Informacija

Može li se metilacija iz DNK kopirati u RNA tijekom transkripcije?

Može li se metilacija iz DNK kopirati u RNA tijekom transkripcije?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Metilacija na genskom tijelu i 3'UTRs ako se kopira u mRNA može potencijalno regulirati modifikacije nakon transkripcije ili regulaciju ekspresije. Ali nisam siguran da li se održavaju nakon transkripcije ili da li dobivaju svu de-novo metilaciju.


Ne vjerujem da bi se išta trebalo promijeniti u većini transkripcije DNK->RNA. Metilacija DNA obično se događa na strani citozina koja nije Watson crick tako da ne bi trebala utjecati na sparivanje baza.

Međutim, postoji nekoliko hipotetskih situacija koje bi rezultirale promjenama transkribirane RNA. Sponatna deaminacija 4' amina pretvorila bi bazu u uracil. Ako postoji dodatni 5' metil, 5-metiluracil bi se prepoznao kao timin.

(uredi) Razgovarao sam s nekoliko ljudi iz genomike o ovoj temi i pokazalo se da je M5Cytosine vrlo otporan na deaminaciju zbog prisutnosti metilne skupine. Kao rezultat toga, primjer koji sam upravo opisao je zapravo vrlo rijedak.

Deaminacija 5mcitozina u timin

Druga situacija bi bila pogreške u DNK lekturi. Utječe li 5mCytosine na vjernost RNA polimeraze? Iskreno ne znam, ali vrijedilo bi ispitati.


Postoji članak u PNAS Conservation and diverction in eukariotske DNA metilacije koji je koristio:

sekvenciranje sljedeće generacije za istraživanje uzoraka metilacije DNA u osam divergentnih vrsta, uključujući zelene alge, biljke cvjetnice, kukce i kralježnjake. Njihovi podaci omogućili su sveobuhvatnu usporedbu profila metilacije cijelog genoma u biljnom i životinjskom carstvu, otkrivajući i očuvane i divergentne značajke metilacije DNA u eukariota.

Dakle, postoji neka konzervacija.


Metilacija

U DNK su zabilježene tri vrste prirodne metilacije. Citozin se može modificirati ili na prstenu da nastane 5-metilcitozin ili na egzocikličkoj amino skupini da nastane N4-metilcitozin. Adenin se može modificirati da nastane N6-metiladenin. N 4 -metilcitozin i N 6 -metiladenin nalaze se samo u bakterijama i arhejama, dok je 5-metilcitozin široko rasprostranjen. Posebni enzimi zvani DNA metiltransferaze odgovorni su za ovu metilaciju, oni prepoznaju specifične sekvence unutar molekule DNA tako da se modificira samo podskup baza. Druge metilacije baza ili deoksiriboze ponekad izazivaju karcinogeni. One obično dovode do pogrešnog sparivanja baza tijekom replikacije i moraju se ukloniti kako ne bi postale mutagene.

Prirodna metilacija ima mnoge stanične funkcije. U bakterijama i arhejama, metilacija čini bitan dio imunološkog sustava štiteći molekule DNA od fragmentacije restrikcijskim endonukleazama. U nekim organizmima metilacija pomaže eliminirati netočne bazne sekvence uvedene tijekom replikacije DNA. Označavanjem roditeljskog lanca metilnom grupom, stanični mehanizam poznat kao sustav popravljanja neusklađenosti razlikuje novo replicirani lanac u kojem se pojavljuju pogreške i ispravan slijed na lancu šablona. U viših eukariota, 5-metilcitozin kontrolira mnoge stanične fenomene sprječavajući transkripciju DNK. Također se vjeruje da metilacija signalizira utiskivanje, proces u kojem se neki geni naslijeđeni od jednog roditelja selektivno inaktiviraju. Ispravna metilacija također može potisnuti ili aktivirati ključne gene koji kontroliraju razvoj embrija. S druge strane, 5-metilcitozin je potencijalno mutagen jer timin proizveden tijekom procesa metilacije pretvara C:G parove u T:A parove. Kod sisavaca, metilacija se odvija selektivno unutar dinukleotidne sekvence CG - rijetka sekvenca, vjerojatno zato što je izgubljena mutacijom. U mnogim vrstama raka, mutacije se nalaze u ključnim genima na CG dinukleotidima.


Sadržaj

Krajolik metilacije DNK kralježnjaka vrlo je specifičan u usporedbi s drugim organizmima. U sisavaca je oko 75% CpG dinukleotida metilirano u somatskim stanicama, [18] a metilacija DNA se pojavljuje kao zadano stanje koje se mora posebno isključiti s definiranih lokacija. [15] [19] Nasuprot tome, genom većine biljaka, beskralježnjaka, gljiva ili protista pokazuje "mozaične" obrasce metilacije, gdje su ciljani samo specifični genomski elementi, a karakterizira ih izmjena metiliranih i nemetiliranih domena. [20] [21]

Visoka CpG metilacija u genomima sisavaca ima evolucijsku cijenu jer povećava učestalost spontanih mutacija. Gubitak amino skupina javlja se s velikom učestalošću za citozine, s različitim posljedicama ovisno o njihovoj metilaciji. Metilirani C ostaci spontano se deaminiraju da tvore T ostatke tijekom vremena, stoga se CpG dinukleotidi stalno deaminiraju u TpG dinukleotide, što je dokazano nedovoljnom zastupljenošću CpG dinukleotida u ljudskom genomu (javljaju se na samo 21% očekivane učestalosti). [22] (S druge strane, spontana deaminacija nemetiliranih C ostataka dovodi do stvaranja U ostataka, promjene koju stanica brzo prepoznaje i popravlja.)

CpG otoci Uredi

U sisavaca, jedina iznimka za ovo globalno smanjenje CpG nalazi se u specifičnoj kategoriji sekvenci bogatih GC i CpG nazvanih CpG otoci koji su općenito nemetilirani i stoga zadržali očekivani sadržaj CpG. [23] CpG otoci se obično definiraju kao regije s: 1) duljinom većom od 200 bp, 2) sadržajem G+C većim od 50%, 3) omjerom opaženog i očekivanog CpG veći od 0,6, iako su ponekad druge definicije korišteni. [24] Isključujući ponovljene sekvence, postoji oko 25 000 CpG otoka u ljudskom genomu, od kojih je 75% manje od 850 bp. [22] Oni su glavne regulatorne jedinice i oko 50% CpG otoka nalazi se u promotorskim regijama gena, dok još 25% leži u genskim tijelima, često služeći kao alternativni promotori. Recipročno, oko 60-70% ljudskih gena ima CpG otok u svojoj promotorskoj regiji. [25] [26] Većina CpG otoka je konstitutivno nemetilirana i obogaćena za permisivnu modifikaciju kromatina kao što je metilacija H3K4. U somatskim tkivima samo je 10% CpG otoka metilirano, a većina ih se nalazi u intergenskim i intragenskim regijama.

Represija CpG-gustih promotora Uredi

Metilacija DNA je vjerojatno bila prisutna u određenoj mjeri kod vrlo ranih predaka eukariota. U gotovo svakom analiziranom organizmu, metilacija u promotorskim regijama negativno korelira s ekspresijom gena. [20] [27] CpG gusti promotori aktivno transkribiranih gena nikada nisu metilirani, ali, recipročno, transkripcijski tihi geni ne moraju nužno nositi metilirani promotor. Kod miševa i ljudi, oko 60-70% gena ima CpG otok u svojoj promotorskoj regiji i većina tih CpG otoka ostaje nemetilirana neovisno o transkripcijskoj aktivnosti gena, kako u diferenciranim tako i u nediferenciranim tipovima stanica. [28] [29] Treba napomenuti, dok je metilacija DNA CpG otoka nedvosmisleno povezana s transkripcijskom represijom, funkcija metilacije DNA u promotorima siromašnim CG ostaje nejasna, iako postoji malo dokaza da bi mogla biti funkcionalno relevantna. [30]

Metilacija DNA može utjecati na transkripciju gena na dva načina. Prvo, sama metilacija DNA može fizički spriječiti vezanje transkripcijskih proteina na gen, [31] i drugo, i vjerojatno važnije, metilirana DNA može biti vezana proteinima poznatim kao proteini domene za vezanje metil-CpG (MBD). MBD proteini zatim regrutiraju dodatne proteine ​​na lokus, kao što su histon deacetilaze i drugi proteini za remodeliranje kromatina koji mogu modificirati histone, tvoreći tako kompaktan, neaktivan kromatin, nazvan heterokromatin. Ova veza između metilacije DNA i strukture kromatina vrlo je važna. Konkretno, gubitak metil-CpG-vezujućeg proteina 2 (MeCP2) je impliciran u Rettov sindrom, a metil-CpG-vezujuća proteinska domena 2 (MBD2) posreduje u utišavanju transkripcije hipermetiliranih gena u "raku".

Potiskivanje prijenosnih elemenata Uredi

Metilacija DNA moćan je transkripcijski represor, barem u CpG gustom kontekstu. Čini se da je transkripcijska represija gena koji kodiraju protein u biti ograničena na vrlo specifične klase gena koji moraju biti tihi trajno i u gotovo svim tkivima. Dok metilacija DNA nema fleksibilnost potrebnu za fino podešavanje genske regulacije, njezina je stabilnost savršena da osigura trajno utišavanje prijenosnih elemenata. [32] Kontrola transpozona jedna je od najstarijih funkcija metilacije DNA koju dijele životinje, biljke i više protista. [33] Čak se sugerira da je metilacija DNA evoluirala upravo u tu svrhu. [34]

Proširenje genoma Uredi

Poznato je da je metilacija DNA prijenosnih elemenata povezana s ekspanzijom genoma. Međutim, evolucijski pokretač ekspanzije genoma ostaje nepoznat. Postoji jasna korelacija između veličine genoma i CpG, što sugerira da je metilacija DNA prijenosnih elemenata dovela do zamjetnog povećanja mase DNA. [35]

Metilacija genskog tijela visoko transkribiranih gena Uredi

Funkcija koja se čini još očuvanijom od utišavanja transposona u pozitivnoj je korelaciji s ekspresijom gena. U gotovo svim vrstama kod kojih je prisutna metilacija DNA, metilacija DNA posebno je obogaćena u tijelu visoko transkribiranih gena. [20] [27] Funkcija metilacije genskog tijela nije dobro shvaćena. Brojni dokazi sugeriraju da bi mogao regulirati spajanje [36] i potisnuti aktivnost intragenih transkripcijskih jedinica (kriptičkih promotora ili prijenosnih elemenata). [37] Čini se da je metilacija genskog tijela usko povezana s metilacijom H3K36. Kod kvasca i sisavaca, metilacija H3K36 je visoko obogaćena u tijelu visoko transkribiranih gena. Barem u kvascu, H3K36me3 regrutira enzime kao što su histon deacetilaze za kondenzaciju kromatina i sprječavanje aktivacije kriptičnih početnih mjesta. [38] U sisavaca, DNMT3a i DNMT3b PWWP domena veže se na H3K36me3 i dva enzima se regrutiraju u tijelo aktivno transkribiranih gena.

Tijekom embrionalnog razvoja Uredi

Obrasci metilacije DNA uvelike se brišu i zatim ponovno uspostavljaju između generacija kod sisavaca. Gotovo sve metilacije od roditelja se brišu, prvo tijekom gametogeneze, a opet u ranoj embriogenezi, pri čemu se svaki put događa demetilacija i remetilacija. Demetilacija u ranoj embriogenezi događa se u predimplantacijskom razdoblju u dvije faze – u početku u zigoti, zatim tijekom prvih nekoliko embrionalnih ciklusa replikacije morule i blastule. Val metilacije tada se događa tijekom faze implantacije embrija, s CpG otocima zaštićenim od metilacije. To rezultira globalnom represijom i omogućuje ekspresiju gena za održavanje kućanstva u svim stanicama. U postimplantacijskom stadiju, obrasci metilacije su specifični za stadij i tkivo, s promjenama koje bi definirale svaki pojedinačni tip stanice koje traju stabilno tijekom dugog razdoblja. [39]

Dok metilacija DNA nije potrebna po sebi za utišavanje transkripcije, ipak se smatra da predstavlja "zaključano" stanje koje definitivno inaktivira transkripciju. Konkretno, čini se da je metilacija DNA kritična za održavanje monoalelnog utišavanja u kontekstu genomskog utiskivanja i inaktivacije X kromosoma. [40] [41] U tim slučajevima, izraženi i tihi aleli razlikuju se po statusu metilacije, a gubitak metilacije DNA rezultira gubitkom otiskivanja i ponovne ekspresije Xist u somatskim stanicama. Tijekom embrionalnog razvoja, nekoliko gena mijenja svoj status metilacije, uz važnu iznimku mnogih gena specifično izraženih u zametnoj liniji. [42] Čini se da je metilacija DNA apsolutno potrebna u diferenciranim stanicama, budući da nokautiranje bilo koje od tri kompetentne DNA metiltransferaze rezultira embrionalnom ili postporođajnom smrtnošću. Suprotno tome, metilacija DNA nezaobilazna je u nediferenciranim tipovima stanica, kao što su unutarnja stanična masa blastociste, primordijalne zametne stanice ili embrionalne matične stanice. Budući da se čini da metilacija DNA izravno regulira samo ograničen broj gena, ostaje otvoreno pitanje koliko točno odsutnost metilacije DNA uzrokuje smrt diferenciranih stanica.

Zbog fenomena genomskog otiska, genomi majke i oca su različito obilježeni i moraju se pravilno reprogramirati svaki put kada prođu kroz zametnu liniju. Stoga, tijekom gametogeneze, primordijalne zametne stanice moraju imati svoje izvorne biparentalne uzorke metilacije DNA izbrisane i ponovno uspostavljene na temelju spola roditelja prenositelja. Nakon oplodnje, očevi i majčinski genomi su ponovno demetilirani i remetilirani (osim za različito metilirane regije povezane s utisnutim genima). Ovo reprogramiranje je vjerojatno potrebno za totipotentnost novonastalog embrija i brisanje stečenih epigenetskih promjena. [43]

U raku Uredi

U mnogim procesima bolesti, kao što je rak, CpG otoci promotora gena dobivaju abnormalnu hipermetilaciju, što rezultira utišavanjem transkripcije koje mogu naslijediti stanice kćeri nakon stanične diobe. [44] Promjene metilacije DNA prepoznate su kao važna komponenta razvoja raka. Hipometilacija, općenito, nastaje ranije i povezana je s kromosomskom nestabilnošću i gubitkom otiskivanja, dok je hipermetilacija povezana s promotorima i može nastati kao sekundarno utišavanje gena (onkogenski supresor), ali može biti meta za epigenetsku terapiju. [45]

Globalna hipometilacija također je uključena u razvoj i napredovanje raka kroz različite mehanizme. [46] Tipično, postoji hipermetilacija gena supresora tumora i hipometilacija onkogena. [47]

Općenito, u progresiji do raka, stotine gena se ušutkaju ili aktiviraju. Iako se utišavanje nekih gena kod karcinoma događa mutacijom, veliki udio utišavanja kancerogenih gena rezultat je promijenjene metilacije DNA (vidi metilacija DNA kod raka). Metilacija DNA koja uzrokuje utišavanje kod raka obično se događa na više mjesta na CpG otocima koji su prisutni u promotorima gena koji kodiraju proteine.

Promijenjena ekspresija mikroRNA također utišava ili aktivira mnoge gene u progresiji do raka (vidi mikroRNA u raku). Promijenjena ekspresija mikroRNA događa se hiper/hipo-metilacijom CpG mjesta u CpG otocima u promotorima koji kontroliraju transkripciju mikroRNA.

Utišavanje gena za popravak DNA metilacijom CpG otoka u njihovim promotorima čini se posebno važnim u progresiji do raka (vidi metilaciju gena za popravak DNA kod raka).

Kod ateroskleroze Edit

Epigenetske modifikacije kao što je metilacija DNA upletene su u kardiovaskularne bolesti, uključujući aterosklerozu. U životinjskim modelima ateroskleroze, vaskularno tkivo, kao i krvne stanice kao što su mononuklearne krvne stanice, pokazuju globalnu hipometilaciju s genskim specifičnim područjima hipermetilacije. Polimorfizmi metilacije DNA mogu se koristiti kao rani biomarker ateroskleroze budući da su prisutni prije uočavanja lezija, što može pružiti rano sredstvo za otkrivanje i prevenciju rizika. [48]

Dvije vrste stanica koje su ciljane za polimorfizme metilacije DNA su monociti i limfociti, koji doživljavaju ukupnu hipometilaciju. Jedan od predloženih mehanizama iza ove globalne hipometilacije je povišena razina homocisteina koja uzrokuje hiperhomocisteinemiju, poznati čimbenik rizika za kardiovaskularne bolesti. Visoke razine homocisteina u plazmi inhibiraju DNA metiltransferaze, što uzrokuje hipometilaciju. Hipometilacija DNA utječe na gene koji mijenjaju proliferaciju stanica glatkih mišića, uzrokuju disfunkciju endotelnih stanica i povećavaju upalne medijatore, a svi su oni ključni u stvaranju aterosklerotskih lezija. [49] Visoke razine homocisteina također rezultiraju hipermetilacijom CpG otoka u promotorskoj regiji alfa (ERα) gena estrogenskog receptora, uzrokujući njegovu smanjenje. [50] ERα štiti od ateroskleroze zbog svog djelovanja kao supresora rasta, uzrokujući da glatke mišićne stanice ostanu u stanju mirovanja. [51] Hipermetilacija promotora ERα tako omogućuje prekomjernu proliferaciju stanica glatkih mišića intime i doprinosi razvoju aterosklerotske lezije. [52]

Drugi gen koji doživljava promjenu statusa metilacije kod ateroskleroze je monokarboksilatni transporter (MCT3), koji proizvodi protein odgovoran za transport laktata i drugih ketonskih tijela iz mnogih tipova stanica, uključujući stanice glatkih mišića krvnih žila. U bolesnika s aterosklerozom dolazi do povećanja metilacije CpG otoka u eksonu 2, što smanjuje ekspresiju proteina MCT3. Smanjenje regulacije MCT3 otežava transport laktata i značajno povećava proliferaciju stanica glatkih mišića, što dodatno doprinosi aterosklerotskoj leziji. Eks vivo eksperiment korištenjem agensa za demetilaciju Decitabina (5-aza-2-deoksicitidin) pokazao je da inducira ekspresiju MCT3 na način ovisan o dozi, budući da su sva hipermetilirana mjesta na otoku egzona 2 CpG postala demetilirana nakon tretmana. Ovo može poslužiti kao novo terapeutsko sredstvo za liječenje ateroskleroze, iako dosad nisu provedena istraživanja na ljudima. [53]

Kod zatajenja srca Uredi

Uz gore opisanu aterosklerozu, identificirane su specifične epigenetske promjene u zatajenom ljudskom srcu. To može varirati ovisno o etiologiji bolesti. Na primjer, kod ishemijskog zatajenja srca promjene metilacije DNA povezane su s promjenama u ekspresiji gena koje mogu usmjeravati ekspresiju gena povezanu s promjenama u metabolizmu srca za koje se zna da se javljaju. [54] Dodatni oblici zatajenja srca (npr. dijabetička kardiomiopatija) i popratnih bolesti (npr. pretilost) moraju se istražiti kako bi se vidjelo koliko su ti mehanizmi uobičajeni. Najupečatljivije je da su kod zatajenja ljudskog srca ove promjene u metilaciji DNK povezane s rasnim i socioekonomskim statusom koji dodatno utječu na promjenu ekspresije gena, [55] i mogu utjecati na način na koji treba liječiti zatajenje srca pojedinca.

U starenju Uredi

Kod ljudi i drugih sisavaca, razine metilacije DNA mogu se koristiti za točnu procjenu starosti tkiva i tipova stanica, tvoreći točan epigenetski sat. [56]

Longitudinalno istraživanje djece blizanaca pokazalo je da je u dobi između 5 i 10 godina došlo do divergencije uzoraka metilacije zbog okolišnih, a ne genetskih utjecaja. [57] Postoji globalni gubitak metilacije DNA tijekom starenja. [47]

U studiji koja je analizirala kompletne DNA metilome CD4 + T stanica u novorođenčeta, 26-godišnjaka i 103-godišnjaka uočeno je da je gubitak metilacije proporcionalan dobi.[58] Hipometilirani CpG uočeni u DNA stogodišnjaka u usporedbi s novorođenčadi pokrivali su sve genomske odjeljke (promotori, intergenske, introničke i egzonske regije). [59] Međutim, neki geni postaju hipermetilirani s godinama, uključujući gene za estrogenski receptor, p16 i faktor rasta sličan inzulinu 2. [47]

U vježbi Uredi

Pokazalo se da tjelovježba visokog intenziteta rezultira smanjenom metilacijom DNK u skeletnim mišićima. [60] Promotorska metilacija PGC-1α i PDK4 odmah je smanjena nakon vježbanja visokog intenziteta, dok se metilacija PPAR-γ nije smanjila tek tri sata nakon vježbanja. [60] U isto vrijeme, šest mjeseci tjelovježbe kod prethodno sjedilačkih muškaraca srednje dobi rezultiralo je povećanom metilacijom u masnom tkivu. [61] Jedna studija pokazala je moguće povećanje globalne genomske DNA metilacije bijelih krvnih stanica s većom tjelesnom aktivnošću kod ne-Hispanjolaca. [62]

U diferencijaciji B-stanica Uredi

Studija koja je istraživala metilom B stanica tijekom njihovog ciklusa diferencijacije, korištenjem bisulfitnog sekvenciranja cijelog genoma (WGBS), pokazala je da postoji hipometilacija od najranijih do najdiferenciranijih stadija. Najveća razlika u metilaciji je između stadija B stanica zametnog centra i B stanica memorije. Nadalje, ova studija je pokazala da postoji sličnost između tumora B stanica i dugovječnih B stanica u njihovim potpisima metilacije DNA. [17]

U mozgu Uredi

Dvije recenzije sažimaju dokaze da su promjene metilacije DNA u neuronima mozga važne za učenje i pamćenje. [63] [64] Kontekstualno uvjetovanje straha (oblik asocijativnog učenja) kod životinja, kao što su miševi i štakori, brzo je i iznimno je robusno u stvaranju sjećanja. [65] Kod miševa [66] i štakora [67] kontekstualno uvjetovanje straha, unutar 1-24 sata, povezano je s promijenjenim metilacijama nekoliko tisuća DNA citozina u genima neurona hipokampusa. Dvadeset četiri sata nakon uvjetovanja kontekstualnog straha, 9,2% gena u neuronima hipokampusa štakora je različito metilirano. [67] Kod miševa, [66] kada su ispitani četiri tjedna nakon kondicioniranja, metilacije i demetilacije hipokampusa su vraćene na izvorne naivne uvjete. Hipokampus je potreban za formiranje sjećanja, ali sjećanja se tamo ne pohranjuju. Kod takvih miševa, četiri tjedna nakon uvjetovanja kontekstualnog straha, dogodile su se značajne diferencijalne CpG metilacije i demetilacije u kortikalnim neuronima tijekom održavanja pamćenja, a bilo je 1223 različito metiliranih gena u njihovom prednjem cingularnom korteksu. [66] Čini se da aktivne promjene u metilaciji i demetilaciji neuronske DNA djeluju kao kontrolori sinaptičkog skaliranja i prometa glutamatnih receptora u učenju i formiranju pamćenja. [63]

U stanicama sisavaca, metilacija DNA događa se uglavnom na C5 poziciji CpG dinukleotida i provodi se pomoću dvije opće klase enzimskih aktivnosti – održavanje metilacije i de novo metilacija. [68]

Održavanje aktivnosti metilacije potrebno je za očuvanje metilacije DNA nakon svakog ciklusa replikacije stanične DNA. Bez DNA metiltransferaze (DNMT), sam stroj za replikaciju proizveo bi lančiće kćeri koji su nemetilirani i s vremenom bi doveli do pasivne demetilacije. DNMT1 je predložena metiltransferaza za održavanje koja je odgovorna za kopiranje uzoraka metilacije DNA na lančiće kćeri tijekom replikacije DNK. Mišji modeli s obje kopije DNMT1 izbrisane su embrionalno smrtonosni otprilike 9. dana, zbog zahtjeva aktivnosti DNMT1 za razvoj u stanicama sisavaca.

Smatra se da su DNMT3a i DNMT3b de novo metiltransferaze koje uspostavljaju obrasce metilacije DNA u ranom razvoju. DNMT3L je protein koji je homologan ostalim DNMT3, ali nema katalitičku aktivnost. Umjesto toga, DNMT3L pomaže de novo metiltransferaze povećavajući njihovu sposobnost vezanja za DNA i stimulirajući njihovu aktivnost. Miševi i štakori imaju treću funkciju de novo enzim metiltransferaze nazvan DNMT3C, koji je evoluirao kao paralog Dnmt3b tandemskim umnožavanjem kod zajedničkog pretka glodavaca Muroidea. DNMT3C katalizira metilaciju promotora prijenosnih elemenata tijekom rane spermatogeneze, aktivnost za koju se pokazalo da je ključna za njihovu epigenetsku represiju i mušku plodnost. [69] [70] Još uvijek nije jasno da li se kod drugih sisavaca koji nemaju DNMT3C (kao ljudi) oslanjaju na DNMT3B ili DNMT3A za de novo metilacija prijenosnih elemenata u zametnoj liniji. Konačno, DNMT2 (TRDMT1) je identificiran kao homolog DNA metiltransferaze, koji sadrži svih 10 motiva sekvenci zajedničkih za sve DNA metiltransferaze, međutim, DNMT2 (TRDMT1) ne metilira DNA, već umjesto toga metilira citozin-38 u petlji antikodonske kiseline aspartinske kiseline . [71]

Budući da su mnogi geni supresori tumora utišani metilacijom DNA tijekom karcinogeneze, bilo je pokušaja da se ti geni ponovno eksprimiraju inhibiranjem DNMT-a. 5-Aza-2'-deoksicitidin (decitabin) je analog nukleozida koji inhibira DNMT tako što ih zarobljava u kovalentnom kompleksu na DNA sprječavajući β-eliminacijski korak katalize, što rezultira degradacijom enzima. Međutim, da bi decitabin bio aktivan, mora se ugraditi u genom stanice, što može uzrokovati mutacije u stanicama kćeri ako stanica ne umre. Osim toga, decitabin je toksičan za koštanu srž, što ograničava veličinu njegovog terapeutskog prozora. Te su zamke dovele do razvoja antisense RNA terapija koje ciljaju na DNMT razgradnjom njihovih mRNA i sprječavanjem njihovog prevođenja. Međutim, trenutno je nejasno je li ciljanje samo na DNMT1 dovoljno za reaktivaciju tumorskih supresorskih gena utišanih metilacijom DNA.

Značajan napredak postignut je u razumijevanju metilacije DNA u modelnoj biljci Arabidopsis thaliana. Metilacija DNA u biljkama razlikuje se od one kod sisavaca: dok se metilacija DNA kod sisavaca uglavnom događa na citozinskom nukleotidu na mjestu CpG, u biljkama citozin može biti metiliran na mjestima CpG, CpHpG i CpHpH, gdje H predstavlja bilo koju jezgru, ali ne i guanin . općenito, Arabidopsis DNA je visoko metilirana, analiza masene spektrometrije procijenila je da je 14% citozina modificirano. [8] : sažetak

Glavnica Arabidopsis Enzimi DNA metiltransferaze, koji prenose i kovalentno vezuju metilne skupine na DNA, su DRM2, MET1 i CMT3. I DRM2 i MET1 proteini dijele značajnu homologiju s metiltransferazama DNMT3 i DNMT1 sisavaca, dok je protein CMT3 jedinstven za biljno carstvo. Trenutno postoje dvije klase DNA metiltransferaza: 1) the de novo klasa ili enzimi koji stvaraju nove oznake metilacije na DNA 2) klasa održavanja koja prepoznaje oznake metilacije na roditeljskom lancu DNA i prenosi novu metilaciju na lance kćeri nakon replikacije DNA. DRM2 je jedini enzim koji je impliciran kao a de novo DNA metiltransferaza. Također se pokazalo da DRM2, zajedno s MET1 i CMT3, sudjeluje u održavanju oznaka metilacije kroz replikaciju DNK. [72] Druge DNA metiltransferaze su izražene u biljkama, ali nemaju poznatu funkciju (vidi bazu podataka kromatina).

Nije jasno kako stanica određuje mjesta de novo DNA metilacija, ali dokazi sugeriraju da je za mnoga (iako ne sva) mjesta uključena RNA-usmjerena metilacija DNA (RdDM). U RdDM, specifični RNA transkripti se proizvode iz genomske DNA šablone, a ta RNA tvori sekundarne strukture koje se nazivaju dvolančane RNA molekule. [73] Dvolančane RNA, bilo putem male interferirajuće RNA (siRNA) ili mikroRNA (miRNA) puteva, usmjeravaju de-novo DNA metilaciju izvorne genomske lokacije koja je proizvela RNA. [73] Smatra se da je ova vrsta mehanizma važna u staničnoj obrani od RNA virusa i/ili transpozona, od kojih oba često tvore dvolančanu RNA koja može biti mutagena za genom domaćina. Metiliranjem svojih genomskih lokacija, kroz još uvijek slabo shvaćeni mehanizam, oni su isključeni i više nisu aktivni u stanici, štiteći genom od njihovog mutagenog učinka. Nedavno je opisano da je metilacija DNA glavna odrednica formiranja embriogenih kultura iz eksplantata u drvenastim biljkama i smatra se glavnim mehanizmom koji objašnjava slab odgovor zrelih eksplantata na somatsku embriogenezu u biljkama (Isah 2016).

Različiti redovi insekata pokazuju različite obrasce metilacije DNK, od gotovo nevidljivih razina kod muha do niskih razina u leptira i viših kod pravih kukaca i nekih žohara (do 14% svih CG mjesta u Blattella asahinai). [74]

Funkcionalna metilacija DNK otkrivena je u pčelama. [75] [76] Oznake metilacije DNK uglavnom su na tijelu gena, a trenutna mišljenja o funkciji metilacije DNK je regulacija gena alternativnim spajanjem [77]

Razine metilacije DNK u Drosophila melanogaster gotovo se ne mogu otkriti. [78] Osjetljive metode primijenjene na DNK Drosophila Predlažu razine u rasponu od 0,1-0,3% ukupnog citozina. [79] Čini se da se ova niska razina metilacije [80] nalazi u obrascima genomskog slijeda koji se vrlo razlikuju od uzoraka viđenih kod ljudi ili drugih životinjskih ili biljnih vrsta do danas. Genomska metilacija u D. melanogaster pronađena je na specifičnim kratkim motivima (koncentrirana u specifičnim motivima sekvence od 5 baza koji su bogati CA- i CT, ali su osiromašeni gvaninom) i neovisna je o aktivnosti DNMT2. Nadalje, vrlo osjetljivi pristupi masene spektrometrije, [81] sada su pokazali prisutnost niske (0,07%), ali značajne razine metilacije adenina tijekom najranijih faza embriogeneze Drosophila.

Mnoge gljive imaju nisku razinu (0,1 do 0,5%) metilacije citozina, dok druge gljive imaju čak 5% metiliranog genoma. [82] Čini se da ova vrijednost varira i među vrstama i među izolatima iste vrste. [83] Također postoje dokazi da metilacija DNA može biti uključena u kontrolu ekspresije gena u gljivama specifičnu za stanje. [ potreban je citat ] Međutim, na granici detekcije od 250 atomola korištenjem ultra-visoke osjetljive masene spektrometrije metilacija DNA nije potvrđena u jednostaničnim vrstama kvasca kao što su Saccharomyces cerevisiae ili Schizosaccharomyces pombe, što ukazuje da kvasci ne posjeduju ovu DNK modifikaciju. [8] : sažetak

Iako pivski kvasac (Saccharomyces), fisijski kvasac (Schizosaccharomyces), i Aspergillus flavus [84] nemaju uočljivu metilaciju DNA, model filamentoznih gljiva Neurospora crassa ima dobro okarakteriziran sustav metilacije. [85] Nekoliko gena kontrolira metilaciju u Neurospori i mutacija DNA metil transferaze, dim-2, eliminira svu metilaciju DNK, ali ne utječe na rast ili spolnu reprodukciju. Dok Neurospora genom ima vrlo malo ponovljene DNK, polovica metilacije događa se u ponovljenoj DNK uključujući transposon relikte i centromernu DNK. Sposobnost procjene drugih važnih fenomena u genetskoj pozadini s nedostatkom DNA metilaze čini Neurospora važan sustav u kojem se proučava metilacija DNA.

Metilacija DNA uglavnom je odsutna u Dictyostelium discoidium [86] gdje se čini da se javlja u oko 0,006% citozina. [5] Nasuprot tome, metilacija DNA je široko rasprostranjena u Physarum polycephalum [87] gdje 5-metilcitozin čini čak 8% ukupnog citozina [4]

Metilacija adenina ili citozina dio je sustava restrikcijskih modifikacija mnogih bakterija, u kojem se specifične sekvence DNA periodično metiliraju kroz genom. Metilaza je enzim koji prepoznaje specifičnu sekvencu i metilira jednu od baza u toj sekvenci ili blizu nje. Strane DNK (koje nisu metilirane na ovaj način) koje se unose u stanicu razgrađuju se restrikcijskim enzimima specifičnim za sekvencu i cijepaju. Ovi restrikcijski enzimi ne prepoznaju bakterijsku genomsku DNK. Metilacija nativne DNK djeluje kao vrsta primitivnog imunološkog sustava, dopuštajući bakterijama da se zaštite od infekcije bakteriofagom.

32 kDa koji ne pripada sustavu ograničenja/modifikacije. Slijed prepoznavanja cilja za E coli Dam je GATC, jer se metilacija događa na poziciji N6 adenina u ovoj sekvenci (G meATC). Tri bazna para koja okružuju svaku stranu ovog mjesta također utječu na vezanje DNA-Dam. Brana igra nekoliko ključnih uloga u bakterijskim procesima, uključujući popravak neusklađenosti, vrijeme replikacije DNK i ekspresiju gena. Kao rezultat replikacije DNA, status GATC mjesta u E coli genom se mijenja iz potpuno metiliranog u hemimetiliran. To je zato što adenin uveden u novi lanac DNK nije metiliran. Ponovna metilacija se događa unutar dvije do četiri sekunde, a tijekom tog vremena se popravljaju greške replikacije u novom lancu. Metilacija, ili njezina odsutnost, je biljeg koji omogućuje staničnom aparatu za popravak da razlikuje predložak i nastajuće niti. Pokazalo se da promjena aktivnosti Dam u bakterijama rezultira povećanom stopom spontanih mutacija. Vijabilnost bakterija je ugrožena u mutantima brana kojima također nedostaju neki drugi enzimi za popravak DNK, što pruža dodatne dokaze o ulozi Dam u popravku DNK.

Jedna regija DNK koja dulje zadržava svoj hemimetilirani status je podrijetlo replikacije, koje ima obilje GATC mjesta. Ovo je središnje za bakterijski mehanizam za određivanje vremena replikacije DNK. SeqA se veže za ishodište replikacije, sekvestrirajući ga i na taj način sprječavajući metilaciju. Budući da su hemimetilirani izvori replikacije neaktivni, ovaj mehanizam ograničava replikaciju DNA na jednom po staničnom ciklusu.

Ekspresija određenih gena, na primjer, onih koji kodiraju za ekspresiju pilusa u E coli, reguliran je metilacijom GATC mjesta u promotorskoj regiji genskog operona. Okolišni uvjeti stanica neposredno nakon replikacije DNA određuju je li Dam blokiran od metiliranja regije proksimalno ili distalno od promotorske regije. Nakon što se stvori obrazac metilacije, transkripcija gena pilusa je zaključana u uključenom ili isključenom položaju dok se DNK ponovno ne replicira. U E coli, ti pili operoni imaju važnu ulogu u virulenciji kod infekcija mokraćnog sustava. Predloženo je [ od koga? ] da inhibitori Dam mogu djelovati kao antibiotici.

S druge strane, DNA citozin metilaza cilja CCAGG i CCTGG mjesta kako bi metilirala citozin na poziciji C5 (C meC(A/T) GG). Drugi enzim metilaza, EcoKI, uzrokuje metilaciju adenina u sekvencama AAC(N6)GTGC i GCAC(N6)GTT.

U Clostridioides difficile, pokazalo se da metilacija DNA na ciljnom motivu CAAAAA utječe na sporulaciju, ključni korak u prijenosu bolesti, kao i na duljinu stanice, stvaranje biofilma i kolonizaciju domaćina. [89]

Molekularno kloniranje Uredi

Većina sojeva koje koriste molekularni biolozi su derivati E coli K-12, i posjeduju i Dam i Dcm, ali postoje komercijalno dostupni sojevi koji su dam-/dcm- (nedostatak aktivnosti bilo koje metilaze). Zapravo, moguće je demetilirati DNK ekstrahiranu iz sojeva dam+/dcm+ transformirajući je u dam-/dcm- sojeve. To bi pomoglo probaviti sekvence koje restrikcijski enzimi osjetljivi na metilaciju ne prepoznaju. [90] [91]

Restrikcijski enzim DpnI može prepoznati 5'-GmeATC-3' mjesta i probaviti metiliranu DNK. Budući da je tako kratak motiv, često se pojavljuje u sekvencama slučajno, i kao takav njegova je primarna upotreba za istraživače razgradnja DNA šablona nakon PCR-a (PCR proizvodi nemaju metilaciju, jer u reakciji nema metilaza). Slično, neki komercijalno dostupni restrikcijski enzimi osjetljivi su na metilaciju na svojim srodnim restrikcijskim mjestima i moraju se, kao što je prethodno spomenuto, koristiti na DNA propuštenoj kroz dam-/dcm-soj kako bi se omogućilo rezanje.

Metilacija DNA može se otkriti sljedećim testovima koji se trenutno koriste u znanstvenim istraživanjima: [92]

    je vrlo osjetljiva i pouzdana analitička metoda za otkrivanje metilacije DNA. MS, općenito, međutim, nije informativan o kontekstu sekvencije metilacije, stoga je ograničeno u proučavanju funkcije ove modifikacije DNA. , koji se temelji na kemijskoj reakciji natrijevog bisulfita s DNA koja pretvara nemetilirane citozine CpG dinukleotida u uracil ili UpG, nakon čega slijedi tradicionalni PCR. [93] Međutim, metilirani citozini neće biti pretvoreni u ovom procesu, a primeri su dizajnirani da preklapaju CpG mjesto od interesa, što omogućuje određivanje statusa metilacije kao metilirane ili nemetilirane. , također poznat kao BS-Seq, koji je visokopropusna analiza metilacije DNA u cijelom genomu. Temelji se na prethodno spomenutoj konverziji genomske DNK natrij bisulfitom, koja se zatim sekvencira na platformi za sekvenciranje sljedeće generacije. Dobivene sekvence se zatim ponovno usklađuju s referentnim genomom kako bi se odredio status metilacije CpG dinukleotida na temelju nepodudarnosti koje su rezultat pretvorbe nemetiliranih citozina u uracil. , također poznat kao RRBS poznaje nekoliko radnih protokola. Prvi RRBS protokol nazvan je RRBS i ima za cilj oko 10% metiloma, potreban je referentni genom. Kasnije je došlo više protokola koji su mogli sekvencirati manji dio genoma i višestruko multipleksiranje uzoraka. EpiGBS je bio prvi protokol u kojem ste mogli multipleksirati 96 uzoraka u jednoj traci Illumina sekvenciranja i gdje referentni genom više nije bio potreban. De novo referentna konstrukcija iz čitanja Watsona i Cricka učinila je probir populacije SNP-a i SMP-a istovremeno činjenicom.
  • HELP test, koji se temelji na diferencijalnoj sposobnosti restrikcijskih enzima da prepoznaju i cijepaju metilirana i nemetilirana mjesta CpG DNA. , koji se temelji na novoj vrsti enzima – metil-usmjerenim DNA endonukleazama specifičnim za mjesto, koje hidroliziraju samo metiliranu DNA. testovima, koji se temelji na sposobnosti komercijalno pripremljenih antitijela da se vežu na proteine ​​povezane s metilacijom DNA poput MeCP2. , kompliciran i sada rijetko korišten test koji se temelji na diferencijalnom prepoznavanju restrikcijskih enzima metiliranih i nemetiliranih CpG mjesta, analiza je konceptom slična HELP testu. (MeDIP), analogno imunoprecipitaciji kromatina, imunoprecipitacija se koristi za izolaciju metiliranih fragmenata DNA za unos u metode detekcije DNK kao što su DNA mikronizovi (MeDIP-chip) ili DNA sekvenciranje (MeDIP-seq). DNK tretirane bisulfitom. Ovo je sekvenciranje amplikona napravljenog od normalnog prednjeg primera, ali biotiniliranog reverznog primera za PCR gen izbora. Pirosekvencer zatim analizira uzorak denaturacijom DNK i dodavanjem jednog po jednog nukleotida u smjesu prema sekvenci koju je dao korisnik. Ako postoji nepodudarnost, ona se bilježi i bilježi postotak DNK za koji je nepodudarnost prisutna. To korisniku daje postotak metilacije po CpG otoku.
  • Lagani molekularni test za aktivnost DNA adenin metiltransferaze – test koji se oslanja na specifičnost restrikcijskog enzima DpnI za potpuno metilirana (metilacija adenina) GATC mjesta u oligonukleotidu obilježenom fluoroforom i gasiteljem. Adenin metiltransferaza metilira oligonukleotid čineći ga supstratom za DpnI. Rezanje oligonukleotida pomoću DpnI dovodi do povećanja fluorescencije. [94][95]
  • Southern Blotting osjetljiv na metil sličan je testu HELP, iako koristi Southern blotting tehnike za ispitivanje gen-specifičnih razlika u metilaciji pomoću restrikcijskih digestija. Ova tehnika se koristi za procjenu lokalne metilacije u blizini mjesta vezanja za sondu.
  • MethylCpG Binding Proteini (MBPs) i fuzijski proteini koji sadrže samo metil vezujuću domenu (MBD) koriste se za razdvajanje nativne DNA u metilirane i nemetilirane frakcije. Postotak metilacije pojedinačnih CpG otoka može se odrediti kvantificiranjem količine cilja u svakoj frakciji. [potreban je citat] Iznimno osjetljiva detekcija može se postići u FFPE tkivima s detekcijom temeljenom na abskripciji. Analiza (HRM ili HRMA) je post-PCR analitička tehnika. Ciljana DNK se tretira s natrijevim bisulfitom, koji kemijski pretvara nemetilirane citozine u uracile, dok se metilirani citozini čuvaju. PCR amplifikacija se zatim provodi s primerima dizajniranim da umnože i metilirane i nemetilirane šablone. Nakon ove amplifikacije, visoko metilirane DNA sekvence sadrže veći broj CpG mjesta u usporedbi s nemetiliranim šablonima, što rezultira različitom temperaturom taljenja koja se može koristiti u kvantitativnoj detekciji metilacije. [96][97]
  • Rekonstrukcija drevne DNA metilacije, metoda za rekonstrukciju metilacije DNK visoke razlučivosti iz drevnih uzoraka DNK. Metoda se temelji na prirodnim procesima razgradnje koji se javljaju u drevnoj DNK: s vremenom se metilirani citozini razgrađuju u timine, dok se nemetilirani citozini razgrađuju u uracile. Ova asimetrija u signalima degradacije korištena je za rekonstrukciju potpunih mapa metilacije neandertalaca i denisovana. [98] U rujnu 2019. istraživači su objavili novu metodu za zaključivanje morfoloških osobina iz podataka o metilaciji DNA. Autori su uspjeli pokazati da povezivanje gena koji su niže regulirani na fenotipove monogenih bolesti, gdje su jedna ili dvije kopije gena poremećene, omogućuje

Diferencijalno metilirane regije, genomske su regije s različitim statusima metilacije među više uzoraka (tkiva, stanice, pojedinci ili drugi), smatraju se mogućim funkcionalnim regijama uključenim u regulaciju transkripcije gena. Identifikacija DMR-ova među višestrukim tkivima (T-DMR) pruža sveobuhvatan pregled epigenetskih razlika među ljudskim tkivima. [103] Na primjer, ove metilirane regije koje su jedinstvene za određeno tkivo omogućuju pojedincima da razlikuju tip tkiva, poput sjemena i vaginalne tekućine. Trenutno istraživanje koje su proveli Lee i sur., pokazalo je da su DACT1 i USP49 pozitivno identificirali sjemenu tekućinu ispitivanjem T-DMR-a. [104] Upotreba T-DMR-a pokazala se korisnom u identifikaciji različitih tjelesnih tekućina pronađenih na mjestima zločina. Istraživači u forenzičkom području trenutno traže nove T-DMR-ove u genima koji će se koristiti kao markeri u forenzičkoj DNK analizi. DMR između raka i normalnih uzoraka (C-DMR) pokazuju aberantnu metilaciju u karcinomima. [105] Dobro je poznato da je metilacija DNA povezana s diferencijacijom i proliferacijom stanica. [106] Mnogi DMR-ovi pronađeni su u fazama razvoja (D-DMR) [107] i u reprogramiranom napretku (R-DMR). [108] Osim toga, postoje intra-individualni DMR-ovi (Intra-DMR) s longitudinalnim promjenama u globalnoj metilaciji DNA zajedno s povećanjem dobi dane osobe. [109] Također postoje inter-individualni DMR (Inter-DMR) s različitim obrascima metilacije među više pojedinaca. [110]

QDMR (Quantitative Differentially Methylated Regions) je kvantitativni pristup za kvantificiranje razlike u metilaciji i identifikaciju DMR-ova iz profila metilacije u cijelom genomu prilagođavanjem Shanononove entropije. [111] Priroda QDMR-a bez platforme i vrste čini ga potencijalno primjenjivim na različite podatke o metilaciji. Ovaj pristup pruža učinkovit alat za visokopropusnu identifikaciju funkcionalnih regija uključenih u epigenetsku regulaciju. QDMR se može koristiti kao učinkovit alat za kvantifikaciju razlike u metilaciji i identifikaciju DMR-a u više uzoraka. [112]

Pokazalo se da je analiza skupa gena (poznata kao alati za analizu puteva koji se obično izvode kao što su DAVID, GoSeq ili GSEA) jako pristrana kada se primjenjuje na podatke o metilaciji visoke propusnosti (npr. MeDIP-seq, MeDIP-ChIP, HELP-seq itd.) , a širok raspon studija je stoga pogrešno prijavio hipermetilaciju gena povezanu s razvojem i diferencijacijom, sugerirano je da se to može ispraviti permutacijom oznaka uzorka ili korištenjem statističkog modela za kontrolu razlika u broju CpG sondi / CpG mjesta koja ciljaju svaki gen. [113]

Oznake metilacije DNA – genomske regije sa specifičnim obrascima metilacije u specifičnom biološkom stanju kao što su tkivo, tip stanice, pojedinac – smatraju se mogućim funkcionalnim regijama uključenim u regulaciju transkripcije gena. Iako različite vrste ljudskih stanica mogu imati isti genom, te stanice imaju različite metilome. Sustavna identifikacija i karakterizacija oznaka metilacije u različitim tipovima stanica ključna je za razumijevanje složene regulatorne mreže za određivanje sudbine stanice. Hongbo Liu i sur. predložio je okvir temeljen na entropiji nazvan SMART za integraciju metiloma za sekvenciranje bisulfita cijelog genoma u 42 ljudska tkiva/stanice i identificirao 757 887 segmenata genoma. [114] Gotovo 75% segmenata pokazalo je ujednačenu metilaciju u svim tipovima stanica. Od preostalih 25% segmenata, identificirali su znakove hipo/hipermetilacije specifične za tip stanice koji su specifično hipo/hipermetilirani u manjini tipova stanica koristeći statistički pristup i predstavili atlas ljudskih metilacijskih oznaka. Daljnja analiza je otkrila da su oznake hipometilacije specifične za tip stanice obogaćene H3K27ac i veznim mjestima faktora transkripcije na način specifičan za stanični tip. Konkretno, primijetili su da su oznake hipometilacije specifične za stanični tip povezane sa super-pojačivačima specifičnim za stanični tip koji pokreću ekspresiju gena staničnog identiteta. Ovaj okvir pruža komplementarnu, funkcionalnu oznaku ljudskog genoma i pomaže razjasniti kritične značajke i funkcije hipometilacije specifične za stanični tip.

Alat za analizu i izvješće specifične metilacije na temelju entropije, nazvan "SMART", koji se usredotočuje na integraciju velikog broja DNA metiloma za de novo identifikaciju metilacijskih oznaka specifičnih za tip stanice. Najnovija verzija SMART-a usredotočena je na tri glavne funkcije uključujući de novo identifikaciju diferencijalno metiliranih regija (DMR) segmentacijom genoma, identifikaciju DMR-a iz unaprijed definiranih područja od interesa i identifikaciju različito metiliranih CpG mjesta. [115]

U identifikaciji i otkrivanju tjelesnih tekućina Edit

Metilacija DNA omogućuje analizu nekoliko tkiva u jednom testu, kao i da se male količine tjelesne tekućine identificiraju korištenjem ekstrahirane DNK. Obično su dva pristupa metilacije DNA ili restrikcijski enzimi osjetljivi na metilaciju ili liječenje natrijevim bisulfitom. [116] Metilirani osjetljivi restrikcijski enzimi djeluju cijepanjem specifičnih CpG, citozina i gvanina odvojenih samo jednom fosfatnom skupinom, mjesta prepoznavanja kada je CpG metiliran. Nasuprot tome, nemetilirani citozini se transformiraju u uracil i u tom procesu metilirani citozini ostaju metilirani. Konkretno, profili metilacije mogu pružiti uvid u to kada i kako su tjelesne tekućine ostavljene na mjestu zločina, identificirati vrstu tjelesne tekućine i približnu dob, spol i fenotipske karakteristike počinitelja. [117] Istraživanja ukazuju na različite markere koji se mogu koristiti za metilaciju DNA. Odlučivanje o tome koji marker koristiti za analizu jedan je od prvih koraka identifikacije tjelesnih tekućina. Općenito, markeri se odabiru ispitivanjem prethodno provedenog istraživanja. Odabrani identifikacijski biljezi trebali bi dati pozitivan rezultat za jednu vrstu stanice. Jedan dio kromosoma koji je područje fokusa pri provođenju metilacije DNA su tkivno specifične, diferencijalno metilirane regije, T-DMR. Stupanj metilacije za T-DMR varira ovisno o tjelesnoj tekućini. [117] Istraživački tim razvio je dvostruki sustav markera. Prvi marker je metiliran samo u ciljnoj tekućini, dok je drugi metiliran u ostatku tekućine. [100] Na primjer, ako je biljeg venske krvi A nemetiliran, a biljeg venske krvi B je metiliran u tekućini, to ukazuje na prisutnost samo venske krvi. Nasuprot tome, ako je biljeg venske krvi A metiliran, a biljeg venske krvi B nije metiliran u nekoj tekućini, to znači da je venska krv u mješavini tekućina. Neki primjeri za markere metilacije DNA su Mens1 (menstrualna krv), Spei1 (slina) i Sperm2 (sjemenska tekućina).

Metilacija DNA pruža relativno dobro sredstvo za osjetljivost pri identifikaciji i otkrivanju tjelesnih tekućina. U jednoj studiji bilo je potrebno samo deset nanograma uzorka da bi se utvrdili uspješni rezultati. [118] Metilacija DNA omogućuje dobro razlučivanje mješovitih uzoraka budući da uključuje markere koji daju "uključeno ili isključeno" signale. Metilacija DNA nije otporna na vanjske uvjete. Čak i pod degradiranim uvjetima primjenom tehnika metilacije DNA, markeri su dovoljno stabilni da još uvijek postoje zamjetne razlike između degradiranih uzoraka i kontrolnih uzoraka. Točnije, u jednoj studiji je otkriveno da nije bilo primjetnih promjena u obrascima metilacije tijekom dugog vremenskog razdoblja. [117]

Metilacija DNA također se može otkriti računalnim modelima putem sofisticiranih algoritama i metoda. Računalni modeli mogu olakšati globalno profiliranje metilacije DNA na kromosomima, a često su takvi modeli brži i jeftiniji za izvođenje od bioloških testova. Takvi suvremeni računski modeli uključuju Bhasin, et al., [119] Bock, et al., [120] i Zheng, et al. [121] [122] Zajedno s biološkim testom, ove metode uvelike olakšavaju analizu metilacije DNA.


Otkriće modifikacije RNA sugerira novi kod za kontrolu ekspresije gena

Novi stanični signal koji je otkrio tim znanstvenika sa Sveučilišta u Chicagu i Sveučilišta Tel Aviv pruža obećavajuću novu polugu u kontroli ekspresije gena.

Studija, objavljena na internetu 10. veljače u časopisu Priroda, opisuje malu kemijsku modifikaciju koja može značajno potaknuti pretvorbu gena u proteine. Zajedno s drugim nedavnim otkrićima, ovo otkriće obogaćuje kritičnu novu dimenziju "središnje dogme" molekularne biologije: epitranskriptom.

"Ovo otkriće dodatno nam otvara prozor u cijeli novi svijet biologije", rekao je Chuan He, profesor kemije John T. Wilson, istraživač s Medicinskog instituta Howard Hughes i viši autor studije. "Ove modifikacije imaju veliki utjecaj na gotovo svaki biološki proces."

Središnja dogma molekularne biologije opisuje stanični put gdje se genetske informacije iz DNK kopiraju u privremene RNA "transkripte", koji daju recept za proizvodnju proteina. Otkako je Francis Crick prvi put postavio teoriju 1956. godine, znanstvenici su otkrili mnoštvo modifikacija DNK i proteina koji reguliraju ovaj proces.

Međutim, tek nedavno su se znanstvenici usredotočili na istraživanje dinamičkih modifikacija koje specifično ciljaju na RNA korak. Godine 2011. He's grupa otkrila je prvu RNA demetilazu koja preokreće najčešću metilaciju mRNA N6-metiladenozin, ili m6A, što implicira da bi dodavanje i uklanjanje metilne skupine moglo dramatično utjecati na ove glasnike i utjecati na ishod ekspresije gena, kao što je također vidljivo za DNK i histone. Nakon toga, znanstvenici su otkrili da dinamička i reverzibilna metilacija m6A dramatično kontrolira metabolizam i funkciju većine stanične glasničke RNA, a time i proizvodnju proteina.

U novom Priroda Studija, istraživači sa UChicaga i Sveučilišta Tel Aviv opisuju drugu funkcionalnu mRNA metilaciju, N1-metiladenozin, ili m1A. Poput m6A, mala modifikacija je evolucijski očuvana i uobičajena te prisutna kod ljudi, glodavaca i kvasca, otkrili su autori. No njegovo mjesto i učinak na ekspresiju gena odražavaju novi oblik kontrole epitranskriptoma i sugeriraju još veću staničnu "kontrolnu ploču".

“Otkriće m1A iznimno je važno, ne samo zbog njegovog vlastitog potencijala da utječe na biološke procese, već i zato što potvrđuje hipotezu da ne postoji samo jedna funkcionalna modifikacija”, rekao je. "Moglo bi postojati više modifikacija na različitim mjestima gdje svaka može nositi posebnu poruku za kontrolu sudbine i funkcije mRNA."

Istraživači su procijenili da je m1A prisutan na transkriptima više od jednog od tri izražena ljudska gena. Metilirani geni pokazali su poboljšanu translaciju u usporedbi s nemetiliranim genima, proizvodeći razine proteina gotovo dvostruko veće u svim tipovima stanica. Ovo povećanje sugerira da m1A, poput m6A, može biti mehanizam kojim stanice brzo pospješuju ekspresiju stotina ili tisuća specifičnih gena, možda tijekom važnih procesa kao što su dioba stanica, diferencijacija ili pod stresom.

“mRNA je savršeno mjesto za regulaciju ekspresije gena, jer mogu kodirati informacije iz transkripcije i izravno utjecati na prijevod, možete dodati konsenzusnu sekvencu grupi gena i koristiti modifikaciju sekvence kako biste lako kontrolirali nekoliko stotina transkripata istovremeno”, On rekao je. "Ako želite brzo promijeniti ekspresiju nekoliko stotina ili tisuću gena, ovo je najbolji način."

Međutim, unatoč svojim komplementarnim učincima, m1A i m6A vrše svoj utjecaj na mRNA različitim putovima. Dok su studije otkrile da se m6A uglavnom lokalizira na repu molekula glasničke RNA, povećavajući njihovu translaciju i stopu obrtanja, m1A je pronađen uglavnom blizu početnog kodona transkripata mRNA, gdje počinje translacija proteina. Različiti mehanizmi mogli bi omogućiti finije podešavanje ekspresije gena nakon transkripcije, ili selektivnu aktivaciju određenih gena u različitim fiziološkim situacijama.

"Ova studija predstavlja revolucionarno otkriće u uzbudljivom, nastajućem polju 'epitrankriptoma', na koji se reguliraju RNA, slično genomu i epigenomu", rekao je Christopher Mason, izvanredni profesor na Weill Cornell Medicine, koji nije bio povezan sa studijom. “Ono što je važno u ovom radu je da je nedavno otkriveno da m6A obogaćuje krajeve gena, a sada znamo da je m1A ono što pomaže regulirati početak gena, a to otvara mnoga pitanja o otkrivanju 'epitrankriptomskog koda' baš kao histonski kod ili genetski kod.”

Buduće studije će ispitati ulogu m1A metilacije u ljudskom razvoju, bolestima kao što su dijabetes i rak, te njezin potencijal kao meta za terapeutsku upotrebu.

Citiranje: "Dinamički N1-metiladenozin metilom u eukariotskoj glasničkoj RNA", Priroda, 10. veljače 2016., Chuan He, Dan Dominissini, Sigrid Nachtergaele, Qing Dai, Dali Han, Wesley Clark, Guanqun Zheng, Tao Pan i Louis Dore sa Sveučilišta u Chicagu i Sharon Moshitch-Moshkovitz, Eyal Peer, Nitkan Kol, Moshe Shay Ben-Haim, Ayelet Di Segni, Mali Salmon-Divon, Oz Solomon, Eran Eyal, Vera Hershkovitz, Ninette Amariglio i Gideon Rechavi sa Sveučilišta u Tel Avivu. DOI: 10.1038/nature16998

Financiranje: Nacionalni instituti za zdravlje, Medicinski institut Howard Hughes, Institut za medicinska istraživanja stjuardesa, Izraelska znanstvena zaklada, Izraelski program centara izvrsnosti, Istraživački program Ernesta i Bonnie Beutler, Biomedicinski konzorcij u Chicagu, Zaklada za istraživanje raka Damona Runyona i Zaklada obitelji Kahn.


18.1: Transkripcija - s DNK na RNA

Bakterije, arheje i eukarioti moraju sve transkribirati gene iz svojih genoma. Iako stanična lokacija može biti različita (eukarioti obavljaju transkripciju u jezgri bakterija, a arheje obavljaju transkripciju u citoplazmi), mehanizmi kojima organizmi iz svake od ovih klada provode ovaj proces su u osnovi isti i mogu se okarakterizirati u tri stupnja: početak, produljenje i završetak.

Kratak pregled transkripcije

Transkripcija je proces stvaranja RNA kopije dijela DNK. Budući da je ovo a postupak, želimo primijeniti rubriku Energetska priča kako bismo razvili funkcionalno razumijevanje transkripcije. Kako izgleda sustav molekula prije početka transkripcije? Kako to izgleda na kraju? Koje se transformacije tvari i prijenosi energije događaju tijekom transkripcije i što, ako išta, katalizira proces? Također želimo razmišljati o procesu sa stajališta Design Challengea. Ako je biološki zadatak stvoriti kopiju DNK na kemijskom jeziku RNA, koje izazove možemo razumno pretpostaviti ili predvidjeti, s obzirom na naše znanje o drugim procesima nukleotidnih polimera, moraju biti prevladani? Postoje li dokazi da je priroda riješila te probleme na različite načine? Koji su kriteriji za uspjeh transkripcije? Shvaćate ideju.

Navodi neke od osnovnih zahtjeva za transkripciju

Razmotrimo prvo zadaće koje su pred nama koristeći neke od naših temeljnih znanja i zamislimo što bi se moglo dogoditi tijekom transkripcije ako je cilj napraviti RNA kopiju dijela jednog lanca dvolančane molekule DNA. Vidjet ćemo da nam korištenje neke osnovne logike omogućuje da zaključimo mnoga važna pitanja i stvari koje moramo znati kako bismo ispravno opisali proces.

Zamislimo da želimo dizajnirati nanomstroj/nanobot koji bi provodio transkripciju. Možemo upotrijebiti razmišljanje o izazovu dizajna kako bismo identificirali probleme i podprobleme koje naš mali robot treba riješiti.

&bull Gdje bi stroj trebao početi? Uz milijune do milijarde parova baza, kamo bi stroj trebao biti usmjeren?
&bull Gdje bi se stroj trebao zaustaviti?
&bull Ako imamo start i stop web-mjesta, trebat će nam načini kodiranja tih informacija kako bi naši strojevi mogli čitati ove informacije&mdashKako će se to postići?
&bull Koliko RNA kopija DNK trebamo napraviti?
&bull Koliko brzo treba napraviti RNA kopije?
&bull Koliko točno treba napraviti kopije?
&bull Koliko će energije trajati proces i odakle će energija doći?

Ovo su, naravno, samo neka od ključnih pitanja. Može se kopati dublje ako želi. Međutim, oni su već dovoljno dobri da počnemo dobivati ​​dobar osjećaj za ovaj proces. Primijetite također da su mnoga od ovih pitanja nevjerojatno slična onima za koje smo zaključili da bi možda bilo potrebno razumjeti replikaciju DNK.

Građevinski blokovi transkripcije

Građevinski blokovi RNA

Podsjetimo iz naše rasprave o strukturi nukleotida da su građevni blokovi RNA vrlo slični onima u DNK. U RNA, građevni blokovi se sastoje od nukleotidnih trifosfata koji se sastoje od šećera riboze, dušične baze i tri fosfatne skupine. Ključne razlike između građevnih blokova DNA i RNA su u tome što se RNA molekule sastoje od nukleotida sa šećerima riboze (za razliku od šećera deoksiriboze) i koriste uridin, nukleotid koji sadrži uracil (za razliku od timidina u DNK). U nastavku imajte na umu da su uracil i timin strukturno vrlo slični i da uracilu samo nedostaje metil (CH3) funkcionalna skupina u usporedbi s timinom.

Slika 1. Osnovne kemijske komponente nukleotida.
Atribucija: Marc T. Facciotti (izvorno djelo)

Pokretanje transkripcije

Promotori

Proteini odgovorni za stvaranje RNA kopije određenog dijela DNK (transkripcija) prvo moraju moći prepoznati početak elementa koji se kopira. A promotor je DNA sekvenca na koju se vežu različiti proteini, zajednički poznati kao transkripcijski strojevi, i započinju transkripciju. U većini slučajeva, promotori postoje uzvodno (5' do regije kodiranja) od gena koje reguliraju. Specifična sekvenca promotora vrlo je važna jer određuje hoće li se odgovarajući kodirajući dio gena transkribirati cijelo vrijeme, povremeno ili rijetko. Iako se promotori razlikuju među vrstama, ponekad je sačuvano nekoliko elemenata sličnog slijeda. U regijama -10 i -35 uzvodno od mjesta inicijacije, postoje dva promotora konsenzus sekvence, ili regije koje su slične u mnogim promotorima i među različitim vrstama. Neki promotori će imati sekvencu vrlo sličnu konsenzus sekvenci (sekvenca koja sadrži najčešće elemente sekvence), a drugi će izgledati vrlo različito. Ove varijacije slijeda utječu na snagu do koje se transkripcijski strojevi mogu vezati na promotor kako bi pokrenuli transkripciju. To pomaže kontrolirati broj transkripata koji se izrađuju i koliko često se izrađuju.

Slika 2. (a) Opći dijagram gena. Gen uključuje promotorsku sekvencu, neprevedenu regiju (UTR) i kodirajuću sekvencu. (b) Popis nekoliko jakih sekvenci promotora E. coli. Kutija -35 i kutija -10 visoko su očuvane sekvence u cijeloj listi jakih promotora. Slabiji promotori će imati više razlika u parovima baza u usporedbi s ovim sekvencama.
Izvor: http://www.discoveryandinnovation.co. predavanje12.html

Koje se vrste interakcija mijenjaju između transkripcijskih strojeva i DNK kada se promijeni nukleotidni slijed promotora? Zašto bi neke sekvence stvorile "jaki" promotor i zašto druge stvaraju "slab" promotor?

Bakterijski naspram eukariotskih promotora

U bakterijskim stanicama konsenzusna sekvenca -10, nazvana regija -10, bogata je AT, često TATAAT. Slijed -35, TTGACA, prepoznaje se i veže protein &sigma. Jednom kada se ostvari ova interakcija protein-DNA, podjedinice jezgrene RNA polimeraze vežu se na mjesto. Zbog relativno manje stabilnosti AT asocijacija, AT-bogata -10 regija olakšava odmotavanje DNA šablona, ​​te se stvara nekoliko fosfodiesterskih veza.

Eukariotski promotori su mnogo veći i složeniji od prokariotskih promotora, ali oba imaju regiju bogatu AT&mdashin eukarioti, obično se naziva TATA kutija. Na primjer, u genu za timidin kinazu miša, TATA kutija se nalazi na približno -30. Za ovaj gen, točna sekvenca TATA kutije je TATAAAA, kako se čita u smjeru od 5' do 3' na lancu koji nije predložak. Ovaj slijed nije identičan E coli -10, ali oboje dijele kvalitetu elementa bogatog AT-om.

Umjesto jedne bakterijske polimeraze, genomi većine eukariota kodiraju tri različite RNA polimeraze, od kojih se svaka sastoji od deset ili više proteinskih podjedinica. Svaka eukariotska polimeraza također zahtijeva poseban skup proteina poznatih kao transkripcijski faktori da ga regrutira promotoru. Osim toga, vojska drugih čimbenika transkripcije, proteina poznatih kao pojačivači i prigušivači pomažu u regulaciji sinteze RNA iz svakog promotora. Pojačivači i prigušivači utječu na učinkovitost transkripcije, ali nisu nužni za pokretanje transkripcije ili njezinu procesiju. Bazalni transkripcijski čimbenici ključni su u formiranju a kompleks predinicijacije na DNA predlošku koji naknadno regrutira RNA polimerazu za inicijaciju transkripcije.

Pokretanje transkripcije počinje vezanjem RNA polimeraze na promotor. Transkripcija zahtijeva da se dvostruka spirala DNK djelomično odmota tako da se jedan lanac može koristiti kao predložak za sintezu RNA. Područje odmotavanja naziva se a transkripcijski balon.

Slika 3. Tijekom elongacije, RNA polimeraza prati DNK šablonu, sintetizira mRNA u smjeru 5' do 3' i odmotava zatim premotava DNK dok se čita.

Produljenje

Transkripcija uvijek polazi od šablonski pramen, jedan od dva lanca dvolančane DNK. Proizvod RNA komplementaran je predloškom lancu i gotovo je identičan lancu koji nije predložak, nazvan kodirajući niz, s iznimkom da RNA sadrži uracil (U) umjesto timina (T) koji se nalazi u DNK. Tijekom produljenja enzim tzv RNA polimeraza nastavlja duž DNA šablona, ​​dodajući nukleotide uparivanjem baza s DNA šablonom na način sličan replikaciji DNA, s tom razlikom što sintetizirani RNA lanac ne ostaje vezan za DNK šablon. Kako produljenje nastavlja, DNK se kontinuirano odmotava ispred jezgrenog enzima i premotava iza njega. Imajte na umu da je smjer sinteze identičan onom sinteze u DNK&mdash5' do 3'.

Slika 4. Tijekom elongacije, RNA polimeraza prati DNK šablonu, sintetizira mRNA u smjeru 5' do 3', odmotava i zatim premotava DNK dok se čita.

Slika 5. Dodavanje nukleotida tijekom procesa transkripcije vrlo je slično dodavanju nukleotida u replikaciji DNA. RNA se polimerizira od 5' do 3', a svakim dodatkom nukleotida enzim hidrolizira fosfoanhidridnu vezu, što rezultira dužim polimerom i oslobađanjem dva anorganska fosfata.
Izvor: http://utminers.utep.edu/rwebb/html/. longation.html

Usporedite i usporedite energetsku priču za dodavanje nukleotida u replikaciji DNA s dodatkom nukleotida u transkripciji.

Bakterijska vs. eukariotska elongacija

Kod bakterija, produljenje počinje oslobađanjem &sigma podjedinica iz polimeraze. Disocijacija od &sigma omogućuje enzimu jezgre da napreduje duž DNA šablona, ​​sintetizirajući mRNA u smjeru 5' do 3' brzinom od približno 40 nukleotida u sekundi. Kako produljenje nastavlja, DNK se kontinuirano odmotava ispred jezgrenog enzima i premotava iza njega. Sparivanje baza između DNA i RNA nije dovoljno stabilno da održi stabilnost komponenti sinteze mRNA. Umjesto toga, RNA polimeraza djeluje kao stabilna poveznica između DNA šablona i novonastalih RNA lanaca kako bi se osiguralo da se produljenje ne prekine prerano.

U eukariota, nakon formiranja preinicijacijskog kompleksa, polimeraza se oslobađa od drugih transkripcijskih čimbenika, a produljenje se dopušta da se nastavi kao što se događa u prokariota s polimerazom koja sintetizira pre-mRNA u smjeru 5' do 3'. Kao što je već spomenuto, RNA polimeraza II transkribira najveći dio eukariotskih gena, tako da će se ovaj odjeljak usredotočiti na to kako ova polimeraza postiže produljenje i terminaciju.

Raskid

U bakterijama

Nakon što se gen transkribira, potrebno je uputiti bakterijsku polimerazu da se odvoji od DNK šablona i oslobodi novonastalu mRNA. Ovisno o genu koji se transkribira, postoje dvije vrste terminacijskih signala. Jedna je bazirana na proteinima, a druga na RNA. Rho ovisan završetak kontrolira rho protein, koji se prati iza polimeraze na rastućem lancu mRNA. Blizu kraja gena, polimeraza nailazi na niz G nukleotida na DNK šablonu i zaustavlja se. Kao rezultat toga, rho protein se sudara s polimerazom. Interakcija s rho oslobađa mRNA iz transkripcijskog mjehurića.

Rho neovisni završetak kontrolira se specifičnim sekvencama u lancu DNA šablona. Kako se polimeraza bliži kraju gena koji se transkribira, nailazi na regiju bogatu CG nukleotidima. mRNA se savija natrag na sebe, a komplementarni CG nukleotidi se vežu zajedno. Rezultat je stabilan ukosnica što uzrokuje zastoj polimeraze čim počne transkribirati regiju bogatu AT nukleotidima. Komplementarna UA regija mRNA transkripta tvori samo slabu interakciju s DNK šablonom. To, zajedno sa zaustavljenom polimerazom, izaziva dovoljno nestabilnosti da se enzim jezgre odvoji i oslobodi novi transkript mRNA.

Kod eukariota

Završetak transkripcije je različit za različite polimeraze. Za razliku od prokariota, produljenje RNA polimerazom II kod eukariota se odvija 1.000&ndash2.000 nukleotida iza kraja gena koji se transkribira. Ovaj pre-mRNA rep se naknadno uklanja cijepanjem tijekom obrade mRNA. S druge strane, RNA polimeraze I i III zahtijevaju terminacijske signale. Geni transkribirani RNA polimerazom I sadrže specifičnu sekvencu od 18 nukleotida koju prepoznaje terminacijski protein. Proces terminacije u RNA polimerazi III uključuje mRNA ukosnicu sličnu rho neovisnoj terminaciji transkripcije u prokariota.

U arhejama

Završetak transkripcije u arheji je daleko manje proučavan nego u druga dva područja života i još uvijek nije dobro shvaćen. Iako će funkcionalni detalji vjerojatno nalikovati mehanizmima koji su viđeni u drugim domenama života, detalji su izvan dosega ovog tečaja.

Stanična lokacija

Kod bakterija i arheja

Kod bakterija i arheja do transkripcije dolazi u citoplazmi, gdje se nalazi DNK. Budući da lokacija DNK, a time i proces transkripcije, nisu fizički odvojeni od ostatka stanice, prevođenje često počinje prije nego što se transkripcija završi. To znači da se mRNA u bakterijama i arhejama koristi kao predložak za protein prije nego što se proizvede cijela mRNA. Nedostatak prostorne segregacije također znači da postoji vrlo malo vremenske segregacije za ove procese. Slika 6 prikazuje procese transkripcije i prevođenja koji se odvijaju istovremeno.

Slika 6. Dodavanje nukleotida tijekom procesa transkripcije vrlo je slično dodavanju nukleotida u replikaciji DNA.
Izvor: Marc T. Facciotti (vlastiti rad)

Kod eukariota.

Kod eukariota, proces transkripcije je fizički odvojen od ostatka stanice, izdvojen unutar jezgre. To rezultira dvjema stvarima: mRNA je dovršena prije nego što prijevod može započeti, a postoji vrijeme za "prilagodi" ili "urediti" mRNA prije nego što prijevod započne. Fizičko odvajanje ovih procesa daje eukariotima priliku da izmijene mRNA na takav način da produže životni vijek mRNA ili čak izmijene proteinski proizvod koji će se proizvesti iz mRNA.

Obrada mRNA

5' G-kapa i 3' poli-A rep

Kada se eukariotski gen transkribira, primarni se transkript obrađuje u jezgri na nekoliko načina. Eukariotske mRNA modificirane su na 3' kraju dodatkom poli-A repa. Ovom nizu A ostataka dodaje enzim koji ne koristi genomsku DNK kao šablonu. Dodatno, mRNA imaju kemijsku modifikaciju 5' kraja, nazvanu 5'-cap. Podaci sugeriraju da ove modifikacije pomažu produžiti životni vijek mRNA (spriječiti njezinu preranu degradaciju u citoplazmi) kao i pomoći mRNA da započne translaciju.

Slika 7. pre-mRNA se obrađuju u nizu koraka. Introni se uklanjaju, dodaju se 5' kapa i poli-A rep.
Izvor: http://www.discoveryandinnovation.co. predavanje12.html

Alternativno spajanje

Spajanje se događa na većini eukariotskih mRNA u kojima se introni uklanjaju iz sekvence mRNA, a egzoni se zajedno ligiraju. To može stvoriti mnogo kraću mRNA nego što je bila inicijalno transkribirana. Spajanje omogućuje stanicama miješanje i spajanje egzona koji su ugrađeni u konačni proizvod mRNA. Kao što je prikazano na donjoj slici, to može dovesti do toga da više proteina kodira jedan gen.


Regulacija u cis

Za razliku od trans-djelujuće lncRNA, koje djeluju preko svog RNA proizvoda, cis-djelujuće lncRNA imaju mogućnost djelovanja na dva fundamentalno različita načina. Prvi način ovisi o proizvodu lncRNA. Glavni primjer opće cis-regulacija je indukcija inaktivacije X od strane Xist lncRNA u ženki sisavaca. Xist ekspresira se iz jednog od dva X kromosoma i inducira utišavanje cijelog kromosoma [24] (slika 1c). Kao primjer regulacije specifične za lokus, predloženo je da pojačivačke RNA aktiviraju odgovarajuće gene u cis preko njihovog proizvoda [25]. Dobro proučen cis-djelujuća lncRNA koja djeluje kroz svoj proizvod je ljudska HOTTIP lncRNA koja je izražena u HOXA klasteru i aktivira transkripciju bočnih gena. Pokazalo se da HOTTIP djeluje tako što veže WDR5 u kompleksu MLL modifikatora histona, čime dovodi histon H3 lizin-4 trimetilaciju (H3K4me3) na promotore bočnih gena [26]. Takav mehanizam u kojem se novi transkript lncRNA veže i isporučuje epigenetske modifikatore na svoje ciljne gene dok je još uvijek vezan za produžujući RNAPII općenito se naziva 'tethering' i često se koristi za objašnjenje cis-regulacija pomoću lncRNA [23, 27] (slika 1e). Predloženo je i djelovanje u biljkama. U Arabidopsis thaliana, the HLADAN ZRAK lncRNA se pokreće iz introna FLC pc i utišava ga ciljajući represivne kromatinske oznake na lokus kako bi se kontroliralo vrijeme cvatnje [28].

Nasuprot tome, drugi način od cis regulacija lncRNA uključuje sam proces transkripcije, što je a priori cis-gluma (slika 1f). Nekoliko linija dokaza sugerira da sam proces transkripcije lncRNA može utjecati na ekspresiju gena ako RNAPII prođe kroz regulatorni element ili promijeni opću organizaciju kromatina lokusa. U ovom pregledu raspravljamo o ovoj podcijenjenoj ulozi transkripcije lncRNA u induciranju utišavanja ili aktivacije gena koji kodira proteine ​​u cis, te pregled mogućih mehanizama za to djelovanje kod sisavaca i nesisavaca. Konačno, opisujemo eksperimentalne strategije za razlikovanje lncRNA koje djeluju kao transkript od onih koje djeluju putem transkripcije.


Opcije pristupa

Dobijte puni pristup časopisu na 1 godinu

Sve cijene su NETO cijene.
PDV će biti dodan kasnije pri naplati.
Obračun poreza bit će dovršen tijekom naplate.

Dobijte vremenski ograničen ili potpun pristup članku na ReadCubeu.

Sve cijene su NETO cijene.


Metilacija DNA potiče transkripciju

Metilacija DNA općenito potiskuje transkripciju, ali je u nekim slučajevima također uključena u aktivaciju transkripcije. Harris et al. identificirali proteinski kompleks u Arabidopsis koji se regrutira u kromatin metilacijom DNA. Ovaj kompleks posebno je aktivirao transkripciju gena koji su već blago transkribirani, ali nije imao utjecaja na transkripcijski tihe gene kao što su transpozicijski elementi. Kompleks se na taj način suprotstavlja učinku potiskivanja uzrokovanom umetanjem transpozona u susjedne gene dok transpozoni ostaju tihi. Stoga, balansiranjem represivnih i aktivacijskih učinaka transkripcije, metilacija DNA može djelovati na fino podešavanje ekspresije gena.


Pokazana je uloga RNA polimeraze u transkripciji gena

U svim organizmima, sintezu RNA provode proteini - poznati kao RNA polimeraze (RNAP) - koji transkribiraju genetske informacije iz DNK u visoko reguliranom, višefaznom procesu. RNAP je ključni enzim uključen u stvaranje ekvivalentne RNA kopije slijeda DNK. Ova transkripcija je prvi korak koji vodi do ekspresije gena. Dok su glavni koraci u sintezi RNA poznati već nekoliko desetljeća, znanstvenici su tek nedavno počeli dešifrirati detaljne molekularne korake složenog procesa transkripcije.

U istraživanju objavljenom u internetskom ranom izdanju od 1. srpnja 2010 Zbornik Nacionalne akademije znanosti, Biofizičari sa Sveučilišta Maryland Devarajan (Dave) Thirumalai i Jie Chen, zajedno sa suradnikom sa Sveučilišta Rockefeller Seth Darstom, daju novi uvid u to kako se pokreće proces transkripcije i ulogu koju RNA polimeraza igra u tome. Budući da su slijed, struktura i funkcija RNA polimeraze s više podjedinica univerzalno očuvani u svim organizmima - od bakterija do ljudi - razumijevanje mehanizama transkripcije bakterijskih gena važan je korak u dešifriranju uloge genetike u bolesti.

"Prije ljudi nisu znali točnu ulogu RNA polimeraze u pokretanju transkripcije", objašnjava ugledni sveučilišni profesor Dave Thirumalai (Odjel za kemiju i biokemiju i Institut za fizikalnu znanost i tehnologiju), "ali smo pokazali da ona igra važnu ulogu u formiranju transkripcijskog mjehurića i u procesu savijanja DNK kako bi se olakšao ulazak DNK u aktivno mjesto. To je proces koji smo opisali računski."

Njihova simulacija početne faze transkripcije u bakterijskoj RNA polimerazi pokazala je proces u tri koraka. Počinje kada se RNA polimeraza veže s regijama DNK koje potiču transkripciju. Kroz interakciju s RNA polimerazom, spirala DNA se zatim odmotava, tvoreći otvoreni "mjehurić" koji omogućuje pristup polimerazi izloženoj DNA sekvenci da započne transkripciju. Molekula DNA se zatim savija kako bi ublažila stres koji nastaje otvorom.

Dr. Jie Chen, koji je proveo ovo istraživanje dok je bio apsolvent na programu Kemijska fizika, simulirao je formiranje transkripcijskih mjehurića koristeći računalni model koji se temelji na Brownovskoj dinamici koji je razvio laboratorij dr. Thirumalaija. "Stvaranjem ovog molekularnog filma možemo pogledati dinamiku RNAP-a i simulirati kako se on prebacuje s jedne strukture na drugu strukturu", objašnjava Chen."Naša simulacija potvrđuje eksperimentalna opažanja i ide dalje u uspostavljanju jasne i aktivne uloge RNA polimeraze."

Istraživačka skupina dr. Thirumalaia nastavlja proučavati RNA polimerazu promatrajući drugu fazu procesa transkripcije u bakterijama i također kroz modele ljudske transkripcije.

Izvor priče:

Materijale osigurava Sveučilište u Marylandu. Napomena: Sadržaj se može uređivati ​​zbog stila i duljine.


Određivanje životnog vijeka RNA tijekom transkripcije

Mettl3 (magenta) ko-transkripcijski veže svoje mete. Zasluge: Institut za biomedicinska istraživanja Friedrich Miescher

Kontrola životnog vijeka RNA ključna je za pravilno funkcioniranje naših stanica. Grupa Marca Bühlera na Institutu za biomedicinska istraživanja Friedricha Mieschera (FMI) otkrila je novi mehanizam koji određuje sudbinu RNA u stanicama sisavaca: dva proteina uključena u RNA interferenciju - Dgcr8 i Drosha - zajedno s metiltransferazom, Mettl3, obilježavaju nastajanje RNA za degradacije kako se transkribiraju. Ovaj mehanizam omogućuje RNA transkriptima da se "zapamte" uvjeta pod kojima su sintetizirani.

Život RNK nikada nije lak. Njegovo stvaranje, obrada, životni vijek i degradacija strogo su regulirani. Ova stroga kontrola metabolizma RNA osigurava da geni postanu aktivni u pravo vrijeme i na pravom mjestu, štiteći funkcije stanica.

U tom kontekstu, kontrolni mehanizam poznat kao RNA interferencija (RNAi) privukao je veliku pozornost. RNAi dovodi do fragmentacije i inaktivacije RNA u citoplazmi. Zanimljivo je da je u kvascu RNAi strojevi također aktivni u jezgri: tijekom sinteze RNA, dok se RNA molekule još povezuju s DNK, on ​​pokreće razgradnju RNA u nastajanju. Ostalo je nejasno igra li RNAi strojevi sličnu ulogu u stanicama sisavaca.

Kako bi se pozabavili ovim pitanjem, Marc Bühler i njegova grupa na FMI-u koristili su matične stanice miša embrija. Bühler komentira: "Ovo je dobar primjer kako znanje stečeno u modelnom organizmu - ovdje u fisijskom kvascu - vodi naše hipoteze i informira naše eksperimente na višim organizmima."

U njihovoj studiji, objavljenoj u Prirodna strukturna i molekularna biologijaznanstvenici su pokazali da dva dobro poznata RNAi čimbenika sisavaca djeluju u interakciji s kromatinom: i Dgcr8 (protein koji veže RNA) i Drosha (RNaza) vežu se na transkripte u nastajanju, čime se utišavaju geni zajedno s transkripcijom. Prvi autor Philip Knuckles, postdoktorski suradnik u Bühlerovom laboratoriju koji financira NCCR, objašnjava: "U višećelijskim organizmima, Dgcr8 i Drosha tvore kompleks koji se naziva mikroprocesor (MP). Ovaj kompleks ne postoji u kvascu, ali naši rezultati sugeriraju da je potrebno nad funkcijom kvasca RNAi protein Dicer. Princip je očuvan, ali se igrači malo razlikuju."

Znanstvenici FMI-ja također su pokazali da enzim poznat kao Mettl3 je uključen u razgradnju RNA u nastajanju. Mettl3 prenosi metilne skupine na adenozinske ostatke u RNA, znak koji također utječe na stabilnost RNA. Knuckles kaže: "U našim smo eksperimentima pokazali da se Mettl3 veže na kromatin dok se RNA transkribira i da ova povezanost Mettl3 stimulira vezanje Dgcr8."

MP/Mettl3 sustav omogućuje stanici da brzo reagira na promjenjive uvjete rasta. Bühler objašnjava: "Tijekom stresne situacije izazvane visokom temperaturom, proizvedeni RNA transkripti toplinskog šoka istodobno su označeni metilacijom adenozina. To označava te RNA za naknadnu razgradnju, omogućujući brz, ali vremenski ograničen odgovor na stres." Prema Bühleru, i brzi odgovor na stres i brzo uklanjanje transkripata i proteina toplinskog šoka važni su za stanice: „Nakupljanje proteina odgovora na stres štetno je za stanicu i često se opaža kod raka.


Epigenetika i zdravlje

Epigenetske promjene mogu utjecati na vaše zdravlje na različite načine:

  1. Infekcije
    Klice mogu promijeniti vašu epigenetiku da oslabe vaš imunološki sustav. To pomaže klici da preživi.

Mycobacterium tuberculosis izaziva tuberkulozu. Infekcije s tim klicama mogu uzrokovati promjene u histonima u nekim vašim imunološkim stanicama koje rezultiraju isključivanjem &ldquooffa IL-12B gen. Isključivanje &ldquooff&rdquo IL-12B gen slabi vaš imunološki sustav i poboljšava preživljavanje Mycobacterium tuberculosis (3).

  1. Rak
    Određene mutacije povećavaju vjerojatnost razvoja raka. Isto tako, neke epigenetske promjene povećavaju rizik od raka. Na primjer, imati mutaciju u BRCA1 gen koji mu onemogućuje pravilan rad povećava vjerojatnost da ćete dobiti rak dojke i druge vrste raka. Slično, povećana metilacija DNA koja rezultira smanjenom BRCA1 ekspresija gena povećava rizik od raka dojke i drugih karcinoma (4). Dok stanice raka imaju povećanu metilaciju DNA na određenim genima, ukupna razina metilacije DNA niža je u stanicama raka u usporedbi s normalnim stanicama. Različite vrste raka koje izgledaju slično mogu imati različite obrasce metilacije DNK. Epigenetika se može koristiti kako bi se utvrdilo koju vrstu raka osoba ima ili može pomoći da se rak teško otkrije ranije. Epigenetika sama ne može dijagnosticirati rak, a karcinom bi se trebao potvrditi daljnjim testovima probira.

Kolorektalni karcinomi imaju povećanu metilaciju na 9. rujna gen. Neki komercijalni epigenetički bazirani testovi za kolorektalni karcinom gledaju na razine metilacije DNA na 9. rujna gen. Kada se koriste s drugim dijagnostičkim testovima probira, ovi epigenetički utemeljeni testovi mogu pomoći u ranom otkrivanju raka (5)(6).

  1. Prehrana tijekom trudnoće
    Okruženje i ponašanje trudnice tijekom trudnoće, kao što je jede li zdravu hranu, mogu promijeniti bebinu&rsquos epigenetiku. Neke od tih promjena mogu ostati desetljećima i mogu povećati vjerojatnost da će dijete dobiti određene bolesti.

Ljudi čije su majke bile trudne s njima tijekom gladi imali su veću vjerojatnost da će razviti određene bolesti kao što su bolesti srca, shizofrenija i dijabetes tipa 2 (7). Otprilike 60 godina nakon gladi, istraživači su promatrali razine metilacije kod ljudi čije su majke bile trudne s njima tijekom gladi. Ovi ljudi su imali povećanu metilaciju na nekim genima i smanjenu metilaciju na drugim genima u usporedbi sa svojom braćom i sestrama koji nisu bili izloženi gladi prije rođenja (8)(9)(10). Ove razlike u metilaciji mogle bi objasniti zašto su ti ljudi imali povećanu vjerojatnost za određene bolesti kasnije u životu (7)(10)(11)(12).


Gledaj video: Transcription Made Easy- From DNA to RNA 2019 (Kolovoz 2022).