Informacija

Kako se mjeri unos nutrijenata kod ljudi?

Kako se mjeri unos nutrijenata kod ljudi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Postoje mnoge tvrdnje o apsorpciji hranjivih tvari, npr. "Iskušenje soka pomaže vam apsorbirati sve hranjive tvari iz povrća". Zanima me kako se mjeri unos nutrijenata.

Npr. je li to jednadžba čistih nutrijenata u odnosu na nutrijente izvan? Ili se mjere razine hranjivih tvari u krvi prije i nakon konzumacije?

Koje su god metode, jesu li dovoljno pouzdane da podrže tvrdnje o relativnoj stopi apsorpcije određenih dijeta ili načina prehrane?


Objašnjenje aktivnog preuzimanja u biologiji

Ljudsko tijelo se sastoji od stanica, intercelularnog matriksa i tjelesnih tekućina. Stanica je tijelo&rsquos funkcionalna jedinica i jedini je dio koji je uistinu živ. Jedno ljudsko tijelo sadrži trilijune stanica. Različite vrste ljudskog tkiva imaju različite tipove stanica (postoji više od 200 tipova), ali stanica je u osnovi uvijek ista, a sastoji se od vanjske membrane, citoplazme ili unutarnjeg staničnog živog materijala i jezgre. Hranjive tvari, proteini i minerali u stalnom su kretanju po cijelom tijelu i zauvijek putuju naprijed-natrag od vanjske, izvanstanične, tekućine do unutarnje stanice, i obrnuto. Biokemijski procesi koji omogućuju tijelu da funkcionira odvijaju se u svakom trenutku dok te čestice ulaze i izlaze iz stanice.

Postoji nekoliko različitih mehanizama pomoću kojih te hranjive tvari i čestice putuju u stanice i iz njih. Neki od mehanizama su pasivni. To uključuje jednostavnu difuziju, olakšanu difuziju i osmozu. Difuzija je pasivno kretanje čestica (atoma, iona ili molekula) iz područja visoke koncentracije u područje niže koncentracije. Primjer za to je izmjena plinova za disanje, pri čemu kisik iz krvi odlazi u stanice tkiva, a ugljični dioksid dolazi iz stanica tkiva i ulazi u krv. Olakšana difuzija je kretanje molekula niz koncentracijski gradijent, prolazeći kroz membranu uz pomoć specifičnog proteina nosača. Osmoza je vrsta difuzije u kojoj voda putuje kroz polupropusnu membranu (ona koja može propuštati samo neke vrste čestica kroz nju) iz razrijeđenije otopine u koncentriraniju otopinu (niz gradijent vodenog potencijala). Primjer osmoze je apsorpcija vode u želucu i debelom crijevu.

Međutim, neki od mehanizama kojima tvari ulaze i izlaze iz stanica zahtijevaju unos energije, pa se stoga nazivaju &ldquoaktivnim.&rdquo Aktivni transport je pumpanje molekula kroz staničnu membranu, protiv gradijenta koncentracije. Drugim riječima, pretpostavimo da je unutar stanice bilo više natrijevih iona nego izvan nje. U aktivnom transportu energija će se koristiti za pumpanje još više natrijevih iona kroz membranu i u stanicu, čineći koncentraciju natrijevih iona unutar stanice još većom. Pumpa protiv gradijenta koncentracije.

Postoje dvije vrste aktivnog transporta, a to su primarni aktivni transport i sekundarni aktivni transport. U primarnom aktivnom transportu, kemijska energija se koristi za pokretanje procesa u obliku ATP-a ili adenozin trifosfata. ATP je tjelesna i rsquos energetska valuta, koja se proizvodi u staničnim i rsquos mitohondrijima, organeli unutar stanice koja koristi hranu za proizvodnju energije. Sekundarni aktivni transport djeluje pomoću elektrokemijskog gradijenta. Ne koristi ATP izravno, ali iskorištava prethodno postojeći gradijent koncentracije.

Moglo bi se postaviti pitanje zašto je aktivan transport neophodan za funkcioniranje tijela i gdje se to događa? Neke tjelesne&rsquos stanice, kako bi ispravno funkcionirale, zahtijevaju visoke koncentracije određenih hranjivih tvari. Te se koncentracije ne događaju jednostavnom difuzijom, i tu dolazi u obzir aktivni transport. Na primjer, epitelne stanice koje oblažu crijeva trebaju donijeti glukozu koja je postala dostupna probavom u tijelo i moraju spriječiti obrnuti tok glukoze iz tijela natrag u crijeva. Glukoza je potrebna u krvotoku, a ne u crijevima. Kad bi crijevne stanice funkcionirale samo difuzijom, tada bi se glukoza nakon jela difundirala iz visoke koncentracije u crijevima do niske koncentracije u krvotoku. Ali kasnije, kada bi koncentracija u krvotoku postala dovoljno visoka, glukoza bi počela difundirati natrag u crijeva. To bi opasno snizilo razinu glukoze u krvi. Aktivni transport, međutim, koristi energetski unos ATP-a kako bi spriječio da se to dogodi i kako bi održao reguliranu razinu glukoze u krvi.

Aktivni transport također igra važnu ulogu u mnogim tjelesnim i drugim sustavima, možda ponajviše u živčanom sustavu. Kada živčana stanica, ili neuron, miruje, održava se razlika naboja između unutarnje i vanjske strane stanice. Ova razlika naboja se proizvodi i održava aktivnim transportom pomoću natrij-kalij pumpi. Razlika u naboju između unutrašnjosti i eksterijera neurona naziva se njegovim membranskim potencijalom mirovanja. Kako živčani impulsi ometaju staničnu membranu, dolazi do druge promjene relativnog napona i stvara se akcijski potencijal, što uzrokuje da impuls putuje duž stanice.

Aktivni transport također se događa u mišićnim stanicama, pumpajući ione kalcija kako bi se stvorila mišićna kontrakcija. Aktivni transport je također važan u bubrezima, gdje se koristi za izmjenu tvari između tubula i kapilara koji okružuju nefron, odnosno bubrežnu stanicu.

Red i složenost ljudskog tijela i svih njegovih fizioloških procesa uistinu je jedno od najvećih čuda prirode. Aktivni transport samo je jedan mali dio te ogromne interakcije. To, međutim, nije jedinstveno za ljudsko tijelo. Javlja se i u drugim živim organizmima. U biljkama, unos minerala kroz korijenje biljke je oblik aktivnog transporta. Zapravo, stanice svih živih organizama imaju zajedničke značajke, a aktivni transport samo je jedan od načina na koji te stanice mogu osigurati da organizam dobije odgovarajuću prehranu i održava svoju homeostatsku ravnotežu.


Stanično programirano dijeljenje hranjivih tvari u mikrookolini tumora

Stanice raka karakteristično troše glukozu kroz Warburgov metabolizam 1 , proces koji čini osnovu snimanja tumora pomoću pozitronske emisijske tomografije (PET). Imunološke stanice koje infiltriraju tumor također se oslanjaju na glukozu, a poremećeni metabolizam imunoloških stanica u tumorskom mikrookruženju (TME) doprinosi imunološkoj evaziji tumorskih stanica 2-4. Međutim, ostaje nejasno je li metabolizam imunoloških stanica u TME-u disreguliran programima unutarnjih stanica ili natjecanjem sa stanicama raka za ograničene hranjive tvari. Ovdje smo koristili PET markere za mjerenje pristupa i unosa glukoze i glutamina od strane specifičnih podskupova stanica u TME. Značajno je da su mijeloične stanice imale najveći kapacitet preuzimanja intratumorske glukoze, a slijede T stanice i stanice raka, u nizu modela raka. Nasuprot tome, stanice raka pokazale su najveći unos glutamina. Ova posebna podjela hranjivih tvari programirana je na način koji je svojstven stanicama putem mTORC1 signalizacije i ekspresije gena povezanih s metabolizmom glukoze i glutamina. Inhibiranje unosa glutamina pojačalo je unos glukoze u tipove stanica rezidentnih tumora, pokazujući da metabolizam glutamina potiskuje unos glukoze, a da glukoza nije ograničavajući čimbenik u TME. Dakle, stanični intrinzični programi pokreću preferencijalno stjecanje glukoze i glutamina od strane imunoloških stanica, odnosno stanica raka. Stanično selektivno razdvajanje ovih hranjivih tvari moglo bi se iskoristiti za razvoj terapija i slikovnih strategija za poboljšanje ili praćenje metaboličkih programa i aktivnosti specifičnih staničnih populacija u TME.


Uvod

Patologija malarije nastaje replikacijom plazmodij paraziti u crvenim krvnim stanicama (RBC). Paraziti malarije proliferiraju unutar parazitoforne vakuole (PV) okružene membranom PV (PVM) [1,2], sučelja između parazita i stanice domaćina. PVM sadrži proteinske komplekse koji služe ključnim funkcijama za unutarstanično preživljavanje parazita [1]. The plazmodij translokon izvezenih proteina (PTEX) posreduje u transportu proteina parazita kroz PVM u stanicu domaćina [3,4,5]. Neselektivne pore dopuštaju prolaz hranjivim tvarima kao što su monosaharidi, folati i aminokiseline kroz PVM [6,7]. Iako su sastav i funkcija PTEX-a detaljno proučavani, molekularna osnova za aktivnost kanala propusnog za hranjive tvari mnogo je manje definirana. PTEX se sastoji od oligomera 3 jezgrene komponente, uključujući izvezeni protein 2 (EXP2), koji tvori heptamerni PVM kanal koji se proteže [8]. Uvjetna mjerenja knockdowna i patch-clampa pokazala su da EXP2 ima dvostruku ulogu i u izvozu proteina kao dijela PTEX-a i u aktivnosti kanala propusnog za hranjive tvari PVM-a [7], zaključak na koji je u početku ukazivala homologija i komplementacijska sposobnost EXP2 za 2 proteina potrebna za aktivnost pora otopljene tvari u Toxoplasma gondii [9].

Ostali PVM proteini uključuju visoko eksprimirane jednoprolazne transmembranske (TM) proteine ​​kao što su rano transkribirani membranski proteini (ETRAMP) [10] i izvezeni protein 1 (EXP1) [11]. EXP1 je bio prvi protein lokaliziran na PVM stadija krvi i jetre gdje tvori homo-oligomere s N-krajem okrenutim prema lumenu PV i C-terminusom izloženim citosolu eritrocita [1,11,12,13]. Neuspješni pokušaji genetskog poremećaja exp1 sugerira bitnu ulogu EXP1 u razvoju parazita [14].

Bioinformatičke analize klasificiraju EXP1 kao člana superfamilije proteina povezanih s membranom u metabolizmu eikosanoida i glutationa (MAPEG) [15,16]. Enzimski in vitro testovi pokazali su da EXP1 posjeduje aktivnost glutation S-transferaze (GST), te je predloženo da se parazit zaštiti od oksidativnog oštećenja detoksikacijom nusproizvoda hemoglobina konjugacijom s reduciranim glutationom (GSH) [16]. Nadalje je predloženo da je EXP1 povezan s rezistencijom na artemisinin (ART), budući da je njegova transkripcija bila pojačana u sojevima parazita otpornih na ART [16]. Studija u P. berghei pokazalo je da EXP1 također može igrati ulogu u preuzimanju lipida tijekom intrahepatičnog razvoja [17].

Ovdje, koristeći uvjetni nokaut (KO) od exp1, pokazujemo da je EXP1 bitan za rast P. falciparum krvne faze neovisno o prethodno predloženoj GST aktivnosti. Otkrili smo da je EXP1 potreban za aktivnost kanala propusnog za hranjive tvari PVM-a. Dosljedno, paraziti sa smanjenom razinom EXP1 postali su preosjetljivi na uvjete koji ograničavaju nutrijente, povezujući propusnost mjerenu na PVM-u sa stjecanjem hranjivih tvari. EXP1 stupa u interakciju s EXP2 na PVM-u i potreban je za pravilnu distribuciju EXP2 i funkcioniranje kao kanal koji propušta hranjive tvari, ali ne i za funkciju EXP2 u izvozu proteina. Stoga EXP1 definira funkciju EXP2 kao kanala propusnog za hranjive tvari i kritičan je za unos hranjivih tvari kroz PVM, što se sada može posebno proučavati.


REZULTATI

Razine glut1 i Δψm opadaju nakon povlačenja IL3

Prethodna izvješća su pokazala da se razina mRNA za Glut1, glavnog prijenosnika glukoze u različitim stanicama koje potječu iz koštane srži, smanjuje nakon povlačenja faktora rasta iz staničnih linija ovisnih o faktoru rasta ili zanemarivanjem primarnih T stanica (Whettonet al., 1984. Rathmell et al., 2000.). Ovo smanjenje je popraćeno smanjenjem potencijala mitohondrijske membrane. Ove promjene nisu poništili antiapoptotični članovi obitelji Bcl-2, ali su ih spriječili konstitutivno aktivni Akt (Garland i Halestrap, 1997. Plas et al., 2001.). Kako bismo dalje istražili fiziološki značaj pada Glut1 mRNA, izmjerili smo razine Glut1 proteina u IL3-ovisnoj staničnoj liniji FL5.12 prije i nakon povlačenja faktora rasta. Bcl-xLEkspresirajuće stanice korištene su u ovim i u kasnijim eksperimentima kako bi se izbjegle zbunjujuće učinke stanične smrti nakon povlačenja IL3. Iako je Bcl-xLsprječava staničnu smrt uzrokovanu povlačenjem faktora rasta, Bcl-xL–zaštićene stanice i dalje atrofiraju i pokazuju promjene u metabolizmu glukoze slične onima uočenim u divljim stanicama FL5.12 nakon povlačenja IL3 (Plas et al., 2001. naši neobjavljeni podaci). Stanice koje eksprimiraju Bcl-xL povučeni su iz IL3 tijekom 24 sata, a razine proteina Glut1 mjerene su Western blottingom. Pad Glut1 proteina kao udjela ukupnog staničnog proteina uočen je nakon povlačenja IL3 (Slika 1A). Nasuprot tome, razine proteina Glut1 održavane su u stanicama FL5.12 koje koeksprimiraju myrAkt i Bcl-xL u odnosu na kontrolne stanice u odsutnosti IL3 (slika 1A). Promjene u metabolizmu glukoze mogu utjecati na mitohondrijalnu homeostazu. Kako bismo utvrdili može li ekspresija myrAkt podržati mitohondrijski metabolizam u odsutnosti faktora rasta, izmjerili smo potencijal mitohondrijske membrane pomoću TMRE. Nakon 24 sata povlačenja IL3, Δψm je pao u stanicama koje eksprimiraju Bcl-xL, ali ne u stanicama koje koeksprimiraju myrAkt (slika 1B).

Slika 1. Aktivirani Akt može djelomično spriječiti smanjenje razine Glut1 proteina i potencijala mitohondrijske membrane uočeno nakon povlačenja IL3. (A) Kontrolne stanice FL5.12 koje eksprimiraju Bcl-xL same ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt održavane su u IL3 ili su povučene iz IL3 tijekom 24 sata, lizirane, a ekvivalentne količine ukupnog proteina ispitane su Western blotom na razine Glut1 i proteina aktina. (B) Stanice su pripremljene kao u A, ali su obojene potenciometrijskom bojom TMRE za procjenu potencijala mitohondrijske membrane. Disipacija mitohondrijskog protonskog gradijenta s CCCP rezultirala je pozadinskim razinama fluorescencije (naši neobjavljeni podaci).

Sposobnost myrAkt-a da promovira stanično preživljavanje djelomično ovisi o prisutnosti izvanstanične glukoze, a predložen je model u kojem metabolizam glukoze kontrolira staničnu predanost apoptozi (Vander Heiden et al., 2001.). Značajan problem s postavljanjem glukoze u kritičnu regulacijsku poziciju za staničnu smrt uzrokovanu povlačenjem faktora rasta je taj što stanice mogu oksidirati alternativne izvore ugljika kako bi potaknule metabolizam mitohondrija. Na primjer, oksidacija aminokiselina može podržati mitohondrijski metabolizam i trebala bi ograničiti staničnu ovisnost o autoprobavi za proizvodnju energije kada je glukoza ograničena. Kako stanična atrofija i gubitak Δψm prate povlačenje faktora rasta, procijenili smo sposobnost stanica povučenih faktora rasta da preuzmu izvanstanične aminokiseline.

Prijenos aminokiselina opada nakon povlačenja IL3

Transporteri aminokiselina kod sisavaca uvelike su definirani na temelju njihovih transportnih svojstava i nekoliko je molekularno kloniranih (Palacin et al., 1998.). Jedan protein povezan s transportom aminokiselina koji je kloniran je teški lanac 4F2 (4F2hc). Također poznat kao CD98, ovaj protein je izvorno opisan kao rani marker za aktivaciju T-stanica i za tumorske stanice i pokazalo se da ima svojstva transformacije u nekim sustavima (Palacin et al., 1998. Deves i Boyd, 2000.). 4F2hc postoji kao heterodimer u kompleksu s različitim lakim lancima i smatra se da djeluje kao šaperon koji usmjerava lake lance na površinu stanice gdje oni funkcioniraju kao transporteri aminokiselina. Procijenili smo FL5.12 stanice za površinsku ekspresiju proteina 4F2hc u prisutnosti i odsutnosti IL3 imunofluorescencijom. U prisutnosti IL3, anti-4F2hc antitijela su bojala prvenstveno staničnu površinu što je reflektirano svijetlim rubom fluorescencije oko stanica (slika 2). Smatra se da se proteini stanične površine razgrađuju prvenstveno u lizosomu. U prisutnosti IL3, vrlo malo 4F2hc pronađeno je u lizosomima, što je određeno kobojanjem s antitijelima na protein lizosomske membrane LAMP-1. Međutim, nakon 24 h od povlačenja IL3, površinsko bojenje za 4F2hc se smanjilo i uočeno je svijetlo, žarišno unutarstanično bojenje. Ovaj uzorak bojenja odražava ciljanje 4F2hc na lizosome jer su te strukture koje sadrže 4F2hc također obojene antitijelima na LAMP-1. Nasuprot tome, ekspresija myrAkt-a u potpunosti je spriječila pojavu žarišnog intracelularnog 4F2hc obrasca bojenja nakon povlačenja IL3 i činilo se da je površinsko bojenje minimalno promijenjeno povlačenjem faktora rasta (slika 3A). Kako bismo izravno procijenili sposobnost stjecanja izvanstaničnih aminokiselina, izmjerili smo stanični unos tricijanih aminokiselina. Nakon 24 sata povlačenja faktora rasta, primijetili smo 50% pad sposobnosti kontrolnih stanica da preuzmu smjesu aminokiselina (slika 3B). Unos aminokiselina u stanice koje eksprimiraju myrAkt bez IL3 bio je jednak onom uočenom u kontrolnim stanicama održavanim u IL3. Dakle, ekspresija myrAkt podržava i površinsku ekspresiju 4F2hc i unos aminokiselina u odsutnosti IL3.

Slika 2. 4F2hc je reguliran naniže i prometuje se u lizosome nakon povlačenja faktora rasta. Bcl-xL– stanice koje eksprimiraju FL5.12 održavane su u prisutnosti ili odsutnosti IL3 24 h i obrađene za imunofluorescenciju. U sloju, 4F2hc bojenje je prikazano crvenom bojom, LAMP-1 bojanje zelenom, a 4,6-diamidino-2-fenilindol bojenje nuklearne DNA u plavoj boji. Bijela traka predstavlja 10 μM.

Slika 3. MyrAkt održava površinske razine 4F2hc i transporta aminokiselina u odsutnosti IL3. (A) Kontrolne stanice FL5.12 koje eksprimiraju Bcl-xL ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt procijenjene su na 4F2hc bojenje nakon 24 h u prisutnosti ili odsutnosti IL3. Bijela traka predstavlja 10 μM. (B) Kontrolne stanice FL5.12 koje eksprimiraju Bcl-xL (CNTL) ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt povučene su iz IL3 na 24 h i procijenjena njihova sposobnost preuzimanja smjese od 15 tricijanih aminokiselina kako je opisano u MATERIJALI I METODE. Vrijednosti su normalizirane na unos u kontrolnim stanicama s IL3. Prikazani su rezultati četiri neovisna eksperimenta, trake pogreške odražavaju SEM.

Faktori rasta kontroliraju pristup stanicama izvanstaničnom kolesterolu

Kolesterol je važna komponenta staničnih membrana i njegova inkorporacija utječe na fluidnost membrane, kao i na staničnu signalizaciju putem lipidnih splava (Simons i Ikonen, 2000.). Iako stanice mogu sintetizirati kolesterol, stanice sisavaca također dobivaju kolesterol iz cirkulacije u obliku LDL čestica. Budući da je kolesterol neophodan za rast stanica i djelomično se stječe iz izvanstaničnog medija, utvrdili smo je li površinska ekspresija LDL receptora također ovisna o faktorima rasta. Stanice su inkubirane na ledu s ljudskim LDL-om obilježenim DiI, a površinsko vezanje procijenjeno je fluorescentnom mikroskopijom. U prisutnosti IL3 uočeno je točkasto površinsko bojenje (slika 4). Ako su stanice pomaknute na 37°C prije fiksacije, ovaj LDL je endocitoziran i na kraju kolokaliziran s lizosomima (naši neobjavljeni podaci). Nasuprot tome, stanice povučene iz IL3 tijekom 24 sata pokazale su smanjene razine površinskog vezanja DiI-LDL. Budući da je ekspresija aktiviranog Akt-a održavala ekspresiju prijenosnika glukoze i aminokiselina u odsutnosti faktora rasta, procijenili smo hoće li ekspresija myrAkt utjecati na ekspresiju LDL receptora. Nije primijećena promjena u površinskom vezanju DiI-LDL nakon 24 sata povlačenja IL3 u stanicama koje eksprimiraju myrAkt (slika 4). Ova zapažanja sugeriraju da čimbenici rasta reguliraju površinsku ekspresiju LDL receptora i da Akt igra ulogu u ovom signalnom putu.

Slika 4. Ekspresija LDL receptora opada s povlačenjem IL3, ali je održava myrAkt. Kontrolirajte Bcl-xL– eksprimirajuće stanice ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt održavane su u prisutnosti ili odsutnosti IL3 tijekom 24 h. Stanice su inkubirane s DiI-obilježenim ljudskim LDL-om tijekom 1 h na ledu, isprane, fiksirane u paraformaldehidu i ispitane fluorescentnom mikroskopijom. Provedena su tri nezavisna eksperimenta.

Faktori rasta kontroliraju unos željeza u stanicama

Željezo je neophodan kofaktor za razne stanične enzime, uključujući citokrom oksidazu i ribonukleotid reduktazu, a nedostatak staničnog željeza dovodi do oštećenja i gubitka funkcije mitohondrija (Sussman, 1992. Walter et al., 2001.). Željezo vezano za transferin preuzimaju stanice putem endocitoze posredovane receptorima. U nekim tipovima stanica uočena je korelacija između brzine proliferacije i površinske razine transferinskog receptora i transferinskog receptora (CD71) je pojačano reguliran u limfocitima nakon aktivacije (Aisen et al., 2001.). Utvrdili smo jesu li površinske razine receptora transferina osjetljive na prisutnost faktora rasta u mediju. U prisutnosti IL3, visoke površinske razine transferinskog receptora uočene su FACS analizom (slika 5) i imunofluorescencijom (naši neobjavljeni podaci). Nakon 24 h povlačenja IL3, površinske razine transferinskog receptora značajno su se smanjile. U skladu s gore navedenim zapažanjima za druge proteine ​​uključene u stjecanje molekula koje potiču rast, stanice koje eksprimiraju myrAkt održavale su više razine transferinskog receptora na površini stanice u odsutnosti IL3 od kontrolnih stanica (Slika 5). Ovi rezultati pokazuju da je površinska ekspresija receptora transferina regulirana IL3 i da myrAkt može podržati ekspresiju receptora transferina neovisnu o faktoru rasta.

Slika 5. Površinska ekspresija receptora transferina regulirana je IL3 i Akt. Kontrolirajte Bcl-xLstanice koje ekspresiraju (CNTL) ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt održavane su u prisutnosti ili odsutnosti IL3 tijekom 24 sata i analizirane pomoću FACS za površinsku ekspresiju receptora transferina (TFNR). Kao negativna kontrola, Bcl-xL stanice su obojene samo sekundarnom (ne 1°). Ista negativna kontrola prikazana je na obje ploče. Provedena su tri nezavisna eksperimenta.

Akt E40K također podržava ekspresiju prijenosnika hranjivih tvari u nedostatku faktora rasta

Kako bismo utvrdili je li sposobnost utjecaja na promet prijenosnika hranjivih tvari ograničena na miristoilirane oblike Akt, procijenili smo drugi aktivirani Akt konstrukt. Ekspresija Akt koja sadrži mutaciju E40K u homološkoj domeni pleckstrina rezultira pojačanom povezanosti s plazma membranom i povećanjem aktivnosti kinaze (Aoki et al., 1998.). Kada je Akt E40K eksprimiran u stanicama FL5.12, apoptoza i atrofija izazvana povlačenjem faktora rasta dramatično su smanjene slično rezultatima dobivenim u stanicama koje eksprimiraju myrAkt. 24 sata nakon povlačenja IL3, vektorske kontrolne stanice bile su 21 ± 1% održive zbog isključenja PI, dok su stanice koje eksprimiraju E40K ostale visoko održive (62 ± 2%). Osim toga, G1 populacija stanica koje eksprimiraju E40K bila je veća od vektorskih kontrolnih stanica i u prisutnosti i u odsutnosti IL3 raspršenim svjetlom prema naprijed (naši neobjavljeni podaci). Kako bismo utvrdili jesu li povećano preživljavanje stanica i smanjena atrofija uočeni u stanicama koje eksprimiraju E40K u korelaciji s održavanjem prijenosnika hranjivih tvari na površini stanice, procijenili smo 4F2hc bojenje u tim stanicama. Slično rezultatima dobivenim u stanicama koje eksprimiraju myrAkt, ekspresija Akt E40K spriječila je promet 4F2hc u lizosome nakon povlačenja IL3 i zadržala protein na površini stanice (slika 6). Dakle, alternativni aktivirani oblici Akt-a mogu utjecati na promet prijenosnika hranjivih tvari, a ova funkcija Akt-a ne zahtijeva src miristoilacijski slijed.

Slika 6. Akt E40K održava površinsku ekspresiju 4F2hc u odsutnosti IL3. Stanice FL5.12 koje eksprimiraju vektor EF6 ili stanice koje eksprimiraju Akt E40K procijenjene su na 4F2hc bojenje nakon 14 h u prisutnosti ili odsutnosti IL3. Bijela traka predstavlja 10 μM.

Rapamicin poništava učinke myrAkt-a

Put odgovora na hranjive tvari u kvascu reguliran je TOR kinazom (Schmelzle i Hall, 2000 Raught et al., 2001.). Kako bismo utvrdili je li homolog mTOR sisavaca potreban za Akt-ovisnu regulaciju transporta hranjivih tvari, testirali smo učinke mTOR inhibitora rapamicina na sposobnost myrAkt-a da sačuva unos aminokiselina u odsutnosti faktora rasta. Istodobno povlačenje faktora rasta i liječenje rapamicinom stanica koje eksprimiraju myrAkt rezultiralo je relokalizacijom 4F2hc u LAMP-1-pozitivne intracelularne strukture kao što je uočeno u kontrolnim stanicama povučenim IL3 (Slika 7A, naši neobjavljeni podaci). Rapamicin nije imao utjecaja na lokalizaciju 4F2hc u kontrolnim stanicama u prisutnosti ili odsutnosti IL3 (naši neobjavljeni podaci). Zatim smo utvrdili je li učinak myrAkt-a na vezanje LDL-a također osjetljiv na liječenje rapamicinom. Kao što je uočeno za pristup aminokiselinama koji podržava myrAkt, liječenje stanica koje eksprimiraju myrAkt IL3 s 20 nM rapamicinom rezultiralo je opadanjem vezanja DiI-LDL (slika 7B). Konačno, procijenjen je učinak rapamicina na Akt-posredovana povećanja ekspresije transferinskih receptora. Liječenje rapamicinom smanjilo je površinsku ekspresiju receptora transferina u odsutnosti IL3 u myrAkt stanicama, ali nije imalo utjecaja na razinu transferinskog receptora u kontrolnim stanicama lišenim IL3 (slika 7C). Ovi rezultati sugeriraju da Akt-posredovano povećanje ekspresije na površini transportera i receptora u odsutnosti IL3 ovisi o aktivnosti mTOR.

Slika 7. Učinci myrAkt na površinsku ekspresiju 4F2hc, LDL receptora i receptora transferina potiskuje rapamicin. (A) Stanice koje eksprimiraju MyrAkt tretirane su s 20 nM rapamicinom (RAP) i održavane u prisutnosti ili odsutnosti IL3 24 h prije fiksacije i bojenja za 4F2hc. Bijela traka predstavlja 10 μM. (B) MyrAkt ekspresirajuće stanice pripremljene su kao u A, ali su inkubirane s DiI-LDL na ledu 1 h prije fiksacije. Bijela traka predstavlja 10 μM. (C) Kontrolne stanice (CNTL) koje eksprimiraju Bcl-xL ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt povučene su iz IL3 tijekom 24 h u prisutnosti ili odsutnosti 20 nM rapamicina (rap) kako je naznačeno i procijenjeno pomoću FACS-a za površinsku ekspresiju transferinskog receptora. Ista negativna kontrola prikazana je na obje ploče.

Gubitak ekspresije prijenosnika hranjivih tvari utječe na Δψm i stanični opstanak

Ako je sposobnost održavanja staničnog pristupa izvanstaničnim molekulama važna komponenta Akt-posredovanog povećanja veličine stanice i preživljavanja nakon povlačenja faktora rasta, tada bi rapamicin trebao ugroziti zaštitne učinke ekspresije myrAkt na ove parametre. Prvo smo ispitali jesu li učinci myrAkt-a na veličinu stanice osjetljivi na rapamicin pomoću protočne citometrije. Nakon 24 h indiciranog tretmana, stanice su obojene bojom za stanično permeantnu DNA Hoechst 33342 i propidijevim jodidom. Analiza je ograničena na propidij jodid-negativne stanice s 2N DNA sadržajem kako bi se izbjegao zbunjujući učinak stanične smrti i staničnog ciklusa na veličinu stanice. Kao što je prikazano na slici 8A, stanice koje eksprimiraju myrAkt veće su od kontrolnih stanica i u prisutnosti i u odsutnosti faktora rasta. Međutim, liječenje stanica koje eksprimiraju myrAkt rapamicinom smanjilo je veličinu tih stanica na veličinu kontrola. Nasuprot tome, rapamicin je smanjio veličinu kontrolnih stanica u prisutnosti, ali ne i u odsutnosti IL3, u skladu s očekivanom razinom aktivacije Akt u tim uvjetima. Zatim smo utvrdili je li rapamicin umanjio antiapoptotički učinak myrAkt-a. Kada su stanice FL5.12 koje eksprimiraju myrAkt povučene iz IL3, apoptoza je odgođena u odnosu na kontrolne stanice vektora (slika 8B). Međutim, kada je povlačenje IL3 provedeno u prisutnosti rapamicina, smanjeno je preživljavanje stanica koje eksprimiraju myrAkt. Rapamicin je imao mali učinak na preživljavanje kontrolnih stanica i nije utjecao na preživljavanje Bcl-xL– stanice koje eksprimiraju u odsutnosti IL3, u skladu s očekivanim nedostatkom Akt aktivnosti u tim stanicama. Na kraju smo ispitali utječe li rapamicin na sposobnost Akt-a da održi Δψm. Kada su myrAkt stanice istodobno liječene rapamicinom i povučene iz IL3, zaštitni učinak myrAkt na Δψm (slika 1B) je eliminiran (slika 8C).

Slika 8. Rapamicin ometa pozitivne učinke myrAkt-a na veličinu stanice, preživljavanje i potencijal mitohondrijske membrane. (A) Kontrolirajte Bcl-xL– eksprimirajuće stanice ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt održavane su u prisutnosti ili odsutnosti IL3 i 20 nM rapamicina kako je naznačeno tijekom 24 h, obojene s PI i Hoechst 33342, i procijenjene FACS sortiranjem. Analiza veličine stanica bila je ograničena na PI-negativne stanice sa sadržajem 2N DNA. Prikazan je volumen ćelije izmjeren u proizvoljnim jedinicama raspršenja svjetlosti pod kutom naprijed. Prikazan je jedan od tri slična eksperimenta, trake pogreške predstavljaju SD trostrukih uzoraka. (B) Vektorska kontrola FL5.12 stanica ili stanica koje eksprimiraju Bcl-xL ili myrAkt održavani su u prisutnosti ili odsutnosti IL3 i 20 nM rapamicina (rap) kako je naznačeno, a njihova održivost je mjerena isključenjem PI u naznačenim vremenskim točkama. Jedan od tri slična eksperimenta pokazuje da trake pogreške odražavaju SD trostrukih uzoraka. (C) Kontrola Bcl-xL-stanice koje eksprimiraju ili stanice koje također eksprimiraju myrAkt tretirane su s 20 nm rapamicinom (rap) i održavane u prisutnosti ili odsutnosti IL3 24 h i obojene s TMRE za procjenu potencijala mitohondrijske membrane. Liječenje s CCCP smanjilo je fluorescenciju na pozadinske razine (naši neobjavljeni podaci).


Fosfor

Fosfor je još jedan esencijalni makronutrijent čiji je nedostatak glavna stvar u sustavima usjeva. Bitan je dio komponenti DNA i RNA, a uključen je u funkciju i integritet stanične membrane. Također je sastavni dio ATP sustava, "energetske valute" biljaka i životinja. Nedostatak fosfora očituje se kao ljubičasta ili crvenkasta promjena boje lišća biljke, a praćen je slabim rastom biljke i korijena, smanjenim prinosom i ranim opadanjem plodova te odgođenom zrelošću. Višak fosfora također može predstavljati probleme, iako nije tako čest. Višak P može izazvati nedostatak cinka kroz biokemijske interakcije. Fosfor je općenito nepokretan u tlu, što utječe na način njegove primjene, a u biljkama je donekle pokretljiv.

Biljke koje rastu pokazuju ljubičasto lišće karakteristično za nedostatak fosfora.


Probava i apsorpcija ugljikohidrata

Osnovni ugljikohidrati koje unosi većina Amerikanaca uključuju jednostavne šećere (glukozu i fruktozu), disaharide (laktozu i saharozu) i složene ugljikohidrate (škrob i glikogen). Iako ugljikohidrati nisu esencijalni u prehrani, oni općenito čine ∼40-45% ukupnog dnevnog kalorijskog unosa ljudi, a biljni škrobovi općenito čine 50-60% kalorija koje se unose ugljikohidratima (9). Glavni konzumirani oligosaharidi su disaharidi saharoza i laktoza, koji čine ∼30-40% ugljikohidrata u prehrani (4). Škrob uključuje amilozu i amilopektin te je polisaharid za skladištenje biljaka od >100 kDa. Škrob se sastoji od ravnog lanca glukoznog polimera amiloze (s α-1,4 glikozidnim vezama) i razgranatog polimera glukoze amilopektina (s α-1,6 glikozidnim vezama u omjeru razgranatih točaka prema 1,4 glikozidnih veza od 1 :20 vidi sl. 1) (6). Glycogen is the polysaccharide storage molecule found in animal cells and is similar in structure to amylopectin except for a greater number of branch points in glycogen (6). Initial digestion of these complex carbohydrates begins with salivary α-amylase while still in the mouth. Both salivary and pancreatic α-amylases are endosaccharidases that are specific for internal α-1,4 glycosidic bonds (6). They have no effect on α-1,6 glycosidic bonds or on α-1,4 bonds of glucose molecules at the branch points or at the ends. The two α-amylases are secreted in active forms and are ∼94% identical in amino acid sequences (4). Salivary α-amylase is deactivated by acid pH so that it remains active in the stomach only as long as it is protected from stomach acid. If trapped within a large bolus of food inside the stomach, salivary α-amylase can continue to digest complex carbohydrates until the bolus is broken up and exposed to stomach acid. Thus, up to 30–40% of the digestion of complex carbohydrates can take place before the food reaches the small intestine.

Fig. 1.Diagrams of the structures of the bonds between carbohydrate moieties in dietary disaccharides and polysaccharides. The sugars are linked through glycosidic bonds between the carbon of one sugar and a hydroxyl group on another sugar. The bond may be either α or β, depending on its position above or below the plane of the sugar. [Modified from Ref. 6.]

Inside the small intestine, pancreatic juice enters the lumen through the hepatopancreatic sphincter (sphincter of Oddi), and its high bicarbonate concentration begins to neutralize gastric acid. Concomitantly, pancreatic α-amylase reaches the lumen and actively continues to break down complex carbohydrates into maltose, maltotriose (isomaltose), trisaccharides, larger oligosaccharides, and α-limit dextrins (oligosaccharides with branch points) (9). Since di-, tri-, and oligosaccharides result from the hydrolysis of starch by α-amylase, additional digestion is required before the absorption of the monosaccharide breakdown products of starch can occur. These starch hydrolysis products must be further broken down by the disaccharidases found as membrane-spanning enzymes in the plasma membranes of the brush borders of intestinal epithelial cells (enterocytes) (4). Table 1 shows a summary of the major carbohydrates found in food with their typical sources, chemical bonds, brush-border membrane enzymes needed, and final monosaccharide products.

Table 1. Sources of carbohydrates, glycosidic bond types, membrane enzymes, and monosaccharide products

These brush-border membrane enzymes have varied specificities and varied locations within the small intestine. They are exoenzymes that cleave one monosaccharide at a time from the oligosaccharides or convert disaccharides into monosaccharides (6). One of the brush-border membrane enzymes is β-glucoamylase (also known as maltase), which hydrolyzes only α-1,4 glycosidic linkages between glucose molecules in maltose or beginning with the residue at the tail end of the polysaccharide (9). Another of the brush-border membrane enzymes is the sucrase-isomaltase complex, which is actually two polypeptides (isomaltase spanning the membrane with associated sucrase) (4). Isomaltase (also known as limit dextrinase or debranching enzyme) hydrolyzes α-1,6 glycosidic bonds at the branch points in a number of limit dextrins and α-1,4 linkages in maltose and maltotriose (4). Sucrase hydrolyzes α-1,2 glycosidic linkages between glucose and fructose molecules and thus splits sucrose. Another of the brush-border membrane enzymes is the β-glycosidase complex, which includes lactase and glucosyl-ceramidase (9). Glucosyl-ceramidase splits β-glycosidic bonds between glucose or galactose and hydrophobic residues such as those found in the glycolipids glucosylceramide and galatosylceramide. Lactase splits β-1,4 bonds between glucose and galactose in milk sugar (9). Lactase deficiency (adult hypolactasia) is common in adults of many ethnic groups and leads to adult lactase levels that may be as low as 10% of those found in infants (9). Lactase-deficient small intestinal epithelial cells allow dietary lactose to reach the colon, where bacteria ferment lactose into gas and organic acids. This lactose produces an osmotic gradient, increasing water in the lumen. Thus, the gut walls are distended by the excess fluid, which increases peristalsis, causing further malabsorption and the frequent consequences of bloating and flatulence along with diarrhea (4).

Another brush-border membrane enzyme is trehalase, which hydrolyzes the glycosidic bond in trehalose, a small disaccharide uncommon in the American diet (9). Trehalose is found in insects, algae, young mushrooms, and other fungi and may cause gastrointestinal distress if consumed by an individual without adequate quantities of trehalase (1). Undigested trehalose arriving in the colon also causes an osmotic gradient leading toward loose stools and diarrhea followed by the digestion of trehalose by the microflora in the colon, producing gases (particularly hydrogen and methane, appearing in the exhaled air) (1). Trehalase is shorter than the other disaccharidases and has only one catalytic site to hydrolyze the α-1,1 linkage between glucose molecules in trehalose. It is still unclear how variable the duodenal trehalase activity may be in the human population however, studies with Eskimos in Greenland and with people in Finland have identified both self-proclaimed mushroom-intolerant and trehalase-deficient individuals (1).

Pancreatic α-amylase acts mostly in the duodenum shortly after its entry through the hepatopancreatic sphincter and generates maltose, maltotriose, and α-limit dextrins from complex carbohydrates (6). Sucrase-isomaltase and β-glycosidase have a high distribution and activity in the proximal jejunum, whereas glucoamylase has its highest activity in the proximal ileum (9). Thus, the spatial distribution of these disaccharidases (little activity in the duodenum and distal ileum and none in the large intestine) maximizes their activity to coordinate with the segments of the small intestine where glucose transporters predominate (4). These disaccharidases thus contribute to the phenomenon known as membrane digestion and provide monosaccharides for absorption across epithelial cells.

Once monosaccharides result from the digestion of carbohydrates by α-amylase and the brush-border membrane enzymes, the monosaccharides are taken up by the enterocytes via specific transport proteins that facilitate the transport of the d -isomers (but not l -isomers) of hexoses (4). d -Glucose and d -galactose are taken up by the Na + -coupled secondary active transport symporter known as Na + -glucose transporter 1 (SGLT1). SGLT1 is a high-affinity Na + -glucose transporter with 12 transmembrane-spanning α-helical domains and 662 amino acid residues with a mass of ∼74 kDa (15). Its Km for sugar transport is a function of the Na + concentration, and its stoichiometry is 2 Na + for every d -glucose molecule (15). In the absence of Na + , d -glucose binds to SGLT1 with a much lower affinity (glucose Km >> 10 mM), but in the presence of Na + , a conformational change allows sugar to bind with high affinity (glucose Km << 0.5 mM). When the intracellular Na + concentration is low (∼10 mM), Na + dissociates from its binding site, causing the transporter affinity for d -glucose to decrease, and the sugar is released into the cytoplasm of the cell. The transporter must complete its cycle by undergoing a third, much slower transition to reorient the binding sites to the extracellular surface (15).

Thus, SGLT1 takes advantage of the Na + gradient (i.e., low intracellular Na + concentration) that is created by basolateral Na + ,K + -ATPases to bring hexoses into the enterocytes. Since SGLT1 moves 2 Na + with each d -glucose, it is capable of generating a glucose concentration gradient across the luminal membrane of 10,000-fold (3). Subsequently, d -glucose can leave the cell on the basolateral side of the cell via facilitated diffusion transporters [glucose transporters (GLUT2s)] from a high concentration inside the cell to a low concentration outside the cell (4). GLUTs are integral membrane transport proteins folded into 12 transmembrane-spanning α-helixes that form a central aqueous channel for the movement of the substrate ( d -glucose, d -galactose, or fructose) across the lipid bilayer. Of the five original GLUTs, only GLUT2 and GLUT5 are able to transport fructose, and GLUT5 has a very limited capacity for transporting d -glucose (12). GLUT2s are distinguished by being a low-affinity, high-turnover transport system with a Km in oocytes of 11 mM. GLUT2s are found in intestinal and kidney basolateral membranes (predominantly), in the liver, and in β-cells of the pancreas and mediate both the uptake and efflux of glucose, galactose, or fructose (12).

However, fructose is not transported by SGLT1 but rather is taken up on the brush-border side of the enterocyte by the specific facilitated diffusion transporter GLUT5. GLUT5s exhibit the weakest homology to other members of the GLUT family of all GLUTs and serve primarily as fructose transporters with a Km of 6 mM (12). They are found in the membranes of fructose-metabolizing tissues, including the brush-border membranes of intestinal cells and the membranes of sperm. They are likely the primary route for dietary fructose uptake in the small intestine. The intracellular conversion of fructose into glucose and lactic acid maintains its low intracellular concentration, aiding its continued absorption via facilitated diffusion from the lumen. As the bloodstream adjacent to the intestinal epithelial cells continuously removes the sugars that traverse entire enterocytes, glucose, galactose, and any remaining intact fructose easily exit the cells down their concentration gradients through facilitated diffusion GLUT2s without the use of cellular energy. Figure 2 shows a summary diagram of the steps involved in the digestion and absorption of carbohydrates.

Fig. 2.Summary of the basic steps involved in carbohydrate digestion and absorption with important enzymes and transporters. The steps are explained in more detail in the text. SGLT1, Na + -glucose transporter 1 GLUT, glucose transporter. [Modified from Ref. 13.]

Clinical example.

Glucose-galactose malabsorption is a rare genetic disease in which the patient has defective intestinal d -glucose and d -galactose absorption (15). It presents as neonatal onset of severe, watery diarrhea, which can result in death unless water and electrolyte balance is quickly restored. Complete removal of glucose, galactose, and lactose from the diet stops the diarrhea within 1 h. Molecular studies have shown that multiple mutations in SGLT1 lead to glucose-galactose malabsorption in the small intestine however, those patients with low glucose absorptive capabilities do not have glycosuria (glucose in the urine) because kidney proximal tubule epithelial cells (as opposed to enterocytes with only SGLT1 in healthy individuals) use both SGLT1 and SGLT2 for the uptake of glucose in the filtrate (4) and SGLT2 is not mutated simultaneously.


The Issue

Nutrient pollution is one of America's most widespread, costly and challenging environmental problems, and is caused by excess nitrogen and phosphorus in the air and water.

Nitrogen and phosphorus are nutrients that are natural parts of aquatic ecosystems. Nitrogen is also the most abundant element in the air we breathe. Nitrogen and phosphorus support the growth of algae and aquatic plants, which provide food and habitat for fish, shellfish and smaller organisms that live in water.

But when too much nitrogen and phosphorus enter the environment - usually from a wide range of human activities - the air and water can become polluted. Nutrient pollution has impacted many streams, rivers, lakes, bays and coastal waters for the past several decades, resulting in serious environmental and human health issues, and impacting the economy.

Too much nitrogen and phosphorus in the water causes algae to grow faster than ecosystems can handle. Significant increases in algae harm water quality, food resources and habitats, and decrease the oxygen that fish and other aquatic life need to survive. Large growths of algae are called algal blooms and they can severely reduce or eliminate oxygen in the water, leading to illnesses in fish and the death of large numbers of fish. Some algal blooms are harmful to humans because they produce elevated toxins and bacterial growth that can make people sick if they come into contact with polluted water, consume tainted fish or shellfish, or drink contaminated water.

Nutrient pollution in ground water - which millions of people in the United States use as their drinking water source - can be harmful, even at low levels. Infants are vulnerable to a nitrogen-based compound called nitrates in drinking water. Excess nitrogen in the atmosphere can produce pollutants such as ammonia and ozone, which can impair our ability to breathe, limit visibility and alter plant growth. When excess nitrogen comes back to earth from the atmosphere, it can harm the health of forests, soils and waterways.


Uvod

Constraint-based genome-scale models and flux balance analysis (FBA) have been widely used to investigate metabolic systems of various organisms. By connecting genotype to phenotype, genome-scale metabolic models (GeM) provide detailed information about biochemical reactions networks that compose cellular metabolism. 1 Assuming pseudo-steady-state for the intracellular metabolites, one can limit the solution space of these underdetermined systems by optimizing one particular reaction via linear programming, referred to as the objective function. Besides a value of the optimized objective function, the resulting solution also provides information about intracellular fluxes within the system. 2 A conventional objective function often used for biological entities is maximization of the growth rate, known as the biomass objective function (BOF), giving the underlying assumption that the “goal” of an organism is to maximize its reproduction, from a perspective of adaptive evolution. 3 This optimization approach has been well-studied and validated for many prokaryotic organisms such as Escherichia coli 4,5 and B. subtilis. 6,7 However for a more complex metabolic system such as mammalian cells, fewer successful constraints-based and FBA-related models have been published. 8 Chinese hamster ovary (CHO) cells represent the most widely used host cell for therapeutic recombinant protein production and have been gaining increased attention for in-silico modeling to better understand the metabolism. Prior to the development of CHO genome-scale models, constraint-based modeling work done on CHO cells included studies using metabolomics and FBA to investigate key metabolism such as energy consumption and lactate production, 9,10 using a non-specific mammalian cell genome-scale model and Mus musculus metabolic model.

A recent CHO-specific genome-scale model contains information on 1766 genes, 6663 reactions, and has led to the generation of three cell line-specific models (CHO-S, CHO-K1, and CHO-DG44). 11 The model was validated by predicting growth rates using sets of metabolic flux data from the literature, and was then applied to study the tradeoff between growth and recombinant protein production. 11 The published CHO GeM has demonstrated its value in facilitating the studies of CHO metabolism. For example, one study tailors the generic CHO GeM into host and recombinant cell-specific models and integrated with multi-omics data to understand the differences of genotypic and phenotypic traits between wild-type and recombinant CHO cells. 12 Another study perturbed the constraints of a CHO GeM to mimic the variation of medium composition and found that CHO cells stop growing when CHO-specific essential amino acids availability decreases, and limitations in non-essential amino acids can be overcome by enhancing amino acid biosynthesis reactions. 10 Besides understanding intracellular physiology and predicting metabolic engineering consequences, constraint-based models can be useful for other applications such as model predictive control, 13,14,15 for various organisms including yeast and mammalian cells. 16,17,18,19

Computational models are useful tools typically because of their capability to describe multiple or hard-to-measure outputs from fewer or easy-to-measure inputs. However, current constraint-based modeling approaches do not fully exploit the value of detailed metabolic models, in particular for mammalian cells with complex, numerous and distinct nutrient inputs. Although intracellular fluxes can be estimated, required inputs are considerable and may be challenging to quantify rapidly. These represent some of the principal difficulties in extending constraint-based models to mammalian cell bioprocesses, eliciting the need for a modeling approach specifically tailored for mammalian cells.

In particular, mammalian cell growth predictions by FBA suffer from a significant complication due to the input requirement of numerous essential amino acids exchange fluxes as part of the constraints. Even slight disagreement between these uptake rate constraints and biomass composition in the model can result in optimization solutions being overly restrictive or even dictated by a single or a few potentially underestimated essential amino acid uptake rates. However, direct estimation of these essential amino acid uptake inputs is possible based on measured growth rates and a “essential nutrient minimization” (ENM) approach which solves for the absolute minimal consumption requirements. These rate estimations can be used to adjust the FBA constraints in order to resolve problematic mass balance constraints. Also, they can be transformed into real-time concentration predictions via a static optimization approach, 14 which can be useful for bioreactor monitoring and control. In this study, we introduce an unorthodox FBA approach based on a set of uptake-rate objective functions (UOFs), which utilizes the measured growth rate as a constraint and independently minimizes the uptake rate of each individual non-essential nutrient. We demonstrate that the UOFs approach reveals insights concerning metabolic differences between mammalian cell line variants not evident from traditional BOF methodologies. Furthermore, sensitivity data derived from the UOFs solution provides a direct visualization of metabolic relationships between nutrients in the networks, providing enhanced characterizations of CHO physiology with applications ranging from cell line evaluation, metabolic engineering to media optimization and biomanufacturing control.


Research Interests:

Research in the Tank lab focuses on the influence of human activities on ecosystem function in streams and rivers. The Tank Lab is committed to interdisciplinary, translational research that includes outreach to a broad community of policy makers, NGOs, and agencies.

Key research themes in the Tank Lab include:

1. Biogeochemistry of streams and rivers:
We study nutrient and carbon cycling in streams and rivers and the effect of human activities on water quality and ecosystem function. To prevent nutrient runoff from polluting downstream ecosystems, we need to understand the role that streams and rivers play in removing nitrogen and phosphorus from water. The movement of nutrients from agricultural areas in the Midwest to the downstream water bodies such as the Great Lakes and Gulf of Mexico have been linked to the recurring “Dead Zones”. For example, we have projects quantifying greenhouse gas emissions in watersheds of contrasting land use, examining regional and seasonal nutrient limitation status in river biofilms, and quantifying the effects of agricultural and urban land use on the uptake and retention of nutrients through biotic pathways.

2. Influence of agricultural land use and conservation on streams:
Researchers in the Tank lab are also working to assess the efficacy of agricultural conservation practices designed to keep nutrients on fields, where farmers need them. For example, we are measuring how the planting of winter cover crops can influence nutrient export in agricultural streams, by preventing nutrient runoff from fields to adjacent waterways. We are also exploring how improved soil health equates to changes in water quality via the planting of cover crops.

3. Stream restoration:
Floodplains connect streams to riparian areas and often function as hotspots for nitrogen removal as well as sediment deposition. Conventionally-managed agricultural streams are generally channelized, and are characterized by high nutrient and sediment export due to runoff and unstable banks. We are studying the "two-stage ditch” practice which restores floodplains to formerly incised streams, reducing erosion, sediment, and associated phosphorus export to sensitive downstream ecosystems. We also study how floodplains, with their saturated organic-rich soils, may increase biological nitrogen removal through the promotion of microbial denitrification.

4. Using experiments to quantify stream transport at ND-LEEF:
The Tank Lab also uses experiments conducted at the Notre Dame Linked Experimental Ecosystem Facility (ND-LEEF), which is a globally-unique research facility associated with the Notre Dame Environmental Change Initiative (ND-ECI). The facility includes two replicated watersheds that each contain linked streams, ponds, and wetlands, and the Tank Lab is investigating the influence of stream substrate on nutrient uptake and particle retention including the transport of novel materials in flowing waters such as environmental DNA (eDNA).



Komentari:

  1. Kazralar

    Niste u pravu. Mogu to dokazati. Pišite u PM, razgovarat ćemo.

  2. Adil

    Šteta što trenutno ne mogu govoriti – jako sam zaposlena. Vratit ću se - svakako ću izraziti svoje mišljenje o ovom pitanju.

  3. Philo

    Very amusing opinion

  4. Zuzragore

    Dobro proizvedeno?



Napišite poruku