napredak bojenja.

14. Uklonite gel sa staklenih ploča i stavite ga na sterilnu površinu.

Provjerite prolazi li UV zračenje kroz sterilnu površinu. Mogu se koristiti sterilne plastične vrećice. Izrežite vrećicu sterilnim skalpelom i stavite gel na unutrašnju stranu.

15. Postavite fluorescentnu TLC ploču ispod gela.

Ploču treba omotati prozirnom i čistom plastičnom folijom u slučaju da prosiječete sterilnu površinu.

16. Pomoću UV lampe (245 nm) provjerite ima li UV sjene uzrokovane RNA. Identificirajte željenu RNA traku i označite traku sterilnim skalpelom.

Budite oprezni i samo nakratko osvijetlite gel UV lampom kako biste izbjegli UV oštećenje RNA. Slika mini STRANICE uzorka može pomoći u bržem pronalaženju ciljane RNA trake.

17. Izrežite željenu traku od gela i zatim narežite na male komadiće.

18. Pomiješajte komadiće gela s 10-20 ml pufera za eluiranje i utisnite smjesu kroz špricu.

Ovaj proces povećava površinu gela radi boljeg eluiranja.

19. Protresite komadiće gela na 4°-25°C preko noći kako bi se RNA eluirala u pufer za eluiranje.

Po želji zamrznite i odmrznite kriške gela kako biste poremetili matriks gela i povećali učinkovitost eluiranja RNA. Nakon eluiranja preko noći, inkubacija na 65°C tijekom 15 minuta i dodatno mućkanje tijekom 30 minuta na 1300 o/min mogu pomoći da se poveća količina eluirane RNA.

20.Filtrirajte pufer za eluiranje sa sterilnim filterom (0,2 µm) i zadržite komadiće gela za daljnje eluiranje.

U nekim slučajevima, eluiranje RNA je teško i možda neće biti završeno preko noći. Stoga dodajte svježi 0,3 M NaOAc u odvojene komade gela i ponovite korake 19 i 20.

21. Dodajte dva i pol do četiri volumena ledeno hladnog apsolutnog etanola da se istaloži RNA i stavite smjesu na -20°C preko noći.

Inkubacija na -80°C tijekom 2 sata također može biti dovoljna.

22. Centrifugirajte na 10 000 × g i 4°C 30-60 min.

Ako je moguće, možete centrifugirati većom brzinom. Držite se ograničenja brzine navedenog u priručniku uređaja za reakcijsku cijev.

23. Uklonite supernatant i sačuvajte ga za daljnje taloženje.

U nekim slučajevima, RNA se ne taloži u potpunosti. U tom se slučaju inkubacija i centrifugiranje mogu ponoviti.

24. Osušite pelet na zraku ili sušite u vakuum koncentratoru 2 minute i rekonstituirajte ga u ddH2O.

Pokrenite analitički denat. PAGE za provjeru čistoće ciljne RNA.

25. Nastavite sa savijanjem, izmjenom pufera i pripremom NMR uzorka kako je opisano u Osnovnom protokolu 1, koraci 30-46.

2: PROČIŠĆAVANJE IZOTOPOM OBILJEŽENE RNA UZORAKA IZ IN VITRO TRANSKRIPCIJE PREKO CENTRIFUGALNE KONCENTRACIJE

Ovaj Alternativni protokol 2 opisuje brzu metodu pročišćavanja za izotopom obilježene RNA iz in vitro transkripcije pomoću centrifugalnog koncentratora (vidi sliku 4). To je najbrža metoda pročišćavanja među strategijama pročišćavanja opisanim u ovom protokolu. Međutim, ovu metodu treba primijeniti samo kada transkripcija proizvodi jedan RNA proizvod, jer se nusproizvodne RNA ili druge transkribirane RNA kao što su ribozimi ne odvajaju. Stoga je važno generirati homogenost 3′-kraja transkribirane RNA korištenjem PCR DNA šablona s 2′-O-metil-modifikacije na posljednja dva nukleotida 5′ kraja (Helmling i sur., 2015 Kao, Zheng i Rüdisser, 1999 Support Protocol 2). Također savjetujemo da se ovaj postupak pročišćavanja ne koristi za eksperimente s NMR titracijom, jer bi preostali enzimi u otopini mogli ometati vezanje liganda.

Materijali

  • Transkribirana RNA (vidi Osnovni protokol 1, koraci 1-15)
  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • 500 mM tris/glutamatni pufer, pH 8,1 (glutaminska kiselina Merck, kat. br. G1149)
  • NMR pufer (vidi recept)
  • Denaturirajući pufer za punjenje RNA (vidi recept)
  • Otopina gela za denaturiranje PAGE (vidi recept)
  • Denaturiranje radnog međuspremnika PAGE (1× TBE vidi recept)
  • Centrifugalni koncentrator (npr. Vivaspin™, Sartorius™)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • PAGE komora za lijevanje i staklene ploče (Biometra multigel Analytik Jena Company)
  • Toplinski blok

1. Pripremite centrifugalni koncentrator kako je opisano u priručniku uređaja.

Odaberite MW cutoff, koji će biti oko trećine veličine vaše ciljne RNA. Na taj način RNA neće proći kroz filter.

2. Uklonite precipitirani magnezijev pirofosfat centrifugiranjem smjese za transkripciju na 3000 × g 5 min na sobnoj temperaturi. Zatim prenesite supernatant u centrifugalni koncentrator.

3. Isperite smjesu za transkripciju sa 5 ml tris/glutamatnog pufera (pH 8,1) da biste uklonili preostali pirofosfat.

4. Koncentrirajte otopinu do 1,0-0,3 ml i isperite sa 60-160 ml NMR pufera ovisno o skali transkripcije.

Uzorak pažljivo promiješajte između koraka pipetom, bez dodirivanja membrane. Pridržavajte se ograničenja brzine koje je odredio proizvođač inače bi se membrana mogla oštetiti. Temperatura unutar centrifuge treba biti u rasponu od 4°-25°C, ovisno o vrsti i stabilnosti ciljne RNA. Viša temperatura će povećati protok.

5. Analizirajte protok i otopinu iznad membrane (ciljna RNA) UV/vis apsorpcijskom spektroskopijom i PAGE analitičkom denaturacijom kako biste osigurali da nijedna RNA nije prošla kroz membranu centrifugalnog koncentratora.

6. U zadnjem koraku ispiranja, koncentrirajte otopinu na 200-300 µl i pipetom uklonite RNA iz centrifugalnog koncentratora.

RNA se može zalijepiti za membranu i stoga se mora snažno ukloniti pipetom. Preporuča se da se otopina RNA pipetira duž unutarnje strane membrane i da se membrana ispere s malom dodatnom količinom NMR pufera (∼50 µl) nakon uklanjanja.

7. Odredite koncentraciju RNA UV/vis apsorpcijskom spektroskopijom.

Uzmite u obzir MgCl2, D2O i DSS koji će se naknadno dodati i razrijediti uzorak.

8. Nastavite sa presavijanjem i pripremom NMR uzorka kako je opisano u Osnovnom protokolu 1, koraci 30-46.

1: PRIPREMA DNA PREDLOŠKA IZ PLAZMIDA

Svaka RNA polimeraza ovisna o DNA koja se koristi u in vitro transkripciji zahtijeva DNA šablon iz kojeg se može očitati slijed i sintetizirati RNA lanac. Uobičajeni šablon je linearizirani DNA plazmid koji kodira kasetu za transkripciju RNA. S linearizacijom izravno nizvodno od kasete za transkripciju nije potreban terminator transkripcije, ali umjesto toga polimeraza će stvoriti transkripte oticanja (Diaz, Rong, McAllister, & Durbin, 1996.). U ovom Protokolu podrške 1 pružamo upute korak po korak o tome kako pripremiti predložak plazmidne DNA.

Materijali

  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • Kompetentan DH5α Escherichia coli stanice (npr. New England Biolabs)
  • SOC medij (isporučuje se s nadležnim stanicama za transformaciju plazmida)
  • LB-agar ploče sa 100 µg/ml ampicilina
  • LB medij (vidi recept)
  • 100 mg/ml ampicilina
  • 50% glicerola (za zalihe glicerola pogledajte korak 6)
  • Komplet za pročišćavanje plazmidne DNK (npr. Macherey Nagel)
  • Restrikcijski enzim (npr. New England BioLabs)
  • 10× CutSmart ® reakcijski pufer (New England Biolabs, kat. br. B7204S isporučen s enzimom)
  • Otopina agaroznog gela (vidi recept)
  • Pufer za punjenje DNK (npr. Gel Loading Dye: Purple, New England Biolabs ili pogledajte recept)
  • DNK tekući pufer (1× TAE vidi recept)
  • Otopina fenol-kloroform-izoamil alkohola (PCI) (npr. ROTI®, kat. br. A156.1)
  • Kloroform (Thermo Fisher Scientific, kat. br. 10293850)
  • 3 M natrijev acetat (NaOAc), pH 5,5
  • Apsolutni etanol (Merck, kat. br. 32205-2,5L-M)
  • 2-Propanol (VWR Chemicals, kat. br. 20842.330)
  • Inkubator za mućkanje
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Komora za lijevanje agaroznog gela i staklene ploče
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)

Transformacija i pojačanje

Ovaj protokol pretpostavlja prethodno uspješno umetanje kasete za transkripciju RNA u odgovarajući bakterijski plazmid. Svaki plazmid sa sekvencom promotora T7 (klasa III) i otpornošću na ampicilin trebao bi biti prikladan.

1. Izvršite transformaciju plazmida u kompetentan DH5α E coli ćelije prema uputama proizvođača.

2. Pripremite 5 ml, 50 ml i 1 L LB medija sa 100 µg/ml ampicilina u odgovarajućim tikvicama.

Dodajte ampicilin neposredno prije upotrebe.

3. Odabrati izolirani klon s LB-agar ploče (npr. sa sterilnim vrhom pipete) i premjestiti u tikvicu kulture od 5 ml.

Također možete inokulirati s prethodno pripremljenom zalivom glicerola. Za to ili nakratko odmrznite temeljac glicerola i dodajte 20-50 µl vašoj kulturi od 5 ml ili prenesite dio smrznutog gliceronskog temeljca izravno koristeći, npr., sterilni vrh pipete.

4. Uzgajajte stanice ∼4-6 sati na 37°C i 120 o/min prije prijenosa 5-ml starter kulture u 50 ml starter kulture. Inkubirajte kulturu od 50 ml na 37°C i 120 o/min preko noći.

5. Izmjerite OD600 starter kulture i prenijeti odgovarajući volumen u glavnu kulturu kako bi se prilagodio početni OD600 do ~0,1.

6. Inkubirajte glavnu kulturu još 6-10 sati na 37°C i 120 o/min.

Za dugotrajno skladištenje i brzu inokulaciju preporučamo pripremu glicerola. Stoga, tijekom eksponencijalne faze rasta stanica, uzmite 0,5 ml stanične kulture i temeljito pomiješajte s 0,5 ml 50% glicerola. Zamrznite suspenziju stanica u tekućem dušiku i pohranite na -80°C. Zalihe glicerola upotrijebite za buduće inokulacije.

7. Centrifugirajte medij kulture na 4000 × g tijekom 15 minuta i 4°C za prikupljanje stanica.

8. Izolirajte plazmidnu DNA prema uputama kompleta za pročišćavanje plazmidne DNA.

Linearizacija

9. Izvedite restrikcijsku digestiju na analitičkoj skali od 50 µl. Za to pripremite reakcijsku smjesu prema protokolu u tablici 4.

Dok ukupni volumen potrebnog enzima ovisi o koncentraciji koju je odredio proizvođač, pazite da volumen enzima ne prelazi 10% ukupnog reakcijskog volumena kako biste spriječili aktivnost zvijezde zbog viška glicerola. Ako je potrebno, povećajte volumen reakcijske smjese.

10. Pomiješajte sve komponente reakcije pri čemu je enzim posljednja komponenta koja se dodaje.

Reagens Količina
Restrikcioni enzim 10 jedinica
10× Cutsmart reakcijski pufer 5 µl (1×)
DNA plazmid 1 µg
ddH2O Dodajte do 50 µl

11. Inkubirajte reakciju probave 1 sat na temperaturi optimalnoj za restrikcijski enzim.

Provjerite specifikacije enzima obično je 25°C ili 37°C.

12. Provjerite učinkovitost linearizacije gel elektroforezom koristeći 1% agarozni gel. Nanesite ∼150 ng DNK po uzorku.

13. Nakon uspješne linearizacije testa, pripremite preparativnu digestiju. Izračunajte količinu enzima koja je potrebna za probavu ukupne količine plazmida (npr. 1 U/µg DNA). Ako je potrebno, pogledajte specifikacije proizvođača i protokole vašeg pojedinačnog enzima.

Količina enzima koji se koristi za preparativnu probavu može se značajno smanjiti kada se vrijeme inkubacije produži. Za vrijeme inkubacije od 8 ili 16 sati potrebno je samo 0,25 odnosno 0,13 U po µg DNA. Provjerite podatke proizvođača o vašem restrikcijskom enzimu da vidite je li prikladan za produženu probavu.

Volumen enzima ne smije prelaziti 10% ukupnog reakcijskog volumena kako bi se spriječila aktivnost zvijezde zbog viška glicerola.

Ekstrakcija fenol-kloroform-izoamil alkoholom

14. Dodajte jedan volumen otopine PCI otopini reakcije digestije i snažno miješajte prije centrifugiranja 10 minuta na 9000 × g na 4°C.

15. Pažljivo prenesite vodenu fazu (gornja faza) u novu epruvetu i ponovno ponovite ekstrakciju s jednim volumenom svježe PCI. Ponovno prebacite vodenu fazu u novu epruvetu.

16. Dodajte jedan volumen kloroforma u vodenu fazu. Temeljito promiješajte i centrifugirajte 10 minuta na 9000 × g. Pažljivo prebacite vodenu fazu (gornju fazu) u novu epruvetu.

U ovom koraku kloroforma uklanjaju se zaostali tragovi fenola.

17. Dodajte jednu desetinu volumena 3 M NaOAc u vodenu fazu, pomiješajte i precipitirajte s 0,7 volumena 2-propanola ili 2,5 volumena apsolutnog etanola. Inkubirajte na -20°C 1 sat.

18. Centrifugirajte 30 min na 9000 × g i 4°C, pažljivo dekantirati supernatant i isprati pelet s 5 ml 70% etanola, prije ponovnog centrifugiranja 15 minuta na 4°C i 9.000 × g.

19. Odlijte supernatant i na zraku suhe pelete 5-10 min. Razdvojite DNK u ∼500-2000 µl ddH2O.

20. Odredite koncentraciju putem UV/vis apsorpcije na 260 nm i izvršite elektroforezu u agaroznom gelu s lineariziranim plazmidom i neprobavljenim plazmidom kao kontrolom.

Pogledajte sliku 5 za referencu. Linearizirani plazmid trebao bi teći drugačije (obično više) u agaroznom gelu od supersmotanog plazmida.

2: PRIPREMA PCR DNA KAO PREDLOŠKA

PCR je brza i prikladna metoda za amplifikaciju DNA (Mullis i sur., 1986.). Predložak DNK za ovu metodu obično se kupuje ili sintetizira u kući sintezom u čvrstoj fazi. Ispravan dizajn ovog predloška DNK opisan je u Strateškom planiranju. Ako je potrebna homogenost 3′, korištenjem 2′-O-metil modificirani reverzni primeri alternativno su rješenje za primjenu ribozima. Metoksi skupina na 5′ kraju PCR šablonske DNA zaustavlja transkripciju jer destabilizira kompleks između polimeraze i šablona, ​​sprječavajući netemplatiranu sintezu RNA (Kao i sur., 1999.).

Za maksimalnu količinu čistog PCR produkta, reakcijski uvjeti kao što su primer, šablon i MgCl2 koncentracije moraju biti optimizirane. Nadalje, temperatura žarenja mora biti optimizirana kako bi se dobio visok prinos DNA produkta. Sve optimizacije i postupak za uspješan PCR opisani su unutar ovog protokola podrške.

Materijali

  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • PCR šablon DNK (Eurofins Genomics)
  • Prednji DNA primer (Eurofins Genomics)
  • Reverzni DNA primer (Eurofins Genomics)
  • Phusion ® DNA polimeraza visoke vjernosti (New England Biolabs, kat. br. M0530)
  • Phusion high-fidelity (HF)/GC pufer (New England Biolabs, kat. br. B0518S/B0519S)
  • dNTP (New England Biolabs, kat. br. N0447L)
  • Native PAGE gel otopina za DNK (vidi recept)
  • Otopina agaroznog gela (vidi recept)
  • Pufer za punjenje DNK (npr. Gel Loading Dye: Purple, New England Biolabs ili pogledajte recept)
  • DNK pufer (1× TAE vidi recept)
  • dimetil sulfoksid (DMSO)
  • Termocikler (Biometra Tone Analytik Jena Company)
  • Komora za lijevanje agaroznog gela i staklene ploče
  • PAGE komora za lijevanje i staklene ploče (Biometra multigel Analytik Jena Company)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)

1. Dizajnirajte PCR šablon DNA (vidi Strateško planiranje) i početnice. Kupite konstrukte ili ih pripremite sintezom u čvrstoj fazi (npr. Eurofins Genomics).

Temeljni premazi moraju imati sličnu temperaturu taljenja. Nadalje, trebale bi imati duljinu od 10-20 nt. Imajte na umu da se početni slijed potencijalno može više puta pojavljivati ​​u ciljnoj DNK sekvenci što dovodi do pogrešnog pražnjenja i neželjenih nusproizvoda.

2. Rekonstituirajte liofiliziranu PCR šablonsku DNA s ddH2O za dobivanje koncentracije od 100 µM.

Pripremite razrijeđenu temeljnu otopinu DNA s koncentracijom od 1 µM, kako biste izbjegli ponovljene cikluse odmrzavanja i zamrzavanja izvorne osnovne otopine za svaki PCR pokus.

3. Rekonstituirajte liofilizirane početnice s ddH2O za dobivanje koncentracije od 100 µM.

4. Provjerite sljedeće korake optimizacije na nativnoj STRANICI za DNK ili agarozni gel.

Nativna PAGE za DNK će otkriti oštrije trake od agaroznog gela. Međutim, za veće DNA konstrukte (>1 kbp) agarozni gel je prikladniji, jer DNK brže migrira kroz matriks gela.

5. Optimizirajte temperaturu žarenja i broj ciklusa (slika 6). Optimizirajte vrijeme istezanja prema duljini predloška. Primjer programa prikazan je u tablici 5.

3°C iznad temperature taljenja temeljnog premaza dobar je izbor za početnu temperaturu žarenja. Optimizirajte u rasponu od ±10°C oko temperatura taljenja temeljnog premaza. Za broj ciklusa koristite do 30 ciklusa.

Korak Temperatura Vrijeme
1. Denaturiranje 98°C 2 min
2. Žarenje 50°-60°C 20 s
3. Produljenje 72°C 15 s
4. Denaturiranje 98°C 10 s
5. Idite na korak 2. Ponovite 20-30 puta

6. Optimizirajte koncentracije prajmera kako biste maksimalno povećali prinos ciljne DNA (slika 7). Pokušajte s 0,5-1,0 µM za svaki primer.

7. Optimizirajte PCR koncentraciju DNA predloška kako biste maksimizirali prinos ciljne DNA i izbjegli dodatni nusprodukt (pogledajte Rješavanje problema). Pokušajte 1-3 ng/µl šablona.

8. Optimizirajte koncentraciju DMSO u slučaju nusproizvoda kako biste olakšali vezanje početnica. Koristite do 3% DMSO.

Ako koristite DMSO, smanjite temperaturu žarenja (∼1°-2°C) jer DMSO smanjuje temperaturu taljenja oligonukleotida. Može se provesti dodatna optimizacija temperature žarenja s DMSO.

9. Odredite količinu DNA potrebnu za reakciju preparativne transkripcije.

10. Postavite glavnu mješavinu sa svim reagensima u reakcijsku epruvetu od 2 ml kao što je prikazano na shemi pipetiranja (Tablica 6) i rasporedite u PCR reakcijske epruvete. Svaka epruveta treba sadržavati 50 µl reakcijske smjese.

Reagens Količina
ddH2O Za ciljani volumen
HF/GC pufer
PCR šablon DNK 1-3 ng/µl
Naprijed temeljni premaz 0,5-1,0 uM
Obrnuti temeljni premaz 0,5-1,0 uM
dNTP mješavina 200 µM
DMSO (opcionalno) do 3%
Phusion DNAP 1 U/50 µl PCR

11. Izvedite PCR s optimiziranim uvjetima.

12. Kombinirajte uzorke iz pojedinačnih PCR reakcijskih epruveta i pokrenite analitičku elektroforezu u agaroznom gelu ili nativni PAGE za DNA kako biste potvrdili uspješnu reakciju.

13. Koristite PCR proizvod izravno za transkripciju bez ikakvih koraka pročišćavanja u slučaju pojedinačnog čistog proizvoda.

Ako se nusprodukti formiraju, ali se ne transkribiraju, PCR proizvod se može koristiti za daljnju transkripciju bez pročišćavanja. Čuvati na -20°C ako se ne koristi izravno.

3: PRIPREMA T7 RNA POLIMERAZE (T7 RNAP)

Iako je T7 RNAP komercijalno dostupan, kupnja količine potrebne za in vitro transkripciju RNA u NMR skali može biti prilično skupa. Ovaj protokol podrške pruža uštedu i jednostavnu alternativu komercijalnom proizvodu. Nadalje, preporučamo korištenje P266L mutanta T7 RNAP budući da značajno poboljšava in vitro transkripciju, osobito iz šablona koji nose nepovoljne početne sekvence (Guillerez i sur., 2005.).

Materijali

  • BL21 DE3 E coli stanice koje nose plazmid pBH161 (plazmid je dar M. Dreyfusa, CNRS, Pariz, Francuska stanice koje je isporučio New England Biolabs)
  • LB ili TB medij (vidi recept)
  • 100 mg/ml ampicilina
  • Antifoam Y-30 emulzija (npr. MilliporeSigma)
  • 1 M IPTG
  • T7 RNAP pufer A (vidi recept)
  • T7 RNAP pufer B (vidi recept)
  • SDS gel za slaganje i razrjeđivanje (vidi recept)
  • SDS radni međuspremnik (vidi recept)
  • SDS pufer za uzorke (vidi recept)
  • Coomassie otopina za bojenje (vidi recept)
  • T7 RNAP pufer C (vidi recept)
  • Glicerol (Carl Roth, kat. br. 3783.1)
  • Inkubator za mućkanje
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Homogenizacija pod visokim pritiskom (npr. Microfluidizer ® M-110 P Microfluidics)
  • FPLC sustav
  • 5-ml Ni-NTA afinitetna kolona (npr. GE HisTrap HP 5 ml kolona)
  • SDS komora za lijevanje i staklene ploče (XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System)
  • Preparativna kolona za isključenje veličine (npr. GE HiLoad 26/600 Superdex 200 pg kolona za gel filtraciju)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)

Ekspresija i prikupljanje stanica

1. Pripremite 50 ml starter kulture i 1 L glavne kulture koja sadrži LB ili TB medij sa 100 µg/ml ampicilina.

Iako se LB medij češće koristi u kulturama bakterijskih stanica, TB medij može dati do tri puta veću gustoću stanica, što rezultira povećanom količinom izraženog proteina. Na temelju prethodnih izraza, 1 L TB medija daje između 5-10 mg pročišćenog proteina.

Dodajte ampicilin neposredno prije upotrebe.

2. Inokulirajte starter kulturu sa zalihama glicerola BL21 DE3 E coli stanice koje sadrže plazmid pBH161 i inkubiraju na 37°C i 120 rpm preko noći.

3. Izmjerite OD600 starter kulture i prenijeti odgovarajući volumen u glavnu kulturu kako bi se prilagodio početni OD600 do ~0,1.

Ako planirate dodati emulziju protiv pjene glavnoj kulturi kako biste spriječili stvaranje pjene, uzmite u obzir da će protupjenilo povećati optičku gustoću medija kulture i da ga treba dodati glavnoj kulturi prije bilo kakvog slijepog mjerenja.

4. Inkubirajte glavnu kulturu na 37°C i 120 o/min do OD600 od 0,6-0,8 za LB medij ili 1-2 za medij TB.

Zbog veće maksimalne gustoće stanica u TB mediju, idealna točka indukcije unutar eksponencijalnog rasta je na višem OD-u600 vrijednost. OD600 od 0,6-0,8 obično se postigne unutar 3-4 sata, OD600 od 1-2 unutar 4-5 sati.

5. Dodajte IPTG do konačne koncentracije od 0,5 mM kako biste potaknuli ekspresiju proteina.

6. Uzgajati stanice na 37°C do OD600 od 10-15 je postignuto. To obično traje 3 sata više.

7. Centrifugirajte medij kulture na 4000 × g i 4°C tijekom 15 min za prikupljanje peleta stanica.

Pročišćavanje

Provedite sve korake pročišćavanja na 4°C.

8. Resuspendirajte staničnu peletu u T7 RNAP puferu A (∼25 ml lizata po 1 L stanične kulture).

9. Liza suspenzija stanica putem homogenizacije pod visokim tlakom.

Postavite tlak u sustavu na 15.000 psi. Nakon ispiranja homogenizatora s 300-400 ml vode, a zatim s 200 ml T7 RNAP pufera A, lizat se provlači kroz sustav pet do šest puta uz stalno hlađenje čaše zavojnice ledom. Imajte na umu da se ti volumeni odnose na Microfluidizer ® i da se mogu mijenjati s različitim modelima ili metodama homogenizacije. Za više pojedinosti, pogledajte protokole proizvođača.

10. Centrifugirajte lizat na >35 000 × g 30 minuta na 4°C.

11. Odlijte supernatant i filtrirajte s veličinom pora od 0,8 µm ako su vidljivi precipitati.

12. Uravnotežite Ni-NTA kolonu od 5 ml s deset volumena stupca (CV) T7 RNAP pufera A.

Za brzine protoka i ograničenja tlaka koristite postavke u skladu sa specifikacijama stupca.

13. Nanesite proteinsku otopinu na kolonu.

14. Isperite kolonu s deset CV T7 RNAP pufera A.

15. Isperite kolonu s deset CV 5% T7 RNAP pufera B.

16. Isperite kolonu s deset CV 10% T7 RNAP pufera B.

17. Nanesite gradijent 100% T7 RNAP pufera B na 100 ml i sakupite eluat u frakcijama od 5 ml (pogledajte sliku 8A za referencu).

18. Pokrenite 12% SDS-PAGE svih frakcija i frakcija koje sadrže T7 RNAP (pogledajte sliku 9A za referencu).

19. Uravnotežite kolonu za gel filtraciju s 1,5 CV 2,5× T7 RNAP puferom C.

20. Stavite T7 RNAP na stupac za isključivanje veličine.

Maksimalni volumen koji se učitava ovisi o veličini stupca i specifikacijama. Provjerite preporuke proizvođača kako biste osigurali optimalno odvajanje. Ako je potrebno, smanjite volumen otopine enzima centrifugalnom koncentracijom.

21. Eluirajte s jednim CV od 2,5× T7 RNAP pufera C i sakupite eluat u frakcijama od 5 ml (pogledajte sliku 8B za referencu).

22. Pokrenite 12% SDS-PAGE svih frakcija i frakcija koje sadrže T7 RNAP (pogledajte sliku 9B za referencu).

23. Provjerite jesu li odabrane frakcije kontaminirane RNase inkubiranjem analitičke količine svake frakcije s ∼15 pg RNK po izboru preko noći na sobnoj temperaturi ili 4 sata na 37°C. Također uključite kontrolni uzorak bez proteina. Provjerite na denaturiranoj STRANICI je li RNA još netaknuta. RNA traka treba biti jasna i oštra. Razmazana RNA traka ili fragmentacija u manje RNA pokazatelj je probave RNKaze. Pool protein koji ne pokazuje nikakve znakove aktivnosti RNase.

24. Podesite koncentraciju proteina na 6 mg/ml s 2,5× T7 RNAP puferom C.

25. Dodajte glicerol do konačne koncentracije od 60% (konačna koncentracija proteina: 2,4 mg/ml 1× T7 RNAP pufer C), alikvot i pohranite enzim na –80°C.

4: PRIPREMA NEORGANSKE PIROFOSFATAZE kvasca (YIPP)

Prinos RNA transkripcije jako ovisi o koncentraciji iona Mg 2+ u reakcijskoj smjesi. Formiranje pirofosfata dovodi do taloženja magnezijevog pirofosfata, istovremeno smanjujući koncentraciju iona Mg 2+ u otopini. Budući da savijanje ribozima i aktivnost T7 RNAP ovise o ionima Mg 2+, njihova koncentracija treba biti stabilna tijekom transkripcije (Karlsson, Baronti i Petzold, 2020.). Da bi se postigla ova stabilnost, 9,6 µg/ml YIPP se može koristiti za razgradnju pirofosfata u monofosfat, čime se sprječava uklanjanje magnezija precipitacijom (Kunitz, 1952.).

Materijali

  • pET-21a(+)-IPP1-Njegov plazmid (plazmid je dar Sebastiana Maerkla Addgenea, plazmid #118978, vidi Lavickova & Maerkl, 2019.)
  • LB medij (vidi recept)
  • 100 mg/ml ampicilina
  • BL21(DE3) Kompetentan E coli stanice (New England Biolabs)
  • 1 M IPTG
  • YIPP pufer A (vidi recept)
  • YIPP pufer B (vidi recept)
  • SDS gel za slaganje i razrjeđivanje (vidi recept)
  • SDS radni međuspremnik (vidi recept)
  • SDS pufer za uzorke (vidi recept)
  • Coomassie otopina za bojenje (vidi recept)
  • YIPP pufer C (vidi recept)
  • YIPP pufer D (vidi recept)
  • Glicerol (Carl Roth, kat. br. 3783.1)
  • Inkubator za mućkanje
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Homogenizacija pod visokim pritiskom (npr. Microfluidizer ® M-110 P Microfluidics)
  • FPLC sustav
  • 5-ml Ni-NTA afinitetna kolona (npr. GE HisTrap HP 5 ml kolona)
  • SDS komora za lijevanje i staklene ploče (XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System)
  • Preparativna kolona za isključenje veličine (npr. GE HiLoad 26/600 Superdex 75 pg kolona za gel filtraciju)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)

Ekspresija i prikupljanje stanica

Na temelju prethodnih izraza, 1 L LB medija daje između 35-40 mg pročišćenog proteina.

1. Pripremite 50 ml starter kulture i 1 L glavne kulture koja sadrži 2× LB medija i 100 µg/ml ampicilina.

Dodajte ampicilin neposredno prije upotrebe.

2. Inokulirajte starter kulturu sa zalihama glicerola BL21 DE3 E coli stanice koje sadrže plazmid pET-21a(+)-IPP1-His i inkubiraju na 37°C i 160 rpm preko noći.

3. Izmjerite OD600 starter kulture i prenijeti odgovarajući volumen u glavnu kulturu kako bi se prilagodio početni OD600 do ~0,1.

4. Inkubirajte glavnu kulturu na 37°C i 130 o/min do OD600 dostiže se od 0,6-0,8.

OD600 od 0,6-0,8 obično se postigne unutar 3-4 sata.

5. Dodajte konačnu koncentraciju od 1 mM IPTG da potaknete ekspresiju proteina.

6. Uzgajati stanice još 5 sati na 37°C.

7. Centrifugirajte medij kulture na 4000 × g 30 min i 4°C da se sakupi pelet stanica.

Pročišćavanje

Kako bi se održala termostabilnost enzima, preporuča se da se svi koraci pročišćavanja provode na 4°C.

8. Resuspendirajte staničnu peletu u YIPP puferu A (∼25 ml lizata po 1 L stanične kulture).

9. Liza suspenzija stanica putem homogenizacije pod visokim tlakom.

10. Odlijte supernatant i filtrirajte s veličinom pora od 0,8 µm ako su vidljivi precipitati.

11. Uravnotežite Ni-NTA kolonu od 5 ml s deset CV YIPP pufera A.

12. Nanesite proteinsku otopinu na kolonu.

13. Isperite kolonu s deset CV YIPP pufera A.

14. Eluirajte s gradijentom YIPP pufera B (0%-100% tijekom 50 min) i sakupite eluat u frakcijama od 5 ml (pogledajte Protokol podrške 3, Slika 8A za referencu).

15. Pokrenite 15% SDS-PAGE svih frakcija i frakcija u grupi koje sadrže YIPP (33,2 kDa pogledajte Protokol podrške 3, sl. 9A za referencu).

Sljedeći korak izuzimanja veličine nije obvezan, ali se preporučuje.

16. Uravnotežite kolonu isključenja veličine s 1,5 CV YIPP pufera C.

17. Učitajte YIPP otopinu u stupac isključenja veličine.

Maksimalni volumen koji se učitava ovisi o veličini i specifikacijama stupca. Provjerite preporuke proizvođača kako biste osigurali optimalno odvajanje. Ako je potrebno, smanjite volumen otopine enzima centrifugalnom koncentracijom.

18. Eluirajte s jednim CV YIPP pufera C i sakupite eluat u frakcijama od 5 ml (pogledajte Protokol podrške 3, Slika 8B za referencu).

19. Pokrenite 15% SDS-PAGE svih frakcija i frakcija u grupi koje sadrže YIPP (pogledajte Protokol podrške 3, sl. 9B za referencu).

20. Provjerite jesu li frakcije koje sadrže YIPP kontaminirane RNase inkubiranjem analitičke količine svake frakcije s ∼15 pg RNK po izboru preko noći na sobnoj temperaturi ili 4 sata na 37°C. Također uključite kontrolni uzorak bez proteina. Provjerite na denaturiranoj STRANICI je li RNA još netaknuta. RNA traka treba biti jasna i oštra. Razmazana RNA traka ili fragmentacija u manje RNA pokazatelj je probave RNKaze. Pool protein koji ne pokazuje nikakve znakove aktivnosti RNase.

21. Kombinirane frakcije dijalizirajte dvaput (svaka po 1 sat) protiv 1 L 2× YIPP pufera D.

22. Podesite koncentraciju na ∼2,4 mg/ml pomoću centrifugalne koncentracije.

23. Dodajte 50% (v/v) glicerola da postignete konačnu koncentraciju zaliha od 1,2 mg/ml.

24. Alikvot i čuvajte enzim na –20°C.

2: PRIPREMA OBILJEŽENIH RNA SPECIFIČNIH MJESTA KORIŠTENJEM KEMO-ENZIMATSKE SINTEZE

NMR spektroskopska karakterizacija sve dužih RNA otežava povećano preklapanje rezonancija. Ovaj se problem potencijalno može izbjeći metodama označavanja specifičnih za mjesto. Međutim, najčešće korištena metoda za te svrhe, sinteza u čvrstoj fazi, ograničena je na ∼50 nt (Jud & Micura, 2017.). Ovdje pružamo protokol za kemo-enzimsku sintezu RNA koje sadrže jedan modificirani/obilježeni nukleotid na željenoj poziciji bez ograničenja veličine. Ugrađivanjem 13 C, 15 N obilježenih ili neprirodno modificiranih nukleozida, kao što su 19 F ili 13 C-metoksi skupine, specifično za mjesto, brojnost signala se dramatično smanjuje i mogu se dobiti spektri s pojedinačnim signalima (Keyhani et al., 2018. ). Koristeći ovu metodu, moguće je čak inkorporirati modificirane nukleozide koji nose sterički zahtjevne modifikacije kao što su fotouklonjive zaštitne skupine (npr. orto-nitrofeniletil) ili fotoprekidači (npr. azobenzen).

Lokalno specifično ugrađivanje modificiranog nukleotida u RNA uključuje tri enzimska koraka (enzimski put na slici 10). Prvi korak je 3′ produžetak akceptorske RNA lanca (RNA 1) s modificiranim nukleozidnim 3′,5′-bisfosfatom (za sintezu vidjeti Protokol podrške 5) korištenjem T4 RNA ligaze 1 (T4 Rnl1). Daljnja proširenja blokirana su fosfatnom skupinom na 3′ poziciji modificiranog nukleotida. Smjesa za ligiranje može se ili pročistiti pomoću RP-HPLC ili se nevezana RNA može oksidirati s NaIO4 kako bi ga uklonili iz enzimskog puta. Fosfatnu skupinu na poziciji 3′ uklanja fosfataza, a RNA se (udlaga) veže s 5′-fosforiliranim donorskim RNA lancem (RNA 2) u prisutnosti DNA udlaga pomoću T4 RNA ligaze 2 (T4 Rnl2 za enzim priprema vidi Protokol podrške 6). RNA je pročišćena, npr. RP-HPLC. Enzimi se mogu kupiti komercijalno, međutim, preporučamo pripremu T4 Rnl2 u kući zbog značajnog faktora troškova i uočene veće učinkovitosti ligacije kao što je opisano u Protokolu podrške 6.

Materijali

  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • 3′,5′-bisfosfatni nukleozid (vidi Protokol podrške 5)
  • Akceptorska RNA (RNA 1) s OH grupom na 3′ kraju (vidi Osnovni protokol 1)
  • Donorska RNA (RNA 2) s fosfatnom grupom na 5′ kraju (Eurofins Genomics ili vidi Osnovni protokol 1)
  • DNA udlaga (Eurofins Genomics)
  • T4 polinukleotidna kinaza (T4 PNK New England Biolabs, kat. br. M0201S)
  • T4 RNA ligaza 1 (New England Biolabs, kat. br. M0204S)
  • T4 RNA ligaza 1 pufer (isporučuje se s T4 RNA ligazom 1)
  • Fosfataza i odgovarajući pufer (npr. alkalna fosfataza škampa, npr. New England Biolabs, kat. br. M0371S)
  • 10× CutSmart ® reakcijski pufer (New England Biolabs, kat. br. B7204S opskrbljen alkalnom fosfatazom škampa)
  • T4 RNA ligaza 2 (vidi Protokol podrške 6 New England Biolabs, kat. br. M0239S)
  • T4 DNA ligazni pufer (New England Biolabs, kat. br. B0202S)
  • DMSO (Carl Roth, kat. br. A994.2)
  • ATP (MilliporeSigma, kat. br. A6419-1G)
  • Otopina fenol-kloroform-izoamil alkohola (PCI) (npr. ROTI®, kat. br. A156.1)
  • Kloroform (Thermo Fisher Scientific, kat. br. 10293850)
  • Natrijev perjodat (NaIO4 Carl Roth, mačka. Ne. 2603.1)
  • 50% (v/v) etilen glikol (Grüssing, kat. br. 103081000U)
  • 3 M natrijev acetat (NaOAc), pH 5,5 (Carl Roth, kat. br. 6773,2)
  • Apsolutni etanol (Merck, kat. br. 32205-2,5L-M)
  • Denaturirajući pufer za punjenje RNA (vidi recept)
  • Otopina gela za denaturiranje PAGE (vidi recept)
  • Denaturiranje radnog međuspremnika PAGE (1× TBE vidi recept)
  • DNaza i odgovarajući pufer (npr. Turbo™ DNase, Thermo Fisher Scientific, kat. br. AM2238)
  • Heksafluor-2-propanol (HFIP Fluorochem, kat. br. 003409)
  • Metanol (Thermo Fisher Scientific, kat. br. M/4000/17)
  • Materijali za preparativnu PAGE (vidi Alternativni protokol 1)
  • Inkubator za mućkanje
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifugalni koncentrator (npr. Vivaspin™, Sartorius™)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)
  • Liofilizator/centrifugalni vakuum koncentrator (Alpha 2-4, Christ vacuum concentrator plus, Eppendorf)
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • PAGE komora za lijevanje i staklene ploče (Biometra multigel Analytik Jena Company)
  • Toplinski blok
  • HPLC uređaj (Elite LaChrom VWR-Hitachi)
  • HPLC kolona (npr. XBridge peptid BEH C18: 300 Å, 3,5 µm, 4,6 × 250 mm)

1. Pripremite modificirani nukleozid 3′,5′-bisfosfat kako je opisano u Protokolu podrške 5.

2. Pripremite akceptorski RNA lanac (RNA 1) i donor RNA lanac (RNA 2) kako je opisano u Osnovnom protokolu 1, koraci 1-27 ili ih kupite komercijalno.

Akceptorski RNA lanac zahtijeva OH skupinu na 3′ kraju, a donorski RNA lanac zahtijeva fosfatnu skupinu na 5′ kraju za kemo-enzimsku inkorporaciju. Ne postoje ograničenja duljine za RNK akceptora ili donora, iako će u slučaju vrlo kratkog fragmenta (

3. Pripremite DNA udlagu za posljednji enzimski korak ili je kupite komercijalno.

DNA udlaga treba imati duljinu od najmanje 40 parova baza. Obje strane trebaju preklapanje od najmanje 10 nt svaka. Preklapanje ne mora biti jednako s obje strane. Temperatura taljenja treba prelaziti 40°C kako bi se osiguralo pravilno žarenje udlaga.

4. Izvedite 5′-fosforilaciju donora RNA lanca (RNA 2), npr. s T4 polinukleotid kinazom (T4 PNK). Slijedite protokol proizvođača.

Kao alternativa, kratki (

5. Preporučamo kupnju T4 RNA ligaze 1 (T4 Rnl1) i fosfataze komercijalno i pripremu T4 RNA ligaze 2 (T4 Rnl2) kod kuće kako je opisano u Protokolu podrške 6.

3′ produžetak akceptorske RNA (RNA 1)

6. Pripremite smjesu za ligaciju koja uključuje sve komponente iz Tablice 7. Inkubirajte smjesu za ligaciju na 37°C i 300 o/min preko noći. Osim toga, pripremite negativnu kontrolu bez T4 Rnl1.

Negativna kontrola je neophodna kako bi se pratilo je li nepovezana RNA uklonjena iz enzimskog puta tijekom oksidacije (korak 9). Stoga će se u sljedećim koracima tretirati kao i svi ostali uzorci i nazivat će se "negativna kontrola 1. koraka" tijekom ovog protokola. Učinkovitost ligacije ovisi o vrsti modifikacije. Povećanje reakcije može dovesti do smanjene učinkovitosti ligacije. Preporuča se da se nekoliko serija priprema paralelno umjesto jedne velike serije.

Reagens Količina
Akceptorska RNA (RNA 1) 50 µM
3′,5′-bisfosfatni nukleozid 200 µM
T4 RNA ligazni pufer
DMSO 20%
T4 RNA ligaza 1 10 jedinica po nmol RNA
ATP 1 mM
ddH2O Dodati do 50-200 µl

7. Izvedite PCI ekstrakciju kako biste uklonili T4 Rnl1.

Preporučamo korištenje 5 Prime Phase Lock Gela iz Quantabio za bolje odvajanje faza, posebno za volumene <150 µl. Za ekstrakciju 5 Prime Phase Lock Gel slijedite priručnik proizvođača.

Kao alternativa, smjesa za ligiranje može se pročistiti RP-HPLC (vidi korak 31). U ovom slučaju, oksidacija u koraku 9 nije potrebna, nastavite s korakom 16. Uzmite u obzir da se duljina obje RNA razlikuje u jednom nukleotidu. Za dugu (>30 nukleotida) akceptorsku RNA (RNA 1), RP-HPLC pročišćavanje neće biti moguće.

8. Dodajte jedan volumen otopine PCI u reakcijsku otopinu i snažno promiješajte. Centrifugirajte 10 minuta na 10 000 × g i 4°C.

9. Pažljivo prenesite vodenu fazu (gornju fazu) u novu epruvetu i ponovite ekstrakciju s jednim volumenom svježe otopine PCI.

Obično su dovoljne dvije ekstrakcije.

10. U vodenu fazu dodajte jedan volumen kloroforma (da biste uklonili tragove fenola) i dobro promiješajte. Centrifugirajte 10 minuta na 10 000 × g i 4°C. Pažljivo prenesite vodenu fazu (gornju fazu) u svježu reakcijsku epruvetu.

11. Pripremite centrifugalni koncentrator kako je opisano u priručniku uređaja.

Odaberite MW cutoff koji je oko trećine veličine vaše ciljne RNA. Na taj način RNA neće proći kroz membranu.

12. Prenesite RNA u centrifugalni koncentrator i centrifugirajte preporučenom brzinom kako biste uklonili pufer za ligaciju.

ATP i DTT u puferu za ligaciju spriječit će oksidaciju NaIO4. Ponovljene precipitacije etanola (otprilike tri) također mogu biti dovoljne za uklanjanje pufera za ligaciju.

13. Provedite oksidaciju s NaIO4 za uklanjanje nepovezane RNA iz enzimskog puta. Oksidirajte "korak 1 negativnu kontrolu". Shema pipetiranja za oksidaciju prikazana je u tablici 8. Inkubirajte reakciju 1 sat i 300 o/min na sobnoj temperaturi (23°C).

NaIO4 je osjetljiv na svjetlost. Stoga se preporuča da se reakcijska smjesa zaštiti od svjetlosti, npr. aluminijskom folijom.

14. Ugasiti reakciju oksidacije dodavanjem 0,5 volumena 50% (v/v) etilen glikola. Inkubirajte smjesu 5 minuta na 300 o/min.

15. Dodajte otopinu NaOAc (pH 5,5) u vodenu fazu do konačne koncentracije od 0,3 M. Dodajte 2,5 volumena hladnog apsolutnog etanola i inkubirajte najmanje 6 sati na -20°C.

16. Centrifugirajte na 8 000 × g i 4°C 40 min. Uklonite supernatant i sačuvajte ga za daljnje taloženje.

Ponekad se RNA ne taloži kvantitativno.

17. Osušite pelet na zraku (15-30 min) ili/i koristite vakuumski koncentrator 2 min.

18. Rekonstituirajte RNA pelet u 50-200 µl ddH2O.

19. Analizirajte RNA UV/vis apsorpcijskom spektroskopijom i analitičkom denaturacijom PAGE.

Uzmite u obzir da UV/vis apsorpcija može biti veća zbog ostatka ATP-a i nukleozida 3′,5′-bisfosfata, koji možda nisu u potpunosti uklonjeni u koraku 3.

Defosforilacija ligirane RNA

20. Za defosforilaciju, npr. brzom intestinalnom alkalnom fosfatazom teleta (CIP), antarktičkom fosfatazom (AnP) ili alkalnom fosfatazom škampa (rSAP), pogledajte odgovarajući priručnik proizvođača fosfataze. Defosforilirajte i "korak 1 negativnu kontrolu".

Preporučujemo sljedeći protokol sa shemom pipetiranja danom u tablici 9.Inkubirajte na 37°C najmanje 6 sati. Defosforilacija bi trebala dovesti do gotovo kvantitativnog preokreta. Povećanje reakcije može dovesti do smanjenja učinkovitosti ligacije. Stoga je preporučljivo pripremati nekoliko serija paralelno umjesto jedne velike serije.

Reagens Količina
Ligirana RNA 20-40 uM
CutSmart ® pufer
rSAP 1 jedinica za 500 pmol RNA
ddH2O Dodajte do 50-100 µl

21. Izvedite PCI ekstrakciju kako biste uklonili fosfatazu kao što je opisano u koracima 3-6.

Ne preporučuje se toplinska deaktivacija jer visoka koncentracija kationa može dovesti do razgradnje RNA.

22. Izvedite precipitaciju etanolom kao što je opisano u koracima 11-13.

23. Rekonstituirajte RNA pelet u 50-100 µl ddH2O.

24. Analizirati RNA UV/vis apsorpcijskom spektroskopijom i analitičkom denaturacijom PAGE.

Podvezivanje defosforilirane RNA s donorskom RNA (RNA 2)

25. Pripremite smjesu za podvezivanje udlagama u skladu s tablicom 10. Udlaga također podvezuje “negativnu kontrolu koraka 1”. Dodatno pripremite negativnu kontrolu bez T4 Rnl2.

Preporuča se optimizacija omjera akceptorske, donorske RNA i DNA udlage kao i njihovih koncentracija u reakcijskoj smjesi. Povećanje razine reakcije može dovesti do smanjenja učinkovitosti ligacije i stoga se svako povećanje također mora testirati. Preporučujemo pripremu nekoliko serija paralelno umjesto jedne velike serije. Naši testovi su pokazali da je učinkovitost ligacije veća s puferom T4 DNA Ligase nego puferom T4 Rnl2.

Reagens Količina
Defosforilirana RNA 1-8 µM
Donor RNA (RNA 2) 1-8 µM
DNA udlaga 1-8 uM
T4 pufer DNA ligaze
ddH2O Dodajte do 50-1000 µl
Omjer za optimizaciju (defosforilirana RNA/donorska RNA/DNA udlaga) 1:1:1, 1:2:1, 2:1:2, 1:1:2

26. Zagrijte uzorak na 80°C tijekom 4 min.

27. Ohladiti uzorak na 37°C tijekom 10 min.

28. Inkubirajte 15 min na 37°C i 300 o/min.

29. Dodajte 1% (v/v) T4 Rnl2 proizvedenog u kući (2 mg/ml) i inkubirajte reakciju još 2-3 sata na 37°C i 300 rpm.

30. Izvedite PCI ekstrakciju kao što je opisano u koracima 3-6.

31. Izvedite precipitaciju etanolom kao što je opisano u koracima 11-13.

32. Rekonstituirajte RNA pelet u 20-200 µl ddH2O.

33. Uklonite DNA udlagu pomoću DNase, npr. Turbo™ DNase. Slijedite upute proizvođača.

Vrlo dugo vrijeme inkubacije (npr. preko noći) može dovesti do razgradnje RNA.

34. Analizirati RNA analitičkim denat. STRANICA. Nanesite uzorak RNA s RNA 1 i RNA 2 na denat. PAGE kao referenca.

“Negativna kontrola 1. koraka” i negativna kontrola bez T4 Rnl2 ne bi smjele pokazivati ​​nikakve vrpce proizvoda na denatu. STRANICA. U slučaju da postoji traka proizvoda, to ukazuje na nepotpunu probavu DNaze ili neuspjelu oksidaciju s NaIO4.

35. Pročistiti RNA produkta pomoću RP-HPLC na 60°C.

Koristimo XBridge Peptide BEH C18 (300 Å, 3,5 µm, 4,6 × 250 mm) kolonu od Watersa (slike 11 i 12). RP-HPLC gradijent opisan je u tablici 11.

Kao alternativa RP-HPLC, RNA proizvoda može se pročistiti preparativnom PAGE (vidi Alternativni protokol 1).

36. Uklonite RP-HPLC pufer putem liofilizatora ili centrifugalnog vakuum koncentratora.

37. Rekonstituirajte pelet u 20-200 µl ddH2O.

38. Analizirajte frakcije analitičkom denaturacijom PAGE.

39. Kombinirajte frakcije koje sadrže čisti proizvod.

40. Presavijte RNA u jednu konformaciju i pripremite NMR uzorak kako je opisano u Osnovnom protokolu 1, koraci 30-46.

5: SINTEZA MODIFICIRANIH NUKLEOZIDA 3′,5′-BISFOSFATA

Modificirani nukleozidi zahtijevaju fosfatnu skupinu na pozicijama 3′,5′ za ugradnju specifičnu za mjesto u RNA kao što je opisano u Osnovnom protokolu 2. Ovaj potporni protokol opisuje sintezu modificiranog nukleozida 3′,5′-bisfosfata (Barrio et al. al., 1978. sl. 13).

Materijali

  • Modificirani nukleozid (vidi Osnovni protokol 2)
  • Inertni plin (npr. argon)
  • 0,1% (v/v) dietil pirokarbonat (DEPC Carl Roth, kat. br. K028.2)
  • Trietilamin (VWR Chemicals, kat. br. 28745.296)
  • Trietilamonij bikarbonatni pufer (TEAB), 1,0 M, pH 8,0
  • Trietilamonij bikarbonatni pufer (TEAB), 0,4 M, pH 8,0
  • Difosforil klorid (MilliporeSigma, kat. br. 381829-5ML)
  • Dvostruko destilirana voda (ddH2O)
  • 2-Propanol (VWR Chemicals, kat. br. 20842.330)
  • 25% otopina amonijaka (NH3 VWR Chemicals, kat. Ne. 1133.1000)
  • Schlenkova cijev
  • Potopni rashladni uređaj (FT902 Julabo)
  • Tankoslojna kromatografija (TLC ALUGRAM ® Xtra SIL G/UV Macherey-Nagel)
  • UV lampa, 245 i 365 nm (UVGL-58 Analytik Jena Company)
  • Liofilizator/centrifugalni vakuum koncentrator (Alpha 2-4, Christ vacuum concentrator plus, Eppendorf)
  • HPLC uređaj (Elite LaChrom, VWR-Hitachi)
  • HPLC kolona (npr. MZ Aqua Perfect, 100 Å, 5 µm 4,6 × 250 mm: analitička 10 × 250 mm: preparativna)
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)

1. Provedite sintezu u zaštitnoj atmosferi radi isključivanja vode (npr. argona).

Difosforil klorid hidrolizira u dodiru s vodom.

2. Pripremite 1 M TEAB pufera. Podesite pH na 8,0 suhim ledom.

Inkubirajte pH elektrodu u 0,1% (v/v) DEPC otopini 30 minuta prije upotrebe kako biste izbjegli kontaminaciju RNase. Oprati elektrodu s ddH2O. Pričekajte da se suhi led otopi, a zatim provjerite pH. Radite ispod dimne nape.

3. Pripremite 0,4 M TEAB pufera. Podesite pH na 8,0 suhim ledom.

4. Ohladite modificirani nukleozid na -12°C u Schlenkovoj epruveti.

Možete početi s količinom od 100 mg.

5. Dodajte deset ekvivalenata difosforil klorida i miješajte 4-6 sati na -12°C.

6. Provjerite napredak reakcije TLC-om.

Koristite 6:3:1 2-propanol/NH3/H2O kao eluent. Reaktant obično migrira brže u usporedbi s proizvodom. Proizvod ima Rf vrijednost ∼0,1-0,3.

7. Nakon potpune konverzije početnog materijala (3-6 sati), polagano dodajte led (dva do tri komada) u reakcijsku smjesu.

U ovom koraku, preostali difosforil klorid se hidrolizira. Led hladi egzotermnu reakciju, kada se doda 1,0 TEAB (pH 8) pufera.

8. Podesite pH na 6,5 ​​(koristite pH papir) s prethodno ohlađenim 1,0 M TEAB puferom (pH 8,0).

Obratite pozornost tijekom dodavanja 1,0 M TEAB pufera (pH 8,0) jer dolazi do jakog stvaranja plina. U slučaju da se reakcijska smjesa ne neutralizira nakon dodavanja 20 ml 1 M (pH 8) TEAB, dodajte male količine (npr. 0,5 ml) postupno 1:1 otopine voda/trietilamin.

9. Smanjite reakcijski volumen (3-5 ml za skalu od 100 mg) centrifugalnim vakuumskim koncentratorom na 4°C.

U slučaju taloženja, dodajte vodu da se talog rekonstituira. Manji reakcijski volumen olakšava RP-HPLC pročišćavanje.

10. Pročistiti s RP-HPLC na sobnoj temperaturi.

Koristimo MZ Aqua Perfect (100 Å, 5 µm, 4,6 × 250 mm: analitička, 10 × 250 mm: preparativna) kolonu (slika 14). Gradijent za pročišćavanje prikazan je u tablici 12.

Mogući nusprodukti sinteze su mono- ili trifosfati, koji se ne mogu odvojiti pomoću RP-HPLC.

11. Odredite frakcije koje sadrže proizvod masenom spektrometrijom i združite ih.

12. Uklonite RP-HPLC pufer (trietilamin) ko-evaporacijom i rekonstituirajte pelet u 10 ml ddH2O.

Možete koristiti liofilizator ili centrifugalni koncentrator.

13. Ponovite korak 12 sedam do deset puta s analitičkom količinom tvari koja se analizira NMR spektroskopijom. Trietilamin ne utječe na prinos ligacije. Za uklanjanje trietilamina dovoljno je tri do pet ciklusa ko-evaporacije.

Uklanjanje trietilamina je neophodno za NMR spektroskopsku karakterizaciju.

14. Odredite koncentraciju UV/vis apsorpcijskom spektroskopijom.

15. Okarakterizirajte proizvod masenom spektrometrijom i NMR spektroskopijom ( 1 H-1D, 13 C-1D, 31 P-1D, 1 H, 1 H-korelacijska spektroskopija [COSY], 1 H, 13 C-HSQC, 1 H, 31 P-HMBC).

Nusprodukte poput mono- ili trifosfatnih nukleozida neće prihvatiti T4 RNA ligaza 1. Stoga nije potrebno potpuno odvajanje. Prinos ovisi o vrsti i položaju modifikacije. 31 P-1D signali su obično na ∼0 ppm.

16. Čuvajte proizvod na -20°C u nedostatku svjetla.

6: PRIPREMA T4 RNA LIGAZE 2

T4 RNA ligaza 2 (T4 Rnl2 Ho & Shuman, 2002.) koristi se za Osnovni protokol 2 i komercijalno je dostupna. Ako kupujete, provjerite ima li ligaza aktivnost 2′,3′cycP esteraze. Međutim, kupnja ligaze je vrlo skupa. Stoga, ovaj jednostavan protokol pruža alternativu za kućnu pripremu enzima. Naši testovi su pokazali da je T4 Rnl2 proizveden u vlastitoj kući čak učinkovitiji od kupljenog T4 Rnl2 (slika 15.).

Materijali

  • LB medij (vidi recept)
  • 100 mg/ml ampicilina
  • BL21(DE3) Kompetentan E coli stanice (New England BioLabs)
  • plazmid pET-RNL2 (plazmid je dar S. Shumana, The Sloan-Kettering Institute, New York)
  • Antifoam Y-30 emulzija (npr. MilliporeSigma)
  • 1 M IPTG
  • T4 RNA ligaza 2 (Rnl2) pufer A (vidi recept)
  • T4 RNA ligaza 2 (Rnl2) pufer B (vidi recept)
  • T7 RNAP pufer A (vidi recept)
  • SDS gel za slaganje i razrjeđivanje (vidi recept)
  • SDS radni međuspremnik (vidi recept)
  • SDS pufer za uzorke (vidi recept)
  • Coomassie otopina za bojenje (vidi recept)
  • T4 RNA ligaza 2 (Rnl2) pufer C (vidi recept)
  • Glicerol (Carl Roth, kat. br. 3783.1)
  • Inkubator za mućkanje
  • UV/Vis spektrofotometar (NanoDrop One/One Thermo Fisher Scientific)
  • Centrifuga (Megafuge 8R Thermo Fisher Scientific)
  • Homogenizacija pod visokim pritiskom (npr. Microfluidizer ® M-110 P Microfluidics)
  • FPLC sustav
  • 5-ml Ni-NTA afinitetna kolona (npr. GE HisTrap HP, 5-ml kolona)
  • SDS komora za lijevanje i staklene ploče (XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System)
  • Preparativna kolona za isključenje veličine (npr. GE HiLoad 26/600 Superdex 200 str)
  • Zamrzivač (-20°C/-80°C)

Ekspresija i prikupljanje stanica

1. Pripremite 200 ml starter kulture i 1 L glavne kulture koja sadrži LB medij i 100 µg/ml ampicilina.

Dodajte ampicilin neposredno prije upotrebe.

2. Inokulirajte starter kulturu sa zalihama glicerola BL21 DE3 E coli stanice koje sadrže pET-RNL2 plazmid i inkubiraju na 37°C i 160 rpm preko noći.

3. Izmjerite OD600 starter kulture i prenijeti odgovarajući volumen u glavnu kulturu kako bi se prilagodio početni OD600 do ~0,1.

4. Inkubirajte glavnu kulturu na 37°C i 130 o/min do OD600 od 0,8 je postignuto.

Ako planirate dodati emulziju protiv pjene glavnoj kulturi kako biste spriječili stvaranje pjene, uzmite u obzir da će protupjenilo povećati optičku gustoću medija kulture i da ga treba dodati glavnoj kulturi prije bilo kakvog slijepog mjerenja.

5. Dodajte IPTG do konačne koncentracije od 1 mM kako biste potaknuli ekspresiju proteina.

6. Uzgajati stanice na 37°C do OD600 od 2 je postignuto. To obično traje ukupno 6 sati.

7. Centrifugirajte medij kulture na 4000 × g i 4°C tijekom 15 min za prikupljanje peleta stanica.

Pročišćavanje

Provedite sve korake pročišćavanja na 4°C.

8. Resuspendirajte staničnu peletu u puferu A T4 RNA Ligase 2 (~25 ml lizata po 1 L stanične kulture).

9. Liza suspenzija stanica putem homogenizacije pod visokim tlakom.

Postavite tlak u sustavu na 15.000 psi. Nakon ispiranja homogenizatora s 300-400 ml vode, a zatim s 200 ml T7 RNAP pufera A, lizat se provlači kroz sustav pet do šest puta uz stalno hlađenje čaše zavojnice ledom. Imajte na umu da se ti volumeni odnose na Microfluidizer ® i da se mogu mijenjati s različitim modelima ili metodama homogenizacije. Za više pojedinosti, pogledajte protokole proizvođača.

10. Centrifugirajte lizat na 35 000 × g i 4°C 30 min.

11. Odlijte i filtrirajte supernatant.

12. Uravnotežite Ni-NTA kolonu od 5 ml s deset CV pufera A T4 RNA ligaze 2.

Za brzine protoka i ograničenja tlaka koristite postavke u skladu sa specifikacijama stupca.

13. Nanesite proteinsku otopinu na kolonu.

14. Isprati kolonu s deset CV T4 Rnl2 pufera A.

15. Isprati kolonu s deset CV 4% T4 Rnl2 pufera B.

16. Eluirati s gradijentom T4 Rnl2 pufera B (0% do 100% tijekom 50 min) i sakupiti eluat u frakcijama od 2,5 ml.

17. Provedite 12% SDS-PAGE svih frakcija i frakcija koje sadrže T4 Rnl2 (42 kDa).

18. Uravnotežite kolonu isključenja veličine s 1,1 CV T4 Rnl2 pufera C.

19. Nanesite otopinu T4 Rnl2 u stupac za isključivanje veličine.

Maksimalni volumen koji se učitava ovisi o veličini stupca i specifikacijama. Provjerite preporuke proizvođača kako biste osigurali optimalno odvajanje. Ako je potrebno, smanjite volumen otopine enzima centrifugalnom koncentracijom.

20. Eluirati s 1,1 CV T4 Rnl2 pufera C i sakupiti eluat u frakcijama od 5 ml.

21. Pokrenite 12% SDS-PAGE svih frakcija i odaberite frakcije koje sadrže T4 Rnl2.

22. Provjerite jesu li odabrane frakcije kontaminirane RNase inkubiranjem analitičke količine svake frakcije s ∼15 pg RNK po izboru preko noći na sobnoj temperaturi ili 4 sata na 37°C. Također uključite kontrolni uzorak bez proteina. Provjerite na denaturiranoj STRANICI je li RNA još netaknuta. RNA traka treba biti jasna i oštra. Razmazana RNA traka ili fragmentacija u manje RNA pokazatelj je probave RNKaze. Pool protein koji ne pokazuje nikakve znakove aktivnosti RNase. Podesite koncentraciju na 4 mg/ml pomoću centrifugalnog koncentratora.

23. Dodajte 50% glicerola za konačnu koncentraciju zaliha od 2,0 mg/ml.

24. Alikvot i pohranite enzim T4 Rnl2 na -20°C.

Heteronuklearno detektirani NMR eksperimenti za RNA

Sljedeći protokoli opisuju provedbu nekoliko 13 C- i 15 N-detektovanih NMR eksperimenata za RNA. To uključuje eksperimente za dodjelu kemijskog pomaka 1 H i 13 C atoma riboze prstena, CN-spin filter HSQC eksperiment za imino i C(N)H-HDQC, kao i "amino"-NOESY za amino skupine. Odabir je nadopunjen protokolom za izvođenje 15 N-deteciranih pokusa BEST-TROSY. Za sve eksperimente dani su skupovi parametara Topspin, koji su generirani na 600 MHz i potrebno ih je prilagoditi pomoću naredbe “paracon” na odgovarajućem spektrometru. Također imajte na umu da navedene impulsne sekvence nisu nužno kompatibilne s naredbom "getprosol".

7: POSTAVKA NMR SPEKTROMETRA ZA NMR EKSPERIMENTE OTKRIVENE HETERONUKLEARNO

Ovaj protokol podrške opisuje opću proceduru, koju treba provesti unaprijed svaki put kada se planira nabava heteronuklearno detektiranih NMR eksperimenata. Prema tome, treba ga primijeniti prije nego što se provedu eksperimenti opisani u Osnovnim protokolima 3-7.

Materijali

  • ≥0,5 mM uzorka RNA (300 μl) od interesa (vidi Osnovne protokole 1 i 2 Alternativne protokole 1 i 2)
  • NMR spektrometar (opremljen po mogućnosti s a z- gradijent osi 13 C, 15 N [ 1 H]-TXO kriogena sonda alternativno, a z- gradijent osi 1 H, [13 C, 15 N]-TCI kriogena sonda)

1. Namjestite NMR spektrometar na željenu temperaturu, opremite NMR cijev s spinerom, stavite NMR uzorak u spektrometar i ostavite da se uravnoteži ~10 min.

Obično provodimo heteronuklearno detektirane NMR eksperimente na 298 K.

2. Provedite sljedeće korake kako biste postavili NMR spektrometar.

  1. Zaključavanje: zaključajte frekvenciju spektrometra na 95% H2O i 5% D2O ili 100% D2O ovisno o otapalu vašeg NMR uzorka.
  2. Ugađanje i usklađivanje: Svi kanali trebaju biti ugađani i usklađeni od visokog do niskog žiromagnetskog omjera za preporučene sonde u ovom protokolu (1 H, 13 C, 2 H, 15 N). Ponovno provjerite sve kanale ako su potrebne prilagodbe velike. Za optimalnu osjetljivost, ugađanje i usklađivanje trebaju biti na točki za kanal, gdje se odvija izravna detekcija (obično 13 C).
  3. Šimming: Uvezite nedavnu datoteku podloška, ​​koja odgovara uvjetima vašeg uzorka, uključujući tip NMR cijevi, koncentraciju soli i temperaturu. Provedite automatsko podmetanje dok se kvaliteta podloška ne smatra dobrom (širina linije, npr. DSS ∼1 Hz).

Obično određujemo 1H puls automatski ili u jednostavnom 1D eksperimentu s jednim impulsom provođenjem impulsa od 360° i mijenjanjem duljine impulsa dok preostali signal ne bude na prijelazu nule. Postavite noseću frekvenciju 1 H na rezonanciju vode (4,7 ppm).

Odredite 13 C i 15 N 90° impulsa i postavite frekvenciju nosioca na rezonantnu.

Određivanje točne duljine impulsa od 90° za 13 C i 15 N temelji se na SOFAST HMQC (Schanda & Brutscher, 2005.). Očitajte skup parametara pulse_calib13C s nizom impulsa decp90_sfhmqc.ric (13 C) ili skup parametara pulse_calib15N s nizom impulsa decp90f3_sfhmqc.ric (15 N). Obje sekvence su modificirane iz Brukerove pulsne biblioteke. Unesite prethodno određen 1 H 90° puls i zadani impuls za 13 C/15 N. Postavite konstantu 11 (cnst11) na 1 i zabilježite eksperiment s odgovarajućim brojem prijelaznih pojava (npr. 8). Obrada bi vam trebala dati 1D spektar sa signalom. Postavite redoslijed korekcije faze 0 ručno ili naredbom apk0. Ova vrijednost se ne smije mijenjati tijekom daljnjeg postupka kalibracije. Postavite cnst11 na 2 i ponovite eksperiment. Ovdje bi svi signali trebali biti na točki prijelaza nule. Promijenite duljinu 13 C/ 15 N 90° impulsa sve dok preostali signal ne bude minimalan. S novijim hardverom (Bruker AVIII i noviji), ovaj decoupler X-jezgri impulsa, određeni gore opisanom metodom, mogu se prenijeti na kanal za promatranje. Za stariji hardver, puls od 90° treba provjeriti u 13 C/15 N 1D eksperimentima. Impuls oblika se također može izračunati iz ovih vrijednosti, bilo izravno u nizu impulsa ili putem PROSOL tablice (vidi Bruker priručnik).

3. Provjerite kvalitetu vašeg NMR uzorka i podloška snimanjem referentnih eksperimenata kao što su eksperimenti 1 H-1D i 13 C/15 N-HSQC.

8: IPAP I DIPAP ZA HOMONUKLEARNO RAZDVAJANJE

Kao što se obično jednolično, 13 C-obilježenih RNA koriste za NMR eksperimente izravno detektirane ugljikom, metode za razdvajanje homonuklearnih 1 JCC potrebne su skalarne sprege. To se može postići korištenjem antifaznih (IPAP Hammarstroem & Otting, 1994. Ottiger, Delaglio, & Bax, 1998.) ili S3E (Meissner, Duus, & Sørensen, 1997.) shema, kao i selektivnih sekvenci razdvajanja tijekom akvizicije ili rekonstrukcija entropije (Hoch, Stern i Mobli, 2011. Serber i sur., 2000.). Kako obično radimo s IPAP i dvostrukim IPAP (DIPAP) sekvencama, opisat ćemo opći postupak kako ih postaviti u sljedećem protokolu. Stoga je ovaj Protokol podrške relevantan za Osnovne protokole 3-6.

Materijali

  • ≥0,5 mM uzorka RNA (300 μl) od interesa (vidi Osnovni protokoli 1 i 2 Alternativni protokoli 1 i 2)
  • NMR spektrometar opremljen po mogućnosti s a z- gradijent osi 13 C, 15 N [ 1 H]-TXO kriogena sonda alternativno, a z- gradijent osi 1 H, [ 13 C, 15 N]-TCI kriogena sonda
  1. Jesu li potrebne jedna/dvije (IPAP/DIPAP) sekvence za homonuklearnu decoupling? To ovisi o broju ugljikovih atoma koje je potrebno odvojiti i o tome jesu li njihovi kemijski pomaci i konstante spajanja međusobno različite. Za pregled vidi Fiala & Sklenár, 2007.
  2. Koja je veličina 1 JCC konstante spajanja (Fiala & Sklenár, 2007.)?

Koliki je kemijski pomak jezgre ugljika koji je otkriven ( 13 Cna) i koliki je/jesu kemijski pomak(ovi) onoga(ih) koji je/su odvojeni (13 Cisključeno/ 13 Cisključeno Fiala & Sklenár, 2007.)?

Na temelju ovih informacija, IPAP parametri će se odrediti u koraku 4.

2. Ako već nije slučaj, uključite IPAP/DIPAP sekvencu u pulsni slijed od interesa ili tijekom posljednjeg koraka neosjetljivog poboljšanja jezgri prijenosom polarizacije (INEPT) (IPAP, slika 16A DIPAP, slika 16C) ili kao zaseban element .

3. Postavite NMR spektrometar u skladu s Protokolom podrške 7.

4. Odaberite oblike impulsa, noseće frekvencije i duljinu impulsa za rezonantne i izvanrezonantne ugljične impulse. Ti su parametri sažeti u tablici 13 (IPAP) i tablici 14 (DIPAP) za sve moguće atome ugljika u RNA.

Imajte na umu da se duljine impulsa i pomaci moraju podesiti prema jakosti magnetskog polja, kada se mjeri pri jačini polja različitoj od 800 MHz.

Duljine impulsa, oblici, pomaci i IPAP vrijeme T uzeti su iz literature navedenih u nastavku. Svi parametri su izračunati za 800 MHz NMR spektrometar.


Evaluacija 15 N-otkrivenih eksperimenata H-N korelacije na sve većim RNA

Nedavno je uvedeno 15 N-detektovanih multidimenzionalnih NMR eksperimenata za istraživanje proteina. Korištenje spore transverzalne relaksacije jezgri dušika u eksperimentu 15 N-TROSY omogućilo je snimanje visokokvalitetnih spektra za proteine ​​visoke molekularne težine, čak i u odsutnosti deuteracije. Ovdje pokazujemo primjenjivost tri 15 N-detektovanih H-N korelacijskih eksperimenata (TROSY, BEST-TROSY i HSQC) na RNA. S novouspostavljenim 15 N-detektiranim BEST-TROSY eksperimentom, koji se pokazao najosjetljivijim 15 N-detektiranim H-N korelacijskim eksperimentom, snimljeni su spektri za pet RNA molekula veličine od 5 do 100 kDa. Ovi spektri su dali visoku rezoluciju u 15 N-dimenziji čak i za veće RNA budući da je povećanje širine linije s molekulskom težinom izraženije u 1 H- nego u 15 N-dimenziji. Nadalje, mogli bismo eksperimentalno potvrditi razliku u relaksacijskom ponašanju imino skupina u AU i GC baznim parovima. Dodatno, pokazali smo da bi 15 N-otkrivenih eksperimenata teoretski trebalo imati koristi od prednosti osjetljivosti i razlučivosti na višim statičkim poljima, ali da je potonje prikriveno dinamikom razmjene unutar RNA.

Ovo je pregled sadržaja pretplate, pristup preko vaše institucije.


Materijali i metode

Rješavanje različitih izvora nejasnoća

Kako bismo riješili prvi izvor dvosmislenosti, nudimo novu metodu inspiriranu [18] koja radi na čitanju bilješki. Ukratko, naša metoda skenira sve pogotke zadanog čitanja. Ako svi pogoci pripadaju istoj klasi bilješki i/ili su neki od njih bez bilješki, pročitano se označava u skladu s tim. U suprotnom, čitanje se proglašava dvosmislenim i daju se sve povezane bilješke. Ova metoda ima nekoliko prednosti:

  • manje je pristrano,
  • koristi sva čitanja,
  • budući da se prijavljuju dvosmislene napomene, povezani lokusi se mogu pregledati,
  • koristi sve pogotke.

Drugi izvor dvosmislenosti obično dolazi kada se različite klase bilješki preklapaju. U tom se slučaju naša strategija sastoji od redoslijeda vrsta bilješki. Na primjer, korisnici mogu odlučiti da miRNA imaju viši rang od introna i time je ova nejasnoća riješena. S druge strane, ako miRNA i druga klasa kao što su snoRNA imaju isti rang i čitanje se preklapa oboje, čitanje će biti proglašeno dvosmislenim.

Kako bi riješio posljednji izvor nejasnoća, gdje se čitanje preklapa s nekoliko napomena, korisnik može dati prag preklapanja, izražen u broju nukleotida ili postotku veličine očitanja. Ako je veličina preklapanja niža od praga, bilješka se ne uzima u obzir. Ako se čitanju još uvijek može dodijeliti nekoliko bilješki, čitanje se proglašava dvosmislenim, kao i prije.

Strategija zabilješke

mmannot zahtijeva tri ulazne datoteke, a nastavlja se u tri glavna koraka (vidi sliku 9):

  • Prvo, mmannot analizira konfiguracijsku datoteku.
  • Drugo, mmannot analizira datoteku s napomenama (koju je dao korisnik) i pohranjuje bilješku u memoriju.
  • Treće, mmannot čita pročitanu datoteku i bilježi svako pročitano.

Primijetite da neke bilješke nedostaju u standardnoj datoteci s napomenama: introni i proksimalna područja obično se ne spominju jer se mogu zaključiti iz priloženih bilješki. U tu svrhu, mmannot automatski izdvaja introne značajki koje su odabrali korisnici i dodaje ih u skup podataka napomena u memoriji (ostavljajući ulaznu datoteku nepromijenjenom). Slično, kodirajuće sekvence (CDS), 5’ i 3’ neprevedene regije (UTR), niže i uzvodne regije bilješki (veličinu nizvodnih i uzvodnih regija definira korisnik) mogu se izdvojiti. Korisnik također može odrediti orijentaciju niza čitanja s obzirom na bilješku (kolinearno ili antisense). Na ovaj način se također mogu kvantificirati introničke, osjetilne, antisense, nizvodne i uzvodne regije. Slika 9A predstavlja jednostavnu GTF datoteku, koja sadrži jedan kodirajući gen i pet miRNA. Izvorno polje (drugo polje) nije navedeno, a polje značajke daje vrstu bilješke.

(A) Jednostavna GTF datoteka koja sadrži jedan kodirajući gen i pet miRNA. (B) Izvadak mmannot konfiguracijske datoteke. (C) Genomska lokalizacija napomene i čitanja (iz svemirskih razloga, slika nije u mjerilu). (D) Pročitajte bilješku. (E) Kvantifikacija. (Ž) Kvantifikacija značajki.

Konfiguracijska datoteka (slika 9B) također je potrebna za odabir bilješki koje treba kvantificirati. Prvi odjeljak, Introni, sadrži popis značajki gdje će se introni ekstrahirati. Ovdje se gen automatski rekonstruira iz GTF datoteke, gdje je značajka exon . Sljedeći odjeljak, Blizina, pruža popis značajki gdje će se izdvojiti uzvodne i nizvodne regije. 5’ i 3’ UTR gena također se automatski zaključuju. Posljednji odjeljak, Red , pruža značajke koje će se kvantificirati. Dvotočka (:) je razdjelnik između izvornog polja (tj. drugi stupci GTF datoteke) i polje značajke (treći stupac GTF datoteke). .:CDS znači izvor. i imaju CDS . Kao rezultat toga, ako je redak .:CDS naveden u odjeljku Narudžba, mmannot će prebrojati broj čitanja koja se ko-lokaliziraju sa svim bilješkama sa značajkama CDS prisutnim u datoteci zabilješki. Ako značajku prati znak plus (+), kao što je .:CDS +, mmannot će brojati samo čitanja koja su kolinearna s napomenom. U tom kontekstu, očitavanje u plus nizu koji se preklapa s CDS-om u minus nizu ne bi se koristilo za kvantifikaciju. Ako nakon značajke slijedi znak minus (-), mmannot će brojati samo čitanja koja su protusmislena u odnosu na bilješku. Bilješke su poredane po prioritetu, tako da je CDS + ispred introna u primjeru danom na slici 9B. Međutim, budući da su CDS + i 5’UTR na istoj liniji, imaju isti prioritet.

Čitanje bilješke odvija se u dva koraka. Prvi korak ima za cilj pronalaženje odgovarajućih bilješki zadanog pogotka (slika 9C). Ako pogodak odgovara nekoliko različitih napomena, bilješka s najvišim prioritetom se zadržava (npr. pročitajte C u primjeru). Ako nekoliko bilješki ima isti prioritet, sve se zadržavaju i pogodak je već dvosmislen (čitajte E u primjeru). U primjeru, bilješke povezane s genom dane su u nijansama zelene i crne. MiRNA su crvenom bojom, a čitanja žutom bojom su označena od A do G. Imajte na umu da se oznake D, F i G pojavljuju dvaput, jer se mogu mapirati na dva različita mjesta. Očitavanja bi trebala biti nasukana, a strelica označava pramen.

Drugi korak rješava nejasnoće i označava svako čitanje. Opća metoda je:

  • Ako se čitanje mapira jedinstveno, bez dvosmislenosti, povećava se broj odgovarajuće napomene.
  • Ako se očitavanje mapira na različitim lokacijama, ali svi učitavanja odgovaraju istoj napomeni, očituje se čitanje spašen, a odgovarajući broj napomena također se povećava (čitaj D). Isto tako, ako čitanje mapira samo jednu bilješku i međugenske regije, tada čitanje pripada ovoj napomeni i čitanje se spašava.
  • Ako se čitanje ili pogodak preklapaju s nekoliko bilješki, bilješke s najvišim prioritetom se čuvaju. Međutim, ako postoji samo jedna bilješka s najvišim prioritetom, čitanje ili pogodak nisu dvosmisleni.
  • Inače, postoji nejasnoća. Nova vrsta napomene, nazvana a spojena bilješka, nastaje. To je spajanje odgovarajućih bilješki (kao što je predloženo u [18]), a njegov se broj povećava.

Tablicu s napomenama (slika 9D) može dati mmannot.

U primjeru, čitanje A samo mapira jednu regiju, koja se samo preklapa uzvodno područje gena. Stoga se nedvosmisleno može pripisati ovoj osobini. Očitano B jedinstveno preklapa CDS gena. Međutim, očitavanje je u − lancu, a gen je na + lancu. Konfiguracijska datoteka navodi da se CDS-u treba pripisati samo kolinearno čitanje i stoga se ovaj slučaj ne može primijeniti. Međutim, gen linije - konfiguracijske datoteke kvalificira se i čitanje se pripisuje ovoj značajci. Očitani C jedinstveno se preslikava na miRNA i intron. Budući da miRNA ima veći prioritet, čitanje se pripisuje ovoj osobini. Očitani D preslikava se na dva različita mjesta, ali se obje te lokacije preklapaju s miRNA. Čitanje se još uvijek može pripisati miRNA, a mmannot spominje da je ovo očitanje bilo spašen. Read E preklapa CDS i miRNA, a ove napomene imaju isti prioritet. Dvosmislenost se ne može riješiti, a E pripisujemo CDS (+)-miRNA. Čitajte F karte na dva različita mjesta. Prvo mjesto preklapa se s 3’UTR, dok se drugo mjesto preklapa s miRNA. Opet, dvosmislenost se ne može riješiti, a F pripisujemo 3’UTR (+)-miRNA. Na kraju, G preklapa 5'UTR i međugensku regiju. U ovom slučaju, G dodjeljujemo 5’UTR i očitavanje proglašavamo spašenim.

Nakon skeniranja svih očitanja, izrađuje se kvantifikacijska tablica (slika 9E).

Tablicu kvantifikacije značajki (slika 9F) također može pružiti mmannot. Broji broj čitanja po (eventualno spojenoj) značajci. Ovdje korisnik može točno odrediti da može postojati neka interakcija između miRNA E i 3’UTR, te moguća nedosljednost između napomena CDS-a i miRNA B.

Detalji provedbe

Algoritam koji koristi mmannot je sljedeći. mmannot skenira datoteku s napomenama, izdvaja intervale napomena, sortira ih i pohranjuje u spremnike koji se ne preklapaju. mmannot zatim čita mapiranu datoteku za čitanje, izdvaja moguće preklapajuće spremnike i uspoređuje povezane bilješke s pročitanim. Odgovarajuće bilješke danog čitanja čuvaju se u memoriji. Kada se skenira posljednji pogodak, povećava se broj (možda spojenih) bilješki, a pročitana informacija se odbacuje iz memorije. U praksi je pretraživanje približno linearno s obzirom na broj čitanja. mmannot može raditi na standardnom računalu, a svaka SAM/BAM datoteka može se skenirati posebnom niti.

mmannot ili pretpostavlja da NH oznaka ulazne SAM/BAM mapirane datoteke čitanja daje broj pogodaka po čitanju, ili da su alternativni pogoci dati u XA oznaci. Nažalost, neki široko korišteni alati za mapiranje kao što je leptir mašna [6] koriste jednu liniju po pogotku i ne postavljaju oznaku NH. Nudimo prateći alat koji čita SAM izlaznu datoteku leptir mašne i dodaje ispravnu NH oznaku. mmannot može proizvesti tri različite izlazne datoteke.

Prva datoteka je tablica brojanja, koja uključuje spojene bilješke. Druga (neobavezna) datoteka daje kvantifikaciju svih napomena (slika 9F). Ova datoteka pruža detaljne informacije o spojenim značajkama i omogućuje istraživanje mogućih interakcija između značajki ili ispravljanje napomena. Treća (neobavezna) datoteka daje odgovarajuće bilješke za svako čitanje (slika 9D). Ova datoteka omogućuje ručnu provjeru svih čitanja koja podržavaju spojenu značajku.

Korišteni podaci

Koristili smo objavljene skupove podataka, koji pokrivaju nekoliko eukariotskih organizama, gdje su povezani članci dali kvantifikaciju ekspresije sRNA klasa. Tablica 2 sažima upotrijebljene podatke.


Pregledajte komentare recenzenta za rukopis

Valerijan Dolja (Recenzent 1)

Pojam preporuke recenzenta: Podržati publikaciju

Ovaj rukopis je koristan u privlačenju pozornosti na slabo istražen problem podrijetla viroida, ali ne pruža dovoljnu podršku konceptu izravnog porijekla viroida iz primordijalnog RNA svijeta. U potpunosti podržavam napor dr. Dienera da revitalizira raspravu o podrijetlu viroida, najmanjih poznatih replikona koji ne kodiraju proteine ​​i posjeduju aktivnost ribozima, čime se rekapituliraju dvije značajke postuliranih primordijalnih replikona svijeta RNA. Treba, međutim, naglasiti da postojećim viroidima, kao i uzročniku Hepatitis delta, nedostaje još važnija značajka, tj. sposobnost samoreplikacije, umjesto da se oslanjaju na proteine ​​polimeraze koje osigurava domaćin. Moje druge velike rezerve prema hipotezi o izravnom porijeklu viroida iz svijeta RNA su sljedeće. Prvo, koliko nam je poznato, parazitski agensi slični viroidima nalaze se samo u dvije vrste organizama, višim biljkama (kritosjemenjačama) i kralježnjacima, ali ni u jednom od njihovih pretpostavljenih predaka, algi i primitivnijim životinjama. Nadalje, nema podataka o takvim uzročnicima u velikom broju jednostaničnih eukariota čija je evolucijska povijest prethodila povijesti biljaka ili životinja stotinama milijuna godina. Što je još najgore, ni u jednom prokariotu nisu zabilježeni agensi slični viroidima, bilo arheje ili bakterije koje su postojale mnogo prije pojave eukariota. Dakle, prema autorovoj hipotezi, primordijalni preci viroida trebali su kročiti vrlo uskim evolucijskim putem koji vodi ravno do kopnenih biljaka, ali biti eliminirani od drugih organizama, čak i onih za koje se vjerovalo da su izravni biljni preci, kao što su Characean alge. Po mom mišljenju, čini se da hipoteza koja dopušta novo podrijetlo viroida u višim biljkama, možda rekombinacijom između već postojeće, stanične RNA koja posjeduje ribozim, s onom koja je proizvodu dodijelila signal prepoznavanja RNA-polimeraze ovisne o DNA, biti jednostavniji i time vjerojatniji scenarij. To ne znači da izvorna ideja dr. Dienera da viroidi, kao najmanji poznati autonomni replikoni najviše podsjećaju na replikone RNA svijeta, nije valjana, i to vrlo. Ne sviđa mi se hipoteza 2 iz jednog jednostavnog razloga: podaci koji podržavaju hipotezu 2 još nisu recenzirani, objavljeni ili neovisno potvrđeni. Čini se prerano koristiti ove podatke dok se to ne dogodi. Zaključno, zalažem se za objavljivanje ovog rukopisa jer je problem podrijetla viroida iznimno važan i uvelike nedovoljno istražen. Autorove hipoteze proširuju raspravu i, nadamo se, mogle bi potaknuti relevantna eksperimentalna istraživanja.

Odgovor na recenziju mog rukopisa dr. Dolje

Zahvaljujem dr. Dolji na promišljenom i konstruktivno kritičkom osvrtu, kao i na izvrsnim prijedlozima za poboljšanje rukopisa. Njegova ideja stvaranja alternativne hipoteze prvobitnom RNA podrijetlu viroidne hipoteze, dopuštajući de novo podrijetlo viroida u višim biljkama putem rekombinacije postojeće, stanične RNA koja posjeduje ribozim, s onom koja je proizvodu obdarila DNK- ovisni signali prepoznavanja RNA polimeraze—obećava da će biti rješenje po narudžbi za ozbiljnu dilemu porijekla viroida. Ipak bi ostalo. uvjerljivo objašnjenje, zašto de novo stvoreni viroidi "upečatljivo" nalikuju njihovim postavljenim primordijalnim značajkama nalik na RNA, koje bi sada bile lišene funkcionalnog značenja.

Dr. Dolja je sasvim u pravu: preliminarni podaci, kao ni hipoteza 2 ukupno, nisu prikladni za objavu. Izbrisao sam oboje, uključujući spominjanje neobjavljenih podataka.


Zaključak

Koristeći tehnologiju sekvenciranja sljedeće generacije, proveli smo profiliranje miRNA transkriptoma i transkriptoma dvije kultivirane manioke i njihovog divljeg prethodnika. Identificirano je ukupno 107 očuvanih miRNA (29 obitelji) i 39 novih miRNA (33 obitelji), a većina miRNA bila je visoko izražena u kultivarima. Od 360 unigena za koje se predviđa da će biti mete 53 obitelji miRNA manioke, potvrđeno je 14 unigena. Osim toga, analiza koekspresije između miRNA i njihovih ciljeva provedena je na temelju transkriptoma miRNA i profiliranja transkriptoma listova i korijena za pohranu, razine ekspresije 28 ciljeva bile su u negativnoj korelaciji s onima njihovih odgovarajućih miRNA. Zaključno, diferencijalna ekspresija miRNA između kultivara i njihovog divljeg potomka, zajedno s našom analizom GO napomene i potvrdom parova miRNA:cilj, mogla bi pružiti uvid u to kako je divlji progenitor udomaćen za uzgojenu manioku.


Ključne reference

Kobori, S. Nomura, Y. Miu, A. Yokobayashi, Y. Analiza visoke propusnosti i inženjering samocijepajućih ribozima sekvenciranjem. Nukleinske kiseline Res. 2015 , 43, e85. (1) Sekvenciranje visoke propusnosti korišteno je za ispitivanje paralelnih >1000 samocjepajućih ribozima mutanata za analizu tercijalnog kontakta u twister ribozima i za identifikaciju alosteričnih ribozima.

Kobori, S. Yokobayashi, Y. High-throughput mutational analysis of a twister ribozyme. Angew. Chem., Int. Ed. 2016 , 55, 10354–10357. (2) Provedena je sveobuhvatna mutacijska analiza svih pojedinačnih i dvostrukih mutanata unutar 42-nt regije twister ribozima, razjašnjavajući funkcionalno relevantne interakcije baza-baza.

Dhamodharan, V. Kobori, S. Yokobayashi, Y. Mutacijska i kinetička analiza samo-hidrolizirajućeg deoksiribozima velikih razmjera. ACS Chem. Biol. 2017 , 12, 2940–2945. (3) Paralelni kinetički test samocijepajućih mutanata deoksiribozima dao je kvantitativne uvide u nelinearne učinke višestrukih mutacija.

Nomura, Y. Yokobayashi, Y. Sustavno minimiziranje ribozima RNA ligaze kroz cikluse dizajna-sinteze-sekvencije velikih razmjera. Nukleinske kiseline Res. 2019 , 47, 8950–8960. (4) Visoko propusno sekvenciranje i sinteza oligomera korišteni su za istraživanje minimalne katalitičke jezgre ribozima RNA ligaze.


Popratne informacije

S1 Slika. Pokrivenost rijetkim sekvenciranjem na CCDC168.

IGV dijagram čitanja usklađen s CCDC168 lokus za uzorak TCGA-D7-6518 u STAD. Nakon filtriranja, samo 12 očitanja usklađeno je s genom, a ovo je srednji broj uzoraka u STAD-u. Za referencu, lokusi mikrosatelitske nestabilnosti (MSI) prethodno identificirani u TCGA [6] također su prikazani u drugom tragu. Nekoliko čitanja u skladu s CCDC168 u ovom uzorku ne preklapaju se dobro s MSI lokusima.

S2 sl. Cijele kohorte s nedovoljnom pokrivenošću.

STAD kohorta (A) nije imala uzorke s dovoljnom pokrivenošću CCDC168 mjesto. Drugi geni dijele isto ponašanje, naime SETD1B, i SOX11 u PRAD kohorti (B), i MALAT1 i XIST u LIHC kohorti (C).

S3 Slika. Pokriveni geni vjerojatno zbog dizajna protokola za hvatanje egzoma.

VCRome exome kit za hvatanje ne sadrži sonde za lokuse koji sadrže MALAT1 (A) i XIST (B), što odgovara slaboj dubini u uzorcima koji koriste komplet. Naprotiv, VCRome komplet sadrži sonde za CCDC168 (C) koji ima očitanja u uzorcima koji koriste ovaj komplet.

S4 sl.

Čini se da ACVR2A (A), prethodno identificirani MSI lokusi adenokarcinoma želuca, ima razumnu pokrivenost MSI regije (treća staza) u dva uzorka TCGA-STAD. SMAP1 (B) i SPINK5 (C) su MSI lokusi povezani s kolorektalnim adenokarcinomom, ali ne i s adenokarcinomom želuca. Čini se da uzorci TCGA-STAD imaju slabu pokrivenost MSI lokusa SMAP1, dok se čini da SPINK5 ima mnogo veću pokrivenost MSI lokusa.

S5 Slika. Standardni pristupi poravnanja TCGA ispravno upravljaju lokusima mikrosatelitne nestabilnosti za SNV/indel pozivanje.

Korak zajedničkog čišćenja u plinovodu Genomic Data Commons koji uključuje lokalno prestrojavanje oko indela rješava ovaj problem. Na primjer, izvršili smo BWA poravnanje očitanja prema lokusima nestabilnosti mikrosatelita u CCDC168 za TCGA-COAD uzorak TCGA-AD-6889 bez koraka su-čišćenja (gornji dio čitanja). Čitanja su grupirana u 3 seta na temelju njihovog nukleotida na poznatom indelu (vertikalna ljubičasta traka). Crveni krug označava lokus s podrškom za višestruko čitanje za SNV prije zajedničkog čišćenja. Nakon zajedničkog čišćenja (donji trag za čitanje), ova čitanja više ne podržavaju SNV status.


Gledaj video: Difference bw DNA u0026 RNA DNA और RNA म अतर (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Stacey

    Uopće ne znam, to ovdje i reći da je moguće

  2. Tezshura

    Odnio sam to u citatnik, hvala!

  3. Horatiu

    Simply the shine



Napišite poruku