Informacija

Schiffova baza u enzimskim mehanizmima

Schiffova baza u enzimskim mehanizmima


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Može li schiffova baza stabilizirati prijelazno stanje i formirati međuprodukt kao u kovalentnoj katalizi sa supstratom u istoj reakciji? Uglavnom, pitam se stvara li schiff baza ping pong reakciju.


Mislim da je odgovor na ovo sasvim definitivno 'da'. Gotovo sve aminotransferaze odvijaju se putem ping-pong mehanizma gdje je šif baza koja uključuje piridoksal fosfat obavezni intermedijer i gdje je često izoliran 'polu-reacijski' modificirani enzimski oblik. Primjer je aspartat aminotransferaza.

Podsjetimo se i da prijelazno stanje nije međuprodukt na putu reakcije (u TS su veze u procesu raskidanja i formiranja), ali može nalikovati jednom.


A3. Kovalentna ili nukleofilna kataliza

  • Doprinos Henry Jakubowski
  • Profesor (kemija) na College of St. Benedict/St. John's University

Jedan od načina da se promijeni aktivacijska energija reakcije je promjena mehanizma reakcije na način koji uvodi nove korake s nižom energijom aktivacije. Tipičan način je dodavanje nukleofilnog katalizatora koji tvori kovalentni međuprodukt s reaktantom. Izvorni nukleofil tada može stupiti u interakciju s intermedijerom u reakciji nukleofilne supstitucije. Ako je nukleofilni katalizator bolji nukleofil od izvornog nukleofila (obično voda) tada se reakcija katalizira. Nukleofilni katalizator i izvorni nukleofil obično stupaju u interakciju s karbonilom C u supstitucijskoj reakciji, u početku tvoreći tetraedarski oksianionski međuprodukt.

Slika: NUKLEOFILNA KOVALENTNA KATALIZA PIRIDINOM.

Ako se amin koristi kao nukleofilni katalizator, tada početni proizvod adicije (karbinolamin) može postati dehidriran, budući da je vjerojatnije da će slobodni par elektrona na N biti podijeljen s ugljikom da tvori dvostruku vezu nego elektroni iz izvorni karbonil O, koji je elektronegativniji od N). Formira se imin ili Schiffova baza, s pKa od oko 7.

Slika: MEHANIZAM FORMIRANJA SCHIFFOVE BAZE

To se lako protonira i formira pozitivno nabijeni N u bivšem karbonilnom O centru. Ovo služi kao izvrstan ponor elektrona za reakcije dekarboksilacije beta-keto kiselina i ilustrira važnu točku. Elektroni u kemijskim reakcijama mogu se promatrati kao da teku iz izvora (kao što je karboksilna skupina) u ponor (kao što je nukleofilni karbonil O ili pozitivno nabijeni N u Schiffovoj bazi).

Slika: MEHANIZAM NUKLEOFILNE KATALIZE AMINIMA – Tvorba SCHIFF-ove baze.

Slika: PROTOK ELEKTRONA: IZVOR ZA POTOPANJE

U sljedećem odjeljku raspravljat ćemo o tome kako proteinski enzimi koriste te iste katalitičke strategije. Postavlja se intrigantno pitanje: koliki je dio strukture velikog proteina stvarno potreban za katalizu? Mnogo je rada usmjereno na razvoj malih molekularnih mimetika velikih proteinskih enzima. Koliko samo malo možete ući u smanjenje veličine proteina i još uvijek dobiti katalizu. Jedna važna značajka enzimske katalize je da oni kataliziraju reakcije u kojima se proizvodi samo jedan enantiomer. To jest, sinteza je asimetrična. To je tipično posljedica asimetričnog enzima (sama kiralnog) koji veže samo jedan enantiomer kao reaktant i/ili nametanja steričkih ograničenja na moguće reakcije vezanog supstrata. Nedavno se pokazalo da sam L-Pro može djelovati kao takav asimetrični katalizator u reakciji aldolne kondenzacije.

Slika: L-PRO KATALIZA ALDOL KONDENZACIJE: MOGUĆI MEHANIZAM


PIRIDOKSAL FOSFATNI ENZIMI

Piridoksal fosfat (PLP) je derivat vitamina B6 ili piridoksala. Nedostaci uzrokuju konvulzije, kroničnu anemiju i neuropatiju. Pomaže u mnogim reakcijama (kataliziranim enzimima ovisnim o PLP). PLP je kovalentno vezan na lizinske ostatke u vezi Schiffove baze (aldimin). U ovom obliku, on reagira s mnogim slobodnim aminokiselinama (kao supstrati) kako bi zamijenio Schiffovu bazu u Lys enzima sa Schiffovom bazom u aminokiselinski supstrat. Prvo osvrt na formaciju Schiffove baze.

PLP: Struktura i kovalentna vezanost za enzim

Za reakcije 6-8, pretpostavite da je aminokiselinski supstrat u Schiffovoj bazi s PLP.

William Jencks je u svom klasičnom tekstu Kataliza u kemiji napisao:

"Rečeno je da je Bog stvorio organizam posebno prilagođen da pomogne biologu da pronađe odgovor na svako pitanje o fiziologiji živih sustava, ako je to tako, mora se zaključiti da je piridoksal fosfat stvoren da pruži zadovoljstvo i prosvjetljenje tim enzimolozima i kemičari koji uživaju u guranju elektrona, jer nijedan drugi koenzim nije uključen u tako široku paletu reakcija, kako u enzimskim tako iu modelskim sustavima, što se može razumno tumačiti u smislu kemijskih svojstava koenzima. Većina ovih reakcija omogućena je zajedničkom strukturnom značajkom. To jest, povlačenje elektrona prema kationskom atomu dušika imina i u ponor elektrona piridoksalnog prstena iz alfa ugljikovog atoma spojene aminokiseline aktivira sva tri supstituenta ovog ugljika za reakcije koje zahtijevaju povlačenje elektrona iz ovog atoma ."

Molekularno modeliranje: PLP: tirozin aminotransferaza Jmol (iz PDB)

6. RX TIP - &alfa -DEKARBOKSILANJE AMINOKISELINA.

7. TIP RX - BETA-ELIMINIRANJE IZ SERINA. Primjer: serin dehidrataza. (savjet: prvo uklonite H na &alpha-C), a zatim OH)

8. VRSTA RX - RACEMIZACIJA AMINOKISELINA. (savjet: prvo uklonite H na &alpha-C)

PLP enzimi također kataliziraju reakcije transaminacije, čiji je primjer prikazan u nastavku:

Amino kiselina 1 + &alfa-keto kiselina 1 <==> &alfa-keto kiselina 2 + aminokiselina 2 Na primjer:

Prvi Asp, vezan na PLP preko Schiffove bazne veze, gubi &alpha-H, tvori ketimin reakcijom tautomerizacije, koji na kraju hidrolizira da nastane oslobođeni oksalacetat i piridoksamin. Priidoksamin reagira s &alfa-ketoglutaratom obrnuto od prve tri reakcije na iz Glu.

9. RX TIP - ACETILACIJA: "Anhidrid octene kiseline" reakcija biološke acetilacije je acetil-CoA, derivat vitamina pantatenske kiseline, koji sadrži slobodni tiol. Acetilira se na tiolu u mnogim metaboličkim reakcijama kako bi se proizveo acetilCoA koji sadrži tioestersku vezu, biološki acetilirajući reagens. Ova se molekula može cijepati na eksergonski način djelomično zbog slabe veze između acetila C i Sk što dovodi do prijenosa acetilne skupine. Prethodno smo raspravljali o važnosti acetilacije histona Lys histon acetilazama u kontroli ekspresije gena.


Struktura i mehanizam podfamilije enzima povezanih s N-acetilneuraminat liazom.

Ovdje opisujemo podobitelji enzima koji su strukturno i funkcionalno povezani s N-acetilneuraminat liazom. Dva člana ove obitelji (N-acetilneuraminatna liaza i dihidrodipikolinat sintaza) imaju poznate trodimenzionalne strukture i sada nastavljamo s prikazom njihove strukturne i funkcionalne veze s dva daljnja proteina, trans-o-hidroksibenzilidenpiruvat hidratazom-aldolazom i D-4-deoksi -5-oksoglukarat dehidrataza. Smatra se da svi ovi enzimi uključuju srednje formiranje Schiffove baze sa svojim odgovarajućim supstratima. Kako bismo razumjeli prirodu ovog međuprodukta, odredili smo trodimenzionalnu strukturu N-acetilneuraminat liaze u kompleksu s hidroksipiruvatom (analog proizvoda) iu kompleksu s jednim od njegovih proizvoda (piruvat). Iz ovih struktura zaključujemo prisutnost blisko sličnog motiva za formiranje Schiffove baze u svim članovima podfamilije N-acetilneuraminatne lizaze. Potvrđeno je da je i peti protein, MosA, član podobitelji, iako je uključivanje srednje Schiffove baze u njegovu predloženu reakciju nejasno.


Mehanizam reakcije glikozilaze s enzimom za popravak ekscizije baze hOGG1: usklađeni učinak Lys249 i Asp268 tijekom ekscizije 8-oksoguanina

Ekscizija 8-oksoguanina (oxoG) pomoću enzima za popravak baze 8-oksoguanin DNA glikozilaze 1 (hOGG1) proučavana je korištenjem QM/MM (M06-2X/6-31G(d,p):OPLS2005) metoda proračuna i spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije (NMR). Izračunata reakcija glikozilaze uključivala je izrezivanje oksoG baze, stvaranje kovalentnog adukta enzima-supstrata Lys249-riboza i formiranje Schiffove baze. Formiranje Schiffove baze s ΔG# = 17,7 kcal/mol bio je korak koji ograničava brzinu reakcije. Ekscizija oxoG baze s ΔG# = 16,1 kcal/mol nastavila se supstitucijom C1΄-N9 N-glikozidne veze s vezom H-N9 gdje su negativni naboj na oxoG bazi i pozitivni naboj na ribozi kompenzirani na usklađen način NH3+(Lys249) odnosno CO2-(Asp268). Učinak Asp268 na eksciziju oxoG demonstriran je 1H NMR za WT hOGG1 i hOGG1(D268N) mutant: ekscizija oxoG bila je značajno potisnuta kada je Asp268 mutiran u Asn. Gubitak funkcije ekscizije baze racionaliziran je QM/MM izračunima i Asp268 je potvrđen kao elektrostatički stabilizator riboze oksokarbenija kroz početni korak ekscizije baze popravka DNA. NMR eksperimenti i QM/MM izračuni dosljedno su ilustrirali reakciju ekscizije baze kojom upravlja hOGG1.

© Autor(i) 2017. Objavio Oxford University Press u ime istraživanja nukleinskih kiselina.

Figure

Enzim hOGG1 BER. Skica…

Enzim hOGG1 BER. Skica QM/MM strukturnog modela uključujući hOGG1 (cijan)…

Lokalne geometrije…

Lokalne geometrije katalitičke jezgre izračunate za stacionarna stanja…

Kemijski dijagram ( A…

Kemijski dijagram ( A ) i profil slobodne energije ( B ) od…

Katalitička funkcija WT…

Katalitička funkcija WT hOGG1 i hOGG1 (D268N). Koncept testa za…

QM/MM-izračunata dvodimenzionalna potencijalna energija…

QM/MM izračunate dvodimenzionalne površine potencijalne energije za izrezivanje baze oxoG s…

Sažetak reakcije ekscizije baze…

Sažetak za reakciju ekscizije baze s hOGG1: kompatibilnost nabijenih ostataka unutar…


Sažetak

Fosfonoacetaldehid hidrolaza (fosfonataza) katalizira hidrolizu fosfonoacetaldehida u acetaldehid i anorganski fosfat. U ovoj studiji, geni koji kodiraju fosfonatazu u Bacil cereus i u Salmonella typhimurium klonirani su za ekspresiju na visokoj razini u Escherichia coli. Određena su kinetička svojstva pročišćenih, rekombinantnih fosfonataza. Schiffov osnovni mehanizam za koji je poznato da djeluje u B. cereus enzim je potvrđen za S. typhimurium enzim inaktivacijom izazvanom fosfonoacetaldehid-natrijevim borhidridom i mutagenezom usmjerenom na mjesto katalitičkog lizina 53. Proteinski slijed izveden iz B. cereus određen je gen fosfonataze, a ovaj slijed je korišten uz onu iz S. typhimurium slijed gena fosfonataze za pretraživanje baza podataka primarnih sekvenci za moguće strukturne homologe. Otkrili smo da fosfonataza pripada novoj obitelji hidrolaza za koje se čini da koriste visoko konzervirano aktivno mjesto aspartatnog ostatka u kovalentnoj katalizi. Na temelju ovog nalaza i poznatog stereokemijskog tijeka hidrolize katalizirane fosfonatazom na fosforu (retencija), predlažemo mehanizam koji uključuje formiranje Schiffove baze s lizinom 53 nakon čega slijedi prijenos fosforila u aspartat (na poziciji 11 u S. typhimurium enzima i položaj 12 u B. cereus fosfonataza) i posljednja hidroliza na imin C(1) i acil fosfat fosfor.

Ovaj rad su podržali NIH Grants GM-36360 (D.D.-M.) i GM-35392 (B.L.W.) i grant Ministarstva energetike DE-FG03-96ER62269 (P.C.B.).

Trenutna adresa: Department of Microbiology, University of Illinois, Urbana, IL 61801-3704.

Nacionalni instituti za zdravlje.

Odgovarajući autor. E-mail: [email protected] Telefon: (505) 277-3383. Faks: (505) 277-6202.


Schiffova baza u enzimskim mehanizmima - biologija

Snimka eksperimentalnih podataka

  • Metoda: DIFRAKCIJA X-ZRAKA
  • Rezolucija: 1,85 Å
  • R-vrijednost besplatno: 0,187 
  • R-vrijednost rada: 0,149 
  • Uočena R-vrijednost: 0,149 

wwPDB provjera valjanosti   3D izvješće Cjelokupno izvješće

Mehanizam tvorbe Schiffove baze fruktoza-1,6-bisfosfat aldolaze: strukturna analiza reakcijskih međuprodukta.

(2005.) Biokemija 44: 4222-4229

  • PubMed: 15766250  Pretražujte na PubMedu
  • DOI: 10.1021/bi048192o
  • Primarni citat srodnih struktura:  
    2YCE, 1W8S
  • PubMed Sažetak: 

Glikolitički enzim fruktoza-1,6-bisfosfat aldolaza (FBPA) katalizira reverzibilno cijepanje fruktoze 1,6-bisfosfata u gliceraldehid 3-fosfat i dihidroksiaceton fosfat. Kataliza tvorbe Schiffove baze FBPA klase I oslanja se na niz intermedijara kovalentno vezanih na katalitički lizin.

Glikolitički enzim fruktoza-1,6-bisfosfat aldolaza (FBPA) katalizira reverzibilno cijepanje fruktoze 1,6-bisfosfata u gliceraldehid 3-fosfat i dihidroksiaceton fosfat. Kataliza tvorbe Schiffove baze FBPA klase I oslanja se na niz intermedijara kovalentno vezanih na katalitički lizin. Koristeći mutante aktivnog mjesta FBPA I iz Thermoproteus tenaxa, riješili smo kristalne strukture enzima kovalentno vezanog na karbinolamin supstrata fruktoza 1,6-bisfosfat i nekovalentno vezanog za ciklički oblik supstrata. Strukture, određene pri razlučivosti od 1,9 A i rafinirane na kristalografske R faktore od 0,148 odnosno 0,149, predstavljaju prvi pogled na bilo koji FBPA I u ove dvije faze reakcijskog puta i omogućuju detaljnu analizu uloga ostataka aktivnog mjesta u katalizi. Geometrija aktivnog mjesta varijante Tyr146Phe FBPA s karbinolaminskim intermedijerom podržava ideju da je u arhealnom FBPA I Tyr146 donor protona koji katalizira pretvorbu između karbinolamina i Schiffove baze. Naša strukturna analiza nadalje pokazuje da je Glu187 donor protona u eukariotskom FBPA I, dok je asparaginska kiselina, konzervirana u svim enzimima FBPA I, u savršenoj poziciji da bude opća baza koja olakšava cijepanje ugljika i ugljika. Kristalna struktura trp144Glu, Tyr146Phe dvostruko mutantnog supstratnog kompleksa predstavlja prvi primjer u kojem je ciklički oblik beta-fruktoze 1,6-bisfosfata nekovalentno vezan na FBPA I. Struktura stoga prvi put omogućuje katalitički mehanizam prstena otvor za rasplet.


UVOD

Popravak oštećene DNA nužan je za očuvanje integriteta genoma, a oštećene baze DNA eliminiraju se enzimima za popravak baze (BER) (1-5). Izrezivanje oštećene baze i cijepanje lanca DNA koji uključuje abazično mjesto obavljaju bifunkcionalni BER enzimi unutar glikozilaze i naknadne reakcije β-liaze (6). Izrezivanje oštećene baze DNA prvi je ireverzibilni korak puta popravka koji započinje formiranjem kompleksa enzim-DNA koji uključuje strukturno preuređenje oštećene DNA lanca (slika 1A) (7-9).

Enzim hOGG1 BER. Skica strukturnog modela QM/MM uključujući hOGG1 (cijan) i DNK koja sadrži oxoG (crvena) koja je izvedena iz 2NOZ (33) kristalne strukture (A). Kemijska struktura guanina (G), oxoG, Lys249 i Asp268 u WT hOGG1 i Asn268 u hOGG1(D268N) mutantu (B). Detalj katalitičke jezgre prije ekscizije oxoG u 2NOZ (žuto) i u QM/MM-optimiziranom reaktantu (obojeno atomom) (C). Detalj katalitičke jezgre uključujući kovalentni adukt Lys249-riboze s otvorenim prstenom šećera u kristalu 1HU0 ( 34) (žuto) i u QM/MM izračunatom reakcijskom produktu (stacionarno stanje P+1) koji opisuje Schiffovu bazu (obojen atomom ) (D).

Enzim hOGG1 BER. Skica strukturnog modela QM/MM uključujući hOGG1 (cijan) i DNK koja sadrži oxoG (crvena) koja je izvedena iz 2NOZ (33) kristalne strukture (A). Kemijska struktura guanina (G), oxoG, Lys249 i Asp268 u WT hOGG1 i Asn268 u hOGG1(D268N) mutantu (B). Detalj katalitičke jezgre prije ekscizije oxoG u 2NOZ (žuto) i u QM/MM-optimiziranom reaktantu (obojeno atomom) (C). Detalj katalitičke jezgre uključujući kovalentni adukt Lys249-riboze s otvorenim prstenom šećera u kristalu 1HU0 ( 34) (žuto) i u QM/MM izračunatom reakcijskom produktu (stacionarno stanje P+1) koji opisuje Schiffovu bazu (obojen atomom ) (D).

Primarni čimbenik koji dovodi do nakupljanja DNK mutacija je oksidativni stres. oxoG, koji nastaje iz oksidativno oštećenog gvanina (G), spada u najzastupljenije i najopasnije lezije DNK (slika 1B) (10-12). oxoG izaziva ozbiljne defekte u organizmima, a njegovo kontinuirano uklanjanje ključno je za otklanjanje neželjenih posljedica bazalnih respiratornih procesa koji se inače javljaju u stanicama (13). Nasuprot tome, pretpostavlja se da je kontrolirano zaustavljanje popravka oxoG u stanicama raka popravak u naprednim terapijama protiv raka (14).

Reakcija glikozilaze kojom upravljaju BER enzimi zahtijeva aktivaciju kako bi se prevladala energetska barijera za cijepanje N-glikozidne veze. Opskrba do 19 kcal/mol ubrzava cijepanje veze 10 14 puta ( 4). Svi BER enzimi su tipično specifični za lezije, što je osobito istinito za hOGG1, koji djeluje protiv oxoG sa zapanjujućom specifičnošću (15-28). Pogrešno ponašanje hOGG1 najvjerojatnije se ne može dogoditi, jer katalitička kontrolna točka sprječava čak i cijepanje G nasilno umetnutog u katalitičko mjesto (29). Umetanje oxoG u katalitičko mjesto događa se mnogo brže od naknadnog preuređivanja katalitičke jezgre (30). Inhibitor hOGG1 koji može oponašati prave supstrate tako bi mogao postati terapeutsko sredstvo protiv određenih vrsta raka (31).

Strukturu katalitičke jezgre hOGG1 otkrila je Verdineova skupina.Prvo, otkrili su mehaničku osnovu za prepoznavanje i izrezivanje oxoG pomoću neaktivnog hOGG1(K249Q) mutanta, gdje je Lys249 zamijenjen s Gln (8). Kasnije su pokazali da je Asp268 još jedan glavni katalitički ostatak koristeći mutant hOGG1(D268N) gdje je Asp268 supstituiran s Asn (slika 1B) (32). Ovi rezultati doveli su nas do fokusa na Lys249 i Asp268 u našem radu. Gly42, prikazan također na slici 1B, vjerojatno je odgovoran za prepoznavanje i pravilno taloženje oxoG unutar katalitičke jezgre silom vodikove veze s H7(oxoG) (29).

Struktura katalitičke jezgre hOGG1, neposredno prije ekscizije oxoG, uhvaćena je u 2NOZ kristalu (slika 1C). Pretpostavljeno je nekoliko mehanizama reakcije glikozilaze za različita stanja protoniranja Asp268 i Lys249 jer su stvarni oblici trenutno nepoznati. CO2 − Pretpostavlja se da (Asp268) osigurava elektrostatičku stabilizaciju oksokarbenijevog kationa na ribozi tijekom rupture N-glikozidne veze, budući da je mutacija Asp268 u Asn značajno potisnula funkciju mutanta hOGG1(D268N) (32, 35). Što se tiče Lys249, slična bliskost Nε dušika s N3, N9 i C1΄ atomima oxoG (slika 1B), uočena u kristalima, ukazuje na različite reakcije ekscizije baze. NH3 + (Lys249) bi mogao stabilizirati negativni naboj na izlaznoj oxoG bazi, dok NH2(Lys249) mogao stabilizirati oksokarbenijev kation na šećeru. Odgovarajuće reakcije ekscizije baze su zapravo pretpostavljene (6, 23, 32, 34, 36, 37). Mutacija Lys249 u Cys ili Gln uzrokovala je gubitak katalitičke funkcije bifunkcionalnog hOGG1 (8, 34, 37). Lys249 tvori Schiffovu bazu s ribozom abazičnog mjesta nakon oxoG ekscizije (8). Kovalentni adukt Lys249-riboze, nastao iz Schiffove baze dodatkom redukcijskog agensa, uhvaćen je u kristalu 1HU0 (34). Važno je da se geometrije reaktanta i produkta zarobljenog u kristalima mogu koristiti za pouzdano teorijsko modeliranje reakcije glikozilaze (Slike 1C i D).

Kompenzacija za naboje koji se razvijaju unutar molekule supstrata glavnim katalitičkim ostacima je tipična enzimska strategija (38). Ova opća strategija razmatrana je u teorijskim izračunima reakcija ekscizije baze koje provodi hOGG1 u brojnim studijama. Učinak NH2(Lys249) na oksokarbenijev kation riboze uspoređen je s učincima drugih nukleofila (39, 40). Kaskadna migracija protona iz NH3 + (Lys249) na O8(oxoG), a zatim na O4΄ riboze aktivirao je otvaranje riboznog prstena i izrezivanje baze oxoG (41). Sinkroni napad NH2(Lys249) do C1΄(riboza) i CO2H(Asp268) do O4΄(riboza) rezultiralo je otvaranjem prstena oxoG riboze i naknadnom ekscizijom oxoG baze (ribozom protonirani mehanizam) (42). Sličan mehanizam predložen je za otvaranje šećernog prstena supstratnog nukleozida s endonukleazom III-DNA (43). Interakcija π–kationa između aromatskog prstena oksoG baze i NH3 + (Lys249) pokrenuo je prijenos protona iz NH3 + (Lys249) do N3(oxoG), što je aktiviralo reakciju ekscizije baze (44, 45). Na kraju, apstrakcija protona iz NH3 + (Lys249) s atomom N9(oxoG) pokrenuo je supstituciju N-glikozidne veze oxoG vezom N9-H na usklađen sinkroni način (mehanizam supstitucije σ-veze) (46).

Prethodne studije jasno pokazuju glavni učinak Lys249 i Asp268 na katalitičku funkciju hOGG1. Kao što je spomenuto, protonacijska stanja dvaju ostataka trenutno su nepoznata, a funkcija tih ostataka tijekom reakcije glikozilaze je stoga nejasna. Ipak, tipične vrijednosti pKa za bočne lance Lys i Asp impliciraju vjerojatni NH3 + (Lys249) i CO2 − (Asp268) oblikuje ( 47). Pod ovom pretpostavkom, Lys249 vjerojatno kompenzira negativni naboj na odlazećoj oxoG bazi, a Asp268 kompenzira početni naboj na oksokarbeniji riboze. Prethodno je predložena reakcija supstitucije σ-veze koja je u skladu s ovim pretpostavkama, uz pretpostavku samo učinka Lys249 (46). U sadašnjem radu, reakcija ekscizije baze s hOGG1 bit će ilustrirana unutar kompletne katalitičke jezgre primjenom metode izračuna QM/MM. Posebno će biti obrađena funkcija Asp268. Poznato je da je ostatak Asp dobro očuvan unutar OGG obitelji BER enzima, međutim, funkcija još uvijek nije jasna (4). Mjerenja nuklearne magnetske rezonancije (NMR) korištenjem WT hOGG1 i hOGG1(D268N) mutanta u ovom radu utvrdila su na koju od funkcija bifunkcionalnog hOGG1 zapravo utječe mutacija D268N. NMR eksperimenti i QM/MM izračuni dali su koherentnu sliku reakcije ekscizije baze unutar reakcije glikozilaze kojom upravlja enzim hOGG1 BER.


Prvo opažanje metamorfoze enzima koji katalizira dvije kemijske reakcije

Slika 2. Ukupna trodimenzionalna struktura FBPA/P. Osam identičnih jedinica okuplja se u strukturu nalik bačvi. Svaka jedinica je predstavljena prelivom bojom (plava, svijetloplava, zelena, žućkasto zelena, narančasta i crvena). Vezane DHAP baze i magnezijevi ioni prikazani su kao ljubičaste, odnosno ružičaste sfere.

Profesor Takayoshi Wakagi i izvanredni profesor Shinya Fushinobu s Fakulteta poljoprivrednih i životnih znanosti, Sveučilišta u Tokiju i kolege bili su prvi koji su razjasnili kako enzim hipertermofilnog porijekla arheja za koji se smatra da se nalazi blizu nastanka života može katalizirati dvije reakcije dok se sama metamorfozira.

Arheje posjeduju mnoge neobične enzime. Među njima je posebno osebujna fruktoza-1,6-bisfosfat (FBP) aldolaza/fosfataza. Očigledno kršeći biokemijske kanone, ovaj enzim katalizira dvije bitno različite kemijske reakcije. Osim toga, ovaj enzim odgovoran je za biosintezu glukoze, proces od kritične važnosti u ranoj fazi evolucije života.

Istraživački tim koristio je Tvornicu fotona u KEK-u kako bi promatrao strukturnu metamorfozu enzima kako bi doveo do katalize dviju različitih reakcija. Takav multifunkcionalni enzim razbija dugotrajna vjerovanja u biokemiju i podiže intrigantnu mogućnost da bi se još takvih enzima moglo otkriti u drugim organizmima.

Hipertermofili žive u ultra-vrućoj vodi i smješteni su blizu korijena evolucijskog stabla života. Kao takvi, smatra se da su bliski zajedničkom pretku života na Zemlji. Mnogi hipertermofili su kategorizirani kao arheje, koje pripadaju različitim granama od onih uobičajenih organizama, kao što su bakterije i eukarioti. Neke hipertermofilne arheje imaju sposobnost izgradnje vlastitog tijela sintetiziranjem složenih spojeva iz jednostavnih anorganskih tvari, na primjer u biosintezi saharida iz ugljičnog dioksida. Smatra se da su reakcioni putevi u kojima organizmi sintetiziraju glukozu važni u evoluciji primitivnih organizama.

Slika 3. Reakcije koje katalizira FBPA/P (lijevo) i shematski prikazi regija u kojima se reakcije javljaju (desno). Tri petlje prolaze kroz značajne konformacijske promjene u promjeni između oblika FBP aldolaze (gore desno) i FBP fosfataznog oblika (dolje desno).

Za najčešće organizme dva različita enzima, fruktoza-1,6-bisfosfat (FBP) aldolaza i FBP fosfataza, sekvencijalno su odgovorni za kemijske reakcije koje dovode do proizvodnje glukoze. Nasuprot tome, hipertermofilne arheje koriste jedan protein, nazvan FBP aldolaza/fosfataza (FBPA/P), da katalizira ove dvije reakcije. Za ovaj bi se enzim moglo reći da je bifunkcionalan.

Istraživački tim proučavao je FBPA/P pronađen u hipertermofilnom arheonu, Sulfolobus, izoliranom iz tople vode u Beppu Onsenu u prefekturi Oita, Japan. Trodimenzionalna struktura FBPA/P izgleda slično buretu od osam identičnih molekularnih jedinica. Reakcije se kataliziraju u područjima između ovih jedinica.

Dvije reakcije koje FBPA/P katalizira su: 1) FBP aldolazna reakcija, u kojoj dihidroksiaceton fosfat (DHAP) i gliceraldehid-3-fosfat (GA3P) proizvode FBP i 2) reakcija FBP fosfataze, u kojoj se FBP cijepa u 6 -fosfat (F6P) i anorganski fosfat (Pi).

Godine 2004. istraživački je tim razjasnio trodimenzionalnu strukturu kompleksa enzim-supstrat dok FBPA/P katalizira reakciju FBP fosfataze. U ovoj studiji, ista grupa uspjela je razotkriti trodimenzionalni oblik kompleksa enzim-supstrat dok FBPA/P katalizira reakciju FBP aldolaze korištenjem rendgenske kristalografije u svojim eksperimentima provedenim na liniji snopa AR-NW12A od Tvornica fotona KEK-a. Usporedba ova dva oblika pokazala je da se aktivno mjesto (područje enzima u kojem se katalizira kemijska reakcija) FBPA/P metamorfozira u dva potpuno različita oblika zahvaljujući opsežnim kretanjima triju petlji (petlja kapaka, petlja s Schiffovom bazom i C-terminalna petlja).

U obliku FBP aldolaze, lizinski ostatak (K232) veže se na prvi supstrat, DHAP. Kada drugi supstrat, GA3P, uđe u aktivni centar, smatra se da susjedni tirozinski ostatak (Y229) posreduje reakciju GA3P i DHAP u FBP (reakcija FBP aldolaze). Kada se FBP proizvodi, lizinski ostatak postaje slobodan i tri petlje se mogu pomicati. Petlja s Schiffovom bazom se preokreće i zatvaraju se i poklopac i C-terminalne petlje, metamorfizirajući enzim u njegov FBP fosfatazni oblik. Zatim, ostatak aspartata (D233) ulazi u aktivni centar i veže ione magnezija, čime se pokreće disocijacija FBP u F6P i Pi (FBP fosfatazna reakcija).

Ovo otkriće otkrilo je da je takva ‘metamorfoza’ ključ za katalizu dviju različitih reakcija za dani slijed enzimske reakcije. Taj mehanizam okreće naopako utvrđenu biokemijsku dogmu koja opisuje da jedan enzim katalizira samo jednu reakciju.

Uobičajeni organizmi novijeg porijekla ne posjeduju FBPA/P, već koriste dva različita enzima odvojeno da kataliziraju dvije reakcije neovisno. Moguće je da bi primitivni organizmi mogli izvoditi biosintezu na jednostavniji način nego što to čine suvremeni organizmi koristeći bifunkcionalne enzime kao što je FBPA/P.

Ova studija je prva koja otkriva mehanizam pomoću kojeg jedan enzim može katalizirati dvije različite kemijske reakcije. Štoviše, trenutni nalaz upućuje na mogućnost da postoji više multifunkcionalnih enzima sličnih FBPA/P. Osim toga, može se očekivati ​​da će biti otkriveno više enzima sposobnih za pretvorbu jednostavnih početnih materijala u sintetički korisne međuprodukte.


Nova tiazolil Schiff baza: antibakterijski i antifungalni učinci i In vitro Modulacija oksidativnog stresa na ljudskim endotelnim stanicama

Schiffove baze (SB) su kemijski spojevi koji pokazuju značajan farmakološki potencijal. Oni su u stanju modulirati aktivnost mnogih enzima uključenih u metabolizam i nalaze se među antibakterijskim, antifungalnim, protuupalnim, antioksidativnim i antiproliferativnim lijekovima. Dobiven je novi tiazolil-triazol SB koji je karakteriziran elementarnom i spektralnom analizom. Antibakterijska i antifungalna sposobnost SB procijenjena je protiv Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija i protiv tri Candida naprezanja. SB je pokazao dobro antibakterijsko djelovanje protiv L. monocytogenes i P. aeruginosa bio je dva puta aktivniji od ciprofloksacina. Anti-Candida aktivnost je bila dvostruko veća u usporedbi s flukonazolom. Učinak SB na vitalnost stanica procijenjen je kolorimetrijskim mjerenjem na staničnim kulturama izloženim različitim koncentracijama SB. Sposobnost SB da modulira oksidativni stres procijenjena je mjerenjem MDA, TNF-αrazine , SOD1, COX2 i NOS2 in vitro, koristeći kulture ljudskih endotelnih stanica izložene mediju obogaćenom glukozom. SB nije promijenio morfologiju stanica. Eksperimentalni nalazi pokazuju da novosintetizirana Schiffova baza ima antibakterijsko djelovanje, posebno na Gram-negativne P. aeruginosai antifungalno djelovanje. SB je također pokazao antioksidativno i protuupalno djelovanje.

1. Uvod

Aerobni organizmi imaju antioksidativni obrambeni sustav protiv oštećenja izazvanih reaktivnim kisikovim vrstama (ROS-) koja nastaju u različitim stresnim uvjetima. ROS su također uključeni u urođeni imunološki sustav i imaju važnu ulogu u upalnom odgovoru, privlače stanice, kemotaksijom, na mjesto upale. Dušikov oksid (NO) je još jedna važna unutarstanična i međustanična signalna molekula uključena u regulaciju više fizioloških i patofizioloških mehanizama. Djeluje kao biološki modulator. NO može regulirati vaskularni tonus i može funkcionirati kao obrambeni efektor domaćina. Također, može djelovati kao citotoksično sredstvo kod upalnih poremećaja. Porodica enzima NO sintaze (NOS) katalizira proizvodnju NO. Inhibicija inducibilnog NOS (iNOS) može biti korisna u liječenju određenih upalnih bolesti [1]. Reakcije između NO i ROS, kao što su superoksidni radikali (O2 ⋅−), dovode do proizvodnje snažnog prooksidantnog radikala (peroksinitrita), izazivajući tako endotelnu i mitohondrijalnu disfunkciju. Glavna stanična obrana od peroksidnih i peroksinitritnih radikala su superoksid dismutaze (SOD) koje kataliziraju transformaciju peroksidnih radikala u vodikov peroksid (H2O2), koji se dalje transformira katalazom u vodu i molekularni kisik. Također, SOD imaju važnu ulogu u sprječavanju stvaranja peroksinitrita [2]. Sve izoforme na svom katalitičkom mjestu imaju prijelazni metal, kao što su bakar i mangan [3].

Nedavne studije su pokazale da egzogeni NO, koji proizvodi bakterijski NOS, štiti Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureusitd.) protiv oksidativnog stresa i povećava otpornost bakterija na široki spektar antibiotika [4]. Rezistencija gljivica na antimikotičko liječenje jedna je od posljedica pojave rezistentnih sojeva, no sve je više, posljednjih godina, otpornost gljivica zbog sposobnosti sojeva gljivica da stvaraju biofilm, koji se smatra kritičnim kod invazivnih gljivičnih infekcija, povezana s visokom smrtnošću. Određene studije su pokazale da je samo nekoliko antimikotika učinkovito protiv biofilma gljivica. Svi oni imaju sposobnost induciranja stvaranja ROS-a u stanicama biofilma gljiva [5]. U tom kontekstu, pronalaženje bioaktivnih tvari koje su sposobne smanjiti sintezu NO u bakterijama ili potaknuti sintezu ROS u biofilmima gljiva moglo bi predstavljati nove smjerove u razvoju novih antimikrobnih lijekova. Među antibakterijskim i protuupalnim lijekovima nalaze se tiazoli, triazoli i njihovi derivati ​​[6-9].

Schiffove baze (SB) su kemijske strukture koje imaju značajan farmakološki potencijal. SB sadrže azometinsku skupinu dobivenu kondenzacijom primarnih amina s karbonilnim spojevima [10]. Farmakoforni potencijal ove skupine posljedica je njihove sposobnosti stvaranja složenih spojeva s dvovalentnim i trovalentnim metalima koji se nalaze u aktivnom središtu brojnih enzima uključenih u metaboličke reakcije. Odnos između kemijske strukture i biološke aktivnosti (SAR) naglašava važnost azometinske skupine za sintezu novih spojeva s antibakterijskim, antifungalnim, pa čak i antitumorskim djelovanjem [11-13].

Više studija pokazalo je sposobnost SB-a da djeluju kao antiproliferativni i antitumorski agensi [14-16]. Farmakofor azometina koristi se u razvoju novih bioaktivnih molekula [17]. Otkriće selektivnih citotoksičnih lijekova utjecalo je na onkološku terapiju. Međutim, još uvijek nisu pronađeni potpuno zadovoljavajući odgovori za pojavu metastaza. Zbog povećane prevalencije neoplazija i postojanja različitih staničnih tumorskih linija otpornih na citotoksičnu terapiju, opravdano je istraživanje novih djelatnih tvari [18, 19].

Sadašnja studija usmjerena je na testiranje novosintetiziranog heterocikličkog SB u smislu antimikrobne aktivnosti protiv gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija i antifungalnih učinaka protiv Candida sojeva [20, 21], kao i za procjenu biokompatibilnosti SB in vitro na ljudske endotelne stanice i sposobnost ovog SB-a da modulira oksidativni stres, procjenom enzima uključenih u staničnu antioksidantnu obranu.

2. Materijali i metode

2.1. Sinteza Schiffove baze

Svi korišteni reagensi i otapala kupljeni su od Sigma-Aldricha i korišteni su bez daljnjeg pročišćavanja. Početni spoj je prethodno objavljen, a sintetizirali smo ga prema metodologijama opisanim u literaturi [21].

Sinteza Schiffove baze (SB) 4-(3-bromobenzilidenamino)-5-(4-metil-2-feniltiazol-5-il)-4H-1,2,4-triazol-3-tiola izvedena je korištenjem općeg postupak (shema 1) [21]. 2 mmol (0,578 g) 4-amino-5-(4-metil-2-feniltiazol-5-il)-4H-1,2,4-triazol-3-tiola suspendirano je u 10 mL apsolutnog etanola. Dobivena suspenzija je dodana s alkoholnom otopinom od 2 mmol 3-bromobenzaldehida u 5 mL apsolutnog etanola i 2-3 kapi koncentriranog H.2TAKO4, kao katalizator. Reakcijska smjesa je refluksirana 6 h. Dobiveni talog je vruć filtriran i ispran apsolutnim etanolom, a zatim je osušen i prekristaliziran iz dimetil sulfoksida (DMSO).

2.2. In vitro antibakterijski i antifungalni probir
2.2.1. Priprema otopine uzorka

SB je otopljen u DMSO, u konačnoj koncentraciji od 100 μg/mL. Otopina uzorka pohranjena je na 4°C [22, 23].

2.2.2. Mjerenja promjera zone inhibicije

Ispitana je antimikrobna aktivnost in vitro korištenjem metode difuzije agar diska kroz mjerenje promjera zone inhibicije. Ploče s agarom inokulirane su standardiziranim inokulumom ispitivanih mikroorganizama: dva gram-negativna bakterijska soja—Salmonella enteritidis ATCC 14028 i Escherichia coli ATCC 25922, dva gram-pozitivna soja bakterija—Listeria monocytogenes ATCC 19115 i Staphylococcus aureus ATCC 49444 i soj gljivica—Candida albicans ATCC 10231. Petrijeve ploče s Mueller Hinton agarom (20,0 mL) korištene su za sve bakterijske testove. Mueller-Hintonov medij s dodatkom 2% glukoze (omogućava odgovarajući rast kvasaca) i 0,5 g/L metilenskog plavog (daje bolju definiciju promjera zone inhibicije) korišten je za antifungalno testiranje. Svaki papirni disk impregniran je s 10 μL otopine (100 μg spoj/disk). Diskovi filter papira stavljeni su na Petrijeve zdjelice prethodno zasijane “u sloju” s inokulumima testiranog bakterijskog soja. Zatim su Petrijeve zdjelice održavane na sobnoj temperaturi kako bi se osigurala jednaka difuzija spoja u mediju, a zatim su zdjelice inkubirane na 37°C tijekom 24 sata. Zone inhibicije mjerene su nakon 24 sata inkubacije. Procjena antimikrobnog učinka provedena je mjerenjem promjera zone inhibicije rasta. Ciprofloksacin (10 μg/jažicu) i flukonazol (25 μg/jažinac) korišteni su kao standard antibakterijski i antifungalni droge. DMSO je korišten za usporedbu, kao negativna kontrola, za sve pokuse i nije inhibirao rast mikroorganizama (

). Prozirne oreole promjera većeg od 10 mm smatraju se pozitivnim rezultatima [22, 23]. Testovi su izvedeni u tri primjerka, a vrijednosti su prikazane kao

2.2.3. Određivanje minimalnih inhibicijskih koncentracija (MIC), minimalnih baktericidnih koncentracija (MBC) i minimalnih fungicidnih koncentracija (MFC)

Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC), minimalne baktericidne koncentracije (MBC) i minimalne fungicidne koncentracije (MFC) određene su metodom razrjeđenja agarom. Korišteni sojevi mikroorganizama bili su sljedeći: Salmonella enteritidis ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Staphylococcus aureus ATCC 49444, Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans (ATCC 18804), i Candida krusei (ATCC 6258) [22–26]. Za eksperiment, 100 μL hranjivih bujona stavljeni su u ploču s 96 jažica, a otopina uzorka pri visokoj koncentraciji (100 μg/mL) dodan je u prve redove mikroploča. 10 μL suspenzije kulture je inokuliran u sve jažice. Ploče su inkubirane na 37°C 16-24 sata (48 sati za gljive). Referentni lijekovi, ciprofloksacin i flukonazol, korišteni su u istim koncentracijama.

2.3. Određivanje antioksidativne aktivnosti DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) testom izbjeljivanja

Ispitivanje antioksidativne aktivnosti DPPH učinjeno je kako je prethodno opisano, uz manje izmjene. SB je otopljen u DMSO (1 mg/mL). DPPH∙ radikal je otopljen u metanolu (0,25 mM). Upotrijebljeni su jednaki volumeni (1,0 mL) metanolne otopine DPPH i otopine uzorka (ili standarda) u metanolu u različitim koncentracijama. Smjese su inkubirane 30 minuta na 40°C u termostatskoj kupelji. Izmjerena je apsorpcija na 517 nm. Postotak sposobnosti uklanjanja DPPH izračunat je na sljedeći način:

, gdje je apsorbancija DPPH radikala i metanola (koji sadrži sve reagense, osim uzorka) i apsorbancija smjese DPPH radikala i uzorka. Nacrtana je krivulja postotka sposobnosti uklanjanja DPPH u odnosu na koncentraciju i IC50 izračunate su vrijednosti. IC50 vrijednost je koncentracija uzorka potrebna za uklanjanje 50% slobodnih radikala DPPH. Što je IC manji50 vrijednost, jači je antioksidativni kapacitet. Dakle, ako

, uzorak pokazuje visok antioksidativni kapacitet ako

, uzorak ima umjereni antioksidativni kapacitet ako

, uzorak ima slabu ili nikakvu aktivnost. Kao pozitivne kontrole korišteni su BHT (butilirani hidroksitoluen) i trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina) [20, 27–30].

2.4. Procjena sposobnosti SB da modulira upalni odgovor i oksidativni stres na staničnim kulturama
2.4.1. Izvor stanice

Korištene su endotelne stanice ljudske pupčane vene (HUVECs, Promocell, Hamburg, Njemačka). Stanice su uzgajane u RPMI mediju s dodatkom 5% fetalnog telećeg seruma, 50 μg/mL gentamicina i 5 ng/mL amfotericina (Biochrom Ag, Berlin, Njemačka). Korištene su kulture stanica od 13. do 15. pasusa. SB je razrijeđen u DMSO (Biochrom Ag, Berlin, Njemačka) da se dobije temeljna otopina od 1 mg/mL. Osnovna otopina je korištena za daljnja razrjeđenja u cijelom mediju za rast stanica, neposredno prije pokusa. Konačna koncentracija DMSO bila je niža od 0,05%, što je netoksična koncentracija za stanice [31].

2.4.2. Ispitivanje vitalnosti stanica

Stanice kultivirane pri gustoći od 10 4/jažici na ELISA plakovima s 96 jažica (TPP, Švicarska) staložene su 24 sata, a zatim izložene različitim koncentracijama tvari u rasponu od 0,001 do 200 μg/mL. Vijabilnost je mjerena kolorimetrijskim mjerenjem obojenog spoja—formazana, generiranog od vitalnih stanica pomoću CellTiter 96® AQueous neradioaktivnog testa proliferacije stanica (Promega Corporation, Madison, SAD). Očitavanja su obavljena na 540 nm, pomoću ELISA čitača ploča (Tecan, Mannedorf, Austrija). Rezultati su predstavljeni kao OD540. Svi pokusi izvedeni su u tri primjerka. Netretirane kulture korištene su kao kontrole [32].

2.4.3. Eksperimentalni dizajn

Napravljene su četiri skupine: (1) kontrolne stanice tretirane samo medijem, (2) stanice izložene mediju s visokim sadržajem glukoze (4,5 g/L), (3) stanice tretirane sa SB 0,001 μg/mL i (4) stanice koje su istodobno izložene visokoj glukozi i SB (0,001 μg/mL). Sve grupe su tretirane 24 sata. Nakon toga, stanice su korištene za procjenu modifikacija citoskeleta – bojenje faloidina (fluorescentna mikroskopija), oksidativni stres (Western blot mjerenje SOD1, COX2 i inducibilnog NOS2 i spektrofotometrijsko mjerenje MDA) i upale (ELISA mjerenje TNF-a).α).

2.4.4. Liza stanica

Stanični lizati korišteni u sljedećim eksperimentima pripremljeni su kako je prethodno opisano [33]. Koncentracije proteina određivane su Bradfordovom metodom, prema specifikacijama proizvođača (Bio-Rad, Hercules, California, USA) i korištenjem goveđeg serumskog albumina kao standarda. Za sve testove, lizati su korigirani ukupnom koncentracijom proteina.

2.4.5. Procjena oksidativnog stresa i upale

Kvantifikacija malondialdehida (MDA) kao markera za peroksidaciju membranskih lipida provedena je spektrofotometrijom, kao što je prethodno opisano [34]. Svi reagensi su kupljeni od Sigma-Aldrich. Podaci su izraženi kao nM/mg proteina [35]. Nakon ispitivanja održivosti i procjene razine MDA, stanice korištene u daljnjim eksperimentima tretirane su koncentracijom od 0,001 μg/mL.

TNF-α Korišten je ELISA komplet za imunotestiranje iz R&D Systems, Inc. (Minneapolis, SAD). Supernatanti stanica tretirani su prema uputama proizvođača, očitanja su učinjena na 450 nm s korekcijskom valnom duljinom postavljenom na 540 nm, korištenjem ELISA čitača ploča (Tecan) [33].

Lizati (20 μg protein/traka) razdvojeni su elektroforezom na SDS PAGE gelovima i prebačeni na poliviniliden difluoridne membrane, korištenjem Bio-Rad Miniprotean sustava (Bio-Rad). Mrlje su blokirane i zatim inkubirane s protutijelima protiv superoksid dismutaze 1 (SOD1), ciklooksigenaze 2 (COX2) i inducibilne sintaze dušikovog oksida 2 (NOS2), zatim su dodatno isprane i inkubirane s odgovarajućim sekundarnim antitijelima povezanim s peroksidazom. Sva antitijela su nabavljena od Santa Cruz Biotechnology. Proteini su detektirani korištenjem Supersignal West Femto Chemiluminescentnog supstrata (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, SAD) i Gel Doc Imaging sustava opremljenog XRS kamerom i softverom za analizu Quantity One (Bio-Rad). Gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH, Trevigen Biotechnology, Gaithersburg, MD (Maryland), SAD) korištena je kao kontrola punjenja proteina.

Faloidin-FITC 50 μg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) korišten je marker za aktinske miofilamente (zeleni), prema uputama proizvođača. Stanice su zasijane u stakalce komore pri gustoći od

/komora, ostavljena da se slegne 24 sata, a zatim izložena visokoj glukozi i SB kako je gore opisano. Tretirane stanice su zatim obojene faloidin-FITC. Slike stanica dokumentirane su uz povećanje od 20x, korištenjem invertnog mikroskopa Olympus BX40 opremljenog fluorescentnom svjetiljkom Olympus CKX-RFA i kamerom E330 (Olympus, Hamburg, Njemačka).

2.5. Statistička analiza

Statistička značajnost razlika između kontrolne skupine i liječenih skupina procijenjena je neparametrijskim Kruskal-Wallisovim testom za više skupina, nakon čega je uslijedila post hoc analiza korištenjem Conoverovog testa. Koeficijenti korelacije između parametara izračunati su pomoću Spearmanovog koeficijenta korelacije za rangove (rho). Statistički testovi provedeni su korištenjem MedCalc verzije 18.11.3 i GraphPad Prism Software verzije 8.0.2. Rezultati su smatrani statistički značajnim na

3. Rezultati

3.1. Kemijska karakteristika SB

Struktura SB potvrđena je elementarnom analizom i na temelju spektra mase (MS), infracrvenog spektra (IR) i nuklearne magnetske rezonancije (1 H NMR i 13 C NMR) [21].

4-(3-bromobenzilidenamino)-5-(4-metil-2-feniltiazol-5-il)-4H-1,2,4-triazol-3-tiol. Prinos 80,3% (0,366 g) t.t. 268-270°C svijetložuti prah Anal. Izračunato za C19H14BrN5S2 (456,38): C, 49,89 H, 3,06 N, 15,33 S, 14,02 Pronađeno: C, 50,1 H, 3,07 N, 15,33 S, 14,07 IR (ATR, cm -1): 3104 (ν NHtriazol), 1618 (ν -N=CH-), 1274 (ν C=S) 1055 (ν C-Br) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): 14,18 (s, 1H, NH), 9,52 (s, 1H, -N=CH-), 7,97–8,06 (d, 2H, ArH), 7,92 (s, 1H, ArH), 7,77 (d, 1H, ArH), 7,59 (d, 1H, ArH), 7,47-7,54 (m, 4H, ArH), 2,41 (s, 3H, CH3) 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6, δ/ppm): 170,12 (C=S), 159,15 (C), 157,66 (CH=N), 153,81 (C), 151,07 (C), 143,96 (C), 135,16 (C), 134,51 (C), 131,21 ( CH), 130,93 (2CH), 130,29 (CH), 129,29 (2CH), 128,94 (CH), 128,68 (C), 127,36 (CH), 127,14 (CH), 15,92 (CH)3) MS (EI, 70 eV) m/z (%): 457 (M + 1).

3.2. Antimikrobno djelovanje

Rezultati dobiveni mjerenjem promjera zona inhibicije rasta ispitivanih mikroorganizama u usporedbi s ciprofloksacinom i flukonazolom, koji se koriste kao standardni referentni lijekovi, prikazani su u tablici 1.

Vrijednosti MIC, MBC i MFC novog spoja prikazane su u tablicama 2 i 3. Rezultati su pokazali da su vrijednosti MIC u rasponu od 1,95 (Listeria monocytogenes) do 62,5 μg/mL, vrijednosti MBC-a bile su između 3,9 i 125 μg/mL, a MFC rezultati su se kretali između 62,5 i 125 μg/mL.

3.3. In vitro antioksidativni kapacitet

Antioksidativni kapacitet SB određen je DPPH metodom izbjeljivanja, a kao pozitivne kontrole korišteni su BHT i trolox. Rezultati su prikazani u tablici 4. Novi spoj pokazao je vrlo nizak IC50 vrijednost (16.10 μg/mL), slično kao i BHT (16,39 μg/mL).

3.4. Viabilnost stanica

SB nije doveo do značajnih promjena u vitalnosti HUVEC-a za doze niže od 0,1 μg/mL (slika 1). Više koncentracije dovele su do smanjenja vitalnosti ovisno o dozi u usporedbi s kontrolom.

3.5. Procjena sposobnosti SB da modulira upalni odgovor i oksidativni stres na HUVECs

Razina peroksidacije lipida (MDA), sposobnost modulacije upalnog odgovora (TNF-α, COX2) i cijenjena je aktivnost enzima uključenih u ravnotežu prooksidans/antioksidans (SOD1, NOS2). Ispitana je sposobnost SB-a da modulira oksidativni stres in vitro na HUVEC, koristeći medij obogaćen glukozom [36–38]. Koncentracija SB od 0,001 μg/mL je korišten za sve eksperimente.

Procijenjen je učinak novosintetiziranog spoja na peroksidaciju lipida (razina MDA). Primjena SB smanjila je razinu MDA u usporedbi s kontrolnim i glukozom obogaćenim medijem, čime je smanjena lipidna peroksidacija u endotelnim stanicama (slika 2).

TNF-α razina je kvantificirana putem ELISA za istu koncentraciju SB (Slika 3). Medij obogaćen glukozom blago povećava TNF-α razini. SB je također povećao TNF-α razina i sama i u kombinaciji s glukozom.

Ista koncentracija SB (0,001 μg/mL) korišteno je za daljnje ispitivanje njegovog učinka na razinu proteina enzima uključenih u ravnotežu oksidans/antioksidans i u upalni odgovor (SOD1, NOS2 i COX2).

Ekspresija upalnog biljega (COX2) i enzima antioksidansa (konstitutivni SOD1 i inducibilni NOS2) kvantificirana je Western Blotom (slika 4).

COX2, upalni marker, značajno se smanjio i nakon tretmana glukozom i SB, u usporedbi s kontrolom. Kombinirana izloženost (SB+G) snažno je smanjila razinu proteina COX2 (slika 4(b)). Ovaj nalaz je u skladu s razinama MDA i može biti posljedica antioksidativnog učinka SB u ovom eksperimentalnom okruženju. Zanimljivo je da nije u skladu s TNF-omα, činjenica koja se može objasniti drugačijim mehanizmom od oksidativnog stresa koji izaziva povećanje TNF-aα. Izloženost mediju obogaćenom glukozom značajno je smanjila SOD1. SB je neznatno smanjio aktivnost SOD1 u usporedbi s kontrolnom skupinom, ali je aktivnost SOD1 održana na značajno višoj razini u usporedbi s glukozom ( ). Kombinirano liječenje (SB+G) značajno je smanjilo SOD1 u usporedbi s glukozom i kontrolom (slika 4(c)). Izloženost glukozi značajno se povećala NOS2. SB je drastično smanjio razinu NOS2 u usporedbi s kontrolnom i glukoznom skupinom (slika 4(d)).

Korelacijska analiza, korištenjem Spearmanovog koeficijenta za korelaciju ranga (Tablica 5), ​​otkrila je statistički značajne pozitivne korelacije između razina MDA i enzima (COX2, SOD1 i NOS2). S druge strane, TNF-α razina negativno korelira i s MDA i sa svim izmjerenim enzimima.

Čini se da na morfologiju stanica ne utječe izlaganje Schiffovoj bazi u usporedbi s kontrolom. Kada su bile izložene visokoj koncentraciji glukoze, stanice su imale sklonost konglomeraciji i stvaranju višeslojnih sfernih tijela, s promjenom dispozicije aktinskih filamenata. Aspekt stanica koje su primale kombinirani tretman bio je sličan onima u kontrolama (slika 5).

4. Rasprava

Struktura Schiffove baze utvrđena je elementarnom analizom i na temelju njezinog spektra mase (MS), infracrvenog spektra (IR) i spektra nuklearne magnetske rezonancije (1 H-NMR i 13 C-NMR). Rezultati kvantitativne elementarne analize C, H, N, S bili su u skladu s izračunatim vrijednostima, unutar ±0,4% teorijskih vrijednosti. Spektralni podaci potvrdili su nastanak SB. Snimljeni maseni spektar otkrio je točan vrh molekularnog iona (

), kao što sugerira molekularna formula. Odsutnost NH2 asimetrične i simetrične vibracije istezanja na 3281 cm -1 i 3186 cm -1 , te prisutnost N=CH rasteznih apsorpcijskih vrpci na 1618 cm -1 u IR spektru konačnog spoja pružile su snažne dokaze za formiranje SB. 1H-NMR spektar početnog spoja zabilježen je kao signalna karakteristika za amino protone, kao singlet, na 5,73 ppm. Odsutnost ovog signala iz 1H-NMR spektra novosintetiziranog spoja i prisutnost singlet karakteristike za N=CH proton na 9,52 ppm dodatno su potvrdili kondenzaciju između 4-amino-5-(4-metil- 2-feniltiazol-5-il)-4H-1,2,4-triazol-3-tiol i 3-bromo-fenil-karbaldehid. 13C-NMR spektar novosintetiziranog spoja bio je u skladu s predloženom strukturom.

Cilj ovog istraživanja bio je procijeniti antibakterijsku i antifungalnu aktivnost novog SB kao i njegovu sposobnost modulacije oksidativnog stresa.

Novi tiazolil SB pokazao je umjereno do dobro antibakterijsko djelovanje protiv testiranih sojeva (tablice 1-3). Inhibicija rasta bakterija bila je izraženija kod gram-negativnih bakterija, osobito u Pseudomonas aeruginosa soja, gdje je SB pokazao bolju aktivnost u usporedbi s ciprofloksacinom, korištenim kao referentni lijek. Što se tiče antifungalne aktivnosti, spoj je pokazao bolji anti-Candida učinak od flukonazola, koji se koristi kao referentni lijek. Prethodne studije su pokazale da SB imaju sposobnost modulacije oksidativnog stresa [17, 39]. Ta se sposobnost može iskoristiti kako bi se koristili kao antibakterijski lijekovi i/ili kao potencijalni modulatori oksidativnog stresa u medicini. SB je testiran na endotelnim stanicama izloženim okolini obogaćenoj glukozom.

Visok unos ugljikohidrata, poremećena tolerancija glukoze i dijabetes melitus dovode do hiperglikemije i kroničnog upalnog statusa. Endotelne lezije često su uključene u patologiju ovih stanja [40]. Tijekom upalnih epizoda, kao što je odgovor na ozljedu, oslobađa se dušikov oksid (NO) kako bi se modulirao vaskularni tonus. Budući da glikokaliks igra važnu ulogu u prijenosu stresa tekućine u citoskelet endotelnih stanica, potiče se proizvodnja vazodilatatorne tvari [40-42]. Visoka koncentracija glukoze povećava oksidativni stres i utječe na strukturu citoskeleta. Izloženost hiperosmolarnom mediju s visokim sadržajem glukoze inducira, korištenjem mehanizma ovisnog o AQP1, remodeliranje F-aktina i citoskeleta [43]. Naši rezultati su u skladu s ovim nalazima (Slika 5). Visoka razina glukoze dovela je do mitohondrijske disfunkcije i povećane proizvodnje ROS-a [44, 45].

Okolina obogaćena glukozom također pokreće oslobađanje proupalnih citokina, kao što je faktor nekroze tumora alfa (TNF-α), stanicama uključenim u imunološke reakcije [46, 47], zajedno s drugim proupalnim molekulama, kao što su CRP, interleukin 6, molekula međustanične adhezije 1 i VCAM-1. U bolesnika s dijabetesom, TNF-α bio je povezan s aterogenim profilom i vaskularnim komplikacijama [48]. Sličan učinak dobiven je u našoj studiji, gdje su više razine TNF-aα opažene su nakon izlaganja hiperglikemiji. Ovaj učinak je također uočen nakon tretmana SB, a pojačan je kombiniranom koncentracijom SB i visoke glukoze. Međutim, TNF-α proizvodnja je bila u negativnoj korelaciji s MDA i antioksidativnim enzimima (Tablica 5). To sugerira da povećani TNF-α nije proizveden pojačanim oksidativnim stresom, već drugačijim mehanizmom. Njegovo pojašnjenje zahtijeva daljnje studije. Budući da TNF-α djeluje kao promotor adhezije leukocita na endotel, SB može biti koristan kao antimikrobni, lokalni imunološki odgovor i modulator oksidativnog statusa u liječenju zaraznih bolesti.

Rezultati dobiveni DPPH studijom pokazali su da SB pokazuje antioksidativno djelovanje. Nizak IC50 vrijednost, slična pozitivnoj kontroli (BHT), odražava snažno antioksidativno djelovanje in vitro. Novi spoj pokazao je aktivnost uklanjanja radikala prema DPPH metodi, a prisutnost -SH skupine vjerojatno je odgovorna za aktivnost uklanjanja radikala [49–51]. Također je ispitan učinak SB-a na oksidativni stres in vitro na staničnim kulturama (HUVECs), procjenom razine MDA, markera peroksidacije lipida i ekspresije dvaju enzima uključenih u oksidacijsku ravnotežu (SOD1 i NOS2). Rezultati su pokazali da je pri ispitivanoj koncentraciji (0,001 μg/mL), SB je smanjio peroksidaciju lipida (MDA) i razinu proteina određenih enzima uključenih u modulaciju oksidativnog stresa i upalnog odgovora (COX2 i NOS2). Ove promjene su u skladu s rezultatom DPPH i upućuju na protuupalni učinak testiranog SB, uglavnom interferirajući s prooksidativnim medijatorima.

Sposobnost SB-a, u niskim koncentracijama, da smanji peroksidaciju lipida, može se objasniti njegovom sposobnošću da formira komplekse s bivalentnim i trovalentnim ionima metala koji se nalaze u aktivnom središtu enzima koji sudjeluju u nastanku oksidativnog stresa ili u čišćenje molekula prooksidansa [52–57]. Antioksidativni učinak na ljudske stanice (Slike 2 i 4) također je u skladu s odsutnošću morfoloških promjena stanica uočenih u ovoj studiji (Slika 5).

S obzirom na antibakterijsko djelovanje, posebno protiv Pseudomonas aeruginosa, smanjenje razine proteina NOS2 u HUVEC-ima nakon izlaganja SB, moglo bi biti moguće da bi se sinteza NO od strane bakterija također mogla smanjiti. Jedna od mnogih predloženih uloga NO u bakterijama je pomoć u zaštiti bakterija od oksidativnog stresa izazvanog antibioticima stanice domaćina, stoga je inhibicija bakterijske sintaze dušikovog oksida identificirana kao obećavajuća antibakterijska strategija, posebno za rezistentne bakterije [58].

Zabilježeno je da inhibitori sintaze dušikovog oksida (NOS) lijekovi koji doniraju NO inhibiraju IL-1β proizvodnja, modulirati PGE2 proizvodnju i zaštitu od apoptoze u ljudskim endotelnim stanicama i ljudskim monocitima [59]. Kod dijabetesa tipa 2, hiperglikemija stimulira migraciju endotelnih stanica u mrežnicu, što dovodi do neoangiogeneze retine i oštećenja vida stimulacijom CXC receptora-4 i aktivacijom PI3K/Akt/eNOS signalnog puta. Stoga bi SB modulacija NOS2 mogla biti korisna za endotelnu disfunkciju u hiperglikemiji [60, 61].

Nedavne studije pokazale su da se čini da su antibakterijska i antifungalna aktivnost općenito i aktivnost antibiofilma nekih novo identificiranih klasa u korelaciji s njihovom sposobnošću da induciraju sintezu ROS [5]. SB je pokazao anti-Candida učinak, s dvostruko povećanom aktivnošću u odnosu na posvećeni antifungalni flukonazol (tablice 2 i 3). Također, rezultati su pokazali da SB smanjuje razinu SOD1 i povećava aktivnost proupalnog citokina (TNF-α). Antifungalni učinak također bi se mogao objasniti sposobnošću testiranog SB-a da formira komplekse između azometinske skupine i metala iz aktivnog središta enzima te također njegovom sposobnošću da inducira proizvodnju ROS-a, slično nekim antifungalnim azolima (npr. mikonazol ) [5].

Potrebne su dodatne studije kako bi se razjasnio učinak spojeva kao što je SB i njihova uloga kao pomoćnog antioksidansa, antimikrobnog i lokalnog modulatora imunološkog odgovora (TNF-α) u liječenju zaraznih bolesti.

5. Zaključci

Nova Schiffova baza pokazala je antibakterijsko djelovanje na Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, kao i antifungalno djelovanje na Candida albicans. Rezultati ove studije pokazuju da novi SB igra ulogu u ravnoteži prooksidans/antioksidans. U ispitivanoj dozi SB ne mijenja morfologiju endotelnih stanica, djeluje antioksidativno, što je dokazano DPPH testom, smanjuje lipidnu peroksidaciju (MDA) i smanjuje inducibilnu razinu NOS2. Stoga se može smatrati potencijalnim kandidatom s obećavajućim antioksidativnim svojstvima koji se može koristiti kao pomoćna terapija kod bolesti uzrokovanih prekomjernom proizvodnjom slobodnih radikala. Smanjenje razina COX2 i NOS2 također može ukazivati ​​na protuupalno djelovanje. Mogući mehanizam antibakterijskog djelovanja na gram-negativne bacile mogao bi uključivati ​​smanjenje razine bakterijskog NOS-a i stvaranje kompleksa s metalima koji se nalaze u aktivnom središtu određenih bakterijskih enzima. Također, SB bi potencijalno mogao djelovati kao antifungalni agens, kroz proizvodnju ROS-a u stanicama biofilma gljivica. Njegovo pojašnjenje zahtijeva daljnje studije.

Dostupnost podataka

Podaci korišteni za potporu nalaza ove studije uključeni su u članak.

Sukob interesa

Autori izjavljuju da ne postoji sukob interesa u vezi s objavljivanjem ovog rada.

Prilozi autora

Cristian Cezar Login, Şoimiţa Suciu, Ioana Bâldea i Brînduşa Tiperciuc osmislili su i planirali eksperimentalni dizajn. Brînduşa Tiperciuc je izvršio kemijsku sintezu i karakterizaciju spojeva. Dan Cristian Vodnar proveo je antibakterijsko i antifungalno ispitivanje. Daniela Benedec izvela je in vitro procjena antioksidativne aktivnosti. Ioana Bâldea je izvela in vitro ispitivanje na staničnim kulturama. Nicoleta Decea izvršila je biokemijsku procjenu nekih markera oksidativnog stresa. Cristian Cezar Login i Ioana Bâldea izvršili su statističku analizu. Cristian Cezar Login, Ioana Bâldea, Brînduşa Tiperciuc, Daniela Benedec i Şoimiţa Suciu analizirali su podatke i napisali rad. Cristian Cezar Login, Brînduşa Tiperciuc, Ioana Bâldea i Daniela Benedec jednako su doprinijeli ovom radu.

Priznanja

Ovo istraživanje financiralo je interno istraživanje Sveučilišta Iuliu Hațieganu Sveučilišta medicine i farmacije Cluj-Napoca br. 4944/23/08.03.2016. (Cristian Cezar Login).

Reference

  1. F. Aktan, “iNOS-posredovana proizvodnja dušikovog oksida i njegova regulacija”, Životne znanosti, sv. 75, br. 6, str. 639–653, 2004. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  2. W. Droge, “Slobodni radikali u fiziološkoj kontroli funkcije stanica”, Fiziološki pregledi, sv. 82, br. 1, str. 47–95, 2002. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  3. T. Fukai i M. Ushio-Fukai, “Superoksidne dismutaze: uloga u redoks signalizaciji, vaskularnoj funkciji i bolestima”, Antioksidansi i Redox signalizacija, sv. 15, br. 6, str. 1583–1606, 2011. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  4. B. D. McCollister, M. Hoffman, M. Husain i A. Vázquez-Torres, “Dušikov oksid štiti bakterije od aminoglikozida blokiranjem energetski ovisnih faza uzimanja lijeka,” Antimikrobna sredstva i kemoterapija, sv. 55, br. 5, str. 2189–2196, 2011. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  5. N. Delattin, B. P. Cammue i K. Thevissen, “Protugljivična sredstva koja induciraju reaktivne kisikove vrste i njihova aktivnost protiv biofilmova gljiva,” Buduća medicinska kemija, sv. 6, br. 1, str. 77–90, 2014. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  6. L. Balanean, C. Braicu, I. Berindan-Neagoe et al., "Sinteza novih 2-metilamino-4-supstituiranih-1,3-tiazola s antiproliferativnim djelovanjem," Revista de Chimie-Bukurešt, sv. 65, str. 1413–1417, 2014. Pogled na: Google Scholar
  7. R. Tamaian, A. Moţ, R. Silaghi-Dumitrescu et al., “Studija odnosa između strukture, lipofilnosti i biološke aktivnosti nekih tiazolil-karbonil-tiosemikarbazida i tiazolil-azola,” Molekule, sv. 20, br. 12, str. 22188–22201, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  8. Y. Ünver, K. Sancak, F. Çelik et al., “Novi tiofen-1,2,4-triazol-5(3)-oni: visoko bioaktivni tiosemikarbazidi, strukture Schiffovih baza i triazol-tioli,” European Journal of Medicinal Chemistry, sv. 84, str. 639–650, 2014. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  9. GY Nagesh, K. Mahendra Raj i BHM Mruthyunjayaswamy, “Sinteza, karakterizacija, termalna studija i biološka procjena Cu(II), Co(II), Ni(II) i Zn(II) kompleksa Schiffovog baznog liganda koji sadrži tiazolni dio ,” Journal of Molecular Structure, sv. 1079, s. 423–432, 2015. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  10. E. M. Zayed i M. A. Zayed, “Sinteza novih Schiffovih osnova visoko potencijalnih bioloških aktivnosti i istraživanje njihove strukture,” Spectrochimica Acta. Dio A, Molekularna i biomolekularna spektroskopija, sv. 143, str. 81–90, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  11. K. P. Rakesh, H. M. Manukumar i D. C. Gowda, "Schiffove baze derivata kinazolinona: sinteza i SAR studije nove serije potencijalnih protuupalnih i antioksidansa", Pisma o bioorganskoj i medicinskoj kemiji, sv. 25, br. 5, str. 1072–1077, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  12. N. Parmar, S. Teraiya, R. Patel, H. Barad, H. Jajda i V. Thakkar, "Sinteza, antimikrobna i antioksidativna aktivnost nekih Schiffovih baza na bazi 5-pirazolona", Časopis Saudijskog kemijskog društva, sv. 19, br. 1, str. 36–41, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  13. M. Yıldız, Ö. Karpuz, C. T. Zeyrek et al., "Sinteza, biološka aktivnost, vezanje DNA i anionski senzori, molekularna struktura i kvantno kemijske studije nove bidentatne Schiffove baze izvedene iz 3,5-bis(trifluorometil)anilina i salicilaldehida," Journal of Molecular Structure, sv. 1094, s. 148–160, 2015. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  14. N. El-wakiel, M. El-keiy i M. Gaber, “Sinteza, spektralna, antitumorska, antioksidativna i antimikrobna istraživanja Cu(II), Ni(II) i Co(II) kompleksa 4-[(1H) -benzoimidazol-2-ilimino)-metil]-benzen-1,3-diol,” Spectrochimica Acta. Dio A, Molekularna i biomolekularna spektroskopija, sv. 147, str. 117–123, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  15. SA Al-Harbi, MS Bashandy, HM Al-Saidi, AAA Emara i TAA Mousa, “Sinteza, spektroskopska svojstva, molekularno spajanje, anti-karcinom debelog crijeva i antimikrobna istraživanja nekih novih metalnih kompleksa za 2-amino-4- derivat feniltiazola” Spectrochimica Acta. Dio A, Molekularna i biomolekularna spektroskopija, sv. 145, s. 425–439, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  16. R. Selwin Joseyphus, C. Shiju, J. Joseph, C. Justin Dhanaraj i D. Arish, “Sinteza i karakterizacija metalnih kompleksa liganda Schiffove baze izvedenih iz imidazol-2-karboksaldehida i 4-aminoantipirina,” Spectrochimica Acta. Dio A, Molekularna i biomolekularna spektroskopija, sv. 133, s. 149–155, 2014. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  17. N. Turan, M. F. Topçu, Z. Ergin i sur., “Prooksidacijski i antiproliferativni učinci Schiffove baze na bazi 1,3,4-tiadiazola i njenih metalnih kompleksa,” Toksikologija lijekova i kemikalija, sv. 34, br. 4, str. 369–378, 2011. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  18. S. Gupta, A. Roy i B. S. Dwarakanath, “Metabolička suradnja i natjecanje u mikrookolišu tumora: implikacije za terapiju,” Granice u onkologiji, sv. 7, str. 68, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  19. K. Zhao, D. Li, W. Xu et al., “Ciljani prolijek hidroksietil škroba za inhibiciju rasta i metastaza raka prostate,” Biomaterijali, sv. 116, str. 82–94, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  20. C. Nastasă, B. Tiperciuc, M. Duma, D. Benedec i O. Oniga, “Novi hidrazoni koji nose tiazolsku skelu: sinteza, karakterizacija, antimikrobno i antioksidativno istraživanje,” Molekule, sv. 20, br. 9, str. 17325–17338, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  21. A. Stana, A. Enache, D. Vodnar i dr., “Nove thiazolil-triazolne Schiffove baze: sinteza i procjena anti-Candida potencijala,” Molekule, sv. 21, br. 11, str. 1595, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  22. C. Nastasă, D. Vodnar, I. Ionuţ et al., “Antibacterial evaluation and virtual screening of new thiazolyl-triazole Schiff baza kao potencijalni inhibitori DNA-giraze,” Međunarodni časopis za molekularne znanosti, sv. 19, br. 1, str. 222, 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  23. A. Stana, D. Vodnar, R. Tamaian i sur., “Procjena dizajna, sinteze i antifungalne aktivnosti novih tiazolin-4-ona kao potencijalnog lanosterola 14α- inhibitori demetilaze, Međunarodni časopis za molekularne znanosti, sv. 18, br. 1, str. 177, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  24. M. A. Hassan, A. M. Omer, E. Abbas, W. M. A. Baset i T. M. Tamer, “Priprema, fizikalno-kemijska karakterizacija i antimikrobna aktivnost novih dvaju derivata fenolnih Chitosanovih baza”, Znanstvena izvješća, sv. 8, br. 1, str. 11416, 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  25. M. Krátký, M. Dzurková, J. Janoušek i dr., “Schiffove baze na bazi sulfadiazina salicilaldehida: sinteza, antimikrobna aktivnost i citotoksičnost,” Molekule, sv. 22, br. 9, str. 1573, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  26. CT Zeyrek, B. Boyacioğlu, M. Yıldız et al., “Sinteza, karakterizacija i evaluacija (E)-metil 2-((2-oksonaftalen-1(2H)-iliden)metilamino)acetata kao biološkog agensa i anionski senzor” Bioorganska i medicinska kemija, sv. 24, br. 21, str. 5592–5601, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  27. Y. Ünver, S. Deniz, F. Çelik, Z. Akar, M. Küçük i K. Sancak, “Sinteza novih 1,2,4-triazolnih spojeva koji sadrže Schiffove i Mannichove baze (morfolin) s antioksidativnim i antimikrobnim djelovanjem ,” Časopis za inhibiciju enzima i medicinsku kemiju, sv. 31, br. sup3, str. 89–95, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  28. W. Yehye, N. Abdul Rahman, O. Saad et al., “Racionalni dizajn i sinteza novih, visoko učinkovitih, multipotentnih Schiffovih baza-1,2,4-triazolnih antioksidansa koji nose butilirane hidroksitoluenske dijelove,” Molekule, sv. 21, br. 7, str. 847, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  29. E. S. Lima, A. C. S. Pinto, K. L. Nogueira i sur., “Stabilnost i antioksidativna aktivnost polusintetskih derivata 4-nerolidilkatehola,” Molekule, sv. 18, br. 1, str. 178–189, 2013. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  30. D. Benedec, L. Vlase, I. Oniga i sur., “Polifenolni sastav, antioksidativna i antibakterijska aktivnost za dvije rumunjske podvrste Achillea distans Waldst. et Kit. bivši Willd,” Molekule, sv. 18, br. 8, str. 8725–8739, 2013. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  31. I. Baldea, G. E. Costin, Y. Shellman et al., “Dvofazni pro-melanogeni i pro-apoptotski učinci sve-trans-retinoične kiseline (ATRA) na ljudske melanocite: studija vremenskog tijeka”, Časopis za dermatološke znanosti, sv. 72, br. 2, str. 168–176, 2013. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  32. I. Baldea, D. E. Olteanu, P. Bolfa i sur., “Učinkovitost fotodinamičke terapije na WM35 melanomu sa sintetičkim porfirinima: uloga kemijske strukture, unutarstanično ciljanje i antioksidativna obrana,” Časopis za fotokemiju i fotobiologiju. B, sv. 151, s. 142–152, 2015. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  33. D. Tudor, I. Nenu, G. A. Filip i dr., “Kombinirani režim fotodinamičke terapije posredovan Galijev ftalocijanin kloridom i metforminom poboljšava učinkovitost protiv melanoma,” PLoS One, sv. 12, br. 3, str. e0173241, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  34. M. L. Hu, “[41] Mjerenje proteinskih tiolnih skupina i glutationa u plazmi,” Metode u enzimologiji, sv. 233, str. 380–385, 1994. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  35. A. Filip, D. Daicoviciu, S. Clichici, T. Mocan, A. Muresan i I. D. Postescu, “Fotoprotektivni učinci dva prirodna proizvoda na ultraljubičasti B-inducirani oksidativni stres i apoptozu u koži miša SKH-1,” Časopis za medicinsku hranu, sv. 14, br. 7-8, str. 761–766, 2011. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  36. J. Shen, M. Liu, J. Xu, B. Sun, H. Xu i W. Zhang, “Prekomjerna ekspresija ARL15 umanjuje oštećenje inzulinske signalizacije uzrokovano visokim glukozom i oksidativni stres u endotelnim stanicama ljudske pupčane vene,” Životne znanosti, sv. 220, str. 127–135, 2019. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  37. R. Chibber, P. A. Molinatti i E. M. Kohner, “Intracelularna glikacija proteina u kultiviranim retinalnim kapilarnim pericitima i endotelnim stanicama izloženim visokoj koncentraciji glukoze,” Stanična i molekularna biologija (Noisy-le-Grand, Francuska), sv. 45, br. 1, str. 47–57, 1999. Pogled na: Google Scholar
  38. R. J. Esper, J. O. Vilariño, R. A. Machado i A. Paragano, “Endotelna disfunkcija u normalnom i abnormalnom metabolizmu glukoze”, Napredak u kardiologiji, sv. 45, str. 17–43, 2008. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  39. J. Joseph i G. B. Janaki, “Bakreni kompleksi koji nose derivate 2-aminobenzotiazola kao potencijalni antioksidans: sinteza, karakterizacija,” Časopis za fotokemiju i fotobiologiju. B, sv. 162, str. 86–92, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  40. N. W. Hansen, A. J. Hansen i A. Sams, “Granica endotela do zdravlja: mehanički dokaz hiperglikemijskog krivca ubrzanja upalne bolesti,” IUBMB Život, sv. 69, br. 3, str. 148–161, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  41. J. A. Florian, J. R. Kosky, K. Ainslie, Z. Pang, R. O. Dull i J. M. Tarbell, “Heparan sulfat proteoglikan je mehanosenzor na endotelnim stanicama,” Istraživanje cirkulacije, sv. 93, br. 10, str. e136–e142, 2003.Pogledajte na: Stranica izdavača | Google Scholar
  42. S. Mochizuki, H. Vink, O. Hiramatsu et al., “Uloga glikozaminoglikana hijaluronske kiseline u oslobađanju dušikovog oksida izvedenom iz endotela,” Američki časopis za fiziologiju. Fiziologija srca i cirkulacije, sv. 285, br. 2, str. H722–H726, 2003. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  43. R. Madonna, Y. J. Geng, H. Shelat, P. Ferdinandy i R. de Caterina, “Visoka hiperosmolarnost izazvana glukozom utječe na proliferaciju, remodeliranje citoskeleta i migraciju pluripotentnih matičnih stanica izazvanih ljudima putem akvaporina-1,” Biochimica et Biophysica Acta, sv. 1842, br. 11, str. 2266–2275, 2014. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  44. W. Zhu, Y. Yuan, G. Liao et al., “Mezenhimske matične stanice poboljšavaju ozljedu endotela izazvanu hiperglikemijom kroz modulaciju mitofagije,” Stanična smrt i bolest, sv. 9, br. 8, str. 837, 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  45. A. Pallag, G. A. Filip, D. Olteanu et al., “Equisetum arvense L. ekstrakt inducira antibakterijsku aktivnost i modulira oksidativni stres, upalu i apoptozu u endotelnim vaskularnim stanicama izloženim hiperosmotskom stresu,” Oksidativna medicina i stanična dugovječnost, sv. 2018., 14 str., 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  46. R. D. Martinus i J. Goldsbury, “Endotelni TNF-α indukcija Hsp60 izlučenim iz monocita THP-1 izloženih hiperglikemijskim uvjetima. Stres u stanicama i zaštitnici, sv. 23, br. 4, str. 519–525, 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  47. I. Castellano, P. di Tomo, N. di Pietro i sur., “Protuupalna aktivnost morskog ovotiola A u in vitro model endotelne disfunkcije izazvane hiperglikemijom,” Oksidativna medicina i stanična dugovječnost, sv. 2018., 12 str., 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  48. D. Tousoulis, N. Papageorgiou, E. Androulakis i sur., “Vaskularno oštećenje povezano s dijabetesom melitusom: novi cirkulirajući biomarkeri i terapijski pristupi,” Journal of the American College of Cardiology, sv. 62, br. 8, str. 667–676, 2013. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  49. M. Kumar, T. Padmini i K. Ponnuvel, “Sinteza, karakterizacija i antioksidativna aktivnost Schiffovih baza su kolesterola,” Časopis Saudijskog kemijskog društva, sv. 21, str S322–S328, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  50. C. Aswathanarayanappa, E. Bheemappa, Y. D. Bodke, P. S. Krishnegowda, S. P. Venkata i R. Ningegowda, “Synthesis and evaluation of antioxidant properties of nove 1,2,4-triazole-based schiff base heterocycles,” Arch Pharm (Weinheim), sv. 346, br. 12, str. 922–930, 2013. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  51. N. Revathi, M. Sankarganesh, J. Rajesh i JD Raja, “Biološki aktivni Cu(II), Co(II), Ni(II) i Zn(II) kompleksi derivata pirimidina Schiffove baze: DNA vezanje, antioksidans, antibakterijske i in vitro studije protiv raka,” Journal of Fluorescence, sv. 27, br. 5, s. 1801–1814, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  52. M. Hajrezaie, S. Golbabapour, P. Hassandarvish et al., “Studije akutne toksičnosti i gastroprotekcije novog kompleksa bakra (II) dobivenog s šiffove baze protiv akutnih želučanih lezija izazvanih etanolom u štakora,” PLoS One, sv. 7, br. 12, str. e51537, 2012. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  53. V. A. Daier, E. Rivière, S. Mallet-Ladeira, D. M. Moreno, C. Hureau i S. R. Signorella, “Sinteza, karakterizacija i aktivnost imidazolat-bridged and Schiff-base dinuclear complexes as models of Cu,Zn-SOD. Komparativna studija” Časopis za anorgansku biokemiju, sv. 163, s. 162–175, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  54. Q. Wei, J. Dong, P. Zhao et al., “DNA vezanje, BSA interakcija i SOD aktivnost dva nova kompleksa nikla(II) s ligandima glutamin Schiffove baze”, Časopis za fotokemiju i fotobiologiju. B, sv. 161, s. 355–367, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  55. C. Palopoli, G. Gómez, A. Foi et al., “Dimerizacija, redoks svojstva i antioksidativna aktivnost dva manganova(III) kompleksa difluor- i diklor-supstituiranih liganda Schiffove baze”, Časopis za anorgansku biokemiju, sv. 167, str. 49–59, 2017. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  56. P. Zhao, S. Zhai, J. Dong et al., “Sinteza, struktura, interakcija DNA i aktivnost SOD tri kompleksa nikla(II) koji sadrže L-fenilalanin Schiffovu bazu i 1,10-fenantrolin,” Bioanorganska kemija i primjena, sv. 2018., 16 str., 2018. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  57. S. Maghraoui, S. Clichici, A. Ayadi et al., “Oksidativni stres u krvi i testisima štakora nakon intraperitonealne primjene aluminija i indija,” Acta Physiologica Hungarica, sv. 101, br. 1, str. 47–58, 2014. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  58. J. K. Holden, M. C. Lewis, M. A. Cinelli i dr., “Ciljanje sintaze bakterijske dušikovog oksida inhibitorima na bazi aminokinolina,” Biokemija, sv. 55, br. 39, str. 5587–5594, 2016. Pogledaj na: Stranica izdavača | Google Scholar
  59. J. N. Sharma, A. Al-Omran i S. S. Parvathy, “Uloga dušikovog oksida u upalnim bolestima”, Inflammofarmakologija, sv. 15, br. 6, str. 252–259, 2007. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  60. M. Botta, E. Distrutti, A. Mencarelli i dr., “Protuupalna aktivnost nove klase inhibitora sintaze dušikovog oksida koji oslobađaju dušikov oksid,” ChemMedChem, sv. 3, br. 10, str. 1580–1588, 2008. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar
  61. S. Hamed, B. Brenner, Z. Abassi, A. Aharon, D. Daoud i A. Roguin, “Hiperglikemija i oksidirani LDL imaju štetan učinak na migraciju endotelnih progenitornih stanica kod dijabetes melitusa tipa 2,” Istraživanje tromboze, sv. 126, br. 3, str. 166–174, 2010. Pogled na: Stranica izdavača | Google Scholar

Autorsko pravo

Autorska prava © 2019. Cristian Cezar Login et al. Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod licencom Creative Commons Attribution License, koja dopušta neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorno djelo ispravno citirano.


66 , 249 (1970).

[28] Grey S, medicinska sestra G, Visser L, Biokemijska i biofizička istraživačka komunikacija, 52,
687 (1973).
[29] Syamal, Maurya M R, Koordinacijske kemijske recenzije, 95, 183-238 (1989).
[30] Hilder V.A, Gatehouse A, Sheerman E, Barker R, Boulter D, Priroda, 330, 160 (1987). [31] Marcos V, Latzin P, Hector A, Sonanini F, Hoffmann, M, Lacher B. Koller, P. Bufler,
T, Nicolai D, Respiratorno istraživanje, 11, 32 (2010).
[32] Andreyev Y, Kushnareva Y E, Starkov A, Biokemija, 70(2), 246-264 (2005).
[33] Amtul Z, Atta-ur-Rahman R, Siddiqui A, Choudhary M, Trenutna medicinska kemija, 9,
1323 (2002).
[34] Qin D, Han F, Yao Y, Zhang Y, Shen Q, Dalton Transaction, 28,5535-41 (2009).
[35] Qiu J, Lu M, Yao Y, Zhang Y, Wang Y, Shen Q, Dalton Transaction, 42(28):10179-
89(2013).

Autorska prava © 2013 SciResPub. IJOART

Međunarodni časopis za napredak u istraživanju i tehnologiji pojačala, svezak 2, broj 8, kolovoz 2013. 66

[36] Abd El-Wahab, ZH, Mashaly, M M, Salman A A, El-Shetary, B A, i Faheim, A A,


Gledaj video: Auf Bootssuche: 62 ft. Stahl Ketch - Über geeignetes Rumpfmaterial u0026 Osmose bei GFK. BootsProfis #3 (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Yozshusar

    Kako će red razumjeti?

  2. Harden

    laugh nimaga !!

  3. Devron

    Što je ovo?

  4. Jaylend

    Sve gore navedeno je istina. Možemo komunicirati na ovu temu.

  5. Gokazahn

    dobar rezultat će se pokazati

  6. Granville

    Mislim da nisi u pravu. Pišite mi na PM, razgovarat ćemo.

  7. Salamon

    Incomparably)))))))

  8. Cosmas

    the right phrase



Napišite poruku