Informacija

Zašto E.coli formiraju paralelne nakupine?

Zašto E.coli formiraju paralelne nakupine?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Discalimer: Nisam biolog. Modeliram rast E.Coli i na gifu Wikipedije se mogu vidjeti neke skupine u kojima su bakterije jedna do druge, orijentirane pod približno istim kutom. Napravio sam neke simulacije i dobio slične rezultate. Postoji li neki razlog zašto se to događa?


Podjela stanica događa se diobom na sredini štapa, tako da su rezultat dvije stanice kćeri koje su pod gotovo istim kutom. Tijekom vremena, u nedostatku agitacije, pomičući stanice uokolo, to će dovesti do skupina stanica koje imaju neovisnu staničnu orijentaciju.

Za više informacija, uključujući kako su ga ljudi naveli na drugačije, pogledajte ovaj rad.


Bakterijske stanice radije se vežu jedna s drugom u paralelnoj orijentaciji tako da imaju maksimalnu površinu kontakta i mogu formirati klasteri biofilma.

Za ovu orijentaciju odgovorni su i fizikalni čimbenici (kao što su Brownovo gibanje, elektrostatičke interakcije, gravitacija, van der Waalsove sile i hidrodinamika) i stanična funkcija u bakterijskim stanicama (pokretljivost bakterija, proizvodnja polisaharida i funkcije struktura u vanjskoj membrani).

(Preko: https://www.nature.com/articles/srep29516)


Neiscrpan potencijal od E coli

E coliNjegova izdržljivost, svestranost, široko nepce i lakoća rukovanja učinili su ga najintenzivnije proučavanim i najbolje shvaćenim organizmom na planeti. Međutim, istraživanje o E coli prvenstveno ga je ispitivao kao uzorni organizam, onaj koji je apstrahiran iz svake prirodne povijesti. Ali E coli je mnogo više od običnog mikrobnog laboratorijskog štakora. Umjesto toga, to je vrlo raznolik organizam sa složenom, višestrukom nišom u divljini. Nedavne studije ‘wild’ E coli su, na primjer, otkrili mnogo o njegovoj prisutnosti u okolišu, njegovoj raznolikosti i genomskoj evoluciji, kao i njegovoj ulozi u ljudskom mikrobiomu i bolesti. Ovi su nalazi rasvijetlili aspekte njegove biologije i ekologije koji postavljaju dalekosežna pitanja i ilustriraju kako se cijeni E coliPrirodna povijest može proširiti svoju vrijednost kao uzornog organizma.


Recenzirati članak

Arshpreet Bhatwa 1,2, Weijun Wang 1, Yousef I. Hassan 1 , Nadine Abraham 1,3, Xiu-Zhen Li 1 i Ting Zhou 1*
  • 1 Guelph istraživački i razvojni centar, poljoprivreda i poljoprivredna hrana Kanada, Guelph, ON, Kanada
  • 2 Odjel za biologiju, Sveučilište Waterloo, Waterloo, ON, Kanada
  • 3 Odjel za molekularnu i staničnu biologiju, University of Guelph, Guelph, ON, Kanada

Rekombinantni proteini postaju sve važniji za industrijsku primjenu, gdje Escherichia coli je najčešće korišteni bakterijski domaćin za njihovu proizvodnju. Međutim, stvaranje inkluzijskih tijela često je izazov za proizvodnju topljivih i funkcionalnih rekombinantnih proteina. Kako bi se prevladala ova prepreka, razvijene su različite strategije prilagođavanjem uvjeta rasta, inženjeringom sojeva domaćina E coli, mijenjanje ekspresijskih vektora i modificiranje proteina od interesa. Ovi će pristupi biti sveobuhvatno istaknuti s nekim od novih razvoja u ovom pregledu. Također će se raspravljati o jedinstvenim značajkama proteinskih inkluzijskih tijela, mehanizmu i čimbenicima utjecaja na njihovo nastajanje te njihovim potencijalnim prednostima.


Važnost genomskih otoka

Svi patogeni sojevi E coli sadrže genomske regije (otoke) napunjene skupom gena virulencije koji kodiraju ključne osobine za prianjanje/kolonizaciju, invaziju, izlučivanje toksičnih spojeva i transportne funkcije, kao i proizvodnju siderofora (Touchon et al., 2009.). Neki od tih kapaciteta prisutni su i u komenzalnoj E coli naprezanja i mogu poboljšati stanje okoliša, iako se to često ne prepoznaje. Za patogenost je često potreban potpuni skup osobina koje se prenose s otoka, a koje zajedno definiraju ponašanje (Touchon et al., 2009.). S osnovom u nedavnim projektima sekvenciranja genoma, raznolikost diljem E coli genomi se sada bolje razumiju nego ikad prije (Kudva et al., 2002 Touchon et al., 2009.). Jasno je da su, posebice, horizontalni prijenosi gena uključeni u širenje genomskih otoka povezanih s virulencijom kroz različite E coli sojevi (Ochman i Jones, 2000 Touchon et al., 2009.). Tako se nedavno pojavila slika jezgre genoma od oko 2000 gena karakterističnog za ovu vrstu, uz otvoreni pan genom (trenutno oko 18� gena) (Touchon et al., 2009.), što ilustrira veliki utjecaj horizontalnog prijenosa gena na genomsku plastičnost vrste (Slika 1.). Analiza mjesta na kojima su se umetanja ili brisanja prvenstveno dogodila na svim E coli genomi su nedavno identificirali 133 takva žarišta (Touchon et al., 2009.). Slika 2a ilustrira hipotetski prikaz takvih mjesta u genomima komenzalnih, EHEC i UPEC sojeva. Jedan konkretan primjer, prikazan na slici 2b, nudi pheV tRNA hotspot, prikazuje različite umetke u sojevima K-12 MG1655, O157:H7 (Sakai) i CTF073 (Touchon et al., 2009.). Zapanjujuće, sva četiri tipična UPEC/ExPEC soja koja su ispitana dosljedno su sadržavala sličan umetak na ovom mjestu, koji je označen kao pap operon. Utvrđeno je da ovaj operon ima ulogu E coli fitnes u invaziji urinarnog trakta. Zanimljivo je da su neki genski moduli bili zajednički između pheV otoci UPEC soja CFT073 i soja K12 (slika 2b). Nasuprot tome, pheV žarište insercije u soju O157:H7 (Sakai) bilo je sastavljeno od 32 kodirajuće regije specifične za soj koje obuhvaćaju gene za hipotetske proteine ​​pored onih za navodni enterotoksin i citotoksin.

Prosječno E coli genom je oblikovan mnoštvom evolucijskih sila koje proizlaze iz njegovih primarnih (domaćina) i sekundarnih staništa, u kojima su i biotički (grabežljivci, konkurenti, varalice, obrambeni mehanizmi domaćina) i abiotički (pH, temperatura, UV, iscrpljivanje minerala i tako dalje) prisutni su pritisci. E coli sojevi posjeduju jezgru od oko 2000 gena, koji ih opremaju svestranim metabolizmom. The E coli pan genom se sastoji od oko 18� gena, od kojih 11% pripada jezgri (tamnoplava), veliki dio (62%, plava) sastoji se od tzv. mogu se smatrati ‘promjenjivim' geni (blijedoplavi) (Touchon et al., 2009.). Događaji stjecanja i gubitka gena dosljedno su povezani s žarišnim točkama umetanja/delecije (crveno) i kooperativno oblikuju E coli genom sa selektivno održavanim core/perzistentnim genima. Ovi događaji mogu rezultirati evolucijom klastera gena koji definira specifične E coli fenotipovi, kao što su pap operon, koji je uključen u patogenezu infekcije mokraćnog sustava uzrokovane UPEC sojevima (vidi sliku 2). Strelica predstavlja hipotetski gradijent u kojem E coli prikazane su genomske značajke koje su najvjerojatnije povezane s hlapljivim, postojanim i core genima.

Kada su kompletni genomi od E coli sojevi su usklađeni, tipična žarišta umetanja/brisanja mogu se identificirati na odgovarajućim mjestima, kao što je hipotetski prikazano u (a). I veličina i sastav gena ovih regija mogu se uvelike razlikovati između sojeva, kao što je prikazano u (b) za pheV žarište umetanja tRNA. Evo, pheV žarišta komenzalnih (K-12 MG1655), enterohemoragičnih (EHEC, O157:H7 Sakai) i uropatogenih (UPEC, CTF073) sojeva uspoređuju se nakon podataka Touchona et al. (2009.). Dijelovi žarišta za umetanje istaknuti različitim uzorcima/bojama odgovaraju različitim genskim modulima (vidi Touchon et al., 2009 za detalje). Pap operon (crveni) ima ulogu u infekciji urinarnog trakta, genomski je potpis UPEC/ExPEC sojeva i može se naći u pheV žarišta insercije sojeva CFT073, APEC O1, S88, UMN026 i IAI39. Crni dijelovi predstavljaju gene/genske module, koji su specifični za odgovarajuće sojeve. The pheV žarište insercije u soju O157:H7 Sakai sastoji se od 32 CD-a specifična za soj koji kodiraju, između ostalih, 22 hipotetska proteina, 4 transpozaze, 1 pretpostavljeni enterotoksin i 1 pretpostavljeni citotoksin. Moduli gena označeni zelenom bojom zajednički su za pheV otoci sojeva K-12 i CFT073. Geni u tim modulima kodiraju, između ostalih, glikolat oksidaze, glikolat transporter i navodne nukleozid trifosfat hidrolaze. (Puna verzija ove slike u boji dostupna je na Časopis ISME na liniji).

Unatoč činjenici da trenutno posjedujemo tako detaljne informacije o često značajnim unutar-E coli genomske varijacije, nedostaje nam opće razumijevanje o tome kako se genomski sastav prevodi u specifično ponašanje/preživljavanje u složenom otvorenom okruženju. Jedna stvarna mogućnost je činjenica da često zanemarujemo ekološku važnost pojedinih otočnih osobina, za koje se smatra da su važne u patogenom procesu. Primjer za to je mobilni operonski sustav za unos željeza ybt, izvorno označen kao takozvani otok visoke patogenosti koji se često nalazi u E coli na asn mjesta umetanja tRNA (Schubert et al., 2004.). Istraživanje online genomskih podataka naučilo nas je da je ovaj operon zapravo bio raširen među različitim E coli podskupine i u patogenim i u komenzalnim oblicima (slika 3). Može se smatrati da operon predstavlja ekološki relevantnu osobinu koja se prenosi horizontalnim prijenosom gena s obzirom na njegovu pojavu u mnogim vrstama i rodovima u obitelji Enterobacteriaceae (Schubert et al., 2009.). Međutim, ne znamo što to dodaje već značajnim sposobnostima čišćenja željeza E coli.

Pojava mobitela ybt operon koji kodira yersiniabactin (Ybt) sustav za stjecanje željeza preko E coli sojevi različitih filogenetskih skupina i stilova života. Svi prikazani sojevi, s izuzetkom ECOR 02 i O6:K5:H1 DSM6601, imaju sekvencionirani kompletni genom. Otok je jako prisutan u B2 i D filotipovima. Njegova pojava kod komenzalnih predstavnika B2 skupine ukazuje na ekološku važnost i, moguće, stjecanje od strane B2 tipova predaka. Uloga od ybt operon kao mogući ‘saprofitski otok' može se pretpostaviti zbog njegove široke zastupljenosti u bakterijama različitih životnih stilova, uključujući E coli sojevi filogenetskih skupina A, B1, B2, D i E (Hacker i Carniel, 2001). Opći prikaz funkcionalnog i ‘mobilnog dijela otoka preuzet je od Schuberta et al. (2004.) i prikazano na gornjoj ploči. asn, asn tRNA gen int, gen koji kodira integrazu. Geni u funkcionalnom operonskom kodu za irp, proteini regulirani željezom, uključujući irp2 (Ybt peptid sintetaza) i irp1 (Ybt peptid/poliketid sintetaza) ybtA, aktivator transkripcije tipa AraC i fyuA, protein vanjske membrane. Drugi geni/klasteri gena često prisutni u genomskim otocima koji mogu omogućiti E coli sojevi koji uspijevaju u više niša ili djeluju kao saprofiti, komensali ili patogeni su oni koji su uključeni u rezistenciju na više lijekova/antibiotika i u proizvodnju čimbenika prianjanja (pregledano u Hacker i Carniel, 2001.).


Protein aktivatora katabolita (CAP): Regulator aktivatora

Baš kao što trp operon je negativno reguliran molekulama triptofana, postoje proteini koji se vežu na sekvence operatora koji djeluju kao pozitivni regulator uključiti gene i aktivirati ih. Na primjer, kada je glukoza oskudna, E coli bakterije se mogu okrenuti drugim izvorima šećera kao gorivo. Da biste to učinili, novi geni za obradu ovih alternativnih gena moraju biti transkribirani. Kada razina glukoze padne, ciklički AMP (cAMP) počinje se akumulirati u stanici. cAMP molekula je signalna molekula koja je uključena u metabolizam glukoze i energije u E coli. Kada se razina glukoze smanji u stanici, nakupljeni cAMP se veže na pozitivni regulator protein aktivator katabolita (CAP), protein koji se veže na promotore operona koji kontroliraju obradu alternativnih šećera. Kada se cAMP veže na CAP, kompleks se veže na promotorsko područje gena koji su potrebni za korištenje alternativnih izvora šećera (slika 1). U ovim operonima, mjesto vezanja CAP nalazi se uzvodno od mjesta vezanja RNA polimeraze u promotoru. To povećava sposobnost vezanja RNA polimeraze na promotorsku regiju i transkripciju gena.

Slika 1. Kada razina glukoze padne, E coli mogu koristiti druge šećere kao gorivo, ali moraju transkribirati nove gene da bi to učinili. Kako zalihe glukoze postaju ograničene, razine cAMP se povećavaju. Ovaj cAMP se veže na CAP protein, pozitivan regulator koji se veže na područje operatera uzvodno od gena potrebnih za korištenje drugih izvora šećera.


4 Biofilm kao zadani način rasta

U laboratoriju se bakterije općenito uzgajaju planktonski, ali utopijski mikrokozmosi stvoreni u posudama za kulturu dizajnirani su da maksimiziraju stope rasta bakterija, a ne da repliciraju prirodne uvjete rasta bakterija. Zapravo, čini se da neke bakterijske vrste konstitutivno koriste biofilmski način izvan laboratorija. Oralni streptokoki vrlo su prilagođeni sjedećem rastu na površini zuba. Većini oralnih bakterijskih vrsta nedostaje niša u okolišu i nalaze se gotovo isključivo u ustima [24]. Za ove bakterije, planktonski rast bi uzrokovao da ih brzo ispere slina, progutaju i unište u kiselim sokovima želuca. Ove bakterije vjerojatno provode većinu svog prirodnog postojanja rastući kao biofilm. Pa ipak, često se uzgajaju planktonski u laboratoriju.

Moguće je da je prisutnost prikladnog supstrata za pričvršćivanje sve što je potrebno da se pokrene stvaranje biofilma. Sve je više dokaza da se odmah nakon početnog prianjanja bakterije na čvrstu površinu počinju događati promjene u regulaciji gena [4, 44]. To sugerira da stanice zapravo osjećaju čvrstu površinu na koju su pričvršćene i da ovaj senzorski sustav pokreće signalnu kaskadu koja može dovesti do nekih od ranih obrazaca ekspresije gena potrebnih za stvaranje biofilma. Na primjer, u P. aeruginosa, izraz od algC, gen potreban za sintezu alginata, povećava se unutar nekoliko minuta nakon vezivanja i kada S. epidermidis dolazi u dodir s čvrstom površinom, normalno sferna stanica tvori dodatak nalik na nogu [45, 46]. Ovi nalazi upućuju na to da, slično eukariotskim stanicama, bakterijske stanice posjeduju površinski senzorski sustav koji inducira unutarstanične signale dovoljno moćne da rezultiraju transkripcijskim i morfološkim promjenama.

Mehanizmi osjeta koje koriste bakterije za otkrivanje prianjanja nisu dobro shvaćeni. Promjene percipirane osmolarnosti uzrokovane nabojima na čvrstim površinama mogu biti važan znak za bakterije da prepoznaju površine [22]. Dvokomponentni sustav EnvZ-OmpR koji je uključen u otkrivanje osmolarnosti okoliša također je pokazao da regulira ekspresiju curli i kolanske kiseline [47, 48]. Vlaknasta površinska struktura kovrča igra ulogu u prianjanju, a kolanska kiselina je egzopolisaharid uključen u agregaciju. Uloga osmolarnosti u regulaciji biofilma također je zabilježena kod stafilokoka [13] i Pseudomonas fluorescens[49]. Općenito, biofilmski način rasta može biti zadani način rasta za barem neke bakterijske vrste što sugerira da bismo se trebali preispitivati ​​što pokreće planktonski način rasta, a ne što motivira biofilmski način rasta.


E coli

Naši će urednici pregledati ono što ste poslali i odlučiti hoće li revidirati članak.

E coli, (Escherichia coli), vrsta bakterije koja inače obitava u želucu i crijevima. Kada E coli ako se konzumira u kontaminiranoj vodi, mlijeku ili hrani ili se prenosi ugrizom muhe ili drugog kukca, može uzrokovati gastrointestinalne bolesti. Mutacije mogu dovesti do sojeva koji uzrokuju proljev oslobađanjem toksina, invazijom na crijevnu sluznicu ili lijepljenjem za crijevnu stijenku. Terapija gastrointestinalnih bolesti uglavnom se sastoji od nadoknade tekućine, iako su specifični lijekovi učinkoviti u nekim slučajevima. Bolest je obično samoograničavajuća, bez dokaza o dugotrajnim učincima. Međutim, opasni sojevi, kao npr E coli O157:H7 i E coli O104:H4, može uzrokovati krvavi proljev, zatajenje bubrega i smrt u ekstremnim slučajevima. Pravilno kuhanje mesa i pranje proizvoda mogu spriječiti infekciju iz kontaminiranih izvora hrane. E coli također može uzrokovati infekcije mokraćnog sustava kod žena.


Mrlja po Gramu

E. coli je opisana kao gram-negativna bakterija. To je zato što boje negativno pomoću boje po Gramu.

Boja po Gramu je diferencijalna tehnika koja se obično koristi u svrhu klasifikacije bakterija. Tehnika bojenja razlikuje dvije glavne vrste bakterija (gram pozitivne i gram negativne) davanjem boje stanicama.

Budući da su gram-negativne bakterije, E. coli imaju dodatnu vanjsku membranu koja se sastoji od fosfolipida i lipopolisaharida. Prisutnost lipopolisaharida na vanjskoj membrani bakterije daje joj ukupni negativni naboj na staničnu stijenku. Zbog ovih svojstava, E. coli ne zadržava kristalno ljubičastu tijekom procesa bojenja po Gramu.


Rasprava

Mogućnost inženjerske fiksacije dušika u usjevima unošenjem nif gena u biljne stanice predlaže se još od prvog koraka prijenosa nif geni iz dijazotrofne bakterije u nediazotrofnu bakteriju ostvaren je prije više od 45 godina (35). Međutim, to nije lak cilj i postoje mnogi dobro prihvaćeni izazovi s kojima se treba suočiti, uključujući mnoštvo uključenih gena, zahtjev za održavanjem uravnotežene ekspresije Nif komponenti, potražnju za energijom i smanjenjem snage, te osjetljivost na kisik nitrogenaza. Razvoj alata za sintetičku biologiju omogućio je nif redizajn klastera i kombinatorne biblioteke genskih dijelova visoke propusnosti za ekspresiju složenih kombinacija Nif proteina u prokariota ili eukariota (15, 29). Da bi se postigla stehiometrijska ekspresija Nif komponenti, korištena je strategija temeljena na poliproteinu za smanjenje broja gena, što je rezultiralo uravnoteženom ekspresijom proteinskih komponenti potrebnih za biosintezu i aktivnost nitrogenaze (36). Kako bi se istražilo mogu li biljni transportni lanci elektrona zamijeniti svoje prokariotske kolege kao donori elektrona koji podržavaju katalizu nitrogenaze, moduli za transport elektrona dobiveni iz biljnih organela rekonstituirani su u E coli i utvrđeno je da služe kao donori elektrona za nitrogenazu (37). Budući da biljke potencijalno mogu osigurati energiju i redukcijsku snagu potrebnu za potporu aktivnosti nitrogenaze, to može dodatno smanjiti broj gena potrebnih za inženjersku fiksaciju dušika u usjevima.

Biljne organele dugo su se smatrale prikladnim mjestima za nitrogenazu s obzirom na njihovu ulogu u pretvorbi energije i stoga potencijalno mogu osigurati visoke koncentracije ATP-a i reducirajuću snagu potrebnu za aktivnost nitrogenaze (10). Respiratorna aktivnost mitohondrija i prisutnost puta skupljanja klastera željezo-sumpor u ovoj organeli upućuju na to da je mitohondrijski matriks vjerojatno osiromašen kisikom i stoga bi mogao osigurati prikladno okruženje za nitrogenazu. To je potvrđeno sjemenom demonstracijom da se protein nitrogenaze Fe, komponenta nitrogenaze najosjetljivija na kisik, može pročistiti u potpuno aktivnom obliku iz aerobno uzgojenog kvasca kada se ekspresira u mitohondrijima (12). Time je riješen problem kisika, barem za ovu organelu. Nasuprot tome, kao što se možda i očekivalo, niža aktivnost Fe proteina mogla bi se oporaviti iz kloroplasta, a u ovom slučaju uključivanje Nif-specifičnih komponenti klastera NifU i NifS bilo je potrebno za postizanje aktivnosti u aerobnim uvjetima (16).

Iako sastavljanje aktivnog Fe proteina zahtijeva relativno malo Nif komponenti, zahtjevi za biosintezom MoFe proteina su daleko složeniji, uključujući u najmanju ruku minimalni skup gena od devet Nif proteina, s dodatnim zahtjevom za opskrbu molibdenom, homocitratom i S-adenozil metionin za podršku biosintezi FeMo-co. Iako su mnogi Nif proteini eksprimirani u mitohondrijima kvasca i biljaka, s ciljem odgovarajuće stehiometrijske ekspresije komponenti, naišli su na probleme topivosti i stabilnosti (13, 15). U nekim slučajevima bilo je moguće iskoristiti biološku raznolikost Nif proteina koji potječu iz različitih dijazotrofa. Koristeći ovu strategiju, topljivi i in vitro funkcionalni NifB iz M. infernus je dobiven kada je izražen u mitohondrijima kvasca (14, 17). Međutim, ekspresija i sastavljanje NifDK tetramera bilo je problematično, vjerojatno zbog aberantne proteolitičke obrade NifD. To stvara značajnu barijeru za postizanje ekspresije aktivnog proteina MoFe u mitohondrijima.

Budući da su mnogi proteini unutar organela kodirani u nuklearnom genomu, inženjerske strategije često koriste pristup ciljanju, u kojem se vodeći peptidi koriste za transport proteina eksprimiranih iz nuklearnih transgena u organele. Ciljanje proteina posebno je važno kod inženjeringa mitohondrija, budući da stabilna i prikladna metoda transformacije za ove organele još nije razvijena. Ovo je također relevantno za inženjering kloroplasta biljaka usjeva, budući da je transformacija plastida rutinska u modelnim dvosupnicama, nije dobro utvrđena u jednosupicama. Pristup ciljanju na organele zahtijeva učinkovitu translokaciju proteina kroz obje mitohondrijske membrane i odgovarajuću obradu i cijepanje vodećeg peptida nakon što predprotein uđe u matriks mitohondrija. Obično ovaj proces rezultira obradom proteina na ispravnu veličinu, iako je često važno isprobati različite vodeće peptide kako bi se postigla točna obrada. Iako smo smatrali da bi niz endopeptidaza kandidata mogao biti odgovoran za razgradnju NifD u mitohondrijskom matriksu, nakon što smo identificirali regiju potrebnu za cijepanje, usredotočili smo se na mogućnost da peptidaza za obradu mitohondrija provodi sekundarnu obradu NifD close do ostatka R98. Iako postoji značajna degeneracija u aminokiselinskim sekvencama koje prepoznaju MPP, važnost R98 i pozicioniranje aromatskog ostatka dva nizvodno (Y100) sugeriralo je cijepanje od strane MPP-a (38). Potpuna konzervacija ostatka ekvivalentnog R98, u kombinaciji s visoko konzerviranim ostatkom Y100 u NifD proteinima iz različitih izvora, implicira da se problem razgradnje ne može riješiti iskorištavanjem biološke raznolikosti NifD proteina (38). Doista, otkrili smo da je to tako kada smo ispitivali stabilnost NifD iz četiri različita diazotrofa u mitohondrijima kvasca i otkrili da se u svakom slučaju cijepanje može spriječiti konstruiranjem ekvivalentne supstitucije R98K (slika 1.E).

Kako bismo nedvojbeno potvrdili da je MPP odgovoran za cijepanje, rekonstituirali smo MPP kvasca u E coli i pokazao da protein provodi endoproteolitičko cijepanje NifD-a kako bi generirao iste obrađene fragmente koji su uočeni u kvascu. Ova aktivnost nije specifična za MPP kvasca, budući da je uočena i kod tri MPP biljnog podrijetla, pri čemu je obrada spriječena varijantom NifD R98 u svakom slučaju (Sl. 2). U kvascu su obje MPP podjedinice lokalizirane na matriksu (39), dok su u biljkama obje MPPα i MPPβ podjedinice su potpuno integrirane u citokrom prije Krista1 kompleksa respiratornog lanca kao Core1 i Core2 proteina, respektivno (40). Od E coli ne posjeduje gene koji kodiraju a cyt bc1 kompleksa (41), rekonstitucija MPP biljnog tipa u ovom domaćinu potencijalno bi mogla utjecati na aktivnost obrade. Međutim, primijetili smo da MPP biljnog tipa učinkovito obrađuju vodeći peptid Su9 E coli (slika 3B), koji podupire prethodne dokaze da prijenos elektrona unutar cyt pr1 kompleks nije potreban za obradu (42).

Iako smo identificirali unutarnje mjesto cijepanja za MPP unutar NifD-a, dostupnost ovog mjesta cijepanja nakon ciljanja na mitohondrije kvasca ostaje nejasna. Translokacija kroz mitohondrijske membrane zahtijeva da NifD bude u nesavijenom stanju, a tijekom tog razdoblja, protein je izložen MPP-u kako bi se uklonio signalni peptid. Pretpostavljamo da MPP također cijepa unutarnje mjesto unutar NifD-a tijekom tog razdoblja, prije nego što se protein presavije u ispravan oblik. Ovaj sekundarni događaj cijepanja mogao bi se dogoditi prije interakcije s NifK, objašnjavajući tako poteškoće u sastavljanju stabilnih NifDK heterotetramera u mitohondrijima kvasca (15). Alternativno, moguće je da MPP prepozna NifD koji je pogrešno savijen nakon translokacije u mitohondrijski matriks. Međutim, da je to slučaj, bilo bi teško racionalizirati kako varijanta R98P izaziva ispravno preklapanje. Štoviše, proteaza je aktivna protiv divljeg tipa NifD u netaknutom bakterijskom sustavu, pružajući snažne dokaze da pogrešno savijanje nije primarni uzrok razgradnje. Ipak, važno je napomenuti da cijepanje NifD u bakterijskom sustavu ne znači nužno da MPP prepoznaje zreli oblik MoFe proteina prepun metaloklastera. MPP cijepanje može se dogoditi u fazi prije sazrijevanja nitrogenaze MoFe proteina, ovisno o kinetici sklapanja. Na primjer, apo-NifDK može biti cijepljen proteazom, ali holo NifDK tetramer, prepun metaloklastera, može imati konformaciju u kojoj je mjesto cijepanja nedostupno. Ukratko, teško je razlučiti da li se cijepanje MPP na unutarnjem mjestu u NifD događa u mitohondrijima kvasca prije savijanja ovog proteina ili je mjesto cijepanja ostalo dostupno tijekom sazrijevanja holo NifDK heterotetramera.

Biljne organele važne su mete za uvođenje heterolognih metaboličkih puteva ili složenih bioloških sustava za biljni genetski inženjering. Naši rezultati ističu probleme povezane s ispravnom obradom stranih proteina usmjerenih na organele i točno ukazuju na rizik od aberantne obrade kao posljedicu subliminalnih mjesta cijepanja signalnih peptida prisutnih u sekvencama proteina koji nisu domaćini. Iako je pojava takvih sekvenci vjerojatno slučajna, proteaze cijepanja signalnih peptida mogu se smatrati "čuvarima vrata" za strane proteine. Budući da postoji značajna degeneracija u sekvencama aminokiselina koje prepoznaju procesne peptidaze, teško je točno predvidjeti hoće li se strani proteini razgraditi nakon ulaska u organele. Naš pristup rekonstruiranju MPP-a u E coli pruža jednostavan biološki test za procjenu stabilnosti prije inženjeringa u eukariota i, ako je potrebno, provedbu usmjerene evolucije za stabilnu ekspresiju u mitohondrijima.


Enzimologija jedne molekule: nanomehanička manipulacija i hibridne metode

K. Manibog, . S. Sivasankar, u Metode u enzimologiji, 2017

3.2 Inženjerski proteini za AFM mjerenja sila

Rekombinantni proteini mogu se generirati za mjerenje sile AFM pomoću standardnih tehnika molekularne biologije. Jedini uvjet je da proteini trebaju biti konstruirani s molekularnom ručkom koja se može koristiti za imobilizaciju proteina na površini. Dok je u literaturi opisan širok raspon kemijskih metoda imobilizacije kao što je imobilizacija putem Cys ostataka (Dietz i sur., 2006.), u našim eksperimentima koristimo streptavidin-biotin kemiju za imobilizaciju Ecada. Ukratko, izvanstanične domene Ecad pune duljine s C-terminalnom Avi-oznakom (za biotinilaciju), Tev sekvencom (za proteolitičko cijepanje) i His-oznakom (za pročišćavanje proteina) eksprimiraju se u HEK293T stanicama i pročišćavaju iz kondicioniranog medija upotrebom nikl NTA smole. Nakon pročišćavanja proteina, slijed Avi-tag se biotinilira pomoću BirA enzima (BirA500 kit Avidity). Budući da su ovi protokoli opširno opisani u našim prethodnim radovima (Manibog et al., 2014 Rakshit et al., 2012 Zhang, Sivasankar, Nelson, & Chu, 2009) i nisu glavni fokus ovog pregleda, nećemo raspravljati o njima. metode detaljnije.


Gledaj video: कलसटरल बढन क सब स आम लकषण. Cholesterol Badhne Ke Lakshan Kya Hain (Kolovoz 2022).