Informacija

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija za bakterijske membrane

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija za bakterijske membrane


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Želio bih proučavati smrzavanje i taljenje bakterijskih membrana i želio bih koristiti diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC) za dobivanje temperature staklastog prijelaza membrane. Međutim, nisam siguran gdje pronaći takve protokole koji opisuju proces. Može li mi netko reći kako koristiti DSC za bakterije kao što je E. coli?


Interakcija sintetičkih polimera sa staničnim membranama i modelnim membranskim sustavima I. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija

Tirrell, David A. i Boyd, Patricia M. (1981.) Interakcija sintetičkih polimera sa staničnim membranama i modelnim membranskim sustavima I. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija. Makromolekularna kemija, Rapid Communications, 2 (2). str. 193-198. ISSN 0250-9733. https://resolver.caltech.edu/CaltechAUTHORS:20150209-164526691

Cijeli tekst nije objavljen u ovom spremištu.


Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija proteinsko-lipidnih interakcija

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) je visokoosjetljiva tehnika bez poremećaja koja se koristi za proučavanje termodinamičkih svojstava toplinski induciranih prijelaza. Budući da na ta svojstva može utjecati vezanje liganda, DSC je osobito koristan za karakterizaciju interakcija proteina s biomimetičkim membranama. Prednosti ove tehnike u odnosu na druge metode sastoje se u izravnom mjerenju intrinzičnih toplinskih svojstava uzoraka, ne zahtijevajući nikakve kemijske modifikacije ili ekstrinzične sonde. Ovo poglavlje opisuje osnovnu teoriju DSC-a i pruža čitatelju razumijevanje mogućnosti DSC instrumentacije i vrste informacija koje se mogu dobiti iz DSC studija o interakcijama lipida i proteina. Posebno, ovo poglavlje pruža detaljnu analizu DSC podataka za procjenu učinaka proteina na biomimetičke membrane.

Ključne riječi: Analiza podataka Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija Fazni prijelaz gel u tekućinu-kristalnu fazu Lamelarni u obrnuti heksagonalni fazni prijelaz Lipidi Interakcija lipid-protein Proteini.


Langmuir monoslojevi i diferencijalna skenirajuća kalorimetrija za proučavanje interakcija između lijekova kamptotecina i modela biomembrane

CPT-11 i SN-38 su kamptotecini s jakim antitumorskim djelovanjem. Ipak, njihove teške nuspojave i kemijska nestabilnost njihova laktonskog prstena doveli su u pitanje uobičajene oblike za njegovu primjenu i usmjerili trenutna istraživanja na razvoj novih prikladnih farmaceutskih formulacija. Ovaj rad predstavlja biofizičku studiju međufaznih interakcija CPT-11 i SN-38 s membranskim mimetičkim modelima korištenjem jednoslojnih tehnika i diferencijalne skenirajuće kalorimetrije. Cilj je dobiti nove spoznaje za razumijevanje mehanike dvosloja nakon ugradnje lijeka i optimizirati dizajn sustava za isporuku lijeka na temelju formiranja stabilnih dvoslojnih struktura. Štoviše, prema našim saznanjima, molekularne interakcije između kamptotecina i fosfolipida nisu detaljno istražene, unatoč njihovoj važnosti u kontekstu djelovanja lijekova. Rezultati pokazuju da ni CPT-11 ni SN-38 ne remete strukturu složenih dvoslojeva liposoma, unatoč njihovoj različitoj topljivosti, da CPT-11, pozitivno nabijen u svojoj skupini piperidina, elektrostatički stupa u interakciju s DOPS-om, čineći stabilnim ugradnju visokog postotak CPT-11 u liposomima i da SN-38 uspostavlja slabe odbojne interakcije s molekulama lipida koje modificiraju kompresibilnost dvosloja bez značajnog utjecaja ni na tlak kolapsa lipida niti na obrazac mješljivosti monoslojeva miješanih lijek-lipid. Pokazana je prikladnost binarne i ternarne smjese lipida za inkapsuliranje SN-38 i CPT-11.

Ključne riječi: Dvoslojni sustavi Biomembranski modeli Kamptotecini Langmuir monoslojevi Liposomi Interakcije membrane.


Sažetak

Proveli smo komparativnu studiju učinka kolesterola na ponašanje termotropne faze distearoilnih i dielaidoilnih molekularnih vrsta fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina i fosfatidilserina primjenom visokoosjetljive diferencijalne skenirajuće kalorimetrije. Za obje molekularne vrste fosfatidilkolina, ugradnja kolesterola proizvodi bimodalne endoterme pri nižim i unimodalne endoterme pri višim koncentracijama sterola. U oba slučaja endoterme zagrijavanja i hlađenja su identične, a visoke koncentracije kolesterola (50 mol %) potpuno poništavaju fazni prijelaz gela u tekući kristal. Za distearoilne molekularne vrste fosfatidilserina i fosfatidiletanolamina, endoterme zagrijavanja i hlađenja nisu identične, a kolesterol pokazuje znatno smanjenu mješljivost u gelu u usporedbi s tekućom kristalnom fazom, osobito u potonjem slučaju. Dakle, ni u jednom slučaju dodavanje 50 mol % kolesterola u potpunosti ne ukida fazni prijelaz kooperativnog taljenja lanca ugljikovodika. Međutim, dielaidoilne molekularne vrste fosfatidilserina i fosfatidiletanolamina pokazuju mnogo bližu korespondenciju u načinima grijanja i hlađenja nego distearoilne vrste, a 50 mol % kolesterola dovoljno je da gotovo ili potpuno ukine gel u tekući kristalni fazni prijelaz dielaidildofeloilatana . Općenito, postoji inverzna korelacija između jačine intermolekularnih interakcija fosfolipida i fosfolipida, što se očituje relativnim temperaturama faznog prijelaza čistih fosfolipida između gela i tekućine kristala, i mješljivosti kolesterola u dvoslojevima, posebno dvoslojevima u stanju gela, nastalih od ovih fosfolipida. Ovi rezultati pokazuju da priroda interakcija kolesterol-fosfolipida, a time i mješljivosti kolesterola u dvosloju, ovise i o strukturi fosfolipidne polarne glave i ugljikovodičnih lanaca, kao i o temperaturi i faznom stanju dvosloja fosfolipida. .


Sažetak

α-Defenzini su antimikrobni peptidi s 29-35 aminokiselinskih ostataka i cisteinom stabiliziranim amfifilnim, trolančanim strukturama β-lista. Koristili smo visokopreciznu diferencijalnu skenirajuću mikrokalorimetriju kako bismo istražili učinke humanog neutrofilnog α-defenzina, HNP-2, na fazno ponašanje modelnih membrana koje oponašaju membrane stanica bakterija i eritrocita. U prisutnosti ovog pozitivno nabijenog peptida, fazno ponašanje liposoma koji sadrže negativno nabijeni fosfatidilglicerol je značajno promijenjeno čak i pri visokom molarnom omjeru lipida i peptida od 500:1. Dodavanje HNP-2 liposomima koji oponašaju bakterijske membrane (mješavine dipalmitoilfosfatidilglicerola i -etanolamina) rezultiralo je razdvajanjem faza zbog toga što su neke domene siromašne peptidima, a druge bogate peptidima. Potonje je karakterizirano povećanjem glavne prijelazne temperature, najvjerojatnije koje proizlazi iz električnog zaklanjanja fosfolipidnih glava peptida. S druge strane, HNP-2 nije utjecao na fazno ponašanje membrana koje oponašaju membrane eritrocita (ekvimolarne smjese dipalmitoilfosfatidilkolina i sfingomijelina) kao ni na čiste pojedinačne komponente. To je u suprotnosti s melitinom, koji je značajno utjecao na fazno ponašanje kolin fosfolipida u skladu sa svojom nespecifičnom litičkom aktivnošću. Ovi rezultati podupiru hipotezu o preferencijalnoj interakciji defenzina s negativno nabijenim staničnim površinama membrane, što je uobičajeno obilježje bakterijskih staničnih membrana, i pokazuju da HNP-2 razlikuje model membranskih sustava koji oponaša prokariotske i eukariotske stanične membrane.

Ovo istraživanje podržano je donacijama Jubiläumsfonds der Österreichischen Nationalbank (Projekt 5100 za K.L.) i NIH (HL-46809 za T.G. i AI 22839 za R.I.L.).

Dio ovog rada objavljen je u apstraktnom obliku (Lohner i sur., 1995.).

Korespondenciju treba uputiti ovom autoru na Institut für Biophysik und Röntgenstrukturforschung, Österreichische Akademie der Wissenschaften, Steyrergasse 17/VI, A-8010 Graz, Austrija. Telefon: **43-316-812004-18. Faks: **43-316-812367. E-pošta: [email protected]


Neke primjene kalorimetrije u biokemiji i biologiji

Mnogi bakterijski grupirani redovito međusobno raspoređeni kratki palindromni ponavljanja (CRISPR) – CRISPR-povezani (Cas) sustavi koriste dvostruku RNA vođenu DNA endonukleazu Cas9 za obranu od invazivnih faga i konjugativnih plazmida uvođenjem specifičnih za mjesto. Čitaj više

Dodatni materijali

Dodatni videozapisi 1 i 2 Pročitajte više

Slika 1: Interferencija DNK posredovana CRISPR-Cas9 u adaptivnom imunitetu bakterija. (a) Tipični CRISPR lokus u CRISPR-Cas sustavu tipa II sastoji se od niza ponavljajućih sekvenci (ponavljanja, smeđi dia.

Slika 2: Mehanizam inženjeringa genoma posredovanog CRISPR-Cas9. Sintetička sgRNA ili crRNA-tracrRNA struktura usmjerava Cas9 endonukleazu na gotovo proizvoljan slijed DNA u genomu kroz a.

Slika 3: Ukupna struktura Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) u apo stanju. (a) Trakasti prikaz kristalne strukture SpyCas9 (PDB ID 4CMP). Pojedinačne Cas9 domene su obojene.

Slika 4: Učitavanje RNA vodiča omogućuje Cas9 da formira konformaciju kompetentnu za prepoznavanje DNK za traženje cilja. (a) Trakasti dijagram koji prikazuje apo strukturu SpyCas9 poravnate u istoj orijentaciji kao .

Slika 5: Strukture CRISPR-Cas9 vezane za DNA supstrate, pokazuju isti pogled kao na slici 4c nakon superpozicije. (a) Kristalna struktura SpyCas9 (površinski prikaz) u kompleksu sa sgRNA.

Slika 6: Shematski prikazi predloženih mehanizama CRISPR-Cas9 posredovanog prepoznavanja i cijepanja ciljne DNK. Nakon učitavanja sgRNA, Cas9 prolazi kroz veliko konformacijsko preuređenje u r.

Slika 7: Strukture ortologa Cas9 otkrivaju i očuvane i divergentne strukturne značajke među ortolognim CRISPR-Cas9 sustavima. Pojedinačne Cas9 domene su obojene prema shemi u.


Životopis

La calorimétrie de balayage différentielle (DSC) i été appliqué à l'étude de la stabilité et du comportement des lipopoliosides (LPS) de la membrane externe des bakterija Gram-negatives et de leur portion.

Les courbes DSC des LPS présentent des caractéristiques thermiques entre 200 i 129°C (depolimerizacija) i entre − 13 i − 36°C (prijelaz de phase vitreuse). Ces deux aspects ont été mis en relation avec la force relative des types de liaison dans la structure de la chaîne O et avec la capacité de lier l'hydrogène intermoléculaire.

Les courbes DSC des lipides A montrent des pics endothermiques entre 40 i 24°C, autour de 15°C, et entre − 23 i − 4°C. Partir de ces résultats il a été possible d'observer de grandes différences dans le comportement thermique entre Brucella et Vibrio cholerae d'un côté, et entre Escherichia coli et Shigella flexneri d'un autre côté. La fluidité des chaînes acyles et le lyotropisme. qui sont les paramètres importants en ce qui caree lɾxpression des activités biologiques, sont discutés à lɺide des données antérieures. Pour expliquer quelques propriétés, la fluidité peut être mise en rapport avec la température de transition de phase (βα) gel ↔ liquide critallin, qui a lieu à température physiologique. Nèanmoins, la fluidité peut être mise en rapport avec la température des caractéristiques thermiques (entre 6 i 20°C), pour lesquelles une fusion partielle de l'échantillon a été mise évidence. L�t observé entre -23° et -4°C indique lɾxistence d'une réduction forte de la koncentracija d⟪u du lipide A de Brucella, ce qui expliquerait le processus de fusion précoce et l➬tivité lipidique dépendante des interakcija hidrofoba.


Fluidnost membrane (sa dijagramom)| Stanična biologija

Uz pomoć tehnike spektroskopije elektronske spinske rezonancije (ESR) utvrđena je fluidnost membrane. Harden MeConnell i O Hayes Griffith napravili su ex­periment koristeći ESR spektar nakon označavanja repa masnih kiselina lipidnog sloja membrane s nitroksidnom skupinom, koja ima nespareni elektron.

Prisutnost ove spin-oznake, tj. nitroksidne skupine, emitira energiju kada je izložena vanjskom magnetskom polju odgovarajućeg intenziteta. Zatim se bilježi ESR spektar uzimajući fos i šifolipidni spoj sa spin-oznakom kao kontrolom.

Utvrđeno je da je spektar biološke membrane srednji između potpuno pokretne i imobilizirane molekule (slika 2.9). Dakle, ESR spektri su pokazali da lipidne molekule bioloških membrana nisu niti u fiksnom stanju kao u kristalu, niti kao potpuno pokretna molekula (fluid).

Stoga se srednje stanje membrane naziva stanje tekućih kristala. Molekule lipida mogu se pomicati bočno unutar dvosloja, držeći orijentaciju netaknutom (tj. hidrofilne skupine glava usmjerene prema površini membrane i hidrofobni repovi prema unutrašnjosti membrane).

Poznato je da se tijekom prijelaza jednog fizičkog stanja u drugo, tj. iz krutog u tekućinu ili tekućine u plin, stvara toplina. Stoga je prijelaz fizičkog stanja u biološkoj membrani (tj. iz krutog u tekuće) uočen pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (slika 2.10).

Uočeno je da se pri niskim temperaturama lipidni slojevi i slojevi mijenjaju u čvrsto ili gel stanje, a na višim temperaturama se topi u tekuće ili tekuće kristalno stanje. Prijelazna temperatura, na kojoj dolazi do promjene stanja, je ispod temperature na kojoj se javlja većina fizioloških i šiloških funkcija.

Postoje različiti čimbenici koji kontroliraju ovu fluidnost membrane. Povećanje fluidnosti membrane povezano je s povećanjem nezasićenih masnih kiselina i smanjenjem duljine lanca masnih kiselina i sadržaja kolesterola.

Opet, povećanje fluidnosti membrane obrnuto je proporcionalno prijelaznoj temperaturi. Ova promjena u fizičkom stanju membrane ima važnu ulogu u funkciji membrane. Mobilnost membranskih proteina također je utvrđena korištenjem antitijela obilježenih fluoresceinom. Proteini membrane sposobni su za brzu lateralnu migraciju u tekućem lipidnom sloju.

Dakle, uočena je nasumična raspodjela membranskih proteina i ponašanje membranskih proteina ovisi o fluidnosti membrane. Dakle, ovaj model nudi dinamičku sliku membrane.


DSC je termoanalitička tehnika koja se koristi za praćenje toplinskih učinaka, posebno u studijama polimera, tekućih kristala, oksidativne stabilnosti, sigurnosnog probira, analize lijekova i opće kemijske analize. Pomoću DSC-a možemo analizirati toplinski kapacitet i fizičku transformaciju (npr., stakleni prijelaz, kristalizacija i taljenje) uzorka proteina. Primjene DSC-a također uključuju određivanje točke taljenja, postotka kristalnosti i kinetike kristalizacije itd. Kreativna biostruktura pruža vrlo osjetljivu i sveobuhvatnu MagHelix™ DSC uslugu za gore navedene svrhe.


Lik. Eksperimentalna postavka za DSC eksperiment. (J Biomol Tech. 2010)

Kalorimetrija je ključna tehnika koja povezuje temperaturu i specifična fizikalna svojstva tvari kako bi se izravno odredila entalpija povezana s procesom od interesa. Postoje različite vrste kalorimetara, među kojima je DSC instrument za termičku analizu za mjerenje promjene fizikalnih svojstava uzorka. Obično se koristi za proučavanje biokemijskih reakcija. Kao što je prikazano na slici, postoje dvije vrste DSC-a koje rade s različitim mehanizmima: DSC s kompenziranom snagom i DSC s toplinskim protokom. U DSC-u s kompenziranom snagom, materijal uzorka je zatvoren u posudi i postoji još jedna prazna referentna posuda, obje posude su okružene zasebnim pećima i zagrijavaju se zasebnim grijačima. Tijekom zagrijavanja, grijač treba dati različitu snagu kako bi uzorak i prazna referentna vrijednost zadržali na istoj temperaturi. Zatim se mjeri razlika toplinske snage koja je potrebna za održavanje iste temperature. U usporedbi s DSC kompenziranom snagom, u instrumentu DSC toplinskog toka, kao što su IR (infracrveni) grijani DSC i SRDSC (samoreferentni DSC) tehnika, postoji samo jedan grijač. Prazna referentna posuda i posuda s uzorkom materijala stavljaju se na termoelektrični disk koji je okružen peći koja se zagrijava grijačem. Konačno, temperaturna razlika između referentne posude i posude za uzorke mjerila bi se površinskim termoelementima zbog toplinskog kapaciteta (Cp) uzorka. Prema toplinskom ekvivalentu Ohmovog zakona, q=ΔT/R, određuje se protok topline. DSC je moćna tehnika u proučavanju biokemijskih reakcija. Olakšava poznavanje termoanalitičkih parametara biomolekula. Sada je također razvijeno nekoliko novih DSC tehnika mjerenja toplinskog toka.

Naše MagHelix™ analitičke metode za biofizičku karakterizaciju biomolekula uključuju, ali nisu ograničene na:

Pooria Gill, et al. Tehnike diferencijalne skenirajuće kalorimetrije: primjene u biologiji i nanoznanosti. Journal of Biomolecular Techniques. 2010. 21. prosinca (4): 167-93.


Gledaj video: 15 Filtriranje (Svibanj 2022).