Informacija

2.6: Transkripcija - Biologija

2.6: Transkripcija - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Protok genetskih informacija

Primarna uloga DNK je pohranjivanje nasljednih informacija koje kodiraju upute za stvaranje organizma. U proteklom desetljeću postali smo vrlo dobri u sekvenciranju DNK, ali još uvijek ne znamo kako pouzdano dekodirati SVE informacije i još uvijek ne razumijemo SVE mehanizme kojima se one izražavaju.

Međutim, postoje neka temeljna načela i mehanizmi povezani s čitanjem i izražavanjem genetskog koda čiji se osnovni koraci razumiju i koji moraju biti dio konceptualnog alata za sve biologe. Dva od ovih procesa su transkripcija i prijevod; kopiranje dijelova genetskog koda zapisanog u DNK u molekule srodne polimerne RNA, nakon čega slijedi čitanje i dekodiranje RNA sekvence (nukleotida) u sekvencu proteina (aminokiselina).

U BIS2A se uglavnom fokusiramo na razvoj razumijevanja

postupak

transkripcije (sjetite se da je energetska priča jednostavno način opisivanja procesa) i njezine uloge u izražavanju genetskih informacija. Motiviramo našu raspravu o transkripciji usredotočujući se na funkcionalne probleme (donošenjem dijelova našeg rješavanja problema/dizajna izazova) koji se moraju riješiti da bi se proces odvijao. Zatim nastavljamo s opisom kako priroda koristi proces za stvaranje različitih funkcionalnih RNA molekula (koje mogu imati različite strukturne, katalitičke ili regulatorne uloge), uključujući molekule glasničke RNA (mRNA) koje nose informacije potrebne za sintezu proteina. Isto tako, fokusiramo se na izazove i pitanja povezana s procesom translacije, procesom kojim ribosomi sintetiziraju proteine.

Osnovni tijek genetskih informacija u biološkim sustavima često je prikazan u shemi poznatoj kao "središnja dogma" (vidi sliku ispod). Ova shema navodi da informacije kodirane u DNA teče u RNA putem transkripcije i konačno do proteina putem translacije. Procesi poput reverzne transkripcije (stvaranje DNA iz i RNA predloška) i replikacija također predstavljaju mehanizme za širenje informacija u različitim oblicima. Ova shema, međutim, ne govori ništa o tome kako su informacije kodirane ili o mehanizmima kojima se regulatorni signali kreću između različitih slojeva tipova molekula prikazanih u modelu. Stoga, dok je shema u nastavku gotovo obavezan dio leksikona svakog biologa, možda zaostala iz stare tradicije, studenti bi također trebali biti svjesni da su mehanizmi protoka informacija složeniji (o nekima ćemo učiti kako idemo, a da "središnja dogma" samo predstavlja neke ključne putove.

Protok genetskih informacija.
Atribucija: Marc T. Facciotti (izvorno djelo)

Genotip u fenotip

Važan koncept u sljedećim odjeljcima je odnos između genetskih informacija, tj genotip, i rezultat njegovog izražavanja, the fenotip. O ova dva pojma i mehanizmima koji ih povezuju raspravljat će se više puta tijekom sljedećih nekoliko tjedana - počnite biti vješti u korištenju ovog rječnika.

Informacije pohranjene u DNK nalaze se u slijedu pojedinačnih nukleotida kada se čitaju od 5' do 3' smjera. Pretvorba informacija iz DNK u RNA (proces koji se naziva transkripcija) proizvodi drugi oblik koji informacija poprima u stanici. mRNA se koristi kao predložak za stvaranje aminokiselinskog slijeda proteina (u prijevodu). Ovdje su prikazana dva različita skupa informacija. Slijed DNK je malo drugačiji, što rezultira dvije različite proizvedene mRNA, nakon čega slijede dva različita proteina, i na kraju, dvije različite boje dlake za miševe.

Genotip odnosi se na informacije pohranjene u DNK organizma, slijed nukleotida, kompilaciju njegovih gena. Fenotip odnosi se na bilo koju fizičku karakteristiku koju možete izmjeriti, kao što su visina, težina, količina proizvedenog ATP-a, sposobnost metaboliziranja laktoze, odgovor na podražaje iz okoline, itd. Razlike u genotipu, čak i male, mogu dovesti do različitih fenotipova koji su podložni prirodnim izbor. Gornja slika prikazuje ovu ideju. Također imajte na umu da se, iako se o klasičnim raspravama o genotipovima i fenotipskim odnosima govori u kontekstu višestaničnih organizama, ova nomenklatura i temeljni koncepti primjenjuju na sve organizme, čak i na jednostanične organizme poput bakterija i arheja.

Predložena rasprava

Može li se nešto što ne možete vidjeti "na oko" smatrati fenotipom?

Predložena rasprava

Mogu li jednostanični organizmi imati više istovremenih fenotipova? Ako je tako, možete li predložiti primjer? Ako ne, zašto?

Geni

Što je gen? A gen je segment DNA u genomu organizma koji kodira funkcionalnu RNA (kao što je rRNA ili tRNA, itd.) ili proteinski proizvod (enzimi, tubulin, itd.). Generički gen sadrži elemente koji kodiraju regulatorne regije (koje se često ne transkribiraju) i regiju koja kodira transkribiranu jedinicu.

Geni mogu steći mutacije - definirane kao promjene u sastavu i/ili slijedu nukleotida - bilo u kodirajućim ili regulatornim regijama. Ove mutacije mogu dovesti do nekoliko mogućih ishoda: (1) kao rezultat se ne događa ništa mjerljivo; (2) gen više nije eksprimiran; ili (3) ekspresija ili ponašanje genskih proizvoda su različiti. U populaciji organizama koji dijele isti gen, poznate su različite varijante gena alela. Različiti aleli mogu dovesti do razlika u fenotipovima pojedinaca i doprinijeti raznolikosti u biologiji koja je pod selektivnim pritiskom.

Počnite učiti ove termine iz rječnika i povezane koncepte. Tada ćete ih donekle upoznati kada ih počnemo detaljnije uranjati tijekom sljedećih predavanja.

Gen se sastoji od kodirajuće regije za RNA ili proteinski proizvod popraćenih njegovim regulatornim regijama. Kodirajuća regija se transkribira u RNA koja se zatim prevodi u protein. Imajte na umu da većina transkripata ne počinje početnim kodonom i završava sa stop kodonom (za razliku od ovog primjera), obično postoje uzvodno i nizvodno neprevedene regije.

Sažetak odjeljka

Sva živa bića moraju sva transkribirati gene iz svojih genoma. Iako stanična lokacija može biti različita (eukarioti obavljaju transkripciju u jezgri; bakterije i arheje - bez jezgre - obavljaju transkripciju u citoplazmi), mehanizmi pomoću kojih organizmi iz svake od ovih klada provode ovaj proces su u osnovi isti i mogu karakterizirati tri stupnja: inicijacija, produljenje i završetak.

Transkripcija: s DNK na RNA

A kratak pregled transkripcije

Transkripcija je proces stvaranja RNA kopije dijela DNK. Budući da je ovo a postupak, želimo primijeniti Energetsku priču kako bismo razvili funkcionalno razumijevanje transkripcije. Kako izgleda sustav molekula prije početka transkripcije? Kako to izgleda na kraju? Koje se transformacije tvari i prijenosi energije događaju tijekom transkripcije i što, ako išta, katalizira proces? Također želimo razmišljati o procesu sa stajališta Design Challengea. Ako je biološki zadatak stvoriti kopiju DNK na kemijskom jeziku RNA, koje izazove možemo razumno pretpostaviti ili predvidjeti s obzirom na naše znanje o drugim procesima nukleotidnih polimera, moramo prevladati? Postoje li dokazi da je priroda riješila te probleme na različite načine? Koji su kriteriji za uspjeh transkripcije? Shvaćate ideju.

Navodi neke od osnovnih zahtjeva za transkripciju

Razmotrimo prvo zadaće koje su pred nama koristeći neke od naših temeljnih znanja i zamislimo što bi se moglo dogoditi tijekom procesa transkripcije ako je cilj napraviti RNA kopiju dijela jednog lanca dvolančane molekule DNK. Vidjet ćemo da nam korištenje neke osnovne logike omogućuje da zaključimo mnoga važna pitanja i stvari o kojima trebamo znati da bismo ispravno opisali proces.

Zamislimo da želimo dizajnirati nanomstroj/nanobot koji će provoditi transkripciju. Možemo upotrijebiti razmišljanje o izazovu dizajna da identificiramo probleme i podprobleme koje treba riješiti naš mali robot.

• Prva stvar koju bismo možda željeli da naš stroj zna je odakle početi. Uz milijune do milijarde parova baza, kamo bi stroj trebao biti usmjeren?
• Isto tako, moramo znati gdje stati.
• Ako imamo mjesta za pokretanje i zaustavljanje, trebat će nam načini kodiranja tih informacija tako da naš stroj(i) može pročitati ove informacije - kako će se to postići?
• Koliko RNA kopija DNK trebamo napraviti?
• Koliko brzo treba napraviti kopije RNA?
• Koliko točno treba napraviti kopije?
• Koliko će energije trajati proces i odakle će energija doći?

Ovo su, naravno, samo neka od ključnih pitanja. Može se kopati dublje ako želi. Međutim, oni su već dovoljno dobri da počnemo dobivati ​​dobar osjećaj za ovaj proces. Primijetite također da su mnoga od ovih pitanja nevjerojatno slična onima za koje smo zaključili da bi možda bilo potrebno razumjeti replikaciju DNK.

Građevinski blokovi transkripcije

Građevinski blokovi RNA

Podsjetimo iz naše rasprave o strukturi nukleotida da su građevni blokovi RNA vrlo slični onima u DNK. U RNK se gradivni blokovi sastoje od nukleotidnih trifosfata koji se sastoje od šećera riboze, dušične baze i tri fosfatne skupine. Ključne razlike između građevnih blokova DNA i RNA su u tome što se RNA molekule sastoje od nukleotida sa šećerima ribozom (za razliku od šećera deoksiriboze) i da umjesto korištenja timidina (nukleotida koji sadrži timin) RNA koristi uridin (uracil koji sadrži nukleotid). U nastavku imajte na umu da su uracil i timin strukturno vrlo slični - uracilu samo nedostaje metil (CH3) funkcionalna skupina u usporedbi s timinom.

Osnovne kemijske komponente nukleotida.
Atribucija: Marc T. Facciotti (izvorno djelo)

Pokretanje transkripcije

Promotori

Proteini odgovorni za stvaranje RNA kopije određenog dijela DNK (transkripcija) prvo moraju moći prepoznati početak elementa koji se kopira. A promotor je DNA sekvenca na koju se vežu različiti proteini, zajednički poznati kao transkripcijski strojevi, i započinju transkripciju. U većini slučajeva, promotori postoje uzvodno (5' do regije kodiranja) od gena koje reguliraju. Specifična sekvenca promotora vrlo je važna jer određuje hoće li se odgovarajući kodirajući dio gena transkribirati cijelo vrijeme, povremeno ili rijetko.

U bakteriji E coli, na -10 i -35 regijama uzvodno od mjesta inicijacije (mjesto prvog nukleotida transkripta), postoje dva promotora konsenzus sekvence, ili regije koje su slične u mnogim promotorima i u raznim srodnim vrstama. Neki promotori će imati sekvencu vrlo sličnu konsenzus sekvenci (sekvenca koja sadrži najčešće elemente sekvence), a drugi će izgledati vrlo različito. Ove varijacije slijeda utječu na snagu do koje se transkripcijski strojevi mogu vezati na promotor kako bi pokrenuli transkripciju. To pomaže kontrolirati broj transkripata koji se izrađuju i koliko često se izrađuju.

(a) Opći dijagram gena. Gen uključuje promotorsku sekvencu, untranslacijsku regiju (UTR) i kodirajuću sekvencu. (b) Popis nekoliko jakih sekvenci promotora E. coli. Kutija -35 i kutija -10 visoko su očuvane sekvence u cijeloj listi jakih promotora. Slabiji promotori će imati više razlika u parovima baza u usporedbi s ovim sekvencama. Izvor: http://www.discoveryandinnovation.co...lecture12.html

Predložena rasprava

Koje se vrste interakcija mijenjaju između transkripcijskih strojeva i DNK kada se promijeni nukleotidni slijed promotora? Zašto bi neke sekvence stvorile "jaki" promotor, a zašto druge stvorile "slabe" promotore?

Bakterijski vs eukariotski promotori

U bakterijskim stanicama, regija -10 je bogata AT, često TATAAT. Protein prepoznaje i veže sekvence uzvodno od -10, kao i -35 (TTGACA). σ ("sigma faktor"), koji je jedna komponenta holoenzima RNA polimeraze. Nakon što se ostvari ova interakcija protein-DNA, sigma faktor olakšava odmotavanje regije -10 i učitava polimerazu na lanac šablona. Sigma faktor tako pomaže polimerazi u prepoznavanju promotorskih sekvenci i učitavanju polimeraze na pravo mjesto, pokazujući u ispravnom smjeru. Zanimljivo je da E. coli stvara nekoliko različitih sigma faktora. U različitim situacijama – na primjer, pod određenim stresom – aktivacija različitog sigma faktora promijenit će tipove gena koji se najčešće transkribiraju RNA polimerazom. Neki bakteriofagi iskoristili su ovaj aspekt bakterijske transkripcije, proizvodeći svoje sigma faktore specifične za fag-gen koji otimaju RNA polimerazu domaćina i preusmjeravaju je na genom faga.

Eukariotski promotori su puno veći i složeniji od prokariotskih promotora, ali oba imaju regiju bogatu AT – kod eukariota se obično naziva "TATA kutija". Na primjer, u genu za timidin kinazu miša, TATA kutija se nalazi na približno -30. Za ovaj gen, točna sekvenca TATA kutije je TATAAAA, kako se čita u smjeru od 5' do 3' na lancu koji nije predložak. Ovaj slijed nije identičan E coli -10, ali oboje dijele kvalitetu elemenata bogatih A–T.

Umjesto jedne bakterijske polimeraze, genomi većine eukariota kodiraju tri različite RNA polimeraze, od kojih se svaka sastoji od 10 proteinskih podjedinica ili više. Svaka eukariotska polimeraza također zahtijeva poseban skup proteina poznatih kao transkripcijski faktori da ga regrutira promotoru. Terminologija za faktore transkripcije je nažalost prilično nedosljedna. Dovoljno je reći da postoji mnogo proteina koji uvijek moraju djelovati istovremeno kako bi učitali, na primjer, bilo koju RNA polimerazu II (polimerazu koja transkribira mRNA). Oni se nazivaju "bazalnim" (ili "općim") faktorima transkripcije. Osim toga, vojska proteina može utjecati na učestalost privlačenja ovih bazalnih čimbenika na promotore, na učestalost učitavanja RNA pol II, pa čak i na "bijeg" kompleksa pol II od eukariotskih promotora (tako da može zapravo obavljaju transkripciju). Pojačivači i prigušivači - oboje DNK sekvence, a ne proteini- prepoznaju ovi regulatorni transkripcijski čimbenici. Bazalni transkripcijski čimbenici ključni su u formiranju a kompleks predinicijacije na DNA predlošku koji naknadno regrutira RNA polimerazu za inicijaciju transkripcije.

slika iz Kelvinsonga

Bez obzira na pojedinosti lokalizacije i orijentacije bakterijske naspram eukariotske polimeraze, inicijacija transkripcije počinje vezanjem RNA polimeraze na promotor. Transkripcija zahtijeva da se dvostruka spirala DNK djelomično odmota tako da se jedan lanac može koristiti kao predložak za sintezu RNA. Imajte na umu da se odvijanje odvija unutar polimeraze; RNA polimeraza, za razliku od DNA polimeraze, ima intrinzičnu aktivnost helikaze. Dvolančana DNK se usisava u enzim (kao i NTP), a nastaje dvolančana DNA, plus RNA. Područje odvijanja naziva se transkripcijski mjehur.

Tijekom elongacije, RNA polimeraza prati DNK šablonu, sintetizira mRNA u smjeru 5' do 3' i odmotava zatim premotava DNK dok se čita. Ovdje ilustrirani niz "nepredložak" često se naziva "kodiranjem", jednostavno zato što će njegov slijed odgovarati slijedu transkripta.

Produljenje

Transkripcija uvijek teče od jednog od dva lanca DNK, koji se naziva šablonski pramen. Proizvod RNA komplementaran je predloškom lancu i gotovo je identičan lancu koji nije predložak, nazvan kodirajući niz, s iznimkom da RNA sadrži uracil (U) umjesto timina (T) koji se nalazi u DNK. Tijekom produljenja enzim tzv RNA polimeraza nastavlja duž DNA šablone dodajući nukleotide uparivanjem baza s DNA šablonom na način sličan replikaciji DNA, s tom razlikom što se sintetizira RNA lanac koji ne ostaje vezan za DNK šablon. Kako produljenje nastavlja, DNK se kontinuirano odmotava ispred jezgrenog enzima i premotava iza njega. Imajte na umu da je smjer sinteze identičan onom sinteze u DNK - 5' do 3'.

Tijekom elongacije, RNA polimeraza prati DNK šablonu, sintetizira mRNA u smjeru 5' do 3' i odmotava zatim premotava DNK dok se čita.

A) Dodavanje nukleotida tijekom procesa transkripcije vrlo je slično dodavanju nukleotida u replikaciji DNA. RNA se polimerizira od 5' do 3' i sa svakim dodatkom nukleotida, enzim hidrolizira fosfoanhidridnu vezu što rezultira dužim polimerom i oslobađanjem dva anorganska fosfata.
Izvor: http://utminers.utep.edu/rwebb/html/...longation.html

Predložena rasprava

Usporedite i usporedite energetsku priču za dodavanje nukleotida u replikaciji DNA s dodatkom nukleotida u transkripciji.

Bakterijsko naspram eukariotskog produljenja

Kod bakterija, produljenje počinje oslobađanjem σ podjedinica holoenzima RNA polimeraze. Disocijacija od σ omogućuje enzimu jezgre da napreduje duž DNA šablona, ​​sintetizirajući mRNA u smjeru 5' do 3' brzinom od približno 40 nukleotida u sekundi. Sparivanje baza između DNA i RNA nije dovoljno stabilno da održi stabilnost komponenti sinteze mRNA. Umjesto toga, RNA polimeraza djeluje kao stabilna poveznica između DNA šablona i novonastalih RNA lanaca kako bi se osiguralo da se produljenje ne prekine prerano.

U eukariota, nakon formiranja preinicijacijskog kompleksa, polimeraza se oslobađa od drugih transkripcijskih čimbenika, a produljenje se dopušta da se nastavi kao što se događa u prokariota s polimerazom koja sintetizira pre-mRNA u smjeru 5' do 3'. Kao što je već spomenuto, RNA polimeraza II transkribira najveći dio eukariotskih gena, tako da će se ovaj odjeljak usredotočiti na to kako ova polimeraza postiže produljenje i terminaciju.

Raskid

U bakterijama

Nakon što se gen transkribira, potrebno je uputiti bakterijsku polimerazu da se odvoji od DNK šablona i oslobodi novonastalu mRNA. Ovisno o genu koji se transkribira, postoje dvije vrste terminacijskih signala. Jedna je bazirana na proteinima, a druga na RNA. Rho ovisan završetak kontrolira rho protein, koji se prati iza polimeraze na rastućem lancu mRNA. Blizu kraja gena, polimeraza nailazi na niz G nukleotida na DNK šablonu i zaustavlja se. Kao rezultat toga, rho protein se sudara s polimerazom. Interakcija s rho oslobađa mRNA iz transkripcijskog mjehurića.

Rho neovisni završetak kontrolira se specifičnim sekvencama u lancu DNA šablona. Kako se polimeraza bliži kraju gena koji se transkribira, nailazi na regiju bogatu C–G nukleotidima. mRNA se savija natrag na sebe, a komplementarni C–G nukleotidi se vežu zajedno. Rezultat je stabilan ukosnica što uzrokuje zastoj polimeraze čim počne transkribirati regiju bogatu A–T nukleotidima. Komplementarna U-A regija transkripta mRNA stvara samo slabu interakciju s DNK šablona. To, zajedno sa zaustavljenom polimerazom, izaziva dovoljno nestabilnosti da se enzim jezgre odvoji i oslobodi novi transkript mRNA.

Kod eukariota

Završetak transkripcije je različit za različite polimeraze. Za razliku od prokariota, produljenje RNA polimerazom II kod eukariota se odvija 1.000-2.000 nukleotida iza kraja gena koji se transkribira. Ovaj pre-mRNA rep se naknadno uklanja cijepanjem tijekom obrade mRNA. S druge strane, RNA polimeraze I i III zahtijevaju terminacijske signale. Geni transkribirani RNA polimerazom I sadrže specifičnu sekvencu od 18 nukleotida koju prepoznaje terminacijski protein. Proces terminacije u RNA polimerazi III uključuje mRNA ukosnicu sličnu rho neovisnoj terminaciji transkripcije u prokariota.

U Arheji

Završetak transkripcije u arheji je daleko manje proučavan nego u druga dva područja života i još uvijek nije dobro shvaćen. Dok funkcionalni detalji vjerojatno nalikuju mehanizmima koji su viđeni u drugim domenama života, detalji su izvan dosega ovog tečaja.

Mobilna lokacija

Kod bakterija i arheja

Kod bakterija i arheja do transkripcije dolazi u citoplazmi, gdje se nalazi DNK. Budući da mjesto DNK, a time i proces transkripcije, nije fizički odvojen od ostatka stanice, prevođenje često počinje prije nego što se transkripcija završi. To znači da se mRNA u bakterijama i arhejama koristi kao predložak za protein prije nego što se proizvede cijela mRNA. Nedostatak prostorne segregacije također znači da postoji vrlo malo vremenske segregacije za ove procese. Slika ispod prikazuje procese transkripcije i prevođenja koji se odvijaju istovremeno.

Ovdje blijedoplavi krugovi predstavljaju RNA polimeraze koje idu duž DNK šablona (slijeva na desno). Imajte na umu da se više polimeraza može učitavati uzastopno na jedan gen. Budući da je ovo prokariot, ribosomi mogu početi koristiti transkript za sintezu proteina prije nego što se transkript završi. Također imajte na umu da se više ribosoma može uzastopno učitavati na jedan transkript.
Izvor: Marc T. Facciotti (vlastiti rad)

Kod eukariota....

Kod eukariota, proces transkripcije je fizički odvojen od ostatka stanice, izdvojen unutar jezgre. To rezultira dvjema stvarima: mRNA je dovršena prije nego što prijevod može započeti, a ima vremena za "prilagodbu" ili "urediti" mRNA prije početka prijevoda. Fizičko odvajanje ovih procesa daje eukariotima priliku da izmijene mRNA na takav način da: produže životni vijek mRNA ili čak izmijene proteinski proizvod koji će se proizvesti iz mRNA.

Obrada mRNA

5' G-Cap i 3' Poly-A rep

Kada se eukariotski gen transkribira, primarni se transkript obrađuje u jezgri na nekoliko načina. Eukariotske mRNA modificirane su na 3' kraju dodatkom poli-A repa. Ovom nizu A ostataka dodaje enzim koji ne koristi genomsku DNK kao šablonu. Dodatno, mRNA imaju kemijsku modifikaciju 5' kraja, nazvanu 5'-cap. Podaci sugeriraju da ove modifikacije pomažu produžiti životni vijek mRNA (spriječiti njezinu preranu degradaciju u citoplazmi) kao i pomoći mRNA da započne translaciju.

Slika: Primjer gotovo potpuno eukariotskog transkripta i signala potrebnih za dodavanje polyA repa (još nije dodan!). Ovi signali će se odcijepiti iz transkripta nakon dodavanja repa.

Slika: 5' kapa eukariotskih transkripata. Često se modificiraju i prva 2 nukleotida (ovdje ljubičaste) mRNA. Obratite pažnju na neparnu vezu od 5' do 5'.

Spajanje

"Spajanje" eukariotskih mRNA odnosi se na uklanjanje nekodirajućih sekvenci (koji se nazivaju introni) ugrađenih u kodirajuću regiju transkripta (egzone) (vidi dolje). Odjeljak dr. Britta neće opširno raspravljati o spajanju, osim da se o njemu govori kao o procesu koji se mora dogoditi prije nego što mRNA potpuno sazrije i može se poslati u citoplazmu radi translacije.


2.6: Transkripcija - Biologija

1. Vještina: Crtanje jednostavnih dijagrama strukture pojedinačnih nukleotida DNK i RNA, koristeći krugove, peterokute i pravokutnike za predstavljanje fosfata, pentoze i baze.

2. DNK se od RNK razlikuje po broju prisutnih lanaca, baza sastav i vrstu pentoze.

3. Nukleinske kiseline DNA i RNA su polimeri nukleotida povezani zajedno od strane kovalentne veze u jedan pramen

  • okosnica: šećer - fosfat - šećer - fosfat
  • dušična baza vezana na 5-ugljični pentozni šećer (deoksiriboza u DNA riboza u RNA)

4. DNK je dvostruka spirala napravljena od dva antiparalelna lanca povezanih nukleotida vodikovom vezom između komplementarnih parova baza.

komplementarno pariranje baze:

  • A = T: adenin tvori dvije vodikove veze sa svojom komplementarnom bazom, timinom
  • G = C: gvanin stvara tri vodikove veze sa svojom komplementarnom bazom, citozinom
  • kombinacija vodikovih veza između A = T i G = C drži dva lanca DNK zajedno
  • svaki lanac tvori spiralu, dvije niti zajedno tvore dvostruku spiralu

Prijave i vještine:

• Primjena: Crick i Watsonovo razjašnjavanje strukture DNK korištenjem izrade modela.

• U dijagramima strukture DNK, spiralni oblik ne treba biti prikazan, ali dva lanca trebaju biti prikazana antiparalelno. Adenin bi trebao biti prikazan u paru s timinom i gvanin s citozinom, ali ne treba se prisjećati relativnih duljina purinskih i pirimidinskih baza, niti broja vodikovih veza između parova baza.


Pozadina

Sekvenciranje preosjetljivih mjesta na DNase-I (DNase-seq [1–4]) i Testovi za sekvenciranje kromatina dostupnog transpozazi (ATAC-seq [5, 6]) dva su široko korištena protokola za identifikaciju otvorenog kromatina u cijelom genomu. DNase-seq i ATAC-seq temelje se na upotrebi enzima za cijepanje (DNase-I i Tn5, respektivno), koji prepoznaju i cijepaju DNA u otvorenim regijama kromatina. Sekvenciranje i poravnavanje očitanja iz tih fragmenata omogućuje otkrivanje otvorenog kromatina identificiranjem genomskih intervala s mnogo očitavanja [1, 2]. Međutim, prisutnost transkripcijskih čimbenika (TF) vezanih za DNK sprječava cijepanje enzima u regiji bez nukleosoma. To ostavlja male regije, koje se nazivaju otisci stopala, gdje pokrivenost čitanjem naglo opada unutar vršnih područja visoke pokrivenosti.

Pokazalo se da računalne metode skeniranja otvorenih kromatinskih profila radi pronalaženja otisaka s velikom točnošću predviđaju mjesta vezanja faktora transkripcije (TFBS) u podacima DNase-seq [7, 8]. Između ostalog, računalni otisak korišten je za otkrivanje regulatornog leksikona nekoliko tipova stanica [9, 10], za mjerenje učinaka genetskih varijanti na vezanje TF-a [11] i za procjenu promjena u aktivnosti TF-a, npr. tijekom upalnih procesa. odgovori [12] ili uvjeti posta [13]. Računalni otisak, koji zahtijeva samo jedan otvoreni eksperiment s kromatinom po stanici od interesa, moćan je alat za proučavanje regulatornih procesa.

ATAC-seq ima nekoliko eksperimentalnih prednosti u odnosu na DNase-seq: zahtijeva manje stanica (50.000 na pojedinačne stanice) i manje je naporan [5, 6]. Nije iznenađujuće da je broj studija temeljenih na ATAC-seq-u pohranjenih u Gene Expression Omnibusu dvanaest puta veći od broja studija temeljenih na DNase-seq-u u prošloj godini (366 ATAC-seq u odnosu na 29 DNase-seq) Fusnota 1. Također postoji dva puta više ATAC-seq uzoraka nego DNase-seq uzoraka po studiji, što potvrđuje da je njegova eksperimentalna jednostavnost čini dobrim izborom za studije s velikom veličinom uzorka, na primjer u kliničkim uvjetima [14]. Međutim, računalni otisak je još uvijek slabo istražen u ATAC-seq podacima. Jedna studija u kojoj se suprotstavljaju ATAC-seq i DNase-seq pokazuje da ATAC-seq otisci imaju nižu točnost od otisaka DNase-seq [15]. Također je objavljeno da ATAC-seq prosječni profili otiska nisu tako dobro definirani kao prosječni profili otiska iz DNase-seq [11]. Međutim, sav dosadašnji rad s otiskom u ATAC-seq [5, 15, 16] koristio je računske metode prilagođene podacima DNase-seq i zanemario karakteristike svojstvene ATAC-seq protokolu.

Mogući razlog za nižu učinkovitost ATAC-seq footprintinga mogao bi biti sam enzim cijepanja Tn5, koji ima veliki (17bp) “Tn5 motiv” [5, 17] i složen mehanizam cijepanja koji zahtijeva dimer Tn5 za djelovanje. Velika veličina dimera Tn5 čini događaje cijepanja ovisnima o strukturnim značajkama susjednih proteina (TF-ova ili histona) i o veličini dostupne DNA [18]. Događaji cijepanja u maloj veznoj DNA između nukleosoma su mogući, ali manje vjerojatni od cijepanja fragmenata iz aktivnih regulatornih regija [5]. Važno je da preferencije enzima za vezanje DNA uzrokuju pristranost cijepanja specifičnog za sekvencu. Stoga je korekcija računalne pristranosti važan aspekt analize DNase-seq [19, 20] i ATAC-seq podataka [21]. Neki radovi koriste matrice težine položaja (PWM), koje pretpostavljaju neovisnost između pozicija, za modeliranje pristranosti DNase-seq [22]. Međutim, većina metoda korekcije pristranosti zaključuju procjene pristranosti korištenjem k-mer sekvence oko početka poravnatih čitanja, procjenom vjerojatnosti pronalaženja a k-mer na mjestima početka čitanja protiv pojava u genomu [19]. Za DNase-seq, a k često se koristio jednak 6 [8, 11, 19, 20, 23]. Ova metoda zahtijeva procjenu multinomske distribucije i vjerojatno će patiti od prekomjernog prilagođavanja za velike k-mers [24]. Alternativno, modeli ovisnosti o položaju (PDM) omogućuju fleksibilnost u vrsti ovisnosti koje se modeliraju [25, 26]. Pokazalo se da prevladavaju problem prekomjernog prilagođavanja u modeliranju preferencija vezanja proteina i DNA. Nisu nam poznate metode koje istražuju učinke lokalne strukture kromatina u ATAC-seq ili korištenje PDM-a za modeliranje pristranosti enzima cijepanja.

Ovdje predlažemo HINT-ATAC, koji je prva metoda otiska koja se bavi karakteristikama ATAC-seq protokola. Prvo, predlažemo korištenje probabilističkog PDM-a koji se temelji na modelima rijetkih lokalnih nehomogenih smjesa (SLIM) za korekciju pristranosti cijepanja [26] i procjenjujemo ga za ATAC-seq i DNase-seq protokole. Drugo, modeliramo novo opažanje da događaji cijepanja ATAC-seq pokazuju pristranost niti, koja je povezana s brojem nukleosoma u fragmentima ATAC-seq. HINT-ATAC, koji se temelji na skrivenim Markovljevim modelima, koristi signale specifične za lančiće, razložene veličine nukleosoma i ispravljene pristranosti za identifikaciju otisaka stopala. Pokazali smo da HINT-ATAC značajno poboljšava oporavak otisaka podržanih TF ChIP-seq podacima [8, 27] iz ENCODE staničnih linija [9]. Štoviše, HINT-ATAC otisci imaju sličnu točnost predviđanja koristeći ATAC-seq ili DNase-seq protokole. Konačno, kao primjer praktične primjene analize otiska, koristimo HINT-ATAC za otkrivanje TF-ova povezanih sa specifikacijom imunoloških dendritičnih stanica (DC).


Rezultati i rasprava

Za istraživanje obrade CD19 ekson 2, tretirali smo NALM-6 B-ALL staničnu liniju s tapsigarginom, koji inducira nesavijeni proteinski odgovor i aktivnost IRE1 [10], te profilirali odabrane transkripte pomoću RT-PCR. Kao što se i očekivalo, razine spojenog XBP1 izoforme su povećane, ali nismo otkrili promjene u prijavljenim CD19 Δex2part proizvod (Dodatna datoteka 1: sl. S1a). To je dovelo u pitanje ulogu IRE1 u obradi eksona 2. Stoga smo odlučili istražiti aberantno spajanje CD19 mRNA u B-ALL detaljnije. U tu svrhu, proveli smo dRNA-seq i cDNA-seq na istom uzorku RNA iz ksenografta dobivenog od pacijenata otpornog na terapiju [17] koristeći dugo čitano ONT sekvenciranje. Oba skupa podataka dokumentirala su pojavu nekoliko prethodno prijavljenih patoloških stanja CD19 izoforme, uključujući preskakanje egzona 2 [2] i zadržavanje introna 2 [4]. Iznenađujuće, nismo uspjeli detektirati Δex2part produkt u dRNA-sequ, iako je jasno uočen u cDNA-sequ (slika 1a). To sugerira da bi to mogao biti artefakt protokola koji se temelji na reverznoj transkripciji (RT)/PCR amplifikaciji. Pomno ispitivanje CD19 slijed eksona 2 otkrio je da bi se navodni eksitron mogao presavijati u stabilnu ukosnicu okruženu s dva izravna ponavljanja od 8-nt (slika 1b), nagovještavajući moguće RT ili PCR klizanje u podnožju ukosnice i posljedično skraćivanje proizvoda.

Prijavljeni exitron u CD19 egzon 2 je artefakt reverzne transkripcije. a Genome browser view showing cDNA-seq and dRNA-seq data for RNA from a patient-derived xenograft (PDX). Junction reads supporting the reported Δex2part product can be observed in cDNA-seq but are absent in the dRNA-seq. b Schematic of the predicted secondary structure and the direct repeats of the putative intron in CD19 exon 2. c Schematic of the eGFP/mCherry-based reporter to detect splicing of the reported CD19 exitron. d RT-PCR assay characterizing the CD19 transcript isoforms for the wild type version and the variants of the reporter shown in panel c. They include two different point mutants predicted to stabilize the putative hairpin (mut+) or disrupt one of the direct repeats (mut−), as well as the control construct wherein the reported exitron has been deleted at the DNA level (exon2part-del). e Flow cytometry-based assay to characterize splicing of the reported exitron in HEK293T cells. f Genome browser view showing the region of CD19 exon 2. cDNA-seq, dcDNA-seq, and dRNA-seq were performed on the same RNA sample from HEK293T cells expressing the mut+ reporter shown in panel c. Several hundred junction reads supporting exitron excision at the direct repeats in the cDNA-seq and dcDNA-seq data are detected, while none are found in the dRNA-seq

To test this hypothesis, we engineered a dual-fluorescence GFP/RFP reporter (Fig. 1c) that would allow detection of CD19 exitron excision by standard RT-PCR, and the corresponding protein product - via restoring the RFP open reading frame detectable by flow cytometry. U skladu s CD19 exitron excision being an RT-PCR artifact, we readily observed the corresponding RT-PCR product, but no RFP/GFP double-positive cells upon transfection into HEK293T cells (Fig. 1d, e). In addition, we introduced point mutations that were predicted to either increase the stability of the secondary structure (mut+ ΔΔG = − 5.1 kcal/mol) or disrupt one of the direct repeats (mut− Fig. 1b). Consistent with our hairpin hypothesis, these reporter variants altered the levels of the Δex2part product in the RT-PCR-based assay. Namely, they were 82% higher in the case of mut+ or completely abolished in the case of mut− (Fig. 1d). Again, neither of them, not even mut+, yielded GFP/RFP double-positive cells (Fig. 1e). As a positive control, we removed the reported exitron from the reporter at the DNA level (exon2part-del) and readily observed both truncated RT-PCR product (Fig. 1d, e Additional File 1: Fig. S1b, c) and robust expression of RFP (Fig. 1e).

To differentiate between RT and PCR artifacts, we performed dRNA-seq, direct cDNA (dcDNA)-seq omitting PCR amplification, and regular PCR-aided cDNA-seq on the reporter-transfected cells. To rule out the sensitivity issue, we used the mut+ reporter variant, which yields the highest levels of the Δex2part product in RT-PCR (Fig. 1e). Strikingly, in the long-read ONT data, the Δex2part product accounted for > 25% of dcDNA-seq and almost 30% of cDNA-seq reads, but was undetectable using dRNA-seq (Fig. 1f). This direct comparison of sequencing protocols indicated that excision of the reported CD19 exitron occurs not in live cells, but in the test tube during the RT step, possibly due to the two direct repeats brought together at the base of the predicted hairpin structure. A similar phenomenon has been previously observed in the human LIP1 i FOXL2 genes [18, 19].

Our results indicate that RT-based sequencing protocols can lead to the widespread mis-identification of exitrons. Doista, the CD19 exitron was recently reported to yield a new isoform in the long-read full-length cDNA-seq dataset obtained using the Rolling Circle Amplification to Concatemeric Consensus (R2C2) method serving to increase detection accuracy [7, 8]. To determine whether other transcripts are prone to such RT artifacts, we performed a targeted search in publicly available ONT sequencing datasets. Specifically, we screened for transcript isoforms that are present only in cDNA-seq but not in the matching dRNA-seq. This was achieved using several filtering steps, such as adjusting for read coverage and excluding the presence of canonical splice sites (Fig. 2a, Additional File 1: Fig. S2a, also see Methods). We first applied this comparison to cDNA-seq and dRNA-seq data for the B-lymphoblastoid cell line GM12878 from the Nanopore RNA Consortium [20]. We readily rediscovered the CD19 exitron along with 19 other questionable exitrons, which we dubbed “falsitrons” (Fig. 2b, c, Additional File 1: Fig. S2b, Additional File 2: Data 1, Additional File 3: Table S1), supporting the common nature of such artifacts. We then extended our search to ONT sequencing data for five commonly used cell lines from the Singapore Nanopore Expression Project (SG-NEx) [21]: A549, HCT116, HepG2, K562, and MCF-7. In total, we discovered 100 candidate events corresponding to 57 unique falsitrons in 43 genes, for which “spliced” reads were present in the cDNA-seq (up to 70% of reads) but completely absent in the matched dRNA-seq (Fig. 2c, Additional File 2: Data 1, Additional File 3: Table S1). Many of these falsitrons were short (median length 353 nt Fig. 2d), with the “spliced” regions flanked by direct repeats (35 out of 57 Fig. 2c, e). This discovery strengthens our hypothesis that falsitrons in many instances arise from RT slippage. These artifacts are not restricted to ONT data, but occur in other long-read sequencing protocols such as Iso-Seq (Isoform Sequencing, PacBio) as well [13]. We detected 33 out of 57 falsitrons in the reconstructed isoforms from publicly available Iso-Seq data for several human RNA samples (Alzheimer brain, lymphoblastoid cell line COLO829BL, melanoma cell line COLO829T and Human Universal Reference RNA—see the “Methods” section and Additional File 1: Fig. S2c).

The detection of questionable exitrons is common in cDNA-seq and dcDNA-seq. a Schematic representation of the workflow to identify falsitrons in public ONT sequencing datasets. b Genome browser view showing the falsitron in TAX1BP3 in ONT sequencing data for GM12878. c Violin plots indicating the detection of falsitrons in cDNA-seq and dcDNA-seq of different human cell lines. d Stacked bar plots showing the fraction of falsitrons of different lengths. e Bar graph depicting the length of falsitron-flanking direct repeats. f Violin plots show relative abundance of falsitron products in DNAJC22 i GAS2L3 for three TCGA cancer cohorts. ESCA, esophageal carcinoma. OV, ovarian serous cystadenocarcinoma. STAD, stomach adenocarcinoma. g Plot showing cumulative percentage with direct repeats of at least a given length. Dashed lines indicate the total fraction of introns with direct repeats (≥ 4 nt). h Sequence logos indicating nucleotide composition at 5′ and 3′ splice sites. Positions of splice site dinucleotide motifs are highlighted

Conceptually, such RT artifacts would not be restricted to long-read cDNA-seq data either and should also be found in conventional short-read RNA-seq protocols. To test this hypothesis, we screened the Cancer Genome Atlas (TCGA) database [22] and immediately found six of the falsitrons in several cancer types. Overall, the abundance of the corresponding isoforms was low (< 5%), but could rise up to > 90% for certain samples and tumor types (Fig. 2f). This is potentially important, because a recent paper reported more than 100,000 exitrons in the TCGA database and suggested that the corresponding isoforms are novel cancer drivers and neoepitopes [23]. To learn whether such analyses might be affected by RT artifacts, we overlaid the falsitrons from our ONT data comparison onto these reported exitrons. We found that five falsitrons, including the CD19 one, overlapped with reported exitrons. To our surprise, we further detected direct repeats (≥ 4 nt) overlapping the putative splice sites in almost 75% of the reported exitrons (91,852 out of 123,337 median length 5 nt), i.e. even more than in our falsitron list (with the shorter median length of 4 nt Fig. 2g). In contrast, only

25% of all annotated introns harbored such direct repeats at their splice sites (median length < 4 nt). Moreover, even though exitrons had been selected for canonical splice site dinucleotides (GU/GC-AG), they lacked other characteristics of 5′ and 3′ splice sites such as U1 complementarity and the polypyrimidine tract (Fig. 2h). This finding indicates that a significant fraction of the reported exitrons could also be RT artifacts. Although this observation awaits experimental validation, it suggests that caution is required when interpreting RNA-seq mapping data. We envision that as more dRNA-seq data become available, the unequivocal classification of cryptic introns as exitrons or falsitrons will be possible.


2.6 – Enzymes

2.6 – Enzymes
2.6.1 – Define enzyme and active site
Enzim – A biological catalyst made of globular protein
Enzymes speed up the reactions by influencing the stability of bonds in the reactants. Oni mogu also provide an alternative reaction pathway, and reduce the energy needed for the reaction.
Aktivna stranica – The region of an enzyme molecule surface where the substrate molecule binds and catalysis occurs
The substrate is drawn in to the active site. It has both binding and catalytic regions. The molecules are positioned to promote the reaction.

2.6.2 – Explain enzyme-substrate specificity
A substrate is the starting substance, which is converted to the product.
Enzymes are very specific, and will only catalyse one type of reaction or a very small group of similar reactions. They recognize the substrate as the active site had a precise shape and
distinctive chemical properties. Hence, only particular substrate molecules will be attracted to the active site and fit there. Others cannot fit and will not bind.
Enzymes can have high specificity (when it will only bind to a single type of substrate) or low specificity (when it will bind to a range of related substances). When they bind, the enzyme substrate complex is formed. U lock and key model, it is suggested that the enzyme and substrate possess specific, complementary shapes that fit exactly into each other.

2.6.3 – Explain the effects of temperature, pH and substrate concentration on enzyme
aktivnost
Temperatura -Each enzyme has an optimal temperature for function. When at this temperature, the enzyme will work at its peak, speeding up the reaction. After the temperature reaches its optimum level, the reaction rate abruptly declines. Many enzymes are adversely affected by high temperatures, at which point denaturation occurs. Many enzymes only have a narrow range of conditions under which they operate properly. This is usually at low temperatures for plant and animal enzymes.

pH -Enzymes also have an optimal pH. At this point, it works best and the reaction occurs the fastest, as the enzyme is the most active. There is lower activity above and below the optimum pH (see graph). Extremes in pH will usually result in a complete loss of activity for most enzymes as it leads to a change in shape of the active site. The H+ ions interfere with hydrogen and ionic bonds within the protein structure, which means that the substrate cannot bind. The optimum pH for each enzyme varies greatly. For example, pepsin has an optimum pH of 1.5, but lipase has an optimum pH of 8.0.

Substrate Concentration – If the amount of the enzyme is kept constant and the substrate concentration is increased, the reaction velocity will increase until it hits its maximum. After that, the velocity plateaus. At this point, all of the enzymes have formed complexes with the substrates.

Enzyme Concentration – The rate of reaction, so long as there is excess substrate, will continue to increase as the concentration of the enzyme increases

2.6.4 – Define denaturation
Denaturation is a structural change in a protein that alters its shape and results in a loss of biological properties. This can be caused by pH or temperature. This is when the protein loses its three-dimensional structure, usually along with function. It is often permanent. The bonds in the secondary and tertiary structure are altered, although the sequence is unchanged.
This can result from strong acids and alkalis, which disrupt ionic bonds, resulting in coagulation. Long exposure will eventually break down the primary structure. Teški metali also disrupt ionic bonds, and form bonds with the carboxyl groups of the R group, reducing the charge of the protein. This generally causes the protein to precipitate. Toplina i radijacija (such as UV rays) disrupt the bonds because of the increased energy provided to the atoms. Detergents and solvents form bonds with the non-polar groups in the protein, which disrupts hydrogen bonding.

2.6.5 – Explain the use of lactase in the production of lactose-free milk
The production of lactose-free milk is an example of industrial use of biotechnology, which is of huge and increasing economic importance. People who cannot digest lactose are lactose intolerant i do not produce lactase. They must instead drink lactose-free milk, which is made by using lactase from bacteria.
This used to be done through whole-cell preparations. This is not efficient, however, and inappropriate for a food like liquid milk. Cell-free preparation is also used, although the enzymes cannot be re-used, and removal can be expensive.
umjesto toga, immobilized enzymes su korišteni. The advantages of this method are:

  • The enzyme preparation can be re-used
  • The product received is enzyme-free
  • The enzyme may be more stable and long lasting due to protection by the inert matrix

Today, lactose free milk is produced by passing milk over lactase enzyme, bound to an inert carrier. The enzyme is obtained from bacteria, purified, and enclosed in capsules. Once the molecule is cleaved, there are no lactose ill-effects. Alternatively, a harmless bacterium may be added (such as L. Acidophilus), which affects the lactose in milk and yoghurt.


Structural basis for backtracking by the SARS-CoV-2 replication-transcription complex

Backtracking, the reverse motion of the transcriptase enzyme on the nucleic acid template, is a universal regulatory feature of transcription in cellular organisms but its role in viruses is not established. Here we present evidence that backtracking extends into the viral realm, where backtracking by the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) may aid viral transcription and replication. Structures of SARS-CoV-2 RdRp bound to the essential nsp13 helicase and RNA suggested the helicase facilitates backtracking. We use cryo-electron microscopy, RNA-protein cross-linking, and unbiased molecular dynamics simulations to characterize SARS-CoV-2 RdRp backtracking. The results establish that the single-stranded 3' segment of the product RNA generated by backtracking extrudes through the RdRp nucleoside triphosphate (NTP) entry tunnel, that a mismatched nucleotide at the product RNA 3' end frays and enters the NTP entry tunnel to initiate backtracking, and that nsp13 stimulates RdRp backtracking. Backtracking may aid proofreading, a crucial process for SARS-CoV-2 resistance against antivirals.

Ključne riječi: RNA-dependent RNA polymerase backtracking coronavirus cryo-electron microscopy molecular dynamics.


Gledaj video: Transcription DNA to mRNA (Srpanj 2022).


Komentari:

  1. Delton

    I što bismo učinili bez vaše vrlo dobre ideje

  2. Hayle

    Nadilazi sve granice.

  3. Ketaxe

    Mislim da nisi u pravu. Siguran sam. Pozivam vas da razgovarate. Pišite u PM, razgovarat ćemo.

  4. Kishicage

    Mislim da nije u pravu. Napiši mi u PM.



Napišite poruku