Informacija

Usporedba razina ekspresije gena između kontrole i bolesti u različitim vremenskim točkama

Usporedba razina ekspresije gena između kontrole i bolesti u različitim vremenskim točkama



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Imam skup podataka s razinama ekspresije popisa gena, mjerenih u repliciranju u dvije različite vremenske točke između dvije skupine; kontrolnu skupinu i skupinu bolesti.

Želim identificirati promjene u izražavanju između dviju skupina, no imam problema s formuliranjem kako to najbolje učiniti. Na primjer, ako imam $[C_0]$ i $[C_1]$ kao kontrolnu grupu izmjerenu na $t=0$ i $t=1$ respektivno, i $[D_0]$ i $[D_1]$ kao grupu bolesti, pokušao sam učiniti:

$$frac{([D_1] - [D_0]) - ([C_1] - [C_0])}{[C_1] - [C_0]}$$

Smatram da bi promjena nabora bila prikladna, no čini se da nema logičnog smisla za gene gdje su $[C_0] = [C_1]$ ili $[D_0] = [D_1]$.

Može li netko predložiti odgovarajući omjer ili mjerenje? Ovo je dovoljno jednostavno kada se jednostavno uspoređuje između C i D (npr. jednostavno pronađete $frac{D}{C}$), no nisam siguran kako tretirati različite vremenske točke.


Profil ekspresije gena može se promijeniti u različitim vremenskim točkama između dvije skupine; trebali biste odlučiti što zapravo želite mjeriti. Ako želite vidjeti razlikuje li se oboljela skupina od kontrolne, trebate ih usporediti u svakoj vremenskoj točki. Za većinu situacija trebali biste usporediti samo njihovo stabilno ponašanje.

Zamislite bolesnu osobu koja pokazuje neke fiziološke razlike u određenim razvojnim fazama u odnosu na kontrolu, ali se na kraju ispostavi da je sasvim normalna. Dakle, ono što je važno u većini slučajeva je stabilno stanje, a ne prijelazni procesi.

Međutim, ako ste zainteresirani za promjena u izrazu onda biste trebali usporediti ([D1] - [D0]) s ([C1] - [C0]). To će vam reći jesu li dinamika oboljelih i kontrolnih uzoraka slična ili ne.

Postoje problemi s promjenama preklopa. Iako su to pristojne mjere, ne možete stvarno primijeniti t-test s promjenama nabora (normalizacija na 1 je druga stvar).

Možete napraviti još jedan t-test između [C1] i [C0] (slično za D). To će vam reći mijenja li bolesna ili kontrolna populacija s vremenom svoj izraz t=1 ili ne.

AFAIK ne možete uspoređivati ​​dinamiku i vrijednosti simultano. Što biste trebali testirati ovisi o tome što vas zanima.


Atlas cirkadijalne ekspresije gena u sisavaca: implikacije za biologiju i medicinu

Generirali smo podatke o multiorganskoj ekspresiji visoke razlučivosti koji pokazuju da gotovo polovica svih gena u genomu miša oscilira s cirkadijanskim ritmom negdje u tijelu. Tako raširene transkripcijske oscilacije nisu ranije zabilježene kod sisavaca. Primjenjujući analizu puta, uočili smo nove prostorno-vremenske odnose posredovane satom. Štoviše, otkrili smo da većina najprodavanijih lijekova u Sjedinjenim Državama cilja na cirkadijalne genske proizvode. Mnogi od ovih lijekova imaju relativno kratak poluživot, a naši podaci predviđaju što bi moglo imati koristi od doziranja u određenom vremenu.


Materijali i metode

Obrada riba i prikupljanje uzoraka

Istražiti utjecaj temperature na ekspresiju gena u Austrofundulus limnaeus Myers, izložili smo ribu četirima laboratorijskim temperaturnim režimima aklimatizacije (slika 1B): konstantnim temperaturama od 20°, 26° ili 37°C ili dnevnom cikličnom temperaturnom režimu od 20-37°C. Promjenjivi temperaturni režim osmišljen je tako da oponaša prirodne varijacije temperature koje svakodnevno doživljavaju A. limnaeus(Podrabsky i sur., 1998. sl. 1A). Odrasli mužjaci ribe prosječne veličine 2,1±1,1 g (srednja vrijednost ± s.d.) korišteni su u ovoj studiji kako bi se izbjegle komplikacije povezane s veličinom i spolno specifičnom ekspresijom gena. Ukupno su uzorkovane 432 ribe tijekom vremenskog režima uzorkovanja. Ribe korištene u ovom eksperimentu proizvedene su iz laboratorijskog materijala koji se nekoliko generacija održavao na 26–28°C. Ribe za svaki režim privikavanja smještene su u staklene akvarije od 210 l. Ribe su hranjene svakodnevno tijekom trajanja pokusa u 09:00 sati smrznutim krvavim crvima (larvama kironomida). Eksperiment je započeo (t=0) u 12:30 h. Ribe su uzorkovane (sl. 1B simboli) svaka 24 h za aklimatizaciju na 20° i 37°C i svaka 4 h tijekom fluktuirajućih (20-37°C) i kontrolnih (26°C) tretmana. Četiri ribe su izvađene iz spremnika za privikavanje u svakoj vremenskoj točki i brzo zamrznute u tekućem dušiku. Ribe su pohranjene na –80°C 2-4 tjedna prije ekstrakcije ukupne RNK iz tkiva jetre.

Prirodne i laboratorijske temperature koje doživljava odrasla osoba Austrofundulus limnaeus. (A) Rekord temperature 5 uzastopnih dana u tipičnom efemernom ribnjaku u kojem žive A. limnaeus(Podrabsky i sur., 1998.). (B) Odrasli mužjaci ribe bili su izloženi četiri različite termalne aklimatizacije. Za tretman temperature ciklusa (20-37°C) (crna linija) ribe su sakupljane (otvoreni krugovi) svaka 4 h u prva tri dnevna ciklusa, a zatim ponovno svaka 4 h 5. i 14. dana. Kontrolna riba (siva linija ) držane na 26°C sakupljane su (otvoreni kvadrati) svaka 4 sata 1. i 14. dana. Ribe izložene konstantnoj temperaturi od 20°C (plava linija) sakupljene su (otvoreni plavi dijamanti) na 24, 48,72, 96, 168 i 336 h. Ribe izložene konstantnoj temperaturi od 37°C (ružičasta linija) sakupljene su (otvoreni ružičasti kvadrati) kao riba na 20°C, osim za vremensku točku od 336 h. Vrijeme 0 za temperaturni ciklus je 12:30 h pri temperaturi od 26°C. Zabilježite slomljenu os u B. Dok je uzorkovano pet temperaturnih ciklusa tijekom 2-tjedne aklimatizacije, temperatura se neprestano mijenjala.

Prirodne i laboratorijske temperature koje doživljava odrasla osoba Austrofundulus limnaeus. (A) Rekord temperature 5 uzastopnih dana u tipičnom efemernom ribnjaku u kojem žive A. limnaeus(Podrabsky i sur., 1998.). (B) Odrasli mužjaci ribe bili su izloženi četiri različite termalne aklimatizacije. Za tretman temperature ciklusa (20-37°C) (crna linija) ribe su sakupljane (otvoreni krugovi) svaka 4 h u prva tri dnevna ciklusa, a zatim ponovno svaka 4 h 5. i 14. dana. Kontrolna riba (siva linija ) držane na 26°C sakupljane su (otvoreni kvadrati) svaka 4 sata 1. i 14. dana. Ribe izložene konstantnoj temperaturi od 20°C (plava linija) sakupljene su (otvoreni plavi dijamanti) na 24, 48,72, 96, 168 i 336 h. Ribe izložene konstantnoj temperaturi od 37°C (ružičasta linija) sakupljene su (otvoreni ružičasti kvadrati) kao riba na 20°C, osim za vremensku točku od 336 h. Vrijeme 0 za temperaturni ciklus je 12:30 h pri temperaturi od 26°C. Zabilježite slomljenu os u B. Dok je uzorkovano pet temperaturnih ciklusa tijekom 2-tjedne aklimatizacije, temperatura se neprestano mijenjala.

Priprema cDNA biblioteka

Jetre su secirane iz smrznute ribe i ukupna RNA ekstrahirana pomoću Trizola prema uputama proizvođača (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ukupna RNA iz jetre četiri ribe skupljena je za svaku vremensku točku. Ovi skupljeni uzorci ukupne RNA korišteni su za pripremu cDNA za proizvodnju mikroniza i za profiliranje promjena u ekspresiji gena tijekom temperaturne aklimatizacije.

Biblioteka cDNA pripremljena je od ukupne RNA prikupljene iz svih riba uzorkovanih tijekom aklimatizacije. SMART cDNA tehnologija (BD Biosciences, San Jose, CA,USA) korištena je za pripremu cDNA prije kloniranja u plazmidni vektor pλTriplEx2 usmjerenog kloniranja (ClonTech). Ukratko, ukupna RNA korištena je kao predložak za stvaranje cDNA kopije svake mRNA korištenjem reverzne transkriptaze (Powerscript, ClonTech). Jednolančana cDNA je zatim amplificirana preko lančana reakcija polimeraze na velike udaljenosti (LD-PCR Cheng i sur., 1994.). Pojačana cDNA je zatim vezana u vektor za kloniranje. Kompetentan E coli (DH10B stanice, Invitrogen) su zatim transformirane s povezanim plazmidima preko elektroporacija. Transformirane stanice su zatim odabrane prema prisutnosti cDNA inserta i otpornosti na ampicilin (100 μg l –1 ) preko plavo/bijelo ispitivanje na LB/agar pločama (Sambrook et al., 1989). Ukupno 4992 cDNA klona izolirano je u mikrotitarske ploče s 384 jažice i uzgajano preko noći u LB mediju (Sambrook et al., 1989.) s dodatkom 10% glicerola. Ove ploče su replicirane i pohranjene na –80°C.

Izgradnja cDNA mikromreža

Umetci cDNA iz svakog izoliranog klona u biblioteci cDNA amplificirani su korištenjem lančane reakcije polimeraze (PCR). Pripremljena je glavna smjesa za PCR koja je sadržavala 1× Taq. Polimerazni pufer (Promega, Madison, WI, SAD), 0,2 mmol l –1 dNTPs i 0,2 μmol l –1 plazmid-specifični primeri. Pojedinačni volumen reakcije bio je 25 μl. PCR glavna mješavina je inokulirana s malom količinom jedne bakterijske bujonske kulture s ploče s 384 jažice pomoću replikatora ploče s 96 jažica (Nalgene/Nunc, Rochester, NY, USA). Reakcije su zatim grijane na 95°C tijekom 2 minute kako bi se lizirale bakterije i oslobodila plazmidna DNA kao šablon za reakciju. Reakcije su zatim izložene 40 ciklusa amplifikacije s korakom denaturacije od 95°C tijekom 0,25 min, korakom žarenja od 56°C tijekom 0,5 min i korakom proširenja od 72°C tijekom 2,5 min. Jedan red reakcija iz svake ploče s 96 jažica nasumično je provjeren preko elektroforeza agaroze kako bi se osigurala pravilna amplifikacija DNA.

Mala količina (7 μl) PCR-amplificirane DNA zatim je prebačena na PCR ploču s 384 jažice koja odgovara izvornom mjestu klona korištenom za zasijavanje reakcije. Koncentracija soli u PCR reakcijama dovedena je na koncentraciju od 3× SSC (1× SSC sadrži 150 mmol l –1 NaCl, 15 mmol l –1 natrijevog citrata, pH 7,0) dodavanjem 20× SSC izravno u PCR produkte. Mikronizovi su otisnuti na staklene pločice obložene poli-l-lizinom prema standardnim protokolima (www.microarray.orgspecifični protokoli su također dostupni na killifish.pdx.edu/protocols.htm). Stakalca za mikroskop obložena poli-l-lizinom proizvedena su pomoću mikroskopskih stakalca Fisher Scientific (Hampton, NH, SAD) Gold Seal i otopine poli-l-lizina marke Sigma Chemical (vidi gornje web stranice). Stakalca su zatim pohranjena u eksikatoru 3 tjedna kako bi se poli-l-lizinski omotač pravilno odležio. Mikronizovi su ispisani korištenjem domaćeg robota koji ima konfiguraciju od 16 iglica (pinovi TeleChem Chip Maker II, Telechem ArrayIt, Sunnyvale, CA, SAD) i ispisom uzorka mrlje 18×18 s razmakom od 240 μm između točaka za svaku iglu. Ova konfiguracija pinova i koncentracije soli u uzorcima DNK rezultirala je tipičnom veličinom mrlje oko 140-150 μm. Mikromaterijali su naknadno obrađeni prema standardnim procedurama (vidi gornje web stranice).

Profiliranje promjena u ekspresiji gena pomoću cDNA mikronize

Fluorescentno obilježene cDNA sonde pripremljene su iz poli(A) + -obogaćenih RNA uzoraka. poli(A) + RNA uzorci pripremljeni su iz uzoraka ukupne RNA korištenjem oligo-dT celuloznog stupca. Svi uzorci poli(A) + RNA skup su jednakih količina RNA od 4 osobe prikupljene u svakoj vremenskoj točki. 1 μg poli(A) + RNA upotrijebljen je kao predložak za izradu jedne kopije cDNA skupa mRNA pomoću reverzne transkriptaze (RT) i usidrenog oligo-dT15i pdN6 nasumične heksamerne prajmere u prisutnosti amino-alil dUTP (vidi gornje web stranice). RNA šablon je uklonjen iz dovršenih RT reakcija inkubacijom na 65°C tijekom 30 minuta u 0,2 mol l –1 NaOH i 0,1 mol l –1 EDTA. Jednolančana cDNA je zatim kovalentno povezana preko amino-alil UTP na Cy3 ili Cy5 monoreaktivnu boju prema uputama proizvođača (Amersham, Piscataway, NJ, SAD). Obilježene cDNA sonde su zatim očišćene korištenjem PCR kolona za pročišćavanje prema uputama proizvođača (Qiagen, Valencia, CA, USA) osim što je pufer PE zamijenjen s 80% etanolom. Sonde su pripremljene za hibridizaciju prema standardnim postupcima (vidi gornje web stranice). Ukratko, očišćene sonde dovedene su do konačnog volumena od 30 μl u otopini koja sadrži 25 mmol l –1 Hepes pufer pH 7,0, 0,75 mg ml –1 tRNA (Sigma), 3× SSC i 0,2% SDS. Sonde su kuhane 2 minute i ostavljene da se ohlade na sobnoj temperaturi tijekom 5 minuta prije početka hibridizacije. Sonde su dodane u mikroniz postavljanjem LifterSlip (15 mm×15 mm) pokrovnog stakla preko niza i korištenjem kapilarnog djelovanja da se otopina uvuče ispod pokrovnog stakla. Hibridizacije su izvedene na 65°C preko noći u hibridizacijskim komorama Genomic Solutions (Ann Arbor, MI, USA). Svaka hibridizacija izvedena je jednom za svaku usporedbu. U skupu podataka predstavljeno je ukupno 55 hibridizacija. Dva dnevna ciklusa, razdvojena s 2 tjedna, uzorkovana su za kontrolne uvjete (26°C). Uzorkovano je pet temperaturnih ciklusa za aklimatizaciju ciklične temperature, što je rezultiralo vrlo dosljednim obrascem ekspresije gena tijekom više temperaturnih ciklusa.

Nakon hibridizacije, nizovi su kratko i nježno isprani kako bi se uklonila sva nevezana boja, a zatim su brzo sušeni centrifugiranjem (www.microarray.org). Ukratko, stakalca su stavljena ravno u otopinu 0,6× SSC i 0,03% natrijevog dodecilsulfata (SDS), a pokrovno stakalce je nježno isprano sa stakalca. Stakalca su zatim prebačena na stalak za stakalce i nježno umočena 10 puta u svježu posudu od 500 ml iste otopine za pranje. Stakalca su zatim prenesena pojedinačno i nježno umočena 10 puta u drugi 500 ml otopine za ispiranje koja je sadržavala 0,06× SSC. Nakon ovog ispiranja, stakalca su umočena 5 puta u 500 ml deionizirane vode i zatim suha u centrifugi pri maloj brzini. Isprani predmeti skenirani su pomoću Axon GenePix 4000B skenera mikromreža (Axon Instruments, Union City, Kalifornija, SAD). Podaci su izvađeni iz skeniranih slika pomoću softvera GenePix 4.0 (Axon Instruments). Podaci su zatim uneseni u Stanford Microarray Database (SMD). Filtriranje i sortiranje podataka obavljeno je unutar SMD baze podataka. Nakon ulaska u bazu podataka, svi podaci su normalizirani kako bi se uravnotežile ukupne razine Cy5 i Cy3 na omjer 1:1 korištenjem jednostavnog faktora korekcije primijenjenog na podatke Cy5. Za svaku točku na svakom nizu, podaci su odabrani za analizu samo ako su imali Cy5/Cy3 koeficijent regresije fluorescencije >gt0,6 i imali intenzitet signala 2,5 puta veći od pozadine. Ova mjesta se nazivaju `fair'data. Ova metoda normalizacije i definicije `poštenih' podataka bile su zadane postavke u SMD-u.

Analiza i prezentacija podataka

Razine ekspresije gena određene su u svakoj vremenskoj točki uspoređivanjem količine transkripta mRNA prisutnog u eksperimentalnom uzorku (sakupljene od četiri ribe u svakoj vremenskoj točki) u usporedbi s referentnim uzorkom (sakupljenim od preko 400 riba korištenih u eksperimentu). Korištenje referentnog uzorka omogućilo je usporedbu relativne količine svakog transkripta u svakoj vremenskoj točki sa zajedničkim uzorkom. Referentni uzorci su rutinski obilježeni Cy3, dok su eksperimentalni uzorci obilježeni Cy5. Međutim, eksperimenti s preokretom boje provedeni su za prva dva dnevna temperaturna ciklusa (12 uzoraka) kako bi se istražila moguća pristranost Cy Dye u našim podacima i procijeniti varijacije u podacima (slika 2). Ovi eksperimenti preokretanja boje ukazuju na vrlo visoku korelaciju između duplih hibridizacija (r=0,96), za klonove cDNA koji doživljavaju promjene u ekspresiji gena veće od dva puta u usporedbi s referentnim uzorcima (slika 2).

Ponovne hibridizacije i pokusi recipročnog označavanja bojom. (A) Dvostruke hibridizacije izvedene su za svaku vremensku točku u prva dva temperaturna ciklusa. Podaci o ekspresiji filtrirani su prihvaćanjem samo mjesta koja su se dvostruko promijenila u najmanje 1 vremenskoj točki. Ovi podaci se ne ispravljaju u odnosu na t=0, ali su srednje središte. Cy3 je korišten za označavanje referentnog uzorka, dok je Cy5 korišten za označavanje eksperimentalnog uzorka u naprijed (F) hibridizacijama. Boje su obrnute (R) u drugom nizu hibridizacija. Vizualni pregled otkriva jak odnos između dva skupa hibridizacija, posebno za mjesta koja se mijenjaju više od dva puta u usporedbi s referentnom. (B) Postoji jaka korelacija između podataka za prednju i obrnutu hibridizaciju (r=0,96) za točke u nizu koje se mijenjaju više od dva puta (N=831). Jednadžba za liniju regresije na grafu je y=1.061x+0,04056. Ovi podaci pokazuju da u ovom skupu podataka nema značajne pristranosti boje. Nadalje, podupire zaključak da promjene u ekspresiji gena uočene u ovoj studiji vjerojatno neće biti posljedica varijacija u hibridizacijama, već su biološki relevantne.

Ponovne hibridizacije i pokusi recipročnog označavanja bojom. (A) Dvostruke hibridizacije izvedene su za svaku vremensku točku u prva dva temperaturna ciklusa. Podaci o ekspresiji filtrirani su prihvaćanjem samo mjesta koja su se dvostruko promijenila u najmanje 1 vremenskoj točki. Ovi podaci se ne ispravljaju u odnosu na t=0, ali su srednje središte. Cy3 je korišten za označavanje referentnog uzorka, dok je Cy5 korišten za označavanje eksperimentalnog uzorka u naprijed (F) hibridizacijama. Boje su obrnute (R) u drugom nizu hibridizacija. Vizualni pregled otkriva jak odnos između dva skupa hibridizacija, posebno za mjesta koja se mijenjaju više od dva puta u usporedbi s referentnom. (B) Postoji jaka korelacija između podataka za prednju i obrnutu hibridizaciju (r=0,96) za točke u nizu koje se mijenjaju više od dva puta (N=831). Jednadžba za liniju regresije na grafu je y=1.061x+0,04056. Ovi podaci pokazuju da u ovom skupu podataka nema značajne pristranosti boje. Nadalje, podupire zaključak da promjene u ekspresiji gena uočene u ovoj studiji vjerojatno neće biti posljedica varijacija u hibridizacijama, već su biološki relevantne.

Iako je korištenje referentnog uzorka pružilo zajedničku osnovu za usporedbu za svaki eksperimentalni uzorak, podaci izraženi u ovom formatu nisu nužno biološki relevantni jer se svaka usporedba odnosi na eksperimentalni uzorak u usporedbi sa srednjom razinom svakog transkripta koja je izražena tijekom cijelog eksperiment. Interpretacija ovih podataka je teška i stoga smo odlučili dodatno prilagoditi podatke biološki relevantnom standardu. Postoji nekoliko načina za prilagodbu podataka u tu svrhu, od kojih svaki ima svoje prednosti i slabosti.

Uobičajena tehnika je prilagođavanje podataka o ekspresiji gena tako da srednja razina ekspresije bude jednaka 0 na zapisniku2 mjerilo za svaku točku u nizu za sve tretmane (tj.omjer 1:1) ova metoda se naziva 'srednjim centriranjem' (Eisen i sur., 1998.). Ova metoda je logična za usporedbu različitih tipova stanica ili stanica u različitim uvjetima stabilnog stanja, ali po našem mišljenju nije bila prikladna za prikaz podataka o vremenskom tijeku zbog temeljne pretpostavke da bi srednja razina ekspresije danog gena trebala biti 0 na dnevnik2 mjerilo. Na primjer, ako je gen snažno induciran u svim uzorkovanim vremenskim točkama, ova snažna indukcija bi bila predstavljena kao srednja razina ekspresije gena i vjerojatno bi uzrokovala da se pravi obrazac ekspresije uvelike oslabi nakon srednjeg centriranja. Promatrali smo ovu vrstu uzorka za mnoge molekularne pratioce u ovoj studiji.

Druga mogućnost, i možda najlogičnija za podatke o vremenskom tijeku, je prilagoditi sve omjere izraza tako da budu relativni t=0. Ova metoda pretpostavlja da početna vremenska točka predstavlja neko stabilno fiziološko stanje u organizmu koje se mora prilagoditi kao odgovor na eksperimentalno liječenje. Međutim, podaci o ekspresiji gena prikazani na ovaj način ovise o visokokvalitetnim podacima za t=0 vremenska točka. Osim toga, ako nedostaju podaci za t=0 vremenska točka tada je nemoguće prilagoditi ostale vremenske točke. Ti se problemi uvelike mogu izbjeći repliciranjem t=0 hibridizacija i korištenje prosjeka tih replika za prilagodbu ostatka skupa podataka. U našem slučaju koristili smo prosjek dvije hibridizacije iz kontrole (26°C, t=0 i t=336 h) za podešavanje skupa podataka u odnosu na početno stanje. Dodatni problem s ovom metodom je taj što učinci temperature nisu odvojeni od učinaka normalnih dnevnih ritmova u podacima o ekspresiji gena za temperaturni ciklus. U mnogim slučajevima prirodni ritmovi u ekspresiji gena pod konstantnim 26°C bili su jaki i prikrivali su učinke temperature na ekspresiju gena.

Kako bismo kontrolirali dnevne promjene u ekspresiji gena koje nisu bile povezane s temperaturnim ciklusom, normalizirali smo podatke o ciklusu temperature da budu relativni u odnosu na kontrolne dnevne obrasce ekspresije gena (prosječno dva dnevna ciklusa na 26°C). Ova operacija zapravo "oduzima" dnevne ritmove u ekspresiji gena koji nisu uzrokovani temperaturom od podataka o cikličnosti temperature. Ova je operacija izvedena množenjem omjera Cy5:Cy3 za svaku eksperimentalnu vremensku točku u cikličnom temperaturnom tretmanu s omjerom Cy5:Cy3 za odgovarajuću kontrolnu vremensku točku (npr. t=4 h pomnoženo s kontrolom t=4 h). Ovu permutaciju podataka nazvali smo "učinak temperature". Podaci prikazani na ovaj način ilustriraju neto učinak temperature na prirodne obrasce ekspresije gena. Međutim, ovi podaci mogu biti pogrešni ako nisu pravilno prikazani. Na primjer, ako postoji jak cirkadijalni ritam u ekspresiji gena na koji temperatura ne utječe, to će rezultirati ravnom dnevnom ekspresijom kada se prikaže na ovaj način, iako se gen može mijenjati nekoliko puta svaki dan. Stoga smo u ovom radu odlučili prikazati podatke u dva formata, u odnosu na t=0 i nakon oduzimanja dnevnih ritmova, jer svaka metoda prezentacije podataka ima snagu i ilustrira različite komponente skupa podataka.

Analiza unakrsne korelacije (Chatfield, 1989.) korištena je za određivanje jesu li obrasci ekspresije gena značajno povezani s temperaturnim ciklusom. Pomoću ove metode moguće je identificirati fazni pomak u podacima koji daje najveći koeficijent korelacije, a time i najznačajniji odnos između obrazaca ekspresije gena i temperaturnih obrazaca. Koeficijenti korelacije identificirani su kao statistički značajni na razini od 0,05.

Podaci o omjeru ekspresije gena grupirani su prema sličnosti u obrascu ekspresije korištenjem Cluster softvera (Eisen i sur., 1998.). Za organiziranje podataka korišteno je Pearsonovo necentrirano, potpuno hijerarhijsko grupiranje veza. Vizualizacija grupiranih podataka postignuta je korištenjem softvera TreeView (Eisen i sur., 1998.).

DNK sekvenciranje

Mjesta mikromreža sa zanimljivim obrascima ekspresije identificirana su sekvenciranjem cDNA inserta izoliranog iz plazmidne DNA iz klona od interesa. Sekvenciranje je izvršeno korištenjem ABI 373 sekvencera s reakcijskom smjesom terminatora boje. Za reakcije sekvenciranja korišteni su prajmeri specifični za plazmid. Sve cDNA od interesa sekvencionirane su od 5′ kraja kako bi se maksimizirala mogućnost identifikacije transkripta. Sekvence su identificirane homologijom s poznatim sekvencama korištenjem NCBI Blastx pretraživanja baze podataka GenBank. Najznačajniji ili relevantni rezultati ovih Blast pretraga, kao i GenBank pristupni brojevi za sekvencirane cDNA klonove predstavljene u ovom radu dostupni su u dodatnoj tablici 1.


Uvod

Parazitoidni napad je glavni uzrok smrtnosti mnogih vrsta insekata (Godfray i Shimada 1999 Asgari i Rivers 2011), vršeći snažnu selekciju na osobine koje utječu na vjerojatnost ili ishod napada. Mehanizmi obrane od endoparazitoida koji dovršavaju svoj razvoj unutar domaćina često uključuju imunološki sustav domaćina, koji brzo evoluira kao odgovor na promjenjivu virulentnost endoparazitoida i pokazuje velike varijacije među vrstama (Carton et al. 2008). Na primjer, Drosophila vrste pokazuju velike varijacije u imunokompetentnosti protiv parazitoida Asobara tabida, gdje je većina vrsta u Drosophila obscura skupina pokazuje imunološki nedostatak i nema inkapsulacije jaja, dok druge svojte pokazuju vrlo jake imunološke odgovore (Eslin i Doury 2006 Havard i sur. 2009 Singh i sur. 2009 Salazar-Jaramillo i sur. 2014). Slični obrasci nedavno su dokumentirani u rodu lisnjaka Galerucella, gdje se tri blisko srodne vrste koje dijele zajedničkog neprijatelja parazitoidne ose razlikuju u pogledu stope parazitiranja, uspješnosti inkapsulacije i proizvodnje hemocita (Fors i sur. 2014., 2016.).

Stanična osnova koja leži u osnovi varijacija u imunokompetentnosti protiv endoparazitoida kod nemodelnih insekata kao što su Galerucella uvelike je sličan Drosophila (Fors i sur. 2014.). Općenito, imunološki odgovor nakon napada parazitoida počinje prepoznavanjem parazitoidnog jajašca. Imunološki signali potom induciraju brzo povećanje i diferencijaciju hemocita koji se pričvršćuju na površinu jajeta, što dovodi do stvaranja kapsule oko jajašca s više slojeva hemocita (Carton i sur. 2008.). U Drosophila, ovaj proces inkapsulacije uključuje tri glavna tipa hemocita: plazmatocite, lamelocite i kristalne stanice. Plazmatociti su uglavnom odgovorni za fagocitozu i čine većinu cirkulirajućih hemocita (>95%). Potonji se također sastoji od malog udjela kristalnih stanica (

U Galerucella, otkriveno je šest vrsta hemocita na temelju njihove morfologije, a tri (lamelociti, fagociti i granulociti) posebno su uključena u proces inkapsulacije (Fors i sur. 2014.). Lamelociti, koji imaju istu funkciju kao u Drosophila melanogaster, neophodni su za dovršetak formiranja kapsule. Fagociti, iako nisu glavni čimbenik, također doprinose procesu inkapsulacije u Galerucella (Carton i sur. 2008. Fors i sur. 2014.). Konačno, granulociti u Galerucella dijele svoj način izlučivanja s kristalnim stanicama u Drosophila (Fors i sur. 2014), koji sudjeluju u melanizaciji rana i kapsula.

Iako su hemociti koji su u osnovi imunološkog odgovora insekata uglavnom karakterizirani, njihova je regulacija samo djelomično shvaćena i prvenstveno karakterizirana u Drosophila. Geni uključeni u imunološke odgovore mogu se klasificirati u sedam funkcionalnih kategorija, kao što su predložili Salazar-Jaramillo i sur. (2014). Prva klasa gena uključuje gene za prepoznavanje, na primjer, proteine ​​za prepoznavanje peptidoglikana (PGRP) i gram-negativne bakterije koje vežu proteine ​​koji su uključeni u prepoznavanje stranih objekata, kao što su parazitoidna jaja. Druga klasa gena uključuje signalne gene za putove transdukcije (Toll, JAK-STAT, JNK i IMD) koji iniciraju proliferaciju hemocita potrebnih za kapsuliranje stranog objekta. Treća klasa uključuje efektorske gene koji kodiraju antimikrobne peptide koji ciljaju bakterijske ili gljivične membrane, što dovodi do oštećenja membrane i smrti stanice (Bulet et al. 1999.). Četvrta klasa gena uključuje moduliranje gena koji kodiraju serpine i serinske proteaze s uglavnom nepoznatom imunološkom funkcijom (npr. Spn88Eb). Peta klasa uključuje gene hematopoeze koji su specifično uključeni u imunitet povezan s parazitima (diferencijacija hemocita, proliferacija i regulacija procesa hematopoeze, npr. gcm, wg, i yantar). Šesta kategorija uključuje gene koji kodiraju za profenoloksidaze i njihove regulatore (npr. PPO3, žuta boja), koji proizvode citotoksične kao i međuprodukte za umrežavanje i konačno melanin potreban za dovršavanje kapsule oko parazitoidnog jajašca. Posljednja klasa gena uglavnom su oni koji kodiraju hitinaze odgovorne za cijeljenje rana nakon parazitoidne ovipozicije. Razjašnjenje ovih gena i puteva značajno je olakšalo naše razumijevanje evolucijske dinamike koja djeluje na gene uključene u antiparazitoidni imunitet, ali njihova pojava i važnost izvan Drosophila vrstama se posvećuje malo pažnje.

Snažan pristup za razumijevanje razlika u imunološkim odgovorima je usporedba uzoraka ekspresije gena između blisko povezanih vrsta koje se razlikuju po svojoj imunokompetentnosti. Ovdje smo ispitali razlike u ekspresiji gena nakon napada parazitoida u blisko srodnih kornjaša Galerucella pusilla i G. calmariensis (Coleoptera: Chrysomelidae). Dijele istu biljku domaćina, Lythrum salicaria (Lythraceae) i napadnuti su od strane istog parazitoida ličinke koinobionta, Asecodes parviclava (Hymenoptera: Eulophidae) (Fors i sur. 2014.). Ove su vrste odabrane za istraživanje jer pokazuju velike razlike u svojoj sposobnosti da inkapsuliraju parazitoidna jajašca, unatoč tome što su se tek nedavno odvojile od zajedničkog pretka (Hambäck i sur. 2013. Fors i sur. 2014.). Stopa parazitiranja na dvije vrste domaćina varira između lokaliteta, ali općenito, G. pusilla doživljava nižu stopu parazitiranja nego G. calmariensis ako se pojavljuju zajedno (Fors i sur. 2014). Događaji inkapsulacije i melanizacije vrlo su česti u G. pusilla ličinke zaražene osama, dok u G. calmariensis, formiranje kapsula i melanizacija jaja osa rijetko se opaža. Ako se inkapsulacija uspješno odvija nakon parazitiranja, formiranje kapsule obično počinje unutar 4-6 h i završava se nakon ~48 h (Fors i sur. 2014.). Tijekom procesa inkapsulacije, kapsula je često melanizirana i melanizirana parazitoidna jaja mogu se jasno uočiti nakon probave nakon 48 h. Zacjeljivanje rana obično se brzo događa na mjestima rane unutar prvih nekoliko sati nakon parazitiranja, pri čemu melanizacija također igra ulogu u pocrnjenju rane. Općenito, G. pusilla ispoljava snažniji imunološki odgovor protiv A. parviclava od G. calmariensis, s istraživanjima na staničnoj razini koja su dokumentirala da su dvije klase hemocita uključene u inkapsulaciju, fagociti i lamelociti, povećale svoju proizvodnju nakon infekcije u G. pusilla (Fors i sur. 2014.). Kako bismo prešli dalje od studije na razini staničnog fenotipa, ovdje smo ispitali razlike u ekspresiji gena između ove dvije vrste, koristeći dizajn uzorkovanja tijekom vremena nakon napada parazita. Osim analize na razini cijelog transkriptoma, također smo se usredotočili na označene imunološke gene temeljene na prethodnim saznanjima iz D. melanogaster i druge vrste člankonožaca (Wertheim et al. 2005 Tribolium Genome Sequencing Consortium 2008). Na temelju prethodnog rada, očekivali smo da će više imunoloških gena, posebno gena za hematopoezu, biti različito izraženo nakon napada parazitoida kod vrsta s jakim imunološkim odgovorom, G. pusilla.


3.8.3 Korištenje projekata genoma (samo A-razina)

Mogućnosti za razvoj vještina

Projekti sekvenciranja pročitali su genome širokog spektra organizama, uključujući ljude.

Određivanje genoma jednostavnijih organizama omogućuje određivanje sekvenci proteina koji potječu iz genetskog koda (proteoma) organizma. To može imati mnoge primjene, uključujući identifikaciju potencijalnih antigena za upotrebu u proizvodnji cjepiva.

U složenijim organizmima, prisutnost nekodirajuće DNK i regulatornih gena znači da se znanje o genomu ne može lako prevesti u proteom.

Metode sekvenciranja se kontinuirano ažuriraju i postale su automatizirane.


RASPRAVA

Sugerirano je da AICD ima važnu biološku ulogu u razvoju AD patologije kroz svoju sposobnost da djeluje kao produkt cijepanja s potencijalom transaktivacije (Cao i Sudhof, 2001.). Do sada je opisano nekoliko gena kandidata ovisnih o AICD-u, a nedostajao je pristup probiru koji obuhvaća cijeli genom. U ovoj studiji uspostavili smo model stanične kulture inducibilnog neuroblastoma s AICD, FE65 ili AICD i FE65 pod kontrolom promotora koji reagira na tetraciklin. Analiza transkripcijskih promjena nakon ekspresije AICD-a i/ili njegovog kofaktora FE65 korištenjem Affymetrix U133A GeneChips-a otkrila je popis od 182 navodna ciljna gena AICD-a (vidi Dodatnu tablicu).

Kvantitativni PCR odabranih gena u stvarnom vremenu pokazao je da su neki geni ovisni samo o indukciji AICD-a, drugi su pokazali povišenu ekspresiju kada je FE65 bio koeksprimiran, dok je treća podskupina bila samo različito regulirana nakon ekspresije i AICD-a i FE65.

Signalizacija neovisna o Fe65 može se objasniti izravnim vezanjem AICD-a na TIP60 (Kinoshita et al., 2002.). Međutim, većina ciljnih gena opisanih u ovom radu pokazala je potrebu za koekspresijom FE65, sugerirajući važnu ulogu ovog veznog proteina u ekspresiji gena ovisne o AICD-u, opažanje koje su također izvijestile druge studije (Cao i Sudhof, 2001. von Rotz et al., 2004.). Doista, postoje dokazi da je vezanje FE65 na AICD neophodno za nuklearnu translokaciju (Kimberly et al., 2001 Murešan i Murešan, 2004 von Rotz et al., 2004.). Predložena su dva različita AICD transkripcijski aktivna kompleksa temeljena na vezanju AICD-FE65 na TIP60 i CP2/LSF/LBP1 (Cao i Sudhof, 2001. Kim et al., 2003.). TIP60 je dio velikog nuklearnog kompleksa s DNA vezanjem, aktivnošću ATPaze i DNA helikaze (Ikura et al., 2000.). U eksperimentima Gal4 reporter gena, ternarni kompleks AICD-FE65-TIP60 je moćan transaktivator, ovisan o razini ekspresije FE65 (Cao i Sudhof, 2001.). Predložen je alternativni mehanizam temeljen na strukturnim modifikacijama FE65 od strane AICD-a koji ne zahtijeva translokaciju AICD-a iz citoplazme u jezgru (Cao i Sudhof, 2004.). Ova hipoteza nije u suprotnosti s našim nalazima, jer bi povišene citosolne razine AICD-a mogle biti dovoljne da izazovu promjenu konformacije FE65. Predloženo je da ovaj drugi ternarni kompleks (AICD-FE65-CP2/LSF/LBP1) modulira ekspresiju kinaze glikogen sintaze-3β (Kim et al., 2003.). Stoga različiti AICD transkripcijski kompleksi mogu objasniti različite obrasce regulacije.

Dugotrajna indukcija ektopično eksprimiranih gena može rezultirati sekundarnim regulacijskim učincima jer bi sami primarno inducirani geni mogli djelovati kao aktivator za druge gene. Stoga smo za naše studije koristili indukciju od 72 sata (dox washout) koja odgovara najranijoj vremenskoj točki mjerljive indukcije AICD-a i/ili FE65. U tim uvjetima nismo uočili diferencijalnu regulaciju prethodno opisanih ciljnih gena AICD-a kao što je KAI1 (Tablica 2). Nismo mogli otkriti regulaciju drugih navodnih ciljnih gena, uključujući SERCA2B (Leissring et al., 2002) ili GSK3β (Kim et al., 2003.). Međutim, naši podaci su u skladu s drugim skupinama koje nisu mogle otkriti regulaciju ovih gena ovisnu o AICD-u u AICD/FE65 transgenih miševa (Ryan i Pimplikar, 2005.) ili u staničnim linijama s farmakološkom inhibicijom ili nedostatkom aktivnosti γ-sekretaze (Hebert et al., 2006.). Nadalje, vjerojatno je da se diferencijalna ekspresija gena AICD ciljeva događa na način specifičan za tip stanice i ovisi o razinama ekspresije endogenih kofaktora. Naš rad je prva studija koja analizira ekspresiju gena ovisnu o AICD-u u stabilnim transficiranim SHEP-SF stanicama neuroblastoma. Važno je da su primarni kortikalni neuroni prolazno transficirani s AICD50/FE65 također pokazali povećanu ekspresiju TAGLN, TPM1 podržavajući hipotezu o ulozi AICD-a u regulaciji razine ekspresije ovih gena. Štoviše, s obzirom na nove dokaze o ulozi AICD signalizacije u patofiziologiji AD, uspjeli smo potvrditi diferencijalnu ekspresiju nekoliko ciljnih gena AICD opisanih u ovom radu u frontalnom korteksu Alzheimerove bolesti u odnosu na kontrolni mozak. α2-Actin, IGFBP3 i TAGLN bili su značajno više eksprimirani u AD mozgu u usporedbi s njihovom dobnom kontrolom. Zanimljivo je da je ranije opisano da je IGFBP3 povezan s neurofibrilarnim zapetljanjima u AD mozgu (Rensink et al., 2002.). Nadalje, druge skupine su također prijavile različitu ekspresiju PRKC (Par-4) (El Guendy i Rangnekar, 2003.) i TPM1 (Galloway et al., 1990.) u uzorcima mozga s AD u usporedbi s mozgom pacijenata koji nisu zahvaćeni. Štoviše, neuritski plakovi pozitivni na neuregulin (Chaudhury et al., 2003.) i fibronektin 1 (Van Gool et al., 1994) pokazala je imunohistokemija.S obzirom na to da je nekoliko naših ciljnih gena AICD-a prethodno pokazalo različite razine ekspresije tijekom progresije AD, zanimljivo je pretpostaviti da povećana ekspresija AICD-a i njegovih ciljeva može igrati važnu ulogu u AD. Nasuprot tome, nismo mogli potvrditi diferencijalnu regulaciju za KAI1 i druge razmatrane ciljne gene u AD mozgu u odnosu na kontrole.

Među reguliranim genima ovisnim o AICD-u identificirali smo nekoliko kandidata koji su prethodno opisani kao regulatori dinamike aktina, uključujući α2-aktin, transgelin i tropomiozin 1. Transgelin, protein umreženog aktina, uključen je u organizaciju aktinski citoskelet i smatra se da povezuje starenje sa stabilnošću aktina (Goodman et al., 2003. Nakano et al., 2005.). Drugi geni kao što su fibronektin1 i RAB3B također su opisani kao povezani s organizacijom citoskeleta. Vizualizacija struktura F-aktina u stanicama neuroblastoma, kao i u kortikalnim neuronima nakon ekspresije AICD i FE65, otkrila je dezorganizaciju aktinskih vlakana unutar staničnog tijela i nakupljanje aktinskih vlakana na periferiji, što ukazuje na povećanu dinamiku aktina. S obzirom da je ovaj fenotip bio odsutan u stanicama koje eksprimiraju FE65 bez AICD-a, naši rezultati sugeriraju da se ova signalizacija događa neovisno o obitelji Ena/Vasp proteina, koji su u interakciji s WW domenama proteina FE65 (Ermekova et al., 1997.). Nasuprot tome, naši podaci sugeriraju da je transaktivacija ovisna o AICD-u odgovorna za reorganizaciju aktinskih filamenata, te stoga može igrati važnu ulogu tijekom razvoja i reorganizacije staničnih struktura kao odgovora na ozljedu. Štoviše, sam APP je transkripcijski reguliran kao odgovor na transekcije živaca, traumu i cerebralnu ishemiju u živčanom sustavu (Banati et al., 1993. Ši et al., 2000. Ciallella et al., 2002), svi procesi koji rezultiraju reorganizacijom citoskeleta. U DrosophilaAPP ekspresija je povezana s povećanjem postrazvojne aksonalne arborizacije i gubitkom neuronskih veza, što je bilo strogo povezano s unutarstaničnom domenom APP (Leyssen et al., 2005.). Štoviše, transgeni miševi Tg2576 stari već od 4 mjeseca pozitivni su na štapićaste inkluzije u stražnjem korteksu koje se sastoje od aktina (Maloney et al., 2005.). Model u kojem su APP i FE65 uključeni u složenu regulaciju pokretljivosti konusa rasta temeljene na aktinu također je podržan od strane drugih podataka (Sabo et al., 2003.). Zanimljivo je da je blokada aksonalnog transporta, koja bi mogla biti posljedica neorganiziranog citoskeleta, najraniji izmjereni poremećaj u mozgu transgenih miševa koji eksprimiraju mutantni ljudski APP (Stokin et al., 2005.). Nadalje, nedavne studije pokazuju da meningealni fibroblasti iz FE65 −/− plus F65L1 −/− miševa otkrivaju poremećeni obrazac F-aktina u usporedbi s miševima divljeg tipa (Guenette et al., 2006.). Zajedno, naša studija sugerira važnu ulogu AICD-a u regulaciji dinamike stanične aktina.


16.6 Eukariotska translacijska i posttranslacijska regulacija gena

Do kraja ovog odjeljka moći ćete učiniti sljedeće:

  • Shvatite proces prevođenja i razgovarajte o njegovim ključnim čimbenicima
  • Opišite kako inicijacijski kompleks kontrolira prijevod
  • Objasnite različite načine na koje se odvija posttranslacijska kontrola ekspresije gena

Nakon što se RNA transportira u citoplazmu, ona se prevodi u protein. Kontrola ovog procesa uvelike ovisi o molekuli RNA. Kao što je već spomenuto, stabilnost RNK će imati veliki utjecaj na njezino prevođenje u protein. Kako se stabilnost mijenja, mijenja se i količina vremena koje je dostupno za prijevod.

Kompleks inicijacije i stopa prijevoda

Poput transkripcije, translaciju kontroliraju proteini koji vežu i pokreću proces. U prijevodu, kompleks koji se sastavlja da započne proces naziva se kompleksom inicijacije prijevoda. Kod eukariota, translacija je pokrenuta vezanjem inicijskog met-tRNAi na 40S ribosom. Ovu tRNA dovodi do 40S ribosoma proteinski inicijacijski faktor, eukariotski inicijacijski faktor-2 (eIF-2). Protein eIF-2 veže se na visokoenergetsku molekulu gvanozin trifosfat (GTP). Kompleks tRNA-eIF2-GTP se zatim veže na 40S ribosom. Drugi kompleks nastaje na mRNA. Nekoliko različitih inicijacijskih čimbenika prepoznaje 5' kapu mRNA i proteine ​​vezane za poli-A rep iste mRNA, tvoreći mRNA u petlju. Protein eIF4F koji veže kapu povezuje kompleks mRNA zajedno s kompleksom ribosoma 40S. Ribosom zatim skenira duž mRNA dok ne pronađe početni kodon AUG. Kada su antikodon inicijatorske tRNA i startni kodon usklađeni, GTP se hidrolizira, inicijacijski faktori se oslobađaju, a velika 60S ribosomska podjedinica se veže kako bi formirala translacijski kompleks. Vezanje eIF-2 na RNA kontrolira se fosforilacijom. Ako je eIF-2 fosforiliran, on prolazi kroz konformacijske promjene i ne može se vezati za GTP. Stoga se inicijacijski kompleks ne može pravilno formirati i translacija je otežana (slika 16.13). Kada eIF-2 ostane nefosforiliran, inicijacijski kompleks se može normalno formirati i translacija se može nastaviti.

Vizualna veza

Povećanje razine fosforilacije eIF-2 primijećeno je kod pacijenata s neurodegenerativnim bolestima kao što su Alzheimerova, Parkinsonova i Huntingtonova bolest. Što mislite, kakav bi to utjecaj mogao imati na sintezu proteina?

Kemijske modifikacije, aktivnost proteina i dugovječnost

Proteini se mogu kemijski modificirati dodatkom skupina uključujući metilne, fosfatne, acetilne i ubikvitinske skupine. Dodavanje ili uklanjanje ovih skupina iz proteina regulira njihovu aktivnost ili duljinu njihovog postojanja u stanici. Ponekad ove modifikacije mogu regulirati gdje se protein nalazi u stanici - na primjer, u jezgri, u citoplazmi ili pričvršćen na plazma membranu.

Kemijske promjene nastaju kao odgovor na vanjske podražaje kao što su stres, nedostatak hranjivih tvari, toplina ili izlaganje ultraljubičastom svjetlu. Ove promjene mogu promijeniti epigenetsku dostupnost, transkripciju, stabilnost mRNA ili translaciju – sve rezultira promjenama u ekspresiji različitih gena. Ovo je učinkovit način da stanica brzo promijeni razine specifičnih proteina kao odgovor na okoliš. Budući da su proteini uključeni u svaku fazu regulacije gena, fosforilacija proteina (ovisno o proteinu koji je modificirana) može promijeniti dostupnost kromosomu, može promijeniti translaciju (promjenom vezanja transkripcijskih faktora ili funkcije), može promijeniti nuklearni shuttling ( utječući na modifikacije kompleksa nuklearnih pora), može promijeniti stabilnost RNA (vezivanjem ili nevezivanjem na RNA radi reguliranja njezine stabilnosti), može modificirati translaciju (povećati ili smanjiti) ili može promijeniti posttranslacijske modifikacije (dodati ili ukloniti fosfate ili druge kemijske modifikacije).

Dodavanje ubikvitinske skupine proteinu označava taj protein za razgradnju. Ubiquitin djeluje kao zastavica koja označava da je životni vijek proteina završen. Ti se proteini premještaju u proteasom, organelu koja služi za uklanjanje proteina, kako bi se razgradili (slika 16.14). Stoga je jedan od načina kontrole ekspresije gena mijenjanje dugovječnosti proteina.


3. Rezultati

3.1. A. phagocytophilum modulira ekspresiju gena u inficiranim I. scapularis nimfama i ISE6 stanicama krpelja

Infekcija s A. marginale pokazalo se da modulira ekspresiju gena krpelja [9]. Međutim, učinak od A. phagocytophilum infekcija na ekspresiji gena krpelja nije poznata. Ovdje su korištena dva eksperimentalna pristupa za karakterizaciju profila ekspresije gena u stanicama krpelja zaraženim s A. phagocytophilum. U prvom pristupu, ekspresija gena krpelja karakterizirana je mikromrežnom analizom RNA iz inficiranih i neinficiranih ISE6 stanica krpelja. U drugom pristupu, geni su identificirani kao različito izraženi u IDE8 stanicama krpelja i krpeljima zaraženim A. marginale korišteni su za karakterizaciju učinka A. phagocytophilum na ekspresiju gena krpelja kod inficiranih I. scapularis nimfe i ISE6 stanice krpelja RT-PCR-om u stvarnom vremenu.

Analiza mikromreža pokazala je u A. phagocytophilum-zaražene stanice krpelja ISE6 povećanje regulacije gena C4B10 s homologijom s von Willebrandovom faktorom i R1E12 s homologijom s ribosomskim proteinom L32, C4A10, C3C3, C4A1 i C3D9 s nepoznatom funkcijom i smanjenjem regulacije gena C3B2 s aspart1A2 homologijom i R2 , C3A7, R2G1, R2D6, C3C11 i R3D4 s nepoznatom funkcijom (Tablica 2). Ekspresija drugih gena s homologijom na troponin I (C2E6), navodni izlučeni protein sline (C4G3) i protein koji sadrži ML domenu (R4G5) nije se promijenio nakon infekcije krpelja ISE6 stanica s A. phagocytophilum (Tablica 2).

Tablica 2

Analiza profila genske ekspresije mikromrežom u A. marginale- i A. phagocytophilum-inficirane i -neinficirane ISE6 stanice krpelja.

ID sonde (a) Opis (b) A. marginale infekcija u odnosu na kontrolu A. phagocytophilum infekcija u odnosu na kontrolu
Promjena preklapanja (c) SD (d) Promjena preklapanja (c) SD (d)
C4A10Nije pronađen homolog6.2490.0002.2080.294
R1A6Nije pronađen homolog2.5390.1621.0490.346
C3C5[Genbank: <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"L22271","term_id":"347817","term_text":"L22271">> L22271] interni transkribirani razmaknik 1 (Ixodes dammini)2.4061.2111.3830.000
C4A8Nije pronađen homolog2.2390.1651.1880.442
R3A7Nije pronađen homolog2.2090.805𢄡.3840.562
C4G3[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAY66629","term_id":"67083387","term_text":"AAY66629">> AAY66629] navodno izlučeni protein sline (Ixodes scapularis)2.1670.3261.0370.614
C2E6[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"ABB89211","term_id":"82698821","term_text":"ABB89211">> ABB89211] protein troponin I (Rhipicephalus haemaphysaloides)2.0400.400𢄡.0680.442
C3C3Nije pronađen homolog1.9160.5593.4221.037
C4A1Nije pronađen homolog1.8570.0002.1210.517
R2A12Nije pronađen homolog1.1990.232𢄢.2190.450
C3A7Nije pronađen homolog1.1350.282𢄣.0280.141
C3D9[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"XP_791420","term_id":"72037502","term_text":"XP_791420">> XP_791420] hipotetski protein (Strongylocentrotus purpuratus)1.0760.3354.8752.069
C3B2[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"BAE53722","term_id":"83319201","term_text":"BAE53722">> BAE53722] asparaginska proteaza (Haemaphysalis longicornis)𢄡.3110.330𢄦.9860.379
R2G1Nije pronađen homolog𢄡.4970.495𢄢.0860.826
R2D6Nije pronađen homolog𢄡.5380.309𢄢.4400.563
C3C11Nije pronađen homolog𢄢.0530.401𢄢.4770.488
C4D12Nije pronađen homolog𢄢.0660.547𢄡.0220.533
R4G5[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAP84098","term_id":"32481528","term_text":"AAP84098">> AAP84098] ML domena koja sadrži protein (Ixodes ricinus)𢄢.0660.1611.0200.266
C4C9[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH56007","term_id":"33417096","term_text":"AAH56007">> AAH56007] H13-prov protein (Xenopus laevis)𢄢.0700.2701.0810.689
C4G11[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"EAA09467","term_id":"157017076","term_text":"EAA09467">> EAA09467] ENSANGP00000010016 (Anopheles gambiae)𢄢.0930.550𢄡.1930.598
C4G9Nije pronađen homolog𢄢.0950.402𢄡.5980.888
R3F5[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAY66764","term_id":"67083657","term_text":"AAY66764">> AAY66764] navodno izlučeni protein sline (Ixodes scapularis)𢄢.1180.310𢄡.0370.320
R3G4Nije pronađen homolog𢄢.2920.2591.0900.415
R1F3Nije pronađen homolog𢄢.3390.570𢄡.3440.855
R1E12[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_001119682","term_id":"187115162","term_text":"NP_001119682">> NP_001119682] L3 protein L3 ribosomAcyrthosiphon pisum) 𢄢.3790.0002.4880.000
C3F10[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAM93633","term_id":"22164256","term_text":"AAM93633">> AAM93633] navodno izlučeni protein (Ixodes scapularis)𢄢.3860.545𢄡.6470.315
R3D4Nije pronađen homolog𢄢.5291.046𢄢.3770.518
C4D2Nije pronađen homolog𢄢.7020.8601.0430.972
R3F4Nije pronađen homolog𢄢.9280.2981.1740.396
C1H10Nije pronađen homolog𢄣.3410.307𢄡.0570.000
C4A4Nije pronađen homolog𢄣.6781.181𢄡.4300.331
C4E12[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAY66942","term_id":"67084015","term_text":"AAY66942">> AAY66942] ribosomski protein S17 (Ixodes scapularis)𢄣.9640.8221.4300.993
C4B10[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAQ01562","term_id":"33285889","term_text":"AAQ01562">> AAQ01562] von Willebrandov faktor (Ixodes ricinus)𢄤.4220.0002.4130.000

(a) ID sonde (bibliotečka ploča i jažica) identificira uzorak (klon) u osnovnim pločama.

(b) Opis sonde na temelju gornjeg (najboljeg) BLASTX poravnanja.

(c) Promjena nabora je promjena nabora normaliziranog omjera log2 ovisnog o intenzitetu Lowess valjanih pozadinskih ispravljenih srednjih vrijednosti u prosjeku između valjanih replika. Samo unosi koji prikazuju izraz mijenjaju se više od 2 puta i P < .05 u oba A. phagocytophilum ili A. marginale prikazane su inficirane stanice. Pozitivne i negativne vrijednosti odgovaraju genima koji su u zaraženim stanicama regulirani gore, odnosno niže.

(d) SD je standardna devijacija određena iz normaliziranog prosječnog log2 omjera, ali određena samo na podacima iz valjanih točaka.

Razine mRNA odabranih gena različito izražene u A. phagocytophilum-inficirane ISE6 stanice krpelja procijenjene su RT-PCR-om u stvarnom vremenu u inficiranim i neinficiranim stanicama (slika 1). Slično rezultatima hibridizacije mikromreža, analiza razina mRNA pomoću RT-PCR-a u stvarnom vremenu pokazala je značajnu regulaciju C4B10 (von Willebrandov faktor) i R1E12 (ribosomalni protein L32) i smanjenje C3B2 (asparaginska proteaza) u stanicama krpelja zaraženim ISE6 A. phagocytophilum (Slika 1). Razine mRNA gena koje su prethodno identificirane kao različito izražene u IDE8 stanicama krpelja i krpeljima zaraženim A. marginale [9] također su procijenjeni RT-PCR-om u stvarnom vremenu u inficiranim i neinficiranim ISE6 stanicama krpelja. Razine mRNA gena različito izražene u A. marginale-inficirane ISE6 stanice bile su slične onima koje su prethodno prijavljene u inficiranim IDE8 stanicama [9], a podaci nisu prikazani. Rezultati u A. phagocytophilum-inficirane stanice ISE6 pokazale su da infekcija patogenom značajno povećava ekspresiju U2A8 (delta receptora signalne sekvence), 1I5B9 (protein koji sadrži iksodegrin-2A RGD) i 1I4G12 (nepoznata funkcija) i smanjuje ekspresiju 2I3A7 (NADH-ubiquinoe oksidoreduktaza) i 1I1H6 (glutation S-transferaza (GST)) u ISE6 stanicama krpelja (Slika 1).

Diferencijalna ekspresija gena u A. phagocytophilum-zaražen I. scapularis krpelja i kultiviranih ISE6 stanica krpelja. RT-PCR u stvarnom vremenu rađen je na neinficiranim i inficiranim I. scapularis nimfe (po tri skupine neinficiranih krpelja, inficiranih krpelja (crne trake Gaillardovog soja) i zaraženih krpelja (bijele trake Dawsonovog soja) s po 10 nimfi) i neinficiranih i NY18 izolatom inficiranih stanica krpelja ISE6 (tri nezavisne kulture, svaka crvene trake). Trake predstavljaju omjer između inficiranih normaliziranih vrijednosti Ct/neinficiranih prosječnih normaliziranih vrijednosti Ct (+SD). Razine mRNA normalizirane su protiv krpelja β-aktin (ACT) i usporedba između inficiranih i neinficiranih krpelja i stanica krpelja od strane Student's t-test (*P ≤ .05).

Ekspresija odabranih gena također je analizirana u I. scapularis nimfe zaražene s dvije različite A. phagocytophilum sojeva (slika 1). U I. scapularis nimfe, ekspresija C4G3 (navodno izlučeni protein sline), C4B10 (von Willebrandov faktor), R1E12 (ribosomalni protein L32) i R4G5 (protein koji sadrži ML domenu) je značajno povećana, a ekspresija U2A8 (delta receptora signalne sekvence) ), UP8 (feritin), 2I3A7 (NADH-ubiquinoe oksidoreduktaza), 2I3A3 (protein sličan gama aktinu), 2IP10 (ubikvitin C varijanta 5 sličan), 1I5B9 (protein koji sadrži iksodegrin-2A RGD), 1I1H6 (GST), 1I1H6 (GST) (troponin I), C3B2 (asparaginska proteaza) i 1I4G12 i 1I3H6 s nepoznatom funkcijom značajno je smanjen. Zanimljivo je da su razine mRNA bile slične u I. scapularis nimfe zaražene s dva različita soja A. phagocytophilum ali se razlikovao od onih dobivenih u inficiranim stanicama ISE6 za neke gene kao što su U2A8, 1I5B9, 1I4G12, C2E6, C4G3 i R4G5 (slika 1).

3.2. Diferencijalna ekspresija gena u nimfama I. scapularis inficiranih A. phagocytophilum i stanicama ISE6 razlikovala se od one uočene nakon infekcije A. marginale

Ovdje prikazani rezultati pokazali su da su profili ekspresije gena različiti za A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane stanice krpelja (Slike 2 i ​ i 3). 3 ). Analiza mikromreža u inficiranim i neinficiranim ISE6 stanicama krpelja pokazala je da ekspresija gena s homologijom na interni transkribirani razmaknik 1 (sonda C3C5), pretpostavljeni izlučeni protein sline (C4G3), troponin I (C2E6), asparaginsku proteazu (C3B2), ML domenu -sadrže protein (R4G5), H13-prov protein (C4C9), ribosomski protein L32 (R1E12), navodno izlučeni protein (C3F10), ribosomski protein S17 (C4E12), von Willebrandov faktor (C4B10) i sekvence s nepoznatom funkcijom (R1A6 , C4A8, R3A7, R2A12, C3A7, C3D9, R2D6, C3C11, R3G4, R1F3, C4D2, R3F4, C1H10, C4A4) bio je različit između A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane stanice (slika 2). Ekspresija ostalih gena promijenila se na sličan način nakon infekcije krpelja ISE6 stanica s A. marginale ili A. phagocytophilum (C4A10, C3C3, C4A1, R2G1, C4D12, C4G11, C4G9, R3F5, R3D4 Slika 2).

Učinak od A. phagocytophilum i A. marginale infekcija na ekspresiji gena ISE6 stanica krpelja. Ukupna RNA je ekstrahirana iz tri A. marginale-zaražene, tri A. phagocytophilum-inficirane i tri neinficirane ISE6 stanične kulture. Promjena ekspresijskog puta određena je hibridizacijom mikromreža 6 dana nakon infekcije (dpi) (približno 70% pratećih kultura inficiranih stanica bilo je terminalno na 8 dpi). Neinficirane stanice uzorkovane su u isto vrijeme kada i inficirane stanice kako bi se uzeli u obzir efekti vremena kulture. Omjeri su izračunati kao Anaplazma-inficirane stanice naspram neinficiranih kontrolnih stanica.Vrijednosti normaliziranog omjera dobivene za svaku sondu su usrednjene u 3 biološka ponavljanja i četiri tehničke replike i samo unosi koji pokazuju značajnu (P ≤ .05) promjena nabora izraza Ϣ u bilo kojem A. phagocytophilum- ili A. marginale-prikazane su inficirane stanice. Prikazani su ID klona (bibliotečka ploča i jažica). Grafikon je izrađen pomoću softvera HCE (http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/hce3.html).

Učinak od A. phagocytophilum i A. marginale infekcija na ekspresiji gena ISE6 stanica krpelja. Razine mRNA uspoređene su između A. phagocytophilum- (bijele trake) i A. marginale- (crne trake) zaražene ISE6 stanice krpelja RT-PCR-om u stvarnom vremenu. Trake predstavljaju omjer između inficiranih normaliziranih vrijednosti Ct i neinficiranih prosječnih normaliziranih vrijednosti Ct (+SD). Razine mRNA normalizirane su u odnosu na 16S rRNA krpelja i uspoređene između njih A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane stanice krpelja od strane Student's t-test (*P ≤ .05). Pozitivne i negativne vrijednosti označavaju pojačanu regulaciju, odnosno nižu regulaciju u odnosu na neinficirane kontrole.

RT-PCR-om u stvarnom vremenu, razine mRNA U2A8 (delta receptora signalne sekvence), 2I3G1 (proteazomska 26S podjedinica, ne-ATPaza), 2I3A3 (protein sličan gama aktinu), 2I1F6 (protein sličan hematopoetskim matičnim/progenitorskim stanicama). ), 1I5B9 (protein koji sadrži iksodegrin-2A RGD), 1I4G12 (nepoznata funkcija), 1I3H6 (nepoznata funkcija), 1I3F5 (ubikvitin) i 1I1H6 (GST) značajno su se razlikovali između A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane ISE6 stanice prikupljene pri 3 dpi s približno 40% inficiranih stanica (slika 3). Osim za U2A8, 1I5B9, 1I4G12, C2E6, C4G3 i R4G5 koji su imali različite razine mRNA u A. phagocytophilum-zaražene nimfe i stanice krpelja ISE6 (slika 1), razine mRNA proučavanih gena također su bile različite između A. phagocytophilum-zaražen I. scapularis nimfe i A. marginale-zaražene stanice krpelja (podaci nisu prikazani).

Budući da kinetika različito izraženih gena može varirati s Anaplazma razine infekcije, ekspresija odabranih gena uspoređena je RT-PCR u stvarnom vremenu A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane ISE6 stanice prikupljene pri 2, 5 i 8 dpi (slika 4(a)). Rezultati su pokazali vremenski ovisne varijacije u omjerima mRNA proučavanih gena između A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane stanice (slika 4(b)). Međutim, uočene su značajne razlike između A. phagocytophilum i A. marginale infekcija u svim vremenskim točkama, što sugerira da su razlike u profilima ekspresije gena koje izazivaju ovi patogeni prisutne tijekom ciklusa infekcije u stanicama ISE6 krpelja.

Usporedba između diferencijalne ekspresije gena u A. phagocytophilum- i A. marginale-inficirane ISE6 stanice krpelja u različitim vremenskim točkama nakon infekcije. Studije su rađene na A. phagocytophilum- (A.p.-) i A. marginale- (Am-) inficirane ISE6 stanice krpelja (dvije nezavisne kulture) 2, 5 i 8 dana nakon infekcije (dpi) s približno 30%�%, 60%�% i 㺐% inficiranih stanica , odnosno. (a) A.p. i ujutro razine infekcije procijenjene su PCR-om u stvarnom vremenu msp4 i normalizirana protiv krpelja 16S rDNA. Poznate količine A.p. i ujutro msp4 PCR proizvod korišten je za konstruiranje standardne krivulje za kvantitaciju patogena po stanici. Podaci predstavljaju prosječni ± SD. (b) Razine mRNA odabranih gena procijenjene su RT-PCR u stvarnom vremenu i normalizirane u odnosu na 16S rRNA krpelja. Trake predstavljaju omjer između prosječnih vrijednosti Ct u stanicama inficiranim A.p./prosječnim vrijednostima Ct u stanicama inficiranim A.m. Razine mRNA uspoređene su između stanica krpelja zaraženih A.p.- i A.m. t-test (*P ≤ .05). Identične razine mRNA u A. phagocytophilum i A. marginale zaražene stanice jednake jedan.


REZULTATI

Uzorkovanje raznolikosti:

Šest od naših 7 primjeraka uključeno je u skup od 96 primjeraka Arabidopsis iz kojih je sekvencirano 875 lokusa (N ordborg et al. 2005) (walnut.usc.edu/2010/), što nam omogućuje da procijenimo količinu polimorfizma DNK na razini cijele vrste sadržanog u našem uzorku akcesija. Identificirali smo polimorfizme prisutne u 875 lokusa raspoređenih po genomu i ocijenili učestalost svakog polimorfizma među 96 primjeraka i je li taj polimorfizam bio varijabilan u naših 6 primjeraka. Naših 6 primjeraka sadržavalo je ∼80% polimorfizama srednje do visoke frekvencije u cijeloj vrsti (manja učestalost alela >10%) (slika 1). U razredu rijetkih do niskofrekventnih, naši su primjerci sadržavali samo 20-30% raznolikosti vrsta (Slika 1.). Stoga su naši prilozi bili reprezentativni za većinu varijacija slijeda srednje i visoke frekvencije u Arabidopsisu.

Uzorkovanje varijacije vrsta. Prikazan je postotak polimorfizama u 96 primjeraka Arabidopsis koji su polimorfni u šest primjeraka koji su zajednički s ovim skupom podataka (Col-0, Cvi-1, Kin-0, Mt-0, Tsu-1 i Van-0) ( N ordborg et al. 2005.). Aleli se spajaju na temelju manjeg postotka alela u skupu podataka od 96 pristupa (prikazano na x-os). Glatka linija predstavlja očekivanu distribuciju slučajnog uzorkovanja za 6 pristupa za svaku klasu postotka alela.

ANOVA podataka mikromreža za različito izražene gene:

ANOVA split-plot otkrila je da su četiri efekta bila značajna za svih 21 para pristupa: niz, gen, interakcija gena s pristupom i gen s vremenskom točkom (podaci nisu prikazani i tablica 1). Budući da se razine ekspresije razlikuju među različitim genima, očekivao se značajan učinak gena. Značajan učinak interakcije gen × pristup ukazuje da se ekspresija gena različito ponašala u različitim akcesijama. Budući da ove razlike mogu biti posljedica potencijalnih ELP-ova ili polimorfizama sekvenci, statistička analiza ne može razlikovati ove dvije alternative. Značajan učinak interakcije gen × vremenska točka pokazuje da različiti geni pokazuju različite obrasce ekspresije tijekom vremena. Značajan učinak niza pokazuje da postoji varijacija od čipa do čipa, ali model podijeljenog dijagrama ispravno je uzeo u obzir ovaj izvor varijacije. Tijekom 21 para pristupa, nije bilo značajnih učinaka za liječenje SA, interakciju pristupa × liječenje i pristupa × liječenje × gena (trosmjerna interakcija), što sugerira da liječenje SA nije snažno utjecalo na ukupnu razinu ekspresije u svim 22.810 gena, što je očekivano s obzirom da je SA induciran samo podskup gena. Međutim, liječenje SA definitivno je utjecalo na regulaciju ekspresije tijekom vremena, što je dokazano značajnim učincima na vremenske točke i sve interakcije povezane s vremenom.

ANOVA razlika u parovima

ANOVA u paru identificirala je u prosjeku 2234 gena koji pokazuju diferencijalni signal ekspresije (potencijalni ELP) između bilo koja dva pristupa u različitim tretmanima, koristeći korekciju višestrukog testiranja stope lažnog otkrića (FDR) (B enjamini i H ochberg 1995.), i 331 gen kada se koristi Holmova višestruka korekcija testiranja (H olm 1979) (slika 2). Pristupni Cvi-1 imao je više potencijalnih ELP-ova u svim svojim parnim usporedbama nego bilo koji drugi pristup (Slika 2). Da bismo procijenili varijabilnost potencijalnih ELP-ova, dodali smo broj usporedbi u paru za koje je bilo koji gen pokazao diferencijalni signal ekspresije. Rezultirajuća distribucija bila je teškog repa i nagnuta prema ELP-ovima niske do umjerene frekvencije i bila je slična za popise gena dobivenih korištenjem FDR-a ili Holmovog postupka (slika 3). Zanimljivo je da je nekoliko stotina gena pokazalo različite signale ekspresije u više od polovice testova u paru, što sugerira da ovi geni imaju više alela koji mogu dati različite razine ekspresije.

Diferencijalna ekspresija gena po parovima priraslica. Prikazan je broj gena koji pokazuju diferencijalnu ekspresiju po pristupnom paru. Lijevo y-os i trake pokazuju broj gena koji pokazuju polimorfnu ekspresiju, što je određeno značajnom H01 (različito izraženo između dva pristupa), sa značajnošću utvrđenom Holmovim testom (vidi materijale i metode za detalje). Pravo y-os i dijamanti pokazuju broj gena s ekspresijskim polimorfizmima koji zadovoljavaju H01 s razinom značajnosti utvrđenom FDR testom. Pristupni par je naveden na x-os: C, Col-0 I, Cvi-1 E, Est K, Kin-0 M, Mt-0 T, Tsu-1 i V, Van-0. Prosjek je prosjek svih usporedbi u paru.

Učestalost razlika u ekspresiji gena za pristupanje u paru. Horizontalna os označava broj pristupnih parova (n = 21 par) za koje se geni detektiraju kao različito izraženi. Pune crtice označavaju broj gena identificiranih Holmovim postupkom otvorene crtice označavaju broj gena identificiranih FDR postupkom.

Uključili smo SA tretman jer nas zanimaju prirodne varijacije u odgovorima na primjenu SA. Korištenje dva tretmana (SA i kontrola) pružilo je priliku za ispitivanje posljedica eksperimentalne varijacije tretmana na skup gena koji pokazuju različitu ekspresiju. SA je glavna signalna molekula uključena u obrambene odgovore biljaka (G affney et al. 1993 D elaney et al. 1995.). Koristili smo tretman SA 0,30 m m, jer su više razine SA uzrokovale fitotoksičnost u nekim akcesijama (podaci nisu prikazani). Statistička analiza identificirala je prosječno 660 gena s FDR-om i 25 gena s Holmovim postupkom koji pokazuje diferencijalni SA odgovor između najmanje jednog para akcesora. Ovi brojevi predstavljaju ∼10-20% gena koji pokazuju razliku u ekspresiji među akcesijama koje nisu pokazale interakciju liječenja. To sugerira da postoje značajne varijacije u odgovorima na ovu ključnu signalnu molekulu, ali je trenutno nepoznato kako se to odnosi na varijacije u otpornosti na bolesti.

Kontrolni geni:

Kako bismo testirali sposobnost naše ANOVA-e da otkrije gene za koje je ranije prijavljeno da variraju između akcesija, proučavali smo skup gena za koje se znalo da pokazuju prirodne varijacije u sekvenci DNA, akumulaciji mRNA i fenotipu. Ova usporedba uključivala je gene uključene u proizvodnju glukozinolata povezanih s obranom biljaka (ESP, AOP2, AOP3, GS-OH, mama 1, i MamL) (K Liebenstein et al. 2001 L ambrix et al. 2001 K roymann et al. 2003.), vrijeme cvatnje (FLC, PET, FLM, i HUA2) (J ohanson et al. 2000 C aicedo et al. 2004 D oyle et al. 2005 L empe et al. 2005. Werner et al. 2005.), svjetlosni odgovori hipokotila (PHYA i CRY2) (E l -A ssal et al. 2001. Odmaknut et al. 2001.), i izazivanje otpora (RPM1, RPS2, RPS4, RPS5, i RPP5) (Grant et al. 1995. P arker et al. 1997 G assmann et al. 1999. H enk et al. 1999. M auricio et al. 2003). Ovi geni su klasificirani na temelju prirode molekularnih polimorfizama (Tablica 2). Svaki polimorfizam (INDEL, polimorfizam mjesta spajanja ili uočena razlika mRNA) koji bi mogao uzrokovati promjenu uočene ekspresije gena naveden je kao potencijalni ELP. Naša statistička analiza identificirala je 12 od 13 gena za koje je prethodno bilo poznato ili predviđeno da imaju različitu ekspresiju (Tablica 2). Jedan gen (FLM) koji nismo identificirali kao polimorfni ima INDEL u pristupu koji nije bio uključen u našu studiju (Werner et al. 2005.). Geni s nonsens ili missense polimorfizmima poslužili su kao kontrole i, kao što se očekivalo, nisu otkriveni kao različito izraženi. Ovi rezultati sugeriraju da naš eksperiment ima nisku stopu lažno negativnih za otkrivanje ELP-ova.

Identifikacija poznatih gena s očekivanim varijacijama u ekspresiji među akcesijama

Kako bismo provjerili je li gornja analiza bila pristrana korištenjem gena za koje je poznato da uzrokuju fenotipske polimorfizme, koristili smo 12 gena koji pokazuju diferencijalnu ekspresiju u sedam pristupa za QRT-PCR analizu za diferencijalnu ekspresiju gena. Prosječna korelacija za vrijednosti ekspresije ovih 12 gena između vrijednosti QRT-PCR i ATH1 GeneChip bila je 0,69, što ukazuje na to da analiza mikromreža točno otkriva gene s ELP-ovima.

SFP-ovi i diferencijalni izraz:

Kako bismo testirali mijenja li prisutnost SFP-a značajno procjenu ekspresije gena, izračunali smo prividne razine ekspresije za 400 gena koji su sadržavali SFP-ove između Col-0 i Cvi-1 sa i bez signala iz sondi koje sadrže SFP i upotrijebili split-split -plan ANOVA. Od 400 gena koji sadrže SFP, SFP je bio odgovoran za ∼0,13% varijance u signalu među tim genima. Nadalje, uključivanje sondi sa SFP-ima u procjenu vrijednosti ekspresije gena dovelo je do samo 7% smanjenja procjene. Stoga, SFP-ovi nisu značajan izvor varijacija u procjenama ekspresije gena, a razlike među akcesijama uglavnom su posljedica stvarnih ELP-ova.

Pristranost funkcije gena:

Prethodni rad sugerirao je pristranost u funkcionalnoj klasifikaciji gena koji pokazuju različitu ekspresiju među akcesijama Arabidopsis (C hen et al. 2005.). Kada su GO biološke napomene korištene za klasifikaciju gena, različito izraženi geni su značajno obogaćeni za gene koji su klasificirani kao kontrolirajući biotičke i abiotske odgovore, stresne odgovore i prijenos signala (slika 4). Ove razlike u učestalosti klasifikacije bile su značajne za χ 2 -testove u svim usporedbama u paru po kategoriji, kao i za prosjek usporedbi u paru nakon prilagodbe za višestruke usporedbe s Bonferronijevom korekcijom (podaci nisu prikazani). Osim toga, došlo je do značajnog smanjenja gena koji su klasificirani kao uključeni u transport (slika 4). Ovaj rezultat bio je sličan onima koje je ranije izvijestio C hen et al. (2005.). Slična usporedba korištenjem molekularnih napomena GO identificirala je značajnu razliku od očekivanja cijelog genoma (u više od polovice usporedbi u paru) samo za gene klasificirane kao vezanje receptora ili aktivnost. Nijedna klasa u GO staničnim bilješkama nije bila značajna u usporedbama u parovima (podaci nisu prikazani).

Usporedba GO bioloških napomena za različito izražene gene. Pune trake pokazuju postotak ukupnih napomena u svakoj GO klasifikaciji bioloških bilješki koristeći potpuno sekvencirani genom Arabidopsis iz Col-0. Zasjenjene trake (sa standardnim pogreškama) pokazuju prosječni postotak ukupnih napomena za svaku od gornjih bioloških klasifikacija GO koristeći sve 21 usporedbu između parova priraslica. Zvjezdica označava one klasifikacije koje se značajno razlikuju od analize cijelog genoma utvrđene χ 2 -testovima, uz Bonferronijevu korekciju. GO biološke klasifikacije koje opisuju nepoznate proteine ​​nisu uključene (tj., drugi fiziološki procesi, drugi metabolički procesi, drugi stanični procesi i biološki procesi nepoznati) jer nisu bili informativni.

Odnos razlika između izraza u paru i divergencije sekvence:

Ako ne postoji glavni mehanizam filtriranja, kao što su diferencijalni selekcijski pritisci na polimorfizam sekvence i ekspresije ili masivni trans-djelujući učinci, kako bi se utjecao utjecaj varijacije slijeda DNA na varijaciju ekspresije gena, očekuje se odnos na nivou genoma između varijacije slijeda DNA i varijacije ELP. Da bismo procijenili ovaj odnos, odredili smo π, prosječnu parnu divergenciju nukleotida (T ajima 1983 N ei 1987) između šest pristupa za koje su postojali podaci o sekvenciji, a zatim usporedili π s brojem gena koje smo otkrili kao različito izražene između gena. isti pristupni par (kako je utvrđeno FDR-om). Postojala je značajna pozitivna povezanost između ovih vrijednosti (Slika 5.). Ova linearna regresijska analiza je objasnila je li par uključivao Col-0, iz kojeg su dizajnirane oligomerne sonde na ATH1 GeneChip (N = 15, P < 0,0001, r = 0,83 Col-0 prisutnost u pristupnom paru, d.f. = 1, P = 0,0483) (slika 5). Procjene divergencije genske ekspresije dobivene Holmovom višestrukom korekcijom testiranja generirale su gotovo identičan odnos između divergencije slijeda i ekspresije gena (N = 15, P < 0,0001, r = 0,86 Col-0 prisutnost u pristupnom paru, d.f. = 1, P = 0,0097). Ova je povezanost također bila značajna kada se usporedi π s brojem gena koji pokazuju razliku ekspresije ovisno o interakciji pristupa × tretmana (N = 15, P < 0,0001, r = 0,95 prisutnost Col-0 u pristupnom paru, d.f. = 1, P = 0,001). Nije vjerojatno da su ti geni bili pod utjecajem hibridizacijskih razlika, poput onih uzrokovanih INDEL polimorfizmima, budući da su ti geni pokazali nepromjenjivu ekspresiju gena u jednom tretmanu u dva pristupa, ali su pokazali diferencijalnu ekspresiju gena pod drugim tretmanom. Ovaj odnos između π i gena značajnih za interakcije pristupa × tretmana dodatno podupire hipotezu da SFP-ovi nisu značajno utjecali na procjene varijacije ekspresije gena i da smo doista mjerili ELP između akcesora.

Divergencija sekvenci i razlike u ekspresiji gena su povezane. Odnos između π i broja ELP-ova između parova šest pristupa (Col-0, Cvi-1, Kin-0, Mt-0, Tsu-1 i Van-0), kako je određeno linearnom regresijom i popisom gena FDR (n = 15, P < 0,001, r 2 = 0,83), prikazan je. Usporedbe u paru koje sadrže Col-0 prikazane su kao otvoreni krugovi puni krugovi označavaju parove koji ne uključuju Col-0. Sličan linearni odnos identificiran je s Holmovim popisom gena (n = 15, P < 0,001, r = 0.80).

Genomska distribucija razlika ekspresije i divergencije sekvenci:

Odnos između π i varijacije ekspresije gena (prethodni odjeljak) prosječna je usporedba za cijeli genom. Kako bismo procijenili postoji li veza između varijacije lokalne DNA sekvence i varijacije ekspresije gena, proveli smo analizu kliznog prozora duž kromosoma Arabidopsis (slika 6). Otkriven je jasan odnos u varijaciji lokalne sekvence i varijaciji ekspresije gena, budući da su dva traga bila vrlo slična na kromosomima (slika 6). Lokalni vrhovi divergencije DNA sekvenci među akcesijama tipično su kolocirani s lokalnim obogaćenjima u broju gena koji pokazuju polimorfnu ekspresiju gena. Konkretno, postoji regija blizu sredine kromosoma III koja ima značajno povišenje polimorfizma ekspresije gena i također je obogaćena varijacijama DNA sekvence (slika 6). Dvije regije s nedostatkom lokalne korelacije između raznolikosti sekvenci i polimorfne ekspresije gena mogu se objasniti tehničkim ili biološkim razlozima.Ravna regija za diferencijalnu ekspresiju gena na vrhu kromosoma IV je područje niske gustoće gena zbog prisutnosti nukleolarnog organizacijskog područja. Regija od ∼10-Mbp na kromosomu V koja je imala niske procjene π također ima mali broj sekvenciranih lokusa i može predstavljati lokalnu pristranost uzorkovanja.

Lokalna kromosomska povezanost između varijacija nukleotida i diferencijalne ekspresije gena. Usporedba varijacije nukleotida s kliznim prozorom (π) vs. prikazana je diferencijalna ekspresija gena u 6 pristupa (Col-0, Cvi-1, Kin-0, Mt-0, Tsu-1 i Van-0) zajedno s 96 pristupa iz baze podataka sekvenci (N ordborg et al. 2005.). Crna linija je prosječan broj ELP-ova po lokusu izmjeren u kliznom prozoru od 500 gena. The x-os svakog grafa je u parovima megabaza kako je označeno. Vodoravne linije predstavljaju P = 0,05 pragova za različito izražen klizni prozor dobiven analizom permutacije (0,056 je P = 0,05 minimum i 0,132 je P = maksimalno 0,05). Siva linija predstavlja analizu kliznog prozora od 5 Mbp prosječnog π po lokusu.


Usporedba razina ekspresije gena između kontrole i bolesti u različitim vremenskim točkama - Biologija

Da bismo razumjeli kako je ekspresija gena regulirana, prvo moramo razumjeti kako gen kodira funkcionalni protein u stanici. Proces se događa i u prokariotskim i u eukariotskim stanicama, samo na malo različite načine.

Prokariotski organizmi su jednostanični organizmi kojima nedostaje stanična jezgra, te stoga njihova DNK slobodno pluta u staničnoj citoplazmi. Za sintezu proteina, procesi transkripcije i translacije odvijaju se gotovo istovremeno. Kada dobiveni protein više nije potreban, transkripcija se zaustavlja. Kao rezultat toga, primarna metoda za kontrolu vrste proteina i koliki je dio svakog proteina izražen u prokariotskoj stanici je regulacija transkripcije DNA. Svi sljedeći koraci odvijaju se automatski. Kada je potrebno više proteina, dolazi do više transkripcije. Stoga je u prokariotskim stanicama kontrola ekspresije gena uglavnom na razini transkripcije.

Eukariotske stanice, nasuprot tome, imaju unutarstanične organele koje doprinose njihovoj složenosti. U eukariotskim stanicama DNK se nalazi unutar jezgre stanice i tamo se transkribira u RNA. Novosintetizirana RNA se zatim transportira iz jezgre u citoplazmu, gdje ribosomi prevode RNK u protein. Procesi transkripcije i translacije fizički su odvojeni nuklearnom membranom. Transkripcija se događa samo unutar jezgre, a translacija se događa samo izvan jezgre u citoplazmi. Regulacija ekspresije gena može se dogoditi u svim fazama procesa (slika 1). Regulacija se može dogoditi kada se DNK odmota i olabavi od nukleosoma da se veže transkripcijski čimbenici (epigenetski razina), kada se RNA transkribira (transkripcijska razina), kada se RNA obrađuje i izvozi u citoplazmu nakon što je transkribirana (post-transkripcijski razina), kada je RNA prevedena u protein (translacijska razina) ili nakon što je protein napravljen (posttranslacijski razina).

Slika 1. Prokariotska transkripcija i translacija odvijaju se istovremeno u citoplazmi, a regulacija se događa na razini transkripcije. Ekspresija eukariotskih gena regulira se tijekom transkripcije i obrade RNA, koje se odvijaju u jezgri, te tijekom translacije proteina, koja se odvija u citoplazmi. Daljnja regulacija može se dogoditi putem posttranslacijskih modifikacija proteina.

Razlike u regulaciji ekspresije gena između prokariota i eukariota sažete su u tablici 1. Regulacija ekspresije gena detaljno se raspravlja u sljedećim modulima.

Tablica 1. Razlike u regulaciji ekspresije gena prokariotskih i eukariotskih organizama
Prokariotski organizmi Eukariotski organizmi
Nedostatak jezgre Sadrži jezgru
DNK se nalazi u citoplazmi DNK je ograničena na nuklearni odjeljak
Transkripcija RNA i stvaranje proteina odvijaju se gotovo istovremeno Transkripcija RNA događa se prije stvaranja proteina, a odvija se u jezgri. Translacija RNK u protein događa se u citoplazmi.
Ekspresija gena regulirana je prvenstveno na razini transkripcije Ekspresija gena regulirana je na mnogim razinama (epigenetska, transkripcijska, nuklearna šatling, post-transkripcijska, translacijska i post-translacijska)

Evolucija regulacije gena

Prokariotske stanice mogu regulirati ekspresiju gena samo kontroliranjem količine transkripcije. Kako su eukariotske stanice evoluirale, složenost kontrole ekspresije gena se povećavala. Na primjer, s evolucijom eukariotskih stanica došlo je do razdvajanja važnih staničnih komponenti i staničnih procesa. Formirana je nuklearna regija koja sadrži DNK. Transkripcija i prijevod fizički su razdvojeni u dva različita stanična odjeljka. Stoga je postalo moguće kontrolirati ekspresiju gena regulacijom transkripcije u jezgri, a također i kontrolom razine RNA i translacije proteina prisutnih izvan jezgre.

Neki su stanični procesi proizašli iz potrebe organizma da se brani. Stanični procesi poput utišavanja gena razvili su se kako bi zaštitili stanicu od virusnih ili parazitskih infekcija. Kada bi stanica mogla brzo isključiti ekspresiju gena na kratko vrijeme, mogla bi preživjeti infekciju kada drugi organizmi ne bi mogli. Stoga je organizam razvio novi proces koji mu je pomogao da preživi i mogao je taj novi razvoj prenijeti na potomstvo.


Gledaj video: VRAĆA VID U NORMALU!!! RIJEŠITE SE BOLESTI OKA! (Kolovoz 2022).