Informacija

Što uzrokuje razdvajanje komplementarne kopije molekule RNK?

Što uzrokuje razdvajanje komplementarne kopije molekule RNK?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nedavno sam pročitao članak koji objašnjava da, u hipotezi RNA Svijeta, molekula RNA biva 'skenirana' nukleinskom kiselinom, katalizirana različitom specifično presavijenom RNA molekulom, kako bi se rasporedila u skladu s izvornom molekulom. Međutim, što uzrokuje da se nova, komplementarna molekula odvoji od izvorne molekule? Uvijek čujem ljude kako kažu da ovo komplementarno uparivanje baza omogućuje reprodukciju molekule RNA, ali nikad nisam sasvim razumio: kako? Ako se komplementarne baze teže povezuju, ne bi li novonastala struktura tada trebala biti stabilna? Što uzrokuje stvarnu reprodukciju?


Prvo, želim istaknuti da je hipoteza RNA svijeta upravo to – hipoteza. Iako je pokazano da je moguće da određene RNA molekule prave kopije same sebe, to nije 'normalna' funkcija bilo koje RNA.

Uredi - za jasniji odgovor na samo pitanje:

Nakon replikacije RNA molekule može formirati stabilnu strukturu zajedno sa svojim šablonom ili se može disocirati. Zbog različitih mogućnosti i složenosti RNA struktura, gotovo je nemoguće to predvidjeti, budući da su i sam (točan) slijed i uvjeti okoline, posebice temperatura, vrlo važni.

Više pozadine iz neuređenog odgovora:

Ne može se uvijek lako odgovoriti na to da li se dva komplementarna lanca ili RNA (ili DNK) vežu zajedno. Za DNK zadane duljine (u danom okruženju/puferu) može se manje-više predvidjeti temperatura na kojoj će se komplementarni lanci odvojiti (često se naziva temperatura taljenja), jer DNK tvori relativno stabilne spirale. RNA, međutim, često tvori komplicirane 3-dimenzionalne strukture, često uključuju samokomplementarne i nije ograničena na tipične spirale koje se mogu vidjeti u DNK. Pokušaj predvidjeti rezultirajuću 3D strukturu RNA molekula još je uvijek u tijeku polje istraživanja. Neke od tih struktura su prilično stabilne (npr. u tRNA), ali u drugim slučajevima također mogu biti vrlo dinamične i brzo se mijenjati. Na kraju uvijek ovisi o sekvenci RNA, temperaturi i mnogim drugim čimbenicima okoline.


Uvod u RNA biologiju: crtano izdanje

DNK sadrži upute kako izgraditi sve u našim tijelima. Svaka vaša stanica sadrži kopiju vaše DNK - poput skupa nacrta. Dijelovi ovih uputa provode se prema potrebi u različitim stanicama.

Obično se slijede upute u DNK nacrtima za izgradnju različitih proteina. Proteini obavljaju veliki dio posla koji je potreban da bi tijelo funkcioniralo. U svakom trenutku, jedna stanica može slijediti upute kako napraviti imunološki protein za obranu tijela od napadača poput virusa, dok druga stvara protein koji pomaže želucu da probavi hranu.

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

Općenito, DNK se čuva unutar jezgre, gdje se nalazi središnja knjižnica nacrta za cijelu stanicu. Međutim, proteini se izgrađuju u drugom dijelu stanice. Kako se upute za proteine ​​prenose s DNK nacrta do mjesta gdje su proteini zapravo izgrađeni? Nose se u obliku glasničke RNA ili mRNA. Svaka mRNA sadrži kopiju specifičnog nacrta iz veće biblioteke DNK. Ovaj nacrt prenosi u stanicu, gdje se stvaraju proteini. (mRNA nisu jedina vrsta RNA. Postoji mnogo drugih tipova koji rade druge stvari, a kasnije ćemo reći više o njima!)

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

mRNA se stvara u procesu koji se zove transkripcija. Enzim nazvan RNA polimeraza putuje duž lanca DNK, donoseći komplementarne građevne blokove RNA kako bi se stvorio "transkript" informacija sadržanih u DNK. Dobivena molekula je RNA lanac s misijom: prenijeti svoju poruku dijelu stanice koji stvara proteine.

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

Nakon što je transkript stvoren, mora proći nekoliko modifikacija kako bi bio spreman za translaciju (proces kojim se sadržaj mRNA čita molekularnim strojem zvanim ribosom i prevodi u slijed građevnih blokova proteina koji se nazivaju aminokiseline).

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

Jennifer Cook-Chrysos/Institut Whitehead

Kako je regulirana mRNA?

Stanice su evoluirale na nekoliko načina da reguliraju koji se proteini proizvode i kada. mRNA će se prirodno razgraditi tijekom vremena, pri čemu većina ima relativno kratak životni vijek: molekule mRNA u stanicama sisavaca mogu se zadržati od nekoliko minuta do nekoliko dana prije nego što se razgrade. Jedan od načina na koji stanice reguliraju koliko se određenog proteina stvara u danom trenutku je kontroliranje koliko dugo mRNA ostaje netaknuta. Sve dok je mRNA netaknuta, može se prevoditi iznova i iznova kako bi se proizvelo više proteina.

Neke mRNA traju čak tisuću puta dulje od drugih. Jedan od glavnih regulatora koliko dugo mRNA ostaju netaknute je druga vrsta RNA, nazvana miroRNA (miRNA).

Mali, ali moćan

MikroRNA su jedna od mnogih vrsta RNA koje ne kodiraju proteine. Ove sićušne RNA, koje su dugačke samo 22 građevna bloka, ne prevode se u ribosomu kao glasničke RNA. Umjesto toga, oni ciljaju i vežu se na sekvence u specifičnim mRNA i mogu blokirati translaciju mRNA.


Struktura i mehanizam RNA ovisne RNaze Cas13a iz Rhodobacter capsulatus

Cas13a su efektori s jednom molekulom klase II, tip VI obitelji CRISPR-Cas sustava koji su dio obrambenih sustava bakterija i arhea. Ove RNA vođene i RNA aktivirane RNA endonukleaze karakterizira njihova sposobnost cijepanja ciljnih RNA komplementarnih slijedu crRNA-razmaknice, kao i promatračke RNA na način nespecifičan za sekvencu. Zbog cijepanja staničnih transkripata oni induciraju mirovanje u stanici domaćinu i tako štite populaciju bakterija prekidajući infektivni ciklus RNA-faga. Ovdje izvještavamo o strukturnoj i funkcionalnoj karakterizaciji enzima Cas13a iz foto-auksotrofnih ljubičastih bakterija Rhodobacter capsulatus. Kristalna struktura RcCas13a-crRNA kompleksa RcCas13a-crRNA otkriva njegov poseban način prepoznavanja crRNA kao i enzim u njegovoj kontrakcijskoj konformaciji prije aktivacije. Korištenjem mutageneze usmjerene na mjesto u kombinaciji s masenom spektrometrijom, identificirali smo ključne ostatke odgovorne za obradu pre-crRNA od strane RcCas13a na njegovom različitom katalitičkom mjestu i razjasnili mehanizam reakcije cijepanja posredovan kiselinom. Osim toga, RcCas13a cijepa ciljnu RNK kao i RNA promatrača Escherichia coli što zahtijeva njegovu katalitičku aktivnu HEPN (višu aktivnost nukleotida vezanja eukariota i prokariota) domenu nukleazne aktivnosti. Naši podaci pružaju daljnji uvid u molekularne mehanizme i funkciju ove intrigantne obitelji RNA-ovisnih RNA endonukleaza koje se već koriste kao učinkoviti alati za detekciju RNA i regulaciju ekspresije gena.


Provlačeći se pored lektora

Početkom 2000-ih, kada su stručnjaci vjerovali da ljudska infekcija koronavirusom ne uzrokuje ništa gore od obične prehlade, Mark Denison se borio da dobije adekvatne savezne potpore za podršku svom laboratoriju u medicinskom centru Sveučilišta Vanderbilt.

Virolog i kliničar, Denison je proučavao koronaviruse od 1984. godine, kada su bila poznata samo dva od sedam koronavirusa za koje se trenutno zna da uzrokuju bolest kod ljudi. Ta dva, zajedno s nekoliko drugih koronavirusa, uzrokuju prehladu.

Denison je u početku smatrao da je virus koji je proučavao, a koji pogađa samo miševe, zanimljiv jer dovodi do mišje verzije multiple skleroze. Usput ga je zainteresiralo kako se virus replicira &mdash, ali uvjeriti finansijere da podrže njegov rad bio je pravi izazov.

Početkom 2003. on i njegova supruga Laura bili su na odmoru na Floridi i vodili težak razgovor. &ldquoMislim da je posao važan. Mislim da su modeli važni,&rdquo prisjetio se kako je rekao. &ldquo(Ali) ne&rsquot ne znam mogu li održati karijeru.&rdquo

Toga je dana saznao za patogen iza smrtonosne respiratorne bolesti SARS, koji je bio na naslovnicama.

&ldquoI&rsquom doslovno na plaži sa suprugom, a netko je sišao iz hotela i rekao mi da sam imao telefonski poziv,&rdquo rekao je. Poziv je bio od kolege koji je podijelio vijest da je identificiran patogen odgovoran za bolest, a radi se o koronavirusu.

Teški akutni respiratorni sindrom zahvatio je južnu Kinu u 26 zemalja 2002. i 2003. godine, usmrtivši oko 10% od otprilike 8000 ljudi koje je zarazio. Iako je epidemija obuzdana, koronavirusi su iznenada prepoznati kao ozbiljan problem potencijalno pandemijskih razmjera.

Gotovo dva desetljeća kasnije, rad obavljen u laboratoriju Denison&rsquos pokazao se ključnim u razvoju molekule, nazvane remdesivir, koja je ušla u velika klinička ispitivanja samo nekoliko tjedana nakon SARS-CoV-2, identificiran je koronavirus koji uzrokuje COVID-19.

Čini se da molekula može nadvladati supermoć koronavirusa: njihovu sposobnost čitanja genoma. Ova sposobnost nije pronađena u drugim RNA virusima i čini koronaviruse otpornim na većinu lijekova koji se koriste protiv drugih RNA virusa.

Istraživači očekuju da će u sljedećih nekoliko tjedana saznati je li remdesivir učinkovit tretman za pacijente s COVID-19. U međuvremenu, laboratorij Denison&rsquos nastavio je raditi na identificiranju drugih molekula koje bi mogle zaobići otpornost virusa.

&ldquoOvo je stvarno ključno pitanje za nas: Je li ovo nova klasa lijekova koja nam može omogućiti bolji dizajn više lijekova koji mogu zaobići funkciju lekture i inhibirati virus?&rdquo rekao je Denison, koji sada vodi odjel za pedijatrijske zarazne bolesti u Vanderbiltu .

Nisu vaši prosječni RNA virusi

Poput mnogih virusa koji uzrokuju ljudske bolesti, i koronavirusi imaju genom koji se sastoji od RNA.

Kada je identificiran virus iza SARS-a, jedan od mnogih eksperimentalnih tretmana koje su kliničari pokušali koristiti bila je molekula nazvana ribavirin. U to vrijeme ribavirin je bio lijek prve linije za mnoge RNA viruse.

Ribavirin cilja virusni protein nazvan RNA-ovisna RNA polimeraza ili RdRp, koji je odgovoran za replikaciju genoma koronavirusa.

Craig Cameron je virolog na Sveučilištu Sjeverne Karoline u Chapel Hillu koji proučava molekularne mehanizme RdRp u picornavirusima. &ldquo(RdRp) je vrlo dobro potvrđena meta za lijekove,&rdquo Cameron je rekao. &ldquoI to je jedna od onih meta koje zapravo imaju potencijal da imaju panvirusno antivirusno djelovanje.&rdquo

Ribavirin pripada klasi antivirusnih lijekova koji se nazivaju analozi nukleotida ili nukleozida.

Čini se da se točno kako ribavirin djeluje razlikuje od virusa do virusa, što ga čini dobrom ilustracijom mnogih mogućih načina djelovanja analoga nukleotida. Neki djeluju tako da blokiraju virusnu polimerazu, prekidajući rastući lanac RNK. Neki su mutageni, koji upadaju u rastući virusni genom, puštajući polimerazu da se nastavi, ali unose određenu molekularnu dvosmislenost u sljedeći krug replikacije koja uzrokuje kaskadu pogrešaka u kasnijim generacijama. Neki blokiraju metaboličke enzime, sprječavajući sintezu ili obradu pravih ribonukleotida i na taj način usporavajući replikaciju.

Sustavni pregled podataka iz 30 kliničkih ispitivanja, provedenih nakon epidemije SARS-a, nije pokazao konačnu korist ribavirina &mdash ili bilo kojeg drugog testiranog liječenja &mdash i neke dokaze da je ribavirin nanio štetu pacijentima.

Ribavirin je bio prvi primjer. Od tada, većina analoga nukleotida isprobanih protiv koronavirusa koji uzrokuju SARS i bliskoistočni respiratorni sindrom, ili MERS, nisu učinkoviti u liječenju. Pozivajući se na ribavirin i klasični analog nukleozida 5-fluorouracil, koji djeluje kao mutagen, Denison je rekao: &ldquoKoronavirusi su potpuno, potpuno otporni na te lijekove. Možete ih natopiti u to, a nemaju učinka.&rdquo

Snažno virusno lektoriranje

Bruno Canard je glavni istraživač grupe za replikaciju virusa u Francuskom nacionalnom centru za znanstvena istraživanja. Prije izbijanja SARS-a, Canard se usredotočio na odnose strukture i aktivnosti nukleotidnih analoga korištenih za liječenje HIV-a i drugih virusa. Poput mnogih virologa, bio je inspiriran skorom promašajem SARS-a da započne nove istraživačke programe.

&ldquoBili smo iznenađeni da je ribavirin prilično toksičan i ne baš učinkovit (protiv) koronavirusa,&rdquo Canard.

I CNRS tim u Marseilleu i Denison&rsquos grupa u Tennesseeju namjeravali su razumjeti više o virusu koji je uzrokovao SARS, a jedno od njihovih glavnih pitanja bilo je zašto ribavirin, općenito učinkovit protiv drugih RNA virusa, nije uspio protiv ovog virusa.

Odgovor je ležao u velikom genomu obitelji virusa&rsquos i kako je evoluirao kako bi se zaštitio.

&ldquoRazlog za koje se smatra da su RNA virusi tako uspješni je to što njihove polimeraze griješe,&rdquo Denison je rekao. &ldquoNedostaje im sposobnost ispravljanja pogrešaka pa generiraju mutantne rojeve virusa koji su spremni za prilagodbu u različitim okruženjima.&rdquo

Strukturni biolozi opisuju RNA-ovisne RNA polimeraze kao nalik na šaku s čašicama, s prstima i palcem koji štite aktivno mjesto enzima. Kako svaka nova nukleobaza u lancu predloška ulazi u aktivno mjesto, polimeraza koordinira novi dolazni ribonukleotid tako što ga uparuje s njegovim dvojnikom u postojećem lancu. Ako je pristajanje ispravno, enzim katalizira stvaranje veze u RNA kralježnici. Ako je prianjanje dovoljno blizu, mnoge virusne RNA polimeraze ionako će katalizirati vezu. Stopa pogreške koja može biti čak i jedna pogreška na 10 000 baza dopušta da nastanu ti rojevi mutanata. Ali za koronaviruse, stopa pogreške u replikaciji je niža.

Koronavirusi imaju neke od najdužih genoma u svijetu RNA virusa. Dok njihovi najbliži rođaci imaju genome u prosjeku 10 kilobaza, genomi koronavirusa su tri puta duži. S toliko genetskog materijala za kopiranje, ako bi koronavirusi mutirali istom brzinom kao i drugi RNA virusi, nakupili bi toliko mutacija da bi jedva proizveli održivo potomstvo.

Kako su istraživači na terenu bolje razumjeli RdRp koronavirusa, otkrili su da polimeraza sama po sebi ne može objasniti prekid veze. Virolog François Ferron, zaposlenik na CNRS-u, radio je na replikaciji koronavirusa od izbijanja SARS-a. &ldquoVirusna RNA polimeraza je prilično labava, što znači da ima tendenciju da napravi mnogo pogrešaka,&rdquo rekao je. &ldquoMožda malo više od obične (stanične) RNA polimeraze.&rdquo

To je navelo istraživače na sumnju da bi koronavirusi mogli imati neki način prepoznavanja i ispravljanja pogrešaka.

Međunarodni tim koji je proveo studiju genoma virusa SARS identificirao je niz potencijalnih enzima za obradu RNA na temelju njihove homologije s drugim poznatim enzimima. Godine 2006. grupa Canard&rsquos radila je s članovima tog međunarodnog tima za bioinformatiku kako bi pokazala da jedan od tih enzima, poput njegovih homologa, može cijepati dvolančanu RNA i potreban je za uspješnu replikaciju virusa.

&ldquoPostojala je nagađanja da bi (koronavirusi) mogli kodirati funkciju lektoriranja koja bi im omogućila stabilizaciju velikog genoma, a postojalo je i predviđeno mjesto u genomu gdje bi se to moglo dogoditi,&rdquo Denison je objasnio. &ldquoTo nas je doista navelo da isprobamo genetske eksperimente.&rdquo

Godine 2007., njegova je skupina otkrila da u virusima koji nemaju protein kodiran na istom mjestu, protein nazvan nsp14, koronavirusi iz virusa mišjeg modela nakupljaju mutacije brzinom sličnom drugim RNA virusima. A sojevi virusa bez nsp14, otkrili su, bili su osjetljivi na ribavirin.

Prateći taj rad, francuska se skupina usmjerila na to kako nsp14 radi u epruveti. &ldquoMi smo&rsquot radili na virusu, kao što je Mark Denison lijepo radio,&rdquo rekao je Canard. &ldquoUpravo smo se koncentrirali na taj enzim &hellip i otkrili smo da on zapravo može ukloniti ribavirin.&rdquo

Tim CNRS-a objavio je enzimološku studiju koja je potvrdila da nsp14 može identificirati i ukloniti nepodudarnosti između baza na kraju rastuće kopije virusne RNA 2018. godine, a potom su potvrdili da kada je ribavirin ugrađen u rastući lanac RNA, protein nsp14 može izgrabiti ga iz zaustavljene niti, dopuštajući da se replikacija nastavi.

Dok su istraživači razrađivali enzimologiju, pojavilo se goruće pitanje: Jesu li njihovi nalazi značili da će svi analozi nukleotida biti beskorisni protiv koronavirusa?

&ldquoOvo je pitanje trenutno ključno u razvoju nukleozidnih analognih inhibitora,&rdquo Canard.

Anatomija molekule: Što čini remdesivir jedinstvenim?

Izbjegavanje virusne lekture

Ovdje dolazi remdesivir.

&ldquoIz moje perspektive, priča o (remdesiviru) započela je 2013. godine,&rdquo Denison. &ldquoOtkrili smo da koronavirusi kodiraju jedini poznati sustav za lektoriranje RNA &hellip (i) htio sam provjeriti postoje li nukleozidi koji bi mogli biti aktivni u okruženju lektoriranja koronavirusa.&rdquo

Denison je čuo od Camerona o istraživačkoj suradnji s Gilead Sciences. Cameron je radio na razumijevanju preciznog mehanizma djelovanja skupine analoga nukleotida koje je tvrtka koristila za liječenje hepatitisa C, RNA virusa koji je zarazio desetke tisuća ljudi svake godine.

Prije utrke za lijekom protiv hepatitisa C, prema Adrianu Rayu, medicinskom kemičaru koji je radio u Gileadu, &ldquoNuc prostor za RNA polimeraze i za RNA viruse doista nije bio previše istražen.&rdquo

U pokušaju da pobijedi konkurente na unosnom tržištu hepatitisa C, Gilead je razvio veliku biblioteku inhibitora RNA-polimeraze ovisnih o RNA, uključujući molekulu koja će postati poznata kao remdesivir. Spoj koji je usko povezan s remdesivirom dospio je do ranih kliničkih testova na hepatitis C, ali je posustao, dijelom zato što ga je, kao i remdesivir, trebalo davati injekcijom. Gilead je promijenio strategije, kupivši biotehnološki startup kako bi dobio pristup startup&rsquos oralno dostupnom analogu nukleotida, koji je postao ključna komponenta Gilead&rsquos hepatitis C koktela.

Radeći s RNA-ovisnom RNA polimerazom iz poliovirusa, Cameron je započeo rad koji će pokazati da je molekula neobvezni terminator lanca, vrsta analoga nukleotida koju bi polimeraza trebala moći ugraditi u rastući lanac i nastaviti dalje. &mdash ali nije mogao.

Zaintrigiran, Denison je kontaktirao Gilead kako bi zatražio dopuštenje da isproba taj odobreni lijek, nazvan sofosbuvir, protiv mišjih koronavirusa.

&ldquoTo je bio njihov lijek koji je promijenio svijet koji je izliječio hepatitis C,&rdquo Denison. &ldquoNisu&rsquot nisu namjeravali dopustiti malo poznatom virologu koji radi na koronavirusu da koristi njihove lijekove.&rdquo Ali nakon niza Cameronova uvoda i nekoliko rasprava, Gilead je pristao dopustiti svom laboratoriju da radi s drugom serijom molekula, onima koje su bile razvijen u kući i odložen za hepatitis C. Pokazali su obećavajuće rezultate u ranim studijama kao kandidat za liječenje drugih virusnih infekcija, uključujući i protiv virusa ebole.

Stigle su molekule kandidata. Denison i njegovi pripravnici nisu imali pojma što su. Ali oni su krenuli i testirali ih. Ono što su otkrili bilo je uzbudljivo: u kulturi mišjih stanica, lijekovi bi mogli blokirati replikaciju koronavirusa.

&ldquoPa smo pitali naše Gilead suradnike, &lsquoŠto je to (spoj)?&rsquo Oni su rekli, &lsquoMi&rsquore vam nećemo reći, ali mi&rsquore ćemo vam poslati 60 predlijekova, kemijskih modifikacija istog spoja,&rdquo Denison je rekao.

Pokazalo se da je jedna od te druge serije molekula remdesivir. Diplomska studentica Maria Agostini, koja se nedavno pridružila laboratoriju Denison&rsquos, bila je jedna od istraživača koji su radili na razumijevanju njegove snažne aktivnosti.

&ldquoMi&rsquove smo radili s nekoliko moćnih spojeva, ali remdesivir je zaista bio jedan od prvih s kojima sam radio,&rdquo Agostini. &ldquoKad ste gledali stanice, mogli ste vizualno vidjeti manje dokaza replikacije virusa.&rdquo

Dok su stanice u njezinim kontrolnim posudama bile vidljivo inficirane, imale su loše citopatske učinke, stanice tretirane remdesivirom nakon infekcije dobro su preživjele. Uzgajanjem mnogih generacija virusa u stanicama tretiranim subterapijskim koncentracijama remdesivira, odabirom mutacija koje bi virusu omogućile da izbjegne lijek, Agostini i kolege Erica Andres i Clint Smith pokazali su da su potrebne mutacije u virusnoj polimerazi da bi se stvorila otpornost na remdesivir &mdash i da su ti mutantni virusi bili manje sposobni zaraziti domaćine od divljeg tipa.

Gilead je lijek isporučio besplatno, a Nacionalni institut za zdravlje financirao je istraživače kroz program usmjeren na razvoj tretmana za nove zarazne bolesti.< /p>

&ldquoOvo ukazuje na vrijednost kolaborativne znanosti,&rdquo Denison je rekao. &ldquoOvo je bila tvrtka koja se obvezala pomoći nam da to učinimo kada nitko nije bio zainteresiran za koronaviruse i mehanizam dodjele bespovratnih sredstava koji omogućuje određenu fleksibilnost u smislu širenja.&rdquo

Nedavno je enzimološki laboratorij Mathias Götte&rsquos u Kanadi istražio kako remdesivir djeluje na enzime polimeraze iz koronavirusa koji uzrokuje MERS. Istraživači u skupini Götte&rsquos utvrdili su da spoj zaustavlja polimerazu, djelujući kao terminator lanca &mdash, ali ne odmah.

Andrea Pruijssers, virologinja koja vodi program istraživanja antivirusnih lijekova u grupi Denison&rsquos, rekla je da &ldquo(Remdesivir) nekako izbjegava prepoznavanje od strane enzima za lekturu.&rdquo

Umjesto da zaustavi polimerazu čim se ona ugradi, čini se da remdesivir pušta enzim da nastavi raditi još nekoliko ciklusa, ali onda uzrokuje njegovo zaustavljanje. Istraživači sumnjaju da molekularni posrnuće može biti uzrokovano neobičnom strukturom u dupleksu RNA s predloškom kopije.

&ldquoMisle da je u tom trenutku analog nukleozida koji je već ugrađen zaštićen od enzima za lekturu,&rdquo Pruijssers.

U laboratoriju Denison&rsquos dugogodišnjeg suradnika Ralpha Barica na Sveučilištu Sjeverne Karoline, Chapel Hill, istraživači su otkrili da je remdesivir učinkovit lijek za miševe zaražene SARS-om. Ti su rezultati bili dovoljno obećavajući da remdesivir unaprijede u studiju MERS-a na majmunima, koju su u veljači objavili istraživači iz laboratorija Rocky Mountain NIH-a. Lijek je pokazao određenu korist u smanjenju ozbiljnosti bolesti, pod uvjetom da su majmuni liječeni profilaktički.

Što se tiče razvoja lijekova, remdesivir &ldquo je nekako ispunio svaku prekretnicu na tom putu, iz naše perspektive,&rdquo Denison.

Slična klasa lijekova, različiti rezultati

Kada su Pruijssers počeli u laboratoriju Denison 2017., imali su još jednu molekulu za istraživanje, beta-D-N4-hidroksicitidin ili skraćeno NHC, koja se testirala na Institutu za razvoj lijekova Emory kao potencijalni antivirusni lijek širokog spektra.

Agostini je vodio i prvu studiju tog lijeka, pokazujući njegovu aktivnost u kulturi tkiva. U ožujku su istraživači iz laboratorija Baric i Denison objavili nastavak u Science Translational Medicine, pokazujući da NHC može blokirati replikaciju u virusima koji uzrokuju MERS i SARS &mdash, kao i u koronavirusu koji uzrokuje COVID-19.

&ldquoTo&rsquos zanimljivo,&rdquo Pruijssers je rekao. &ldquo(NHC) ne djeluje kao završetak lanca. Ugrađuje se u genom, a zatim uzrokuje smrtonosnu mutagenezu.&rdquo

Svojom sposobnošću uparivanja baza s više od jednog nukleotida u komplementarnom lancu, NHC uvodi kaskadu pogrešaka u uzastopnim krugovima replikacije. Na kraju, virusno potomstvo nema informacije koje su im potrebne za stvaranje novog virusa.

Dok remdesivir zaustavlja polimerazu u njezinim tragovima, uzrokujući nekoliko novih mutacija, eksperimenti dubokog sekvenciranja u nekoliko virusa koji su se pojavili nakon NHC tretmana pokazali su da lijek uzrokuje brojne mutacije.

&ldquoIdentificirali smo dva spoja koja strukturno spadaju u istu klasu analoga nukleozida, ali djeluju vrlo različito na koronaviruse,&rdquo Agostini.

Posebno su bili ohrabreni jer je rad pokazao da NHC ima određenu terapijsku učinkovitost u mišjem modelu MERS &mdash i da može blokirati čak i sojeve koronavirusa otporne na remdesivir.

U intervjuu početkom ožujka, Pruijssers je rekao da je NHC još uvijek relativno neprovjeren kao terapeutik. &ldquoTeško je razviti mutagen, jer FDA obično ne voli ideju o mutaciji osim ako nije za bolest opasnu po život.&rdquo

Ali pandemija je promijenila stvari. Emory se udružio s biotehnološkom tvrtkom Ridgeback Biotherapeutics iz Miamija za razvoj molekule, a Emory je podnio zahtjev američkoj Upravi za hranu i lijekove za dopuštenje za početak prvih ispitivanja na ljudima za testiranje sigurnosti molekule&rsquos.

Denison je opisao ključnu ulogu koju je odigrao Agostini: &ldquoU pet godina poslijediplomske škole, Maria je testirala i razvila detaljnu in vitro analizu o dva potencijalna lijeka za liječenje ovog pandemijskog koronavirusa &mdash i provela ih kroz taj in vitro pretklinički razvoj.&rdquo

To&rsquos izvanredan i vrlo neobičan podvig. Razvoj lijekova poznat je po visokoj stopi neuspjeha. Naravno, mnogi kandidati za lijekove koji izgledaju obećavajući u pretkliničkim studijama posustaju u velikim pokusima na ljudima.

Suočavanje s pandemijom

Nakon što je desetljeće tvrdio da svijet mora biti spreman za pandemiju, rekao je Denison početkom ožujka, bilo je čudno suočiti se s njom.

&ldquoIt&rsquos stvarno je čudno što smo radili na tome posljednjih šest godina, a lijekovi su bili samo proći, a oni su upravo bili spremni za polazak,&rdquo rekao je. &ldquoMi&rsquoll vidjeti kakav je ishod.&rdquo

Zabrinut je oko toga kako interpretirati podatke iz kliničkih ispitivanja koja testiraju koliko dobro remdesivir djeluje na COVID-19 kod ljudi, od kojih se očekuje da će prvo biti objavljeno ovog mjeseca kao pokus u bolnici prijateljstva Kine i Japana u Wuhanu. (Druga ispitivanja, sponzorirana od Gileada, NIH-a i Svjetske zdravstvene organizacije, pokrenuta su kasnije.)

Prvo, podaci o životinjama s drugih koronavirusa sugeriraju da je lijek najučinkovitiji kada se isporučuje profilaktički, nakon što su životinje izložene, ali prije nego što počnu razvijati simptome. U kontekstu globalne pandemije, to bi bilo teško postići kod ljudi. U nekom trenutku tijekom infekcije, iznimno jak imunološki odgovor počinje činiti više štete od virusa u tom trenutku, rekao je Denison, možda je prekasno da antivirusni lijek pomogne.

Drugo, podaci iz prvih nekoliko ispitivanja vjerojatno će biti nijansirani i zahtijevati pažljivo tumačenje i za što Denison brine da javni diskurs nije dobro pripremljen. Rana ispitivanja sestrinskog spoja remdesivir&rsquos na ljudima kod pacijenata s hepatitisom pokazala su dramatične razlike među pojedincima u antivirusnom odgovoru, a sam remdesivir pokazao je ograničenu korist u usporedbi s drugim kandidatskim terapijama u kliničkom ispitivanju na pacijentima s ebolom. &ldquoLjudi obično imaju mentalitet pobjednika ili gubitnika,&rdquo rekao je. &ldquoOni&rsquove su nazvali remdesivir &lsquotkoji nije uspio lijek protiv ebole,&rsquo zar ne? Nije&rsquot propao u ispitivanju ebole, samo nije&rsquot napredan jer nije&rsquot pokazao toliko koristi kao druga dva spoja.&rdquo

Bez obzira na ishod kliničkih ispitivanja remdesivira i NHC-a, Denison je rekao da se nada da će ova kriza naglasiti važnost financiranja istraživanja potencijalno pandemijskih virusa prije nego što počnu epidemije.

&ldquoPokušati održati osnovne istrage i razvoj lijekova protiv nečega što&rsquos ima visok, visok, veliki utjecaj, ali nisku, nisku, nisku vjerojatnost je stvarno teško u našem svijetu. Stvarno teško,&rdquo rekao je. &ldquoMi&rsquove jednostavno nikada nismo odustali od ideje da te stvari moramo imati spremne i imati ih u kanti.&rdquo


Mreškanje reverzne transkriptaze

Godine 1970. dva su laboratorija biokemijski demonstrirala da se RNA može koristiti kao predložak za DNK. Howard Temin je tvrdio da se RNA nekih virusa mora kopirati u DNK u određenim tipovima stanica kako bi se objasnila 'transformacija' normalnih stanica u stanice raka od strane tih virusa. Otkrivanje enzima odgovornog za ovu sintezu DNK ovisne o RNA bio je važan dokaz koji je mnoge bivše skeptike uvjerio da je njegova teorija valjana. Mnogima su se novi rezultati činili u skladu s predviđanjima središnje dogme, ali za druge su ti nalazi smatrani izazovom za njih. Jedan je pisac otišao toliko daleko da je sugerirao da postojanje 'obrnute transkripcije' (kopiranje RNK za stvaranje DNK) znači da je potrebno preispitati cjelokupnu središnju dogmu. Gledajući unatrag, čini se pomalo čudnim da se ovaj (anonimni) pisac nije potrudio ponovno pročitati izvornu formulaciju prije nego što je pozvao da se ona odbaci! Crick je odgovorio na izazov i nekoliko tjedana kasnije objavio prošireni pogled na središnju dogmu. Ponovio je da je prijenos informacija s RNA na RNA, s RNA na DNK, ili možda čak s DNK na protein (izravno, bez RNA međuprodukta) "posebni prijenosi" koji se mogu dogoditi u određenim tipovima stanica. Kao takvi, bili su savršeno u skladu i s hipotezom o sekvenciji i s protokom informacija između nukleinskih kiselina ili od nukleinskih kiselina do proteina. Tako novootkrivene 'reverzne transkriptaze', kako se danas nazivaju RNA-ovisne DNA polimeraze, nisu poremetile središnju dogmu, unatoč početnom 'mrebanju'. Međutim, Crick je također ukazao na tri 'nepoznata prijenosa', s proteina na protein, RNA ili DNK. Takvi prijenosi, ako se pokaže da postoje, zahtijevali bi radikalnu preformulaciju molekularnih principa. Kad bi genski proizvodi (proteini) mogli mijenjati gene (sekvence DNK), bio bi utro put za nasljeđivanje stečenih karakteristika. Godine 1970. Crick je smatrao da su dostupni dokazi još uvijek nedostatni da se zaključi da je središnja dogma sigurno točna, iako je tvrdio da će vjerojatno ostati korisna. Nedavno je otkriveno da su se pod određenim okolnostima sekvence DNK organizma mijenjale na način koji se činio usmjeren kao odgovor na podražaje iz okoline. Osim što su proširili naše razumijevanje podrijetla mutacija, eksperimenti su povećali mogućnost da 'povoljni' proteini mogu uzrokovati 'povoljni' mutacije. Stoga je analiza podrijetla 'adaptivnih' mutacija ključna za procjenu valjanosti središnje dogme, budući da su one povećale mogućnost da informacije mogu teći od proteina do nukleinskih kiselina. Vidi također Retrovirusna replikacija, Baltimore, David, i Temin, Howard Martin


'RNA svijet'

Svestranost RNA u funkciji i obliku pomogla je inspirirati ideju poznatu kao "RNA world" hypothesis.

Organisms rely on an astoundingly complicated system of DNA, RNA and protein to transmit hereditary information, and scientists have long wondered how this system could have arisen in early life-forms. RNA offers a logical answer, He said: This molecule can both store genetic information and catalyze reactions, suggesting that early, simple organisms could have relied solely on RNA.

"It's a hybrid," He said. "So it makes perfect sense as a start."

Additionally, He said, RNA's sugar base, ribose, always appears first in organisms, as it's easier to make. Deoxyribose then gets created from ribose. "So that implies in life, you have the ribose, the RNA first, and then the DNA comes later," He said.

From that simpler RNA start, more-complex life could arise, evolving the stabler DNA to serve as a long-term library and developing protein as a more efficient catalyst.


Functions of RNA Polymerase

Traditionally, the central dogma of molecular biology has looked at RNA as a messenger molecule, that exports the information coded into DNA out of the nucleus in order to drive the synthesis of proteins in the cytoplasm: DNA → RNA → Protein. The other well known RNAs are transfer RNA (tRNA) and ribosomal RNA (rRNA) which are also intimately connected with the protein synthetic machinery. However, over the past two decades, it has become increasingly clear that RNA serves a range of functions, of which protein coding is only one part. Some regulate gene expression, others act as enzymes, some are even crucial in the formation of gametes. These are called non-coding or ncRNA.

Since RNAP is involved in the production of molecules that have such a wide range of roles, one of its main functions is to regulate the number and kind of RNA transcripts formed in response to the cell’s requirements. A number of different proteins, transcription factors and signaling molecules interact with the enzyme, especially the carboxy-terminal end of one subunit, to regulate its activity. It is believed that this regulation was crucial for the development of eukaryotic plants and animals, where genetically identical cells show differential gene expression and specialization in multicellular organisms.

In addition, the optimal functioning of these RNA molecules depends on the fidelity of transcription – the sequence in the DNA template strand must be represented accurately in the RNA. Even a single base change in some regions can lead to a completely non-functional product. Therefore, while the enzyme needs to work quickly and complete the polymerization reaction in a short span of time, it needs robust mechanisms to ensure extremely low error rates. The nucleotide substrate is screened at multiple steps for complementarity to the template DNA strand. When the correct nucleotide is present, it creates an environment conducive to catalysis and the elongation of the RNA strand. Additionally, a proofreading step allows incorrect bases to be excised.

There is remarkable similarity in the RNA polymerases found in prokaryotes, eukaryotes, archea and even some viruses. This points to the possibility that they evolved from a common ancestor. Prokaryotic RNAP is made of four subunits, including a sigma-factor that dissociates from the enzyme complex after transcription initiation. While prokaryotes use the same RNAP to catalyze the polymerization of coding as well as non-coding RNA, eukaryotes have five distinct RNA polymerases.

Eukaryotic RNAP I is a workhorse, producing nearly fifty percent of the RNA transcribed in the cell. It exclusively polymerizes ribosomal RNA, which forms a large component of ribosomes, the molecular machines that synthesize proteins. RNA Polymerase II is extensively studied because it is involved in the transcription of mRNA precursors. It also catalyzes the formation of small nuclear RNAs and micro RNAs. RNAP III transcribes transfer RNA, some ribosomal RNA and a few other small RNAs and is important since many of its targets are necessary for normal functioning of the cell. RNA polymerases IV and V are found exclusively in plants, and together are crucial for the formation of small interfering RNA and heterochromatin in the nucleus.


Basics of DNA Replication

Figure 4. The three suggested models of DNA replication. Grey indicates the original DNA strands, and blue indicates newly synthesized DNA.

The elucidation of the structure of the double helix provided a hint as to how DNA divides and makes copies of itself. This model suggests that the two strands of the double helix separate during replication, and each strand serves as a template from which the new complementary strand is copied. What was not clear was how the replication took place. There were three models suggested: conservative, semi-conservative, and dispersive (see Figure 4).

In conservative replication, the parental DNA remains together, and the newly formed daughter strands are together. The semi-conservative method suggests that each of the two parental DNA strands act as a template for new DNA to be synthesized after replication, each double-stranded DNA includes one parental or “old” strand and one “new” strand. In the dispersive model, both copies of DNA have double-stranded segments of parental DNA and newly synthesized DNA interspersed.

Meselson and Stahl were interested in understanding how DNA replicates. They grew E coli for several generations in a medium containing a “heavy” isotope of nitrogen ( 15 N) that gets incorporated into nitrogenous bases, and eventually into the DNA (Figure 5).

Figure 5. Meselson and Stahl experimented with E. coli grown first in heavy nitrogen ( 15 N) then in 14 N. DNA grown in 15 N (red band) is heavier than DNA grown in 14 N (orange band), and sediments to a lower level in cesium chloride solution in an ultracentrifuge. When DNA grown in 15 N is switched to media containing 14 N, after one round of cell division the DNA sediments halfway between the 15 N and 14 N levels, indicating that it now contains fifty percent 14 N. In subsequent cell divisions, an increasing amount of DNA contains 14 N only. This data supports the semi-conservative replication model. (zasluge: izmjena djela Mariane Ruiz Villareal)

The E coli culture was then shifted into medium containing 14 N and allowed to grow for one generation. The cells were harvested and the DNA was isolated. The DNA was centrifuged at high speeds in an ultracentrifuge. Some cells were allowed to grow for one more life cycle in 14 N and spun again. During the density gradient centrifugation, the DNA is loaded into a gradient (typically a salt such as cesium chloride or sucrose) and spun at high speeds of 50,000 to 60,000 rpm. Under these circumstances, the DNA will form a band according to its density in the gradient. DNA grown in 15 N will band at a higher density position than that grown in 14 N. Meselson and Stahl noted that after one generation of growth in 14 N after they had been shifted from 15 N, the single band observed was intermediate in position in between DNA of cells grown exclusively in 15 N and 14 N. This suggested either a semi-conservative or dispersive mode of replication. The DNA harvested from cells grown for two generations in 14 N formed two bands: one DNA band was at the intermediate position between 15 N and 14 N, and the other corresponded to the band of 14 N DNA. These results could only be explained if DNA replicates in a semi-conservative manner. Therefore, the other two modes were ruled out.

During DNA replication, each of the two strands that make up the double helix serves as a template from which new strands are copied. The new strand will be complementary to the parental or “old” strand. When two daughter DNA copies are formed, they have the same sequence and are divided equally into the two daughter cells.


Umjetničke veze

Figure Errors in splicing are implicated in cancers and other human diseases. What kinds of mutations might lead to splicing errors? Think of different possible outcomes if splicing errors occur.

Figure Mutations in the spliceosome recognition sequence at each end of the intron, or in the proteins and RNAs that make up the spliceosome, may impair splicing. Mutations may also add new spliceosome recognition sites. Splicing errors could lead to introns being retained in spliced RNA, exons being excised, or changes in the location of the splice site.


Gledaj video: Domaća zadaća za 9. razred: Biologija - DNK i RNK (Kolovoz 2022).